菌种选育与培养

工业微生物菌种的选育、保藏与培养

工业微生物菌种的选育、保藏与培养自然环境中的微生物是混杂生长的，要想得到生产某一目的产物的野生菌株，就需要采取一定的方法将它们分离出来。菌株分离（separation）就是将混杂着各种微生物的样品按照实际需要和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的过程。菌株分离和筛选是获得目的菌种的两个重要环节。菌株的分离要根据生产实际需要、目的代谢产物的性质、可能产生所需目的产物的微生物种类、微生物的分布、理化特性及生活环境等，设计选择性高的分离方法，才能快速地从环境或混杂了多种微生物样品中获得所需菌种。筛选方法也很重要，在设计筛选方案时有两点必须注意，即所采用方法的选择性和灵敏度。微生物细胞内含物及其周围的培养基成分非常复杂，目标产物往往又含量极低。因此，需要建立灵敏度高、快速、专一性强的检测方法。菌种收集和筛选途径：（1）向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。（2）由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等，从中进行分离筛选。（3）从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌等。该类发酵制品经过长期的自然选择，具有悠久的历史，从这些传统产品中容易筛选到理想的菌株。发酵工业对菌种的要求如下：①能在廉价原料制成的培养基上生长，且生成目的产物产量高、易于回收；②生长较快，发酵周期短；③培养条件易于控制；④抗噬菌体及杂菌污染的能力强；⑤菌种不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定；⑥对放大设备的适应性强；⑦菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。菌种筛选主要步骤：调查研究及查阅充分的资料筛选 ↓↓ 设计实验方案初筛（1株1瓶）↓确定采集样品的生态环境↓ 采样复筛（1株3～5瓶） ↓确定特定的增殖条件↓结合初步工艺条件摸索增殖培养再复筛（1株3～5瓶）↓确定特殊的选择培养基及可能的↓ ↓定性或半定量快速检出法3～5株平板分离↓ ↓单株纯种分离原种斜面↓生产性能试验及毒性试验↓确定发酵培养基础条件菌种鉴定一、菌种的分离筛选一）样品采集与预处理总的原则是：样品的来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。特别是在一些极端的环境中，如高温、高压、高盐等极端环境中，可找到能适应苛刻环境压力的微生物类群。 1、从土壤中采样土壤由于具备了微生物所需的营养、空气和水分，是微生物最集中的地方。从土壤中几乎可以分离到任何所需的菌株，空气、水中的微生物也都来源于土壤，所以土壤样品往往是首选的采集目标。一般情况下，土壤中含细菌数量最多，且每克土壤的含菌量大体有如下的递减规律：细菌（108）>放线菌（107）>霉菌（106）>酵母菌（105）>藻类（104）>原生动物（103），其中放线菌和霉菌指其孢子数。但各种微生物由于生理特性不同，在土壤中的分布也随着地理条件、养分、水分、土质、季节而有很大的变化。因此，在分离菌株前要根据分离筛选的目的，到相应的环境和地区去采集样品。

菌种培养

第一章无菌操作技术第一节灭菌技术一、干热灭菌 1.1、灼烧灭菌【总操作程序】主要分两个步骤：点燃火源灼烧2～3次。具体操作如下： ①点燃火源一般使用酒精灯或煤气灯，点燃酒精灯或煤气灯。 ②灼烧2～3次一般右手持待灭菌的器具，在火焰的外焰上来回灼烧2～3次。【达标标准】灭菌后的器具干燥，所有的微生物被杀死。【注意事项】 ①正确使用火源，防止失火。使用酒精灯时，先要检查灯芯，如果灯芯顶端不平或已烧焦，需要剪去少使其平整，然后检查灯里有无酒精，灯里酒精的体积应大于酒精灯容积的1/4，少于2/3。在使用酒精灯时，应注意，绝对禁止用酒精灯引烧另一盏酒精灯，而应用燃着的火柴或木条来引燃；用完酒精灯，必须用灯帽盖灭，不可用嘴去吹灭，否则可能将火焰沿灯颈压入灯内，引起着火或爆炸。不要碰倒酒精灯，万一洒出的酒精在桌上燃烧起来，不要惊慌，应立即用湿抹布扑盖。灼烧时应用火焰的外焰 ②主要用于实验室接种针、接种环、试管口和玻璃棒等的灭菌。涂布平板用的玻璃棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。【相关知识】干热灭菌的原理：热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。 1.2、干热灭菌【总操作程序】主要分五个步骤：装入待灭菌物品升温恒温降温开箱取物。具体操作如下： ①装入待灭菌物品将包好的待灭菌物品（培养皿、试管、吸管等）放入电热干燥箱内，关好箱门。 ②升温接通电源，拨动开关，打开电热干燥箱排气孔，旋动恒温调节器至绿灯亮，让温度逐渐上升，当温度上升到100℃时，关闭排气孔，在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温；此时如果还未达到所需的160～170℃,则需转动调节器使红灯再亮，如此反复调节，知道达到所需温度。 ③恒温当温度升到160～170℃时，借恒温调节器的自动控制，恒温2h。 ④降温切断电源，自动降温。 ⑤开箱取物

