腺相关病毒包装操作手册剖析
腺病毒中文操作手册
腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介1 第二章应用重组腺病毒的优点2 第三章AdEasyTM技术3 3.1技术概况3 3.2AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程4 4.1将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 缩写英文全称中文全称 AdAdenovirus腺病毒 Ad5Adenovirusserotype5血清5型腺病毒AdVAdenoviralVector腺病毒载体 AmpAmpicillin氨苄青霉素 β-Galβ-Galactosidaseβ-半乳糖苷酶 bpBasePair碱基对 BSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白cDNAComplementaryDNA互补DNA cccDNAClosedCircularCoiledDNA闭环螺旋DNA CPECytopathicEffect细胞病理效应CsClCesiumChloride氯化铯 DMEMDulbecco’sModifiedEagleMediumDMEM培养基DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜DTTDithiothreitol二硫苏糖醇EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸EtBrEthidiumBromide溴化乙锭FBSFetalBovineSerum胎牛血清 HrHour小时 ITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复KanKanamycin卡那霉素 kbKilobases千碱基对 KDaKiloDaltons千道尔顿LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite多克隆位点 MinMinute分钟 MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell)感染复数mRNAMessengerRNA信使RNA MWCOMOIecularWeightCut-off PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PFUPlaqueFormingUnit空斑形成单位 piPostInfection感染后RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸 TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%组织培养感染剂量 TCPTotalCellularProtein细胞总蛋白 TETris/EDTATE溶液 wtWildType野生型 X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷 第一章简介 当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。为解决这一问题，基因输送技术(通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒)通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。 1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。1977年，FrankGraham博士建立了一种细胞株，可在无辅助病毒的情况下产生重组腺病毒（Graham等，1977）。此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广
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腺病毒载体操作手册中文版 腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章 AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术 7 第五章常用技术 8 5.1 QBI-293A细胞培养 8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存 8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 9 5.2.1 感染QBI-293A细胞 9 5.2.2 病毒空斑形成 9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 9 5.3 MOI测定 10 5.4 腺病毒感染力测定 10
5.4.1 X-Gal染色 11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交 13 5.5.4 Southern杂交和点杂交 13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定 14 5.5.7 功能测定 14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 16 5.7.1 不连续密度梯度离心 17 5.7.2 连续密度梯度离心 17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集 17 5.8 病毒滴度测定 18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法 20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法 20 第六章疑难解答 22 6.1 QBI-293A细胞培养 22 6.2 感染力测定 22 6.3 转移载体克隆 23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞 25 6.6 筛选和测定 25 6.7 在QBI-293A细胞中表达 26 6.8 重组腺病毒的扩增 26 6.9 纯化 26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒 Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒 AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素 β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶 bp Base Pair 碱基对
病毒包装原理
汉恒生物2017产品手册 --您身边的病毒载体专家
专注于基因技术的研发与应用转化 病毒载体为工具的基因技术操作全平台 汉恒已成为国内生物医药科研与研发领域最主流的基因载体与基因技术供应商 覆盖、并抢占国内主流科研、临床前研究及药物研发的AAV市场，完成基础底层市场的教育及占领 与国内临床机构合作申报并实施基因治疗临床前及临床研究项目 上市1-2种自主知识产权的基因治疗AAV药物 2012年4年多的发展短期目标 中期目标2-5年内长期目标10年内 2010成立汉恒简史 汉恒生物成立于2010年，专注于基因技术的研发与应用转化。2012年， 汉恒建立了以病毒载体为工具的基因技术操作全平台，经过7年多的发展，汉恒已成为国内生物医药科研与研发领域最主流的基因载体与基因技术供应商。 汉恒在一系列基因载体技术如腺病毒、慢病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、细胞功能学服务的基础上，进一步开发基因及信号通路研究工具，包括自噬流 研究工具、lncRNA&环状RNA载体工具、分子载体探针、基于病毒载体的Crispr/Cas9基因编辑工具等。 以核心基因技术为基础，汉恒更加注重技术应用与临床转化。 公司简介 目 录 1 Zhu Y , Di S, Hu W et al. A new flavonoid glycoside (APG) isolated from Clematis tangutica attenuates myocardial ischemia/reperfusion injury via activating PKCepsilon signaling. Biochim Biophys Acta 2017; 1863:701-711. 