HPV的致癌机制治疗宫颈癌

《医学微生物学导论》课程论文

拮抗Bcl-2——从HPV的致癌机制治疗宫颈癌

拮抗Bcl-2——从HPV的致癌机制治疗宫颈癌

摘要自从1972年Kerr提出细胞凋亡的概念至今，人们对细胞凋亡现象进行了广泛、深入的研究。但是，凋亡的分子和生化机制迄今尚未彻底明了；而已形成的初步认识大多源于对Bcl-2基因家族的研究。基于已清楚的Bcl-2与细胞凋亡的联系，细胞凋亡与宫颈癌的联系，经过小组内以及小组间的讨论和查阅有关资料，找到了Bcl-2与宫颈癌的治疗的关系。

关键词HPV、Bcl-2、宫颈癌的治疗

前言

癌症是当今世界最难攻克的顽症之一，是一个全球性公共健康问题。卫生部公布的调查结果显示，2006年我国无论是城市还是乡村，恶性肿瘤死亡率均位居致死疾病之首，占死亡原因的20％以上，且增幅最大。在我国，癌症已成为威胁人民健康的第一杀手。其中宫颈癌又是严重威胁女性健康的疾病之一。因此，研究宫颈癌的发病机制，找到治疗宫颈癌的有效方法是医学研究的一项重要工作。

主体

HPV的分类

1995年世界卫生组织中的国际癌症研究所正式提出高危型人乳头状瘤病毒（HPV）感染是宫颈癌发病的主要原病因。

到目前为止已经发现具有不同核苷酸序列的HPV共200多种，其中85种的基因型已经确定。病毒根据其组织嗜异性的不同分为皮肤型和黏膜型。皮肤型主要感染手部和足部的皮肤而黏膜型主要感染泌尿生殖道、口腔、喉部和呼吸道的黏膜。感染女性生殖道的HPV约有30种，根据其致癌能力的大小又被分为两类：①HRHPV包括HPV16、18、31、33、34、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68和70，主要引起高级别宫颈上皮内瘤变和宫颈浸润癌，其中最常见的是HPV16和18型；②低危型HPV，包括HPV6、11、42、43和44，主要引起良性的生殖道疣和低级别宫颈上皮内瘤变CINⅠ。[3]

HPV的流行病学

宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，在发达国家如北美、欧洲的国家其发病率远低于乳腺癌、子宫内膜癌及卵巢癌；而在一些发展中国家其发病率却高居首位。国际癌症研究生估计，全世界每年大约有50万新发病例，其中80%的病例发生在发展中国家。我国每年的新发病例在13.5万例左右，约占全世界宫颈癌

新发病例的29.0%。近50年来我国广泛开展宫颈癌筛查工作，使宫颈癌的发病率和死亡率都明显下降；但由于今年来人乳头状瘤病毒（HPV）感染者急剧增多，使得宫颈癌发病率在我国某些地区呈明显上升趋势，且患者趋于年轻化。[1]

流行病学

一、流行病学特点

（一）地理分布特点

不同的国家宫颈癌的发病率和死亡率有着较大的差异。同发达国家相比，发展中国家宫颈癌的发病率和死亡率均较高。世界卫生组织（WHO）报道，宫颈癌发病率最高的国家是智利（15.4/10万）其次是中国（14.6/10万）第三是委内瑞拉(11.2/10万)；日本最低（2.4/10万）。在我国宫颈癌的分布主要是在中西部地区，20世纪90年代死亡抽样调查结果显示，宫颈癌死亡率超过5/10万以上者有甘肃、陕西、湖南、江西、新疆、内蒙古等省自治区，形成一个自北向南的高死亡率的条形地带，并且整体呈现的分布特点是农村高于城市，山区高于平原。如湖北五峰县鱼关区、陕西略阳县、甘肃武都县、江西靖安县均为全国的高发地区，而且这些地区的发病率和死亡率高居不下；死亡率较低的有北京、上海等地。地理分布特点反应了宫颈癌的发病率与经济发展状况密切相关，但并非是唯一的影响因素。[2]

（二）人群分布特点

1、年龄我国的普查资料显示，在30岁以上的妇女中，宫颈癌的发病率随年龄

的增加而明显升高，44岁～49岁是高发年龄组，之后宫颈癌发病率呈下降趋势。但是近几年宫颈癌发病人群有年轻化的趋势。研究表明这可能跟性因素及HPV感染等有关。

2、民族同一地区不同民族的居民，其宫颈癌发病率也有所不同，发病率最高的

民族多为本地区民族或长期移居该地区的少数民族。另外移居的居民中其宫颈癌和环境的因素也有关，例如从高发地区移民至低发地区的人群，其宫颈癌发病率要低于其原籍居民。我国少数民族中，宫颈癌死亡率最高的前三位分别是维吾尔族（17.27/10万）、蒙古族（15.72/10万）和回族（12.29/10万）；而苗族、藏族和彝族的发病率较低。