菌种传代与复苏修订稿

菌种传代与复苏 WEIHUA system office room 【WEIHUA 16H-WEIHUA WEIHUA8Q8-

菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种、微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种传代与保藏是一项重要的基础工作。菌种代号国内药品微生物检验所用的菌种代号是CMCC(F)或CMCC(B)，CMCC--中国医学菌种保藏中心，、，B——代表细菌，F——代表真菌。金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003大肠杆菌CMCC(B)44102 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003 传代和接种菌种冻干粉复苏把冻干菌种管、灭菌1ml滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化台。先用砂轮将冻干菌种安瓿瓶颈部挫出挫痕，再将冻干菌种管外壁用75%酒精擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，是骤冷而炸裂。取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面进行培养。菌种斜面传代操作

培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上注明菌种名及菌种编号。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手无名指，小指及掌部夹住棉塞，拨开棉塞，将接种环深入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种环，并将菌种管口移至火焰旁。堵上棉塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面一支，照上述操作打开棉塞，将接种环深入管内至琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上。取出接种棒，在火焰旁将培养基管棉塞堵上，然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌。菌种的培养与保存大肠杆菌35-37摄氏度培养48小时金黄色葡萄球菌30-35摄氏度培养48小时枯草芽孢杆菌30-35摄氏度培养48小时白色念珠菌23-28摄氏度培养7天黑曲霉23-28摄氏度培养7天将培养物管自培养箱取出后放入冰箱（2-8摄氏度）保存，一般2个月转种一次。菌悬液的制备取上述培养好的菌种斜面移入接种室或净化工作台，放置室温后，用接种环取菌苔少许接种至营养肉汤中（10ml/支，已灭菌），将已接种毕的细菌管置35-37摄氏度培养18-24小时，取出备用。一般于冰箱中保存可用两周。

污水处理培养菌种方法

培菌方法： 1、所谓活性污泥培养，就是为活性污泥的微生物提供一定的生长繁殖条件，即营养物，溶解氧，适宜温度和酸碱度。（1）营养物：即水中碳、氮、磷之比应保持100∶5∶1。（2）溶解氧：就好氧微生物而言，环境溶解氧大于0.3mg/l，正常代谢活动已经足够。但因污泥以絮体形式存在于曝气池中，以直径500μm活性污泥絮粒而言，周围溶解氧浓度2mg/l时，絮粒中心已低于0.1mg/l，抑制了好氧菌生长，所以曝气池溶解氧浓度常需高于3－5mg/l，常按5－10mg/l控制。调试一般认为，曝气池出口处溶解氧控制在2mg/l较为适宜。（3）温度：任何一种细菌都有一个最适生长温度，随温度上升，细菌生长加速，但有一个最低和最高生长温度范围，一般为10－45oC，适宜温度为15－35oC，此范围内温度变化对运行影响不大。（4）酸碱度：一般PH为6－9。特殊时，进水最高可为PH 9－10.5，超过上述规定值时，应加酸碱调节。 2、培菌法：（1）生活污水培菌法：在温暖季节，先使曝气池充满生活污水，闷曝（即曝气而不进污水）数十小时后，即可开始进水。引进水量由小到大逐渐调节，连续运行数天即可见活性污泥出现，并逐渐增多。为加快培养进程，在培菌初期投加一些浓质粪便水或米泔水等，以提高营养物浓度。特别注意，培菌时期（尤其初期）由于污泥尚未大量形成，污泥浓度低，故应控制曝气量，应大大低于正常期曝气量。（2）干泥接种培菌法：最好取水质相同已正常运行的污水系统脱水后的干

污泥作菌种源进行接种培养。一般按曝气池总溶积1％的干泥量，加适量水捣碎，然后再加适量工业废水和浓粪便水。按上述的方法培菌，污泥即可很快形成并增加至所需浓度（3）数级扩大培菌法：根据微生物生长繁殖快的特点，仿照发酵工业中菌种→种子罐→发酵罐数级扩大培菌工艺，分级扩大培菌。如某工程设计为三级曝气池，此时可先在一个池中培菌，在少量接种条件下，在一个曝气池内培菌，成功后直接扩大至二三级。（4）工业废水直接培菌法：某些工业废水，如罐头食品、豆制品、肉类加工废水，可直接培菌；另一类工业废水，营养成分尚全，但浓度不够，需补充营养物，以加快培养进程。所加营养物品常有：淀粉浆料、食堂米泔水、面汤水（碳源）；或尿素、硫氨、氨水（氮源）等，具体情况应按不同水质而定。（5）有毒或难降解工业废水培菌：有毒或难降解工业废水，只能先以生活污水培菌，然后再将工业废水逐步引入，逐步驯化的方式进行。（6）直接引进种菌种培菌：有些特殊水质菌种难于培养，还可利用当地科研力量，利用专业的工业微生物研究所培养菌种后再接种培养，如PVA（聚乙烯醇）好氧消化即有专门好氧菌。此法，投资大，周期长，只有特殊情况才用。 3、驯化：在培菌阶段后期，将生活污水和外加营养物量，逐渐减少，工业废水比例逐渐增加，最后全部转为受纳工业废水，这个过程称为驯化。理论上讲，细菌对有机物分解必须有酶参与，而且每种酶都要有足够数量。驯化时，每变化一次配比时，需要保持数天，待运行稳定后（指污泥浓度未减少，处理效果正常），才可再次变动配比，直至驯化结束。