2 Zheng X, Chen W, Hou H et al. Ginsenoside 20(S)-Rg 3 induced autophagy to inhibit migration and invasion of ovarian cancer. Biomed Pharmacother 2017; 85:620-626. 3 Zhao H, Xue Y , Guo Y , Sun Y , Liu D, Wang X. Inhibition of endocan attenuates monocrotaline-induced connective tissue disease related pulmonary arterial hypertension. Int Immunopharmacol 2017; 42:115-121. 4 Yang Z, Hou Y , Hao T et al. A human proteome array approach to identifying key host proteins targeted by Toxoplasma kinase ROP18. Mol Cell Proteomics 2017. 5 Xu J, Zhang X, Wang H et al. HCRP1 downregulation promotes hepatocellular carcinoma cell migration and invasion through the induction of EGFR activation and epithelial-mesenchymal transition. Biomed Pharmacother 2017; 88:421-429. 6 Wang X, Fu Z, Chen Y , Liu L. Fas expression is downregulated in gastric cancer. Mol Med Rep 2017; 15:627-634. 7 Wang T, Wang P , Cao Z et al. Effects of BMP9 and pulsed electromagnetic fields on the proliferation and osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells. Bioelectromagnetics 2017; 38:63-77. 8 Wang P , Wang Y , Tang W et al. Bone Morphogenetic Protein-9 Enhances Osteogenic Differentiation of Human Periodontal Ligament Stem Cells via the JNK Pathway. PLoS One 2017; 12:e0169123. 9 Li M, Y uan Y , Hu B, Wu L. Study on Lentivirus-Mediated ABCA7 Improves Neurocognitive Function and Related Mechanisms in the C57BL/6 Mouse Model of Alzheimer's Disease. J Mol Neurosci 2017. 10 Li C, Guo XD, Lei M et al. Thamnolia vermicularis extract improves learning ability in APP/PS1 transgenic mice by ameliorating both Abeta and 2017客户最新文献节选 06一流质量标准汉恒专利08 产品介绍 07公司优势 02汉恒客户发表文献专题研究 33HB-infusion TM 无缝克隆试剂盒 36SaveIt TM 抗支原体试剂盒 37 Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒 34LipoFiter TM 脂质体转染试剂汉恒自主研发试剂 30CRISPR-Cas9专题研究 27环状RNA专题研究28自噬专题研究 32 探针工具 细胞器定位工具 25悬浮细胞专用病毒 26 原代T细胞专用病毒 17化学遗传学AAV现货工具 14光遗传学AAV现货工具22慢病毒 24 逆转录病毒 09 腺相关病毒AAV 19腺病毒特色服务
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腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统 AdEasyTM操作手册 目录 第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 4 4.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生5 4.2.1 共转化的一般原则 5 4.2.2 共转化方法 5 4.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 6 4.4.1 细胞铺板 6 4.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术8 5.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞9 5.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定10
5.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12 5.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14 5.5.6 免疫测定14 5.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 19 5.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答22 6.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组24 6.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27 缩写英文全称中文全称 Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清
慢病毒包装实验步骤
慢病毒包装实验的要点： 1：良好的293FT细胞状态是转染成功的首要因素，细胞代数不宜超过30代； 2：细胞铺板需均匀，避免细胞成团，影响转染效率；尽量多的细胞转入质粒，产生的病毒就越多； 3：细胞换液和共转染时，动作要轻柔避免细胞漂浮。尽量少的细胞死亡，产生的病毒就越多； 实验前要准备的试剂、耗材和仪器； 试剂准备：10%灭活胎牛血清+90%DMEM配好的完全培养基,0.25%胰酶，PBS,TRL转染试剂，包装质粒，目的质粒，无血清培养基。 耗材准备：10cm细胞培养皿，6孔细胞培养板，吸头规格1ml、200ul、10ul，10ml移液管，离心管规格15ml、5ml、1.5ml，0.22um PVDF滤膜和10ml无菌注射器，试管架。仪器准备：倒置荧光显微镜，普通光学倒置显微镜，电动移液器，吸引器，移液枪，二级生物安全柜，二氧化碳细胞培养箱。 第一天：上午（病毒包装质粒共转染前，293FT细胞复苏后至少让其传代两次以上，293FT 细胞能成倍的增长，确定细胞状态好）； 实验前准备： 安全柜开紫外灯照30分钟； 把培养基和试剂放置常温； 消化细胞： 从37 5%的co2细胞培养箱拿出细胞状态良好的293FT细胞，吸出原培养基，加入PBS 1ml略洗之后吸出，加入1ml胰酶消化1-2min，轻轻拍打培养皿，再加入3ml新鲜培养基终止消化，将培养皿中的细胞转移至15ml离心管内离心1000r /5min,吸出上清液，加入10ml PBS 吹打混匀后，离心1000r /5min, 吸出上清液。 细胞铺板： 在10cm细胞培养皿上标记细胞名称、细胞代数、时间和操作人，将计数好大约2.5×106个293FT细胞吸入15ml离心管，再加入完全培养基至10ml充分混匀，然后把混匀的293FT细胞移入10cm培养皿）。放置培养箱中培养48h。 插入铺板后图片
病毒包装实验整体流程及原理#(精选.)