3、社会经济状况和职业一般来说，社会经济状况低下的妇女的宫颈癌发病率较

高。我国宫颈癌发病率分布的特点也反应出在经济状况差的地区妇女宫颈癌发病率较经济状况好的地区显著升高。天津肿瘤研究所根据20世纪80年代相关报道资料分析发现32～65岁宫颈癌职业发病率在经济、文化和卫生水平较低的农业人口和从事装卸、建筑、制革、皮毛业的女工中较全市区同龄妇女人群的发病率高十至数十倍。[2]

（三）时间分布特点

WHO统计28个发达国家，从1960到1980年间宫颈癌的死亡率下降了30%。

而我国自20世纪50年代末期开展了宫颈癌普查防治工作以来，全国宫颈癌的死亡率由20世纪70年代的10.28/10万下降到20世纪90年代的5/10万，下降了69%。但是今年很多国家包括德国、挪威、英国、美国部分地区

及中国等出现一个新的现象是年轻妇女的宫颈癌发病率呈上升趋势，这可能与性自由程度如早年性生活、多个性伴侣等危险因素增加有关。[2]

二、流行因素

（一）HPV感染

生殖道HPV感染与宫颈病变及宫颈癌的关系最早由德国病毒学家zur-Hausen提出。通过流行病学研究和病原学研究，已经明确HPV感染是宫颈癌前病变和浸润性宫颈癌发生的必要条件。[1]

（二）性行为

初次性交年龄过早、多个性伴侣盒宫颈癌密切相关。研究结果显示，宫颈癌妇女较对照组妇女有更多的性伴侣，且患病的危险性与性伴侣数成正比。报道表明，有婚外性伴侣（1个或2个以上）发生宫颈癌的相对危险度为1.08和4.31.Velema等研究报道20岁以上开始性生活的妇女患CIN的风险较16岁以前开始者降低50%以上；16岁以前开始性生活的妇女宫颈癌发病率是20以后者的2倍多。一些学者研究发现，配偶的性行为及其他行为对妇女宫颈癌发病也有影响作用。宫颈癌配偶的性伴侣数较对照组的性伴侣数为多；宫颈癌患者的配偶大多有各种性病史，包括生殖器疣、淋病、生殖器疱疹等；男性阴茎癌患者的妻子较其对照组妇女患宫颈癌的危险性高3~6倍。另外，前妻患宫颈癌的男性，其仙子阿的妻子患宫颈癌的危险较对照组妇女高约2倍；包皮环切者的妻子患宫颈癌的相对危险性很低，使用避孕套可以降低患宫颈癌的危险性。

（三）分娩因素

早孕、多孕多产与宫颈癌的相关性已被证实。我国台湾地区1991~1994年的资料显示：阴道分娩≥4次者与≤1次者相比较，前者患宫颈癌的危险性较后者增加了2倍。随着分娩次数的增加，患宫颈癌的风险亦增加。此相关性可能为分娩对宫颈的创伤及妊娠对内分泌及营养的改变所致。此外，还发现妊娠妇女HPV检出率很高，很可能是妊娠期免疫功能低下，促使病毒的活性增高所致。

（四）口服避孕药

关于妇女口服避孕药是否会增加宫颈癌发生目前还存在争议。Beral等对46000名妇女25年的随访表明，口服避孕药是宫颈癌发生的治病因素。WHO 关于肿瘤与甾体类避孕药的多中心协作研究发现，使用避孕药的妇女患宫颈癌的危险性增加，并且用药时间越长，危险性越大。最近资料显示，单纯口服避孕药与宫颈癌之间无显著相关性，但具有协同其他危险因素如HPV感染等致癌的作用。

（五）吸烟

1977年，Winkelstein首次提出吸烟可能与宫颈癌发病有关的假设。后许多研究发现，吸烟室宫颈癌发病的高危因素。在吸烟者的宫颈黏膜中可以检测到烟草中特有的致癌成分如尼古丁、亚硝胺等。Gram等研究表明吸烟年限、每日吸烟量及初始吸烟年龄均与宫颈癌发病有关。这不仅是由于烟草中含有许多致癌物质，还因为吸烟会影响体液和细胞免疫功能，阻碍抑癌基因起作用，从而可能会增加感染HPV的机会及加强HPV的致癌作用。

常见病因

根据大量流行病学资料和相关研究认为与宫颈癌相关的危险因素主要包括以下几类：第一类为生物学因素，包括病毒、细菌、衣原体等各种微生物的感染；第二类是行为危险因素，诸如性生活混乱、多孕多产、口服避孕药、吸烟、营养不良等；第三类是机体免疫因素，包括外源性和内源性免疫抑制剂，如药物、HIV感染等；第四类是遗传易感性，目前仅有少量研究表明宫颈癌可能存在着家族聚集现象。[2]