香菇菌种生产的方法与步骤

香菇菌种生产的方法与步骤 (一)母种生产培养基的配方选择一是马铃薯、葡萄糖、琼脂培养基(PDA)：去皮马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂16~23克，水1 000毫升。氢离子浓度1 000~10000纳摩／升(pH5~6)，用于分离、培养菌种。二是PDA改良培养基(甲)：马铃薯(去皮)200克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾(KH2PO4)2克，硫酸镁(MgSO4)0．5克，维生素B110毫克，琼脂20克，水1000毫升，灭菌后氢离子浓度3163～10000纳摩／升(pH5．0～5．5)，用于培养、分离菌种。三是PDA改良培养基(乙)：马铃薯(去皮)200克，麸皮或米糠50克，硫酸镁0.5克，维生素B110毫克，琼脂20克，灭菌后氢离子浓度3163～3981纳摩／升(pH5．4～5．5)。四是PDA改良培养基(丙)：心材木200克，细米糠(或麸皮)100克，硫酸铵1克，麦芽糖(或葡萄糖)20克，琼脂20克，水1 000毫升，灭菌后氢离子浓度3163～10000纳摩／升 (pH5.0～5.5)，用于分离菌种。五是麦芽浸膏、酵母浸膏、琼脂培养基(MYD)：麦芽浸膏3克，葡萄糖10克，酵母浸膏3克，琼脂20克，蛋白胨5克，水1 000毫升(用于菌种培养)。六是麦芽浸膏、蛋白胨培养基(MPA)：麦芽浸膏20～25克，蛋白胨10克，琼脂20克，水1 000毫升(用于分离、培养、保存菌种)。上述6个培养基配方中，马铃薯、葡萄糖、琼脂(PDA)配方应用最普遍。在此着重介绍PDA培养基的配制方法与步骤： 1．制备培养基的操作程序选择优质马铃薯，去皮或挖去发芽眼，削去发青皮，切成薄片，称取200克，置于钢精锅，加水1 000毫升，煮沸后小火保持30分钟，趁热用8层纱布过滤后放人有1 000毫升刻度的量杯(或量筒)中，补充水到1 000毫升，倒回钢精锅，加琼脂继续加热，待琼脂溶化后，再加葡萄糖，再补水至1000毫升，用玻璃棒搅均匀，趁热分装试管，或装入三角瓶备用。 2．分装试管将配制好的PDA培养基，趁热(60℃)倒人事先准备好的量杯或玻璃漏斗，分装试管。每支试管装培养基为管长的1／4，培养液不可贴附管口内壁，如有沾附物必须揩拭干净。 3．做棉塞取适量棉花做成较紧实的棉塞，塞入试管约2厘米左右，外留1厘米，紧贴试管内壁，松紧度

菌种的选育

第一章菌种选育第一节工业常用微生物及要求一、常见微生物（一）细菌（bacteria）发酵工业中常用的细菌主要是杆菌,主要有：醋杆菌属（Acetobacter）乳杆菌属（Lactobacillus）杆菌属（Bacillus）:α-淀粉酶，蛋白酶，肌苷、鸟苷等核苷。其中最为重要的是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）短杆菌属（Brevibacterium）：谷氨酸棒杆菌属（Corynebacterium）：谷氨酸（二）放线菌（actinomyces）属原核微生物（有菌丝体，无横隔，不具完整的核。）最大的经济价值在于产生多种抗生素（antibiotic）。链霉菌（Streptomyces）：红，金，土，氯，链霉素小单孢菌属（Micromonospora）：庆大霉素（三）霉菌（mould）亦称丝状真菌（不是分类学上的名词，凡在营养基质上形成绒毛状，网状或絮状菌丝的真菌统称霉菌。） 1.曲霉属（Aspergillus）黑曲霉（A. niger）产蛋白酶，淀粉酶，果酸酶，变异菌株产柠檬酸米曲霉（A. oryzae）产淀粉酶，蛋白酶，酿酒的糖化曲和酱油曲黄曲霉（A. flavus）产黄曲霉毒素米曲霉和黄曲霉均为半知菌。 2.青霉属（Penicillum）：例如桔子上的绿色斑点桔青霉（P. citrinum）：产生5’－磷酸二酯酶，降解核糖核酸为四个单核苷酸。 3.根霉属（Rhizopus）接合菌

米根霉（R. oryzae）华根霉（R. chinensis）酒药和酒曲中含有米根霉或华根霉。 4.红曲霉属（Monascus）淀粉酶，麦芽糖酶，蛋白酶，柠檬酸等。可生产食用红色素。（四）酵母（yeast）单细胞真核微生物，低等真菌。 ①酵母属（Saccharomyces）啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） ②假丝酵母属（Candida）产朊假丝酵母（Candida utilis）生产饲料酵母，其蛋白质和维生素含量都比啤酒酵母高。可利用糖蜜，土豆淀粉废液生产人畜可食用蛋白质。 ③毕赤酵母属（Pichia）产膜酵母，在液面形成白膜，是酿造物和酒类饮料的污染菌。（五）其它微生物 1.担子菌（basidiomycetes）即菇类（mushroom）担子菌资源的利用已经引起人们的重视。可用于多糖及抗癌药物开发。 2. 藻类（alga）是分布极广的一类自养微生物资源，许多国家把它用作人类保健食品和饲料。从蛋白质产率看，螺旋藻是大豆的 28倍，每公顷珊列藻所得蛋白质是小麦的20～35倍。（六）噬菌体（phage）凡用细菌和放线菌为生长菌株的发酵工业，均存在噬菌体的危害问题。噬菌体在自然界分布极为广泛。其三大特点是： ①体积比细菌小的多，可以通过细菌滤器。 ②没有细胞结构，由核酸的蛋白质构成。 ③营专性活物寄生，即只能在特异性寄主细胞中增殖。烈性噬菌体——引起寄主细胞迅速裂解。受感染的细菌称敏感性细菌。温和噬菌体——随寄主细胞的繁殖而繁殖。含温和噬菌体的细菌称溶原性细菌。