病毒感染细胞实验整体流程及原理 目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。 1、病毒的种类 病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 1.1慢病毒 1.1.1原理 慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA / miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA 和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA 载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1.1.2特点 1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi 研究和体内实验中难以转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。 3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1.1.3慢病毒包装简要流程： 1）含有目的基因的慢病毒RNAi 干扰载体的构建和质粒纯化提取。 2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、- 80 ℃保存。 6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1.2、腺病毒
1.2.1原理 腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 1.2.2特点 1）几乎可以感染所有类型的细胞 2）可以获得复制缺陷型(E1 和E3 缺失) 的腺病毒 3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012 PFU/mL，能有效的进行增殖。 4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 1.2.3腺病毒包装简要流程 1）构建表达siRNA/miRNA 的腺病毒载体 2）采用PacI 消化纯化的质粒。 3）消化好的腺病毒表达载体转染293A 细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。 4）将病毒粗提液感染293A 细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 1.3、慢病毒和腺病毒的比较
MicroRNA腺病毒表达系统使用手册0828
产品手册│ MirAd TM MicroRNA前体腺病毒表达系统 本产品仅限用于研究，严禁用于任何动物或人类疾病诊断。 本产品仅供购买方内部研究使用，未经ViGene生物科技有限公司书面许可，严禁转售。
目录│ 产品简介 4 产品组成 5 保存条件 5 使用安全注意事项 6 pMirAd 载体图谱 6 质粒扩增 6 病毒载体扩增 7 常见问题解答 8
产品有限责任担保 Vigene生物保证您收到的产品符合产品目录上的规格。本担保规定了Vigene 更换产品的责任。Vigene生物不提供其他任何形式的对于产品商业或健康用途的保证。Vigene生物不对任何由于使用或不正确使用本公司产品造成的直接、间接的、衍生的或偶然的损害所产生的后果负责。 产品订购和技术支持 山东维真生物科技有限公司暨美国ViGene Biosciences公司中国办事处 美国地址：12111 Parklawn Dr. Rockville, MD 20852 US 北京办事处：北京市海淀区北三环西路43号青云里满庭芳园D座1206室上海办事处：上海市徐汇区肇家浜路201弄11号602室 广州办事处：广州市天河区骏景花园骏景路棋乐街33号404室 山东办事处：济南市高新区开拓路2350号留学人员创业园717室 Email: service@https://www.360docs.net/doc/1416961600.html, Phone: 400-077-2566 https://www.360docs.net/doc/1416961600.html,(美国) https://www.360docs.net/doc/1416961600.html,（中国） 欢迎您致电或发邮件，咨询产品技术信息。