菌种保存方法

菌种保藏方法中国工业微生物菌种保藏管理中心微生物菌种保藏对于微生物菌种的研究和利用至关重要。以下是中国工业微生物菌种保藏管理中心整理的目前国际国内常用的菌种保藏方法，包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80℃冰箱冻结法、液氮超低温冻结法，各种菌种保藏方法都有详细的步骤说明。定期移植法亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。操作步骤如下： 1 培养基制备 1.1 器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。 1.2 溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。 1.3 调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。 1.4 加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断

搅拌至融解，再补足所蒸发水分。 1.5 过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。 1.6 包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。 1.7 灭菌根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。 1.8 斜面摆放灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。 1.9 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。 2接种 2.1 斜面接种 2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。 2.1.2 中央划线从斜面中央自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。 2.1.3 稀波状蜿蜒划线法从斜面底部自下而上划“之”字形线。适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。2.1.4 密波状蜿蜒划线法

污水处理菌种培养方法

污水处理菌种培养方法培菌方法： 1、所谓活性污泥培养,就是为活性污泥的微生物提供一定的生长繁殖条件,即营养物，溶解氧,适宜温度和酸碱度。 (1）营养物：即水中碳、氮、磷之比应保持1００∶5∶1。?(２)溶解氧:就好氧微生物而言,环境溶解氧大于0.3mg/ｌ,正常代谢活动已经足够。但因污泥以絮体形式存在于曝气池中，以直径5０0μm活性污泥絮粒而言,周围溶解氧浓度２ｍｇ/l时,絮粒中心已低于0.1mｇ/l,抑制了好氧菌生长,所以曝气池溶解氧浓度常需高于3-５mｇ/ｌ，常按5－10mｇ/ｌ控制。调试一般认为，曝气池出口处溶解氧控制在2mg／ｌ较为适宜。 (３）温度:任何一种细菌都有一个最适生长温度，随温度上升，细菌生长加速,但有一个最低和最高生长温度范围，一般为10-４5oC，适宜温度为15-35oC,此范围内温度变化对运行影响不大。?(4）酸碱度:一般PH为6-9。特殊时,进水最高可为PH 9-１0.5,超过上述规定值时,应加酸碱调节。?2、培菌法:?（1）生活污水培菌法:在温暖季节，先使曝气池充满生活污水，闷曝（即曝气而不进污水）数十小时后，即可开始进水。引进水量由小到大逐渐调节，连续运行数天即可见活性污泥出现,并逐渐增多。为加快培养进程,在培菌初期投加一些浓质粪便水或米泔水等,以提高营养物浓度。特别注意,培菌时期（尤其初期)由于污泥尚未大量形成，污泥浓度低，故应控制曝气量，应大大低于

正常期曝气量。 (2)干泥接种培菌法:最好取水质相同已正常运行的污水系统脱水后的干污泥作菌种源进行接种培养。一般按曝气池总溶积1%的干泥量，加适量水捣碎，然后再加适量工业废水和浓粪便水。按上述的方法培菌，污泥即可很快形成并增加至所需浓度(3）数级扩大培菌法：根据微生物生长繁殖快的特点，仿照发酵工业中菌种→种子罐→发酵罐数级扩大培菌工艺,分级扩大培菌。如某工程设计为三级曝气池，此时可先在一个池中培菌,在少量接种条件下,在一个曝气池内培菌，成功后直接扩大至二三级。?（4)工业废水直接培菌法：某些工业废水，如罐头食品、豆制品、肉类加工废水，可直接培菌;另一类工业废水，营养成分尚全,但浓度不够,需补充营养物,以加快培养进程。所加营养物品常有:淀粉浆料、食堂米泔水、面汤水(碳源);或尿素、硫氨、氨水(氮源）等，具体情况应按不同水质而定。 (5）有毒或难降解工业废水培菌：有毒或难降解工业废水,只能先以生活污水培菌,然后再将工业废水逐步引入，逐步驯化的方式进行。?(6)直接引进种菌种培菌：有些特殊水质菌种难于培养,还可利用当地科研力量,利用专业的工业微生物研究所培养菌种后再接种培养，如PVA(聚乙烯醇）好氧消化即有专门好氧菌。此法,投资大,周期长,只有特殊情况才用。３、驯化:在培菌阶段后期，将生活污水和外加营养物量,逐渐

第二章生产菌种的扩大培养、选育与保藏[1]

第二章生产菌种的扩大培养、选育与保藏目前工业规模的发酵罐容积已达到几十立方米或几百立方米。如按百分之十左右的种子量计算，就要投入几立方米或几十立方米的种子。要从保藏在试管中的微生物菌种逐级扩大为生产用种子是一个由实验室制备到车间生产的过程。其生产方法与条件随不同的生产品种和菌种种类而异。如细菌、酵母菌、放线菌或霉菌生长的快慢；产孢子能力的大小；及对营养、温度、需氧等条件的要求均有所不同。因此，种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量足够的种子。这种种子接入发酵罐后，将使发酵生产周期缩短，设备利用率提高。种子液质量的优劣对发酵生产起着关键性的作用。种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。发酵工业生产过程中的种子的必须满足以下条件：（1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短；（2）生理形状稳定；（3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；（4）无杂菌污染；（5）保持稳定的生产能力。第一节种子的制备过程在发酵生产过程中，种子制备的过程大致可分为两个阶段：（1）实验室种子制备阶段（2）生产车间种子制备阶段一、实验室种子的制备实验室种子的制备一般采用两种方式：对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液

体培养法。（一）孢子的制备 1，细菌孢子的制备细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。培养温度一般为37℃。细菌菌体培养时间一般为1~2天，产芽孢的细菌培养则需要5~10天。 2，霉菌孢子的制备霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。培养的温度一般为25~28℃。培养时间一般为4~14天。 3，放线菌孢子的制备放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。培养温度一般为28℃。培养时间为5~14天。（二）液体种子制备 1，好氧培养对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌（S. griseus）、产卡那霉素的卡那链霉菌（S. Kanamuceticus）可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。其过程如下：试管→三角瓶→摇床→种子罐 2，厌氧培养（略）二、生产车间种子制备实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。 1，种子罐的作用：主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。 2，种子罐级数的确定种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，取决于：（1）菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度；（2）所采用发酵罐的容积。比如：细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。茄子瓶→种子罐→发酵罐霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵孢子悬浮液→一级种子罐（27℃,40小时孢子发芽，产生菌丝）→二级种子罐（27℃，10~24小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐

菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程

菌种管理制度 1、目的建立菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程，规范微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。 2、适用范围本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的购买、保存、传代、使用及销毁等。 3、定义标准菌株是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。传代用菌种是指用标准菌株制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。 4、职责 4.1部门主管负责菌种的申购、接收、保存分发。 4.2微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。 5、规程 5.1菌种的申购部门主管根据菌种的使用情况，提出年度购买计划（包括临时检验需要），填写申购流程，经审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌株）或传代用菌种，购买时，需确定菌种的代数，以便控制传代代数。 5.2菌种的接收菌种到达实验室后，由部门主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《标准菌株库存记录》上，内容包括：名称、数量、编号（无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其暂贮存于4～8℃冰箱中，在一周内必须完成转种。 5.3菌种的保存 5.3.1工作用菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的琼脂斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至4～8℃冰箱中保存。此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况，经应灭活处理后销毁。保存时间根据菌种种类而

菌种选育和发酵培养基如何配制

菌种选育和发酵培养基如何配制如何选育菌种? 自然界中微生物资源异常丰富,土壤、水、空气、腐败的动植物残骸,都是微生物的主要集居和生长繁衍的场所.其种类之多,至今仍然是一个难于估测的未知数.以其集居环境(包括特殊和极端环境)、营养类型、生存方式、生理类型、代谢途径、合成能力等比较,均居生物界之冠.因此,微生物资源的开发和应用是当今世界瞩目的重大课题. 菌种的分离,不仅是把混杂的各类微生物有效地分开,得到纯种,更重要的是依着生产实际的要求,有的放矢、快速、准确地将能产生所需产物,或具有某种生化反应性能的菌种,从大量的微生物中挑选出来.有时是设计一种在分离阶段便能识别所需菌种的方法,更多的是利用特定的方法分离,获得所需菌种后,再进行识别.为了使获得的菌种能满足工业生产的需要,须考虑各种性能指标.因此,菌种分离和筛选的方法和策略就十分重要. 一般的菌种分离纯化和筛选步骤可分为采样、增殖与分离、发酵与性能测定等几个步骤.步骤和方法如下图所示: 发酵培养基如何配制? 首先需了解微生物需要的营养物质. (1)微生物需要的营养物质营养物质应满足微生物的生长、繁殖和完成各种生理活动的需要.它们的作用可概括为形成结构(参与细胞组成)、提供能量和调节作用(构成酶的活性和物质运输系统). 微生物的营养物质有六大类要素,即水、碳源、氮源、无机盐、生长因子和能源.

①水水是微生物的重要组成部分,在代谢中占有重要地位.水在细胞中有两种存在形式:结合水和游离水.结合水与溶质或其他分子结合在一起,很难加以利用.游离水(或称为非结合水)则可以被微生物利用. ②碳源碳在细胞的干物质中约占50%,所以微生物对碳的需求最大.凡是作为微生物细胞结构或代谢产物中碳架来源的营养物质,称为碳源. 作为微生物营养的碳源物质种类很多,从简单的无机物(CO2、碳酸盐)到复杂的有机含碳化合物(糖、糖的衍生物、脂类、醇类、有机酸、芳香化合物及各种含碳化合物等).但不同微生物利用碳源的能力不同,假单孢菌属可利用90种以上的碳源,甲烷氧化菌仅利用两种有机物:甲烷和甲醇,某些纤维素分解菌只能利用纤维素. 大多数微生物是异养型,以有机化合物为碳源.能够利用的碳源种类很多,其中糖类是最好的碳源. 异养微生物将碳源在体内经一系列复杂的化学反应,最终用于构成细胞物质,或为机体提供生理活动所需的能量.所以,碳源往往也是能源物质. 自养菌以CO2、碳酸盐为唯一或主要的碳源.CO2是被彻底氧化的物质,其转化成细胞成分是一个还原过程.因此,这类微生物同时需要从光或其他无机物氧化获得能量.这类微生物的碳源和能源分别属于不同物质. ③氮源凡是构成微生物细胞的物质或代谢产物中氮元素来源的营养物质,称为氮源.细胞干物质中氮的含量仅次于碳和氧.氮是组成核酸和蛋白质的重要元素,氮对微生物的生长发育有着重要作用.从分子态的N2到复杂的含氮化合物都能够被不同微生物所利用,而不同类型的微生物能够利用的氮源差异较大. 固氮微生物能利用分子态N2合成自己需要的氨基酸和蛋白质,也能利用无机氮和有机氮化物,但在这种情况下,它们便失去了固氮能力.此外,有些光合细菌、蓝藻和真菌也有固氮作用. 许多腐生细菌和动植物的病原菌不能固氮,一般利用铵盐或其他含氮盐作氮源.硝酸盐必须先还原为NH+4