产品简介 MicroRNAs（miRNAs）是一类长度为18-24个核苷酸的非编码RNA分子。MiRNA通过与靶基因mRNA上的互补序列结合，降解mRNA或抑制mRNA的翻译。MiRNAs在细胞分化、增殖、凋亡和癌细胞发生中发挥重要的调控作用。MiRNAs来源于具有60-80个核苷酸茎环结构的microRNA前体（premir）和序列更长一些的microRNA初级转录产物（primir）。MiRNA在核内由RNA聚合酶II（polII）转录生成，最初产物primir具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴。 ViGene生物的mirAD-腺病毒microRNA前体表达系统包括三个相关产品：microRNA前体穿梭载体、microRNA前体腺病毒载体和预制microRNA前体腺病毒。 重组腺病毒是进行基因转移和表达的工具，功能强大且易于操作。腺病毒独特的生物学特征使它成为“载体的首选”，被科研工作者广泛应用。首先，它能够感染包括分裂、非分裂细胞和干细胞在内的多种细胞。第二，病毒滴度高。第三，高滴度的病毒可获得高感染效率和高表达量。第四，病毒进入细胞后，病毒基因组不整合到细胞染色体上，因此瞬时表达外源基因的重组腺病毒不会诱导宿主细胞中染色体的变化。ViGene生物选用的是应用最广泛的复制缺陷型的人类血清5型腺病毒，该腺病毒载体缺失E1和E3基因。E1基因在组装感染性病毒颗粒时必不可少，可在HEK293T细胞病毒包装过程中得到补充，而E3基因可有可无。由于E1和E3基因的缺失，腺病毒载体可插入高达7.5kb的外源基因。 pMir-microRNA precursor是基于microRNA前体表达系统的质粒。microRNA前体天然的茎环结构被克隆到质粒的SgfI和MluI双酶切位点。为了保持推测的发卡结构和诱导正确的内源性反应，miRNA茎环结构的两侧具有它的150-200bp的天然序列。MicroRNA前体在CMV启动子启动下表达，其上游有GFP荧光标记，并具有SV40 poly（A）加尾信号。穿梭载体含有SV40启动子启动的puromycin嘌呤霉素标记，可以用来进行稳转细胞株的筛选。穿梭载体还含有两个腺病毒ITR序列和两个与腺病毒Ad5同源的序列，可
慢病毒生产及使用操作手册
慢病毒生产及使用操作手册 一、实验流程 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。以下容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。 二、实验材料 （一）慢病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pHBLV TM系列质粒。 1、载体信息（见附录） 2、细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 三、包装细胞293T细胞的培养 （一）293T细胞的冻存 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。 1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基； 2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。 3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入3mL 37 ℃预热的10％DMEM，用10mL 移液管进行吹打，较大力吹打6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取50ul 混匀后的细胞于1.5mL eppendorf 管中，加入450ul 10％DMEM，即为10 倍稀释，混匀，取10ul 细胞于计数板中计数。计数板上共4 大格，每大格16 小格。计数时，4 大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10 倍稀释），即为实际n万/mL 细胞浓度。
慢病毒包装操作方案
慢病毒包装操作流程 一、材料 1 细胞培养试剂 试剂名称终浓度试剂品牌DMEM/High glucose基础培养基90%Invitrogen 胎牛血清10%Invitrogen/Gibco 丙酮酸钠1mM Invitrogen DMSO（冻存用）10% 2 慢病毒包装试剂 试剂名称浓度试剂品牌Lipofectamine 2000Invitrogen Opti-MEM基础培养基Invitrogen PEG6000溶液50%Wako NaCl溶液40 mM HBSS溶液Invitrogen 3 耗材 50 mL离心管 15 mL离心管 10 cm细胞培养皿 μm过滤器 2 mL EP管 二、操作流程
1细胞培养 1.1293T/293FT细胞的复苏 1)将完全培养液从4°C中取出放置到室温预热30 min左右。在超净台内，用吸管吸取6~7mL 完全培养液至15 mL离心管中； 2)快速将冻存的细胞从液氮中取出，并迅速用镊子夹住盖子放入37°C水浴中快速晃动（水不 要没到盖子），使其在1~2分钟内完全融化； 3)在超净台内，用酒精棉球擦拭冻存管外壁消毒，用吸管吸取所有融化的细胞悬液至装准备好的 完全培养液中，轻轻吹打混匀，使冻存液分散开（目的是让DMSO分散，降低恢复室温的DMSO 对细胞造成的毒性作用）。 4)在室温条件下，250 g离心4分钟。 5)离心后，在超净台内小心倒去上清，用吸管吸取 2 mL新鲜完全培养液重悬细胞至单细胞悬液， 再转移已经加好培养基的培养瓶/培养皿中，写上细胞名称、日期，放置 37°C、5% CO2饱和 湿度培养箱内培养。（首次复苏细胞时，离心重悬后需取样计数，根据细胞数选择面积合适的 培养容器。） 6)复苏翌日，给复苏的293T细胞更换新鲜的完全培养基。 7) 1.2293T/293FT细胞传代 1)待细胞长至60%-70%融合度即可传代。将培养瓶里的所有培养液全部移去，用1×PBS洗涤细 胞两次（洗涤速度要快，避免细胞干涸时间过长），以去除残余的培养液和血清（血清含有胰 酶的抑制因子）； 2)加入适当的胰酶溶液，能使其完全浸过细胞即可，室温孵育1-2分钟。在显微镜下观察，可看 到大部分细胞变圆不贴壁，拍打培养瓶两侧会有大量细胞脱离，此时应立即终止消化，若细胞 仍然有大部分贴壁，可适当延长孵育时间； 3)加入等体积完全培养液终止消化，并用吸管吹打培养瓶底2-3次使所有细胞彻底脱壁。用吸管
慢病毒转染手册
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。 基本概述 慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 慢病毒的应用 目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。构建载体前通常要通过合成siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后从中挑选符合载体要求的序列，将其引入siRNA表达载体。 慢病毒载体
自噬监测——LC3双标腺病毒(完整版)
自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南 1 自噬双标腺病毒（mRFP-GFP-LC3）使用指南 背景： 自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating ）”的现象，凋亡是“自 杀（Self-killing ）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白， 但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指 膜（目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层）包 裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与 溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳 态和细胞器的更新。目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略 和手段有：通过western blot 检测LC3的剪切；通过电镜观测自噬体 的形成；在荧光显微镜下采用GFP （-RFP ）-LC3等融合蛋白来示踪自 噬体形成以及降解。近几年对自噬流的研究日趋增多，针对于此我们 汉恒生物科技（上海）有限公司自主研发了用于实时监测自噬(流) 的mRFP-GFP-LC3腺病毒，mRFP 用于标记及追踪LC3，GFP 的减弱可指 示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP 荧光蛋白对 酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检 测到红色荧光。这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了 细胞自噬流的水平，是我们自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利 器。
mRFP-GFP-LC3腺病毒的操作 收到病毒后的处理 （一）、腺病毒的储存 1、腺病毒采用冰袋运输。 （1）、收到病毒液后如未融化请置于-80℃冰箱，下次使用时再进 行分装； （2）、如客户收到时腺病毒已融化，请直接分装后置于-80℃冰箱 保存；若短期内用于实验，可分装部分于4℃保存（尽量一周内用完）。 2、尽量避免反复冻融，否则会降低病毒滴度（每次冻融会降低病 毒滴度10%）。建议不要在-20℃下长期保存。如果病毒储存时间 超过6个月，应该重新测定病毒滴度。 3、建议收到病毒产品后根据实验需求自行分装或购买经过分装的小 包装病毒产品（购买时请提出）。 （二）、腺病毒的稀释需要稀释病毒时，将病毒取出后置于冰上融解，使用培养目的细胞 用PBS 或培养基稀释到所需浓度后混匀分装后4℃保存，并尽快用于 实验（尽量一周内用完），动物实验建议使用注射用平衡液来稀释， 并尽快用完。 感染目的细胞 2
腺相关病毒操作手册--汉恒生物
汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 1 汉恒生物---腺相关病毒操作手册 一、腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector ，AAV ）简介 腺相关病毒属微小病毒科( parvovirus)，为无包膜的单链线状 DNA 病毒。AA V 的基因组约 4700bp ，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由 145 个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。 基因组中有 3 个启动子(P5、P19 和 P40) 和 2 个开放阅读读框(ORF)，rep 和 cap ，如图 1 所示。