菌种活化方法

低温保存管（cryo tube）中之一般菌种临时存放及活化 A. 低温保存管之临时存放及解冻 1. 低温保存管（cryo tube）应存放于－20℃ ~ －80℃之低温条件下。 2. 准备 37℃之 70﹪（V/V）酒精浴槽（只能在电气水浴槽中改放酒精，不可以火加温，以免危险；若以 37℃水浴取代，应避免水中微生物污染），其中事先安放小试管架（可放置 cryotube 之大小），液面不可高达管塞。 3. 将 cryotube 从低温保存条件中取出，置于 37℃浴槽之小试管架上。 4. 不断轻微摇动 cryotube，液面不可高至管塞，直至结冰完全溶解（约需 2 分钟）。 B. 菌株活化: 在无菌操作下 1. 用无菌微量吸管，从已溶解之 cryotube 吸取 50 ?l（或 1 ~ 2 滴）之菌液，滴入固态指定培养基(培养基编号及温度示于菌株订购单)某一边缘附近，以划线法接种于培养基。 2. 将接种好的培养基置于指定温度的培养箱中培养。 C. 划线法 1. 手持金属接种环，用酒精灯将接种环（共约 5 公分）烧至火红，并不断来回烧烤金属固定杆之前约 10 公分，等待约 10 秒钟，将接种环前端轻触培养基边缘凝胶（无菌体部份），待接种环完全冷却后，以环沾黏菌滴，由培养基边缘向中央轻轻横划紧接的并行线，直到涵盖 1/3 培养基为止（I 区）。 2. 灼烧接种环，待数秒冷却后，旋转培养基自 I 区涂布的边缘再横划数条线到未接种的区域（II 区）。 3. 重复 2. 的动作完成 III 区与 IV 区。 4. 灼烧接种环，将接种环归位。 D. 图示（1）金属接种环

（2）平板划线法冷冻干燥管之开管说明下列步骤请在无菌环境下操作： 1、以沾有70%酒精的棉花，擦拭外管，在火焰上加热外管之尖端。 2、滴数滴无菌水于加热处，使外管破裂，再以硬棒敲破尖端。 3、取出隔热纤维纸和内管，以灭菌过的镊子取出内管之棉塞。 4、( a ) 适用于细菌用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml指定之液体培养基，滴入内管内，并轻微震荡（可用该吸管协助），直到均匀悬浮。 ( b ) 适用于霉菌、酵母菌用无菌吸管，吸取0.3-0.5 ml无菌水，滴入内管内，待干燥粉末溶解后，以无菌吸管吸取并滴入约含有5ml无菌水之试管内，轻微震荡使其均匀后，静置30至60分钟。 5、取0.1-0.2 ml之菌体悬浮液于指定的平板培养基上，做划线分离培养或做成一系列之稀释，用无菌L型玻棒均匀涂抹，以检验菌种之纯度及活化情形，而剩余的菌体则全部移入指定的液体培养基内，并依指定的温度培养之。 6、某些菌种经过冷冻干燥保存后，迟滞期 ( lag period ) 较长，必须等培养二倍时间后才能长出，且再经过一、二次继代培养 (Subculture) 后才能正常生长。经过以上的努力后仍培养失败，才视为不能活化。 7、若菌种未能活化，或活化之菌落有疑问时，请于收到菌种之一个月内，以问题菌株反应单传真至本中心，即进行处理。

《食品微生物学》授课教案第六章微生物的遗传变异与菌种选育

《食品微生物学》授课教案第六章微生物的遗传变异与菌种选育教学目的： 1、掌握微生物基因突变的类型、特点和机制。 2、掌握微生物分离纯化的方法步骤。 3、掌握营养缺陷型突变菌株的筛选方法和具体应用。教学重点与难点：掌握微生物分离纯化的方法步骤。教学课时：2学时教学方法：多媒体教学教学内容：微生物在遗传上特点：1、微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。2、很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖。3、对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。大多是无性生殖，变异易保留。一、微生物遗传变异的物质基础 1、证明经典实验 1）转化实验 2）噬菌体T2的感染实验 3）病毒拆开与重建实验 2、遗传物质在细胞中存在方式 1）细胞水平 2）核水平（plasmid）

3）染色体水平 4）核酸水平 5）基因水平（遗传功能单位） 6）密码子水平（遗传信息单位） 7）核苷酸水平（最低突变或交换单位）质粒种类： 1）F因子（致育因子）：大肠杆菌中发现，含质粒为F+（♂）；无质粒为F-（♀）；质粒DNA整合到染色体上为Hfr. 2）R因子（耐药性）：痢疾杆菌，多价耐药性，耐药信息携带在质粒上。 3）Col因子（大肠杆菌素产生因子） 4）青霉素酶质粒 5）Ti质粒（诱癌质粒）：植物根癌，植物基因工程重要载体。 6）降解质粒：Pseudomonas 二、微生物的基因突变突变是指遗传物质核酸中的核苷酸顺序突然发生了可遗传的变化。包括基因突变（点突变）和染色体畸变（一）基因突变 1、类型形态突变型、生化突变型营养缺陷型：由基因突变引起某酶合成能力丧失，必须在原有培养基中添加相应的营养成分才能生长。致死突变型：基因突变导致个体死亡。

微生物菌种操作方法汇总

常用的几种微生物接种方法接种细菌应用接种针（环）来沾取细菌标本，进行接种。接种环与接种针为用白金丝或合金丝所制，亦可用电炉丝代替，因它能耐高热且散热快，便于接种前后通过火焰灭菌（整个接种环烧红即达到灭菌目的）。在使用接种环时一般用右手持笔式较为方便，左手可持培养基进行配合，其接种程序可分为：灭菌接种环→稍冷→沾取细菌样品→进行接种（包括：启盖或塞、接种划线、加盖或塞）→进行接种环灭菌等五个程序。不同培养基，接种方法也不同，分述如下：一、平板划线接种法（分离培养法）是将细菌分离培养的常用技术，其目的是将混有多种细菌的培养物，或标本中不同的细菌（病原菌与非病原菌）使其分散生长，形成单个菌落或分离出单一菌株，便于识别鉴定。平板划线接种方法较多，其中以分段划线法与曲线划线法较为常用。（一）分段划线法平板分段划线(左)及培养后菌落分布图本法多用于含菌量较多的标本。方法是以接种环沾取少许样品先涂布于平板培养基表面一角作为第一段划线（划线时接种环与培养基表面呈45度角），然后将接种环置火焰上灭菌，俟冷（可接触平板试之，如不融化琼脂，即已冷却），于第二段处再作划线，且在开始划线时与第一段的划线相交接数次，以后划线不必再相接，待第二段划完时，再如上法灭菌，接种划线，依次划至最后一段，灭菌接种环。这样每一段划线内的细菌数逐渐减少，即以获得单个菌落，划线接种完毕，盖好平皿盖，倒置（平板底部向上）于37℃温箱中培养。（二）连续划线法：此法多用于接种材料中含菌数量不太多的样品或培养物。方法是先将样品或培养物涂于平板表面的一角，然后用接种环自样品涂擦处开始，向左右两侧划开并逐渐向下移动，连续划成若干条分散的平等线。

菌种培养方法

菌种培养方法污水处理-生活污水培菌法：在温暖季节，先使曝气池充满生活污水-污水处理，闷曝（即曝气而不进污水）数十小时后，即可开始进水。引进水量由小到大逐渐调节-污水处理，连续运行数天即可见活性污泥出现，并逐渐增多。为加快培养进程-污水处理，在培菌初期投加一些浓质粪便水或米泔水等，以提高营养物浓度。特别注意，培菌时期-污水处理（尤其初期）由于污泥尚未大量形成，污泥浓度低，故应控制曝气量-污水处理，应大大低于正常期曝气量。 1. 前期准备阶段 1.1. 物料准备①污泥准备对于万立方米级污水处理装置而言，其生化池体积较大，为了保证生化池初始污泥浓度，需要准备投加的原始污泥量很大。理论上讲，投加后生化池的污泥的质量浓度最好控制在2 500mg/L左右。实际运行时，为了节约成本，调试期间初始污泥的质量浓度可控制在1 500mg/L左右，一日处理1×104m3污水生化时间为12h的污水处理装置为例，调试前需准备含水率在80%的活性污泥约40m3。污泥品种最好是同类或相似的活性污泥。如有困难，其它活性较强的污泥也可使用。污泥在使用前为保证一定的活性，对待用的污泥需进行喷水保湿处理，在保湿条件下污泥的活性至少可保持15d以上。 ②碳源培养前的准备生化调试过程中理想的碳源是大粪及淀粉。一般来说调试前期以加入大粪为主，中后期以加入淀粉为主，为接生成本，淀粉可用地脚面粉替代。由于大粪无法事先储存，因此，事前需和有关部门确定好调试期间需要的数量。调试期间碳源准备量一般按如下原则进行估算。每天投加到生化池的COD量按混合后生化池COD的质量浓度在200~300mg/L水平计，其中地脚面粉COD的质量折算量约为1t[COD]/t[面粉]。大粪的COD 折算比较困难，根据经验，在整个调试期间需100~150 m3的大粪。加入大粪的目的除补充碳源外，还可增加生化池菌种的引入。地脚面粉可准备10~15t。③磷源、氮源的准备补充碳源一般以普钙Ca（H2PO4)2为主，补充的氮源以尿素CO（NH2）2为主。生化池COD的质量浓度在300mg/L时估计BOD5值一般以100mg/L计，补充量按 m（BOD5）：m（N）：m （P）=100：5：1折算，每天需补充淀粉2000-3000kg，尿素100kg，补普钙200kg，质量比按照淀粉：尿素：普钙=20-30：1：2补给。调试期间需准备尿素2~3t，普钙5~6t。另外如有条件可准备10~20kg粉状阴离子聚丙烯酰胺（PAM）。 1.2. 物料化制及输送设备由于调试期间需要的物料量很大，加之生化调试无污水进入，池内污水流动性较差，为提高接种速度，需要将污泥及补充碳源尽可能均匀地输入各生化池内。因此，对于一定规模的污水处理设施设置物料化制及物料输送系统，对减轻劳动强度提高调试效率是必需的。根据经验，物料化制池宜设于地下，池内设空气搅拌装置，池容积一般在20~30m3。池内分二区，一区为化制区，该区需设置物料化制及初级垃圾清理装置；二区为输送取，设置潜水泵或液下泵，同时在泵周围设置垃圾同以防泵发生堵塞。输送管道在生化池附近宜使用软管以便根据需要调整投加料点位置。另外，物料化制旁最好设置一个消火栓或供水管，用于化制污泥及其它物料时供水。 1.3. 监测仪器准备为配合生化调试，需对生化池中的COD（铬法）、溶解氧、pH值、细菌等指标进行监测。一般生化处理调试需配备以下监测仪器：COD测定仪、溶解氧测定仪、pH值测定仪、显微镜。 2. 调试阶段 2.1. 初期（3d）①首先将生化池注入一定量的清水和部分待处理的污水，然后将污泥倒入物料化制池。一般第1次投加20m3污泥，同时投加大粪等培养料，加水搅