rep 编码 4 个重叠的多功能蛋白，即 Rep78、Rep68、Rep52 和 Rep40，其中 Rep78 与 Rep68 参与 AA V 的复制与整合，Rep52 和 Rep40 具有解螺旋酶和 ATP 酶活性，与 Rep78、Rep68 共同参与单链基因组的复制；cap 编码的 VP1、VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白，它们在 AA V 病毒整合、复制和装配中其重要作用。 图 1. AA V 基因组结构 二、腺相关病毒的优点 1. 安全性高：迄今从未发现野生型A A V 对人体致病，重组A A V 基因组序列上去除了大部分的野生型A A V 基因组元件，进一步保证了安全性； 2. 免疫原性低：AA V2 的基因组仅 4681 个核苷酸，便于用常规的重组 DNA 技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小； 3. 宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞； 4. 表达稳定：能介导基因的长期稳定表达； 5. 物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿； 三、重组腺相关病毒载体系统简介
腺病毒包装操作手册
汉恒重组腺病毒操作手册 目录 腺病毒安全使用和注意事项 腺病毒储存与稀释的注意事项 一、整体实验流程 二、实验材料 三、腺病毒包装和浓缩 四、重组腺病毒滴度（PFU）的测定 五、重组腺病毒感染目的细胞 六、重组腺病毒用于动物实验 附1：汉恒生物腺病毒载体 附2：腺病毒感染细胞最佳MOI的摸索（表达荧光的病毒）附3：汉恒生物常见三种病毒感染目的细胞比较
腺病毒安全使用和注意事项 ?腺病毒安全使用注意事项（*非常重要！！！*） 1)腺病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。 2)操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。 3)操作病毒时需要特别小心病毒溅出。如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用 70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。 4)接触过病毒的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液浸泡后统一处理。 5)如实验过程中需要离心，应使用密封性好的离心管，必要时请用封口膜封口后离心。 6)病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌后处理。 7)实验完毕后请用香皂清洗双手。 ?腺病毒储存与稀释的注意事项 1）腺病毒的储存 收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于4℃保存（一周内使用完最佳）；如需长期保存请分装后放置于-80 ℃。 注：
a.反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会使病毒滴度降低10%~50%），因此在病毒使用过程中 尽量避免反复冻融。汉恒生物对病毒已进行分装（200 μl/tube），收到后请直接放置-80℃冰箱保存即可。 b.若病毒储存时间超过6个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度（参见附表2-慢病毒滴 度测定方法）。 2）腺病毒的稀释 需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于4℃保存(一周内使用完最佳)。 重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。重组腺病毒具有以下几个显著优点：感染范围广，几乎可以感染所有的细胞系、原代细胞和部分组织；感染效率高达100%，可全面超越其他病毒载体工具和脂质体转染；对外源基因容载能力大（可以高达8Kb）；不整合基因组；滴度高，操作方便。因此，重组腺病毒是一种最具有潜力的基因递送工具。 目前常用的腺病毒载体基于人腺病毒5型（Ad5），其基因组是36Kb长的线性双链DNA。腺病毒可通过自身的纤维（fiber）和细胞表面的受体结合被内吞进入细胞，然后从内吞体（endosome）转移到细胞质和细胞核内，借助细胞的转录和翻译机器启动病毒的复制组装。一个完整的病毒生活周期会引发细胞死亡从而释放出病毒粒子。 目前最常用的腺病毒包装体系有AdEasy和AdMAX两种，其共同特点是目的基因首先克隆到穿梭载体，然后再重组到腺病毒的大骨架上。这两个系统均具有腺病毒早期转录复制基因E1和E3的缺陷(ΔE1, ΔE3)，其中E3基因对病毒产生并非必需。因此，腺病毒包装
慢病毒包装操作说明