活性污泥菌种培养复习课程

活性污泥菌种培养

活性污泥有多种培养方法，但不同的方法所要求的培养时间和人力物力均不同。应根据废水水质、气候、实际许可的条件等情况来选择培养方法。 1.培养前的准备工作（1）各构筑物建成，并经清池清除建筑垃圾，静压试验证明无渗漏，无下沉位移，最后按有关规程验收合格。（2）电器、机械、管路等全部设备建成并经单机试车、联动试车正常。最后按有关规程（说明书）验收合格。（3）根据日后运行管理需要，有条件的污水处理厂（站）需进行最基本的常规化验测试，如pH、水温、COD、DO、生物相等，用以指导活性污泥的培养过程和日常运行。（4）基础数据的调查摸底，包括污水流量昼夜变化情况，水质（pH、水温、COD、BOD5/CODCr、含氮、含磷、有毒物质等）及其变化情况，各种设施和设备的技术参数。有条件的地方最好对受纳水体(如接纳排污的河流等)本底水质调查备案，以便考察若干年后对受纳水体的影响提供依据。

（5）根据处理水质状况备足必需的营养物(碳源、氮源、磷源)，以备缺什么补什么。采用接种培菌法还需备足污水性质相似其他污水处理厂（站）的干（或浓缩）污泥作为活性污泥微生物培养用的菌种。（6）操作人员应熟悉整个系统的管道布置和公用工程方面的情况，了解污泥培养的基本过程和控制要求。（7）人员到位，自培养和驯化后一般应使系统连续运行，不能脱人。（8）编制必要的化验和运转的原始记录报表以及初步的建章立制。从培菌伊始，逐步建立较规范的组织和管理模式，确保启动与正式运行的有序进行。自然培菌自然培菌，也称直接培菌法。它是利用废水中原有的少量微生物，逐步繁殖的培养过程。城市污水和一些营养成份较全、毒性小的工业废水，如食品厂、肉类加工厂废水，可以考虑这种培养方法，但培养时间相对较长。自然培菌又可分为间歇培菌和连续培菌二种。（1）间歇培菌。将曝气池注满废水，进行闷曝（即只曝气而不进废水），数天后停止曝气，静置沉淀1 h，然后排出池内约1/5的上层废水，并注入相同量的新鲜

菌种传代与保藏作业指导书

菌种传代与保藏作业指导书 1.标准菌的来源标准菌株必须购买具备资质的菌种保藏中心提供的冷冻干燥菌种（0代）（提供菌种证书）。 2.标准菌的验收从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。储存于2～ 8 ℃，有效期为3个月。 3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备 3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球3.2培养基改良马丁琼脂培养基:用于霉菌复苏、复壮. 营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、

余作为储备管。黑曲霉的h项下洗脱液按h项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液20ml。以无菌技术向复壮后的菌种中加入20ml 、30%的无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻存管。制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。内容包括：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。 i．储备菌种管制备成功，储存于－20℃，有效期为三年。 3.4菌种确认用无菌接种环从质控管中取细菌培养物接种到营养琼脂培养基平板上，或相应的宜于该细菌生长的鉴别平板上，划线分离出单个菌落。然后在30～35℃下培养2～3天；同样的方法取真菌到玫瑰红钠琼脂培养基平板，并在23～28℃下培养7天；培养后，观察其菌落形态，应符合该菌种形态特征。 3.5污染处理假如在该平板上发现有其他菌落生长，则说明或操作有污染或菌种不纯。将此被污染了的培养物灭菌处理。可寻找原因重新分离挑选纯菌落转接斜面菌种作为第四代。并重新制备储备菌种管 3.6菌种的传代与保藏