Clontech-Lenti-X? Lentiviral Expression Systems User ManualProtocol No. PT5135-1慢病毒包装操作说明 A.用Lenti-X HTX Packaging System生产慢病毒悬浮物为了获得最高效价的病毒悬液，用Lenti-X 293T细胞系，严格尊守以下说明，尤其尊守（1）培养体系和培养量（2）DNA的量和转染质量（3）无四环素血清（4）孵育时间。 所有的Xfect?转染成份，量和条件最好用Lenti-XVectors，Lenti-XHTX包装混合物，Lenti-X293T细胞。 用10cm组织培养板并确保血清无四环素，四环素污染的血清对表达包装成份是有害的。 所有的实验步骤均在无菌组织培养器血中完成。 包装病毒需要有微生物安全等级2的生物安全柜中进行，注意重组的假性慢病毒包装颗粒能够感染人。 6 1.转染24小时前，在10cm培养板接种4-5×10个293T细胞，添加10ml的生长培养基。 在37℃，5%CO2℃条件下过夜。 在进行第7步前确保培养血有80-90%的覆盖率。 2.充分混均Xfect Polymer。 3.每个转染样品需准备两个离心管，按顺序添加如下试剂Tube 1(Plasmid DNA) Tube 2(Polymer)557μlXfectReaction Buffer 592.5μl Xfect ReactionBuffer36μl Lenti-X HTX Packaging Mix 7.5μl Xfect Polymer7μl Lenti-X Vector DNA(1μg/μl)600μl 总量600μl 总量注意： Xfect Polymer不要在室温下搁置长于30min
病毒包装经验总结(病毒包装注意点)
病毒包装需要注意什么--病毒包装经验总结 在做病毒包装实验中，有科研工作者常遇到：用同样一个病毒载体系统进行病毒包装实验，为什么有人做的很好，次次成功，有人却是时常做不出来，稳定性很差，不是滴度低就是根本不出毒? 当然你也可以找公司例如汉恒生物，进行病毒包装。 从我们对不同载体系统病毒包装的多年经验总结，主要以下几个方面心得： 第一，病毒包装的几个关键节点就是细胞因素、载体系统(尽量使用成熟的商业化载体系统)、构建重组的质粒正确与否、质粒抽提纯化情况、包装转染控制(24、48 小时的细胞及荧光状态判断)、目的基因对病毒包装影响(基因大小、序列情况、蛋白功能毒性等都会影响到是否能包装成功)。 第二，如果有细胞培养和细胞转染实验的常规经验，细胞因素应该没有什么问题(细胞培养人员一定要关注，包装或转染感染前一定要重视细胞干净细微污染与否、饱满立体感是否好、铺板均匀细胞密度适中否)，细胞产毒出毒期间过程中的活力是包装正常和出来的病毒滴度高低的一个重要环节(正常包装出病毒情况，慢病毒、逆转录病毒包装一个细胞出一个病毒颗粒，腺病毒是1000 个，腺相关病毒是10000 个)，所以实践操作表明，病毒包装转染时细胞的密度要控制，使得收毒(72 小时)时细胞密度在90%-95%左右。 第三，建议使用商品化的成熟毒载体系统(不要用来路不清或基本被淘汰很少人在使用的系统)，从文献和我们多年的实践可以结论，这类系统是稳定的，因而分析原因时尽量少花精力在对载体系统的验证上，这样会白花力气。 第四，至于包装转染时的操作控制细节及其转染试剂因素，只要在操作时按相关使用说明和操作步骤，应该没有大问题，所以也不要白花太多精力在这上面。
腺相关病毒细胞感染手册
腺相关病毒（AAV）感染目的细胞 腺相关病毒（AAV）感染目的细胞 一、腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector，AAV）简介 腺相关病毒属微小病毒科(parvovirus)，为无包膜的单链线状DNA病毒。AA V的基因组约4700bp，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由145个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。 基因组中有3个启动子(P5、P19和P40)和2个开放阅读读框(ORF)，rep和cap，如图1所示。rep编码4个重叠的多功能蛋白，即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40，其中Rep78与Rep68参与AAV的复制与整合，Rep52和Rep40具有解螺旋酶和ATP酶活性，与Rep78、Rep68共同参与单链基因组的复制；cap编码的VP1、VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白，它们在AA V病毒整合、复制和装配中其重要作用。 图1.AA V基因结构 二、腺相关病毒的优点 1.安全性高：迄今从未发现野生型AA V对人体致病，重组AA V基因组序列上去除了大部分的野生型AA V基因组元件，进一步保证了安全性； 2.免疫原性低：AA V2的基因组仅4681个核苷酸，便于用常规的重组DNA技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小； 3.宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；
4.表达稳定：能介导基因的长期稳定表达； 5.物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿； 三、重组腺相关病毒载体不同血清型 研究发现AA V具有多种血清型，各种不同血清型的AA V载体的主要区别是衣壳蛋白不同，因此对不同的组织和细胞的转染效率存在差异。目前汉恒生物在包装腺相关病毒时有9中不同的AAV血清型可供客户选择，建议客户针对不同组织器官选择相应血清型的AAV病毒，见表1。