一、生物学因素

人乳头状瘤病毒（HIV）是宫颈癌发生的最主要致病因子；生殖系统感染尤其是性传播疾病也与宫颈癌密切相关。

（一）HPV

宫颈癌的发生是一个复杂的病理过程，而近几年来的分子生物学研究已证实：人乳头状瘤病毒的持续感染时宫颈上皮内瘤样病变(CIN)及宫颈癌的主要致病因子，HPV感染和宫颈癌的相关度甚至高于吸烟和肺癌的关系。在一项全世界范围内上千例宫颈癌的研究中发现宫颈癌患者HPV的感染率达到99.7%。

（二）单纯疱疹病毒-2（HSV-2）

是首先被认为与宫颈癌发生有关的一种病毒。研究表明从宫颈活检中发现25%患活动性HSV-2病毒感染的患者，将会发生宫颈上皮内瘤样病变或浸润性宫颈癌。其次，实验检测表明宫颈癌患者血清中HSV-2抗体浓度较对照组明显升高，并在宫颈癌组织中分离出HSV-2病毒的DNA和mRNA。此外，在一项体外实验中发现，HSV-2可转变大田鼠的正常细胞，并使其他大田鼠产生肿瘤。

（三）人巨细胞病毒（HCMV）

HCMV同属疱疹病毒家族。用原位杂交方法在宫颈癌活检组织中测得了HCMV-DNA 相关序列。HCMV具有致癌的潜在能力，患者可长期隐性感染而无明显临床症状。（四）人免疫缺陷病毒（HIV）

报道显示患获得性免疫缺陷综合征的妇女宫颈癌的发病率亦高，这可能与免疫抑制导致的HPV易感相关。研究还发现HIV的tat蛋白可以上调HPV的两个主要致癌基因E6和E7的表达。并且HIV阳性患者发生宫颈癌后，往往期别晚，进展快，且对治疗不敏感。

二、行为危险因素

（一）吸烟

现已证实吸烟能降低免疫力，增加宫颈癌患病风险，是宫颈癌的危险因素之一。高危HPV感染妇女主动及被动吸烟者发生高度鳞状上皮内病变是危险度增加。在控制了其他各种因素后发现吸烟的影响依然存在。大多数的研究结果显示吸烟者宫颈癌的危险性增加2倍，高危患者大多为长期大量吸烟者。Gram的研究表明吸烟年限、每日吸烟量及初始吸烟年龄均与宫颈癌发生相关。

（二）性行为

早在19世纪40年代，一位意大利医生从死亡登记资料分析中发现，患宫颈癌的妇女大多数为已婚者，未婚者很少，而修女几乎不患宫颈癌，因此他提出结婚与否和宫颈癌发生有关。人们首先从修女中宫颈癌极为罕见这一现象认识到宫颈癌可能与婚产情况及性混乱有关，继之这一观点得到大量流行病学资料证实。（三）月经及分娩因素

研究发现经期及产褥期卫生不良者与对照组间发生宫颈癌的相对危险度为 2.27.而早育、多子女亦是造成宫颈癌的重要诱因。宫颈癌的发生率随妊娠次数的增加而递增，一项多中心的研究发现妇女分娩的次数与宫颈鳞状细胞癌的危险性之间有直接的联系：分娩7次者患宫颈癌的危险性是没有分娩女性的3.8倍，是分娩1次或2次妇女的2.3倍。

（四）避孕方法

流行病学资料表明，长期使用口服避孕药的女性患CIN的风险增加，使用5年以上的女性发病率增加2倍。而使用避孕套，杀精药膜则可降低宫颈癌发病率。口服避孕药可引起叶酸缺乏，导致致癌物代谢下降被认为是危险性增加的机制。但目前尚无确凿的临床依据需要采用停用口服避孕药以治疗宫颈癌。

（五）饮食营养因素

食物中维生素A或胡萝卜素缺乏可致CIN和宫颈癌的危险性增加。饮食中多摄入维生素A、维生素C、维生素E，且提高某些微量营养素的循环浓度是控制宫颈肿瘤发生的保护因素。

三、免疫因素

外源性或内源性免疫抑制均可增加宫颈癌的发病危险性。机体系统免疫能力下降或局部免疫功能缺陷可致HPV病毒清除能力下降，导致病毒持续感染状态，从而增加了发病率。研究发现肾移植患者由于长期使用免疫抑制剂，其CIN的发生率为常规人群的16倍。同样，艾滋病女性患者由于免疫机制被破坏，CIN及宫颈癌的发生率明显增加，且浸润前病变的治疗失败比例亦增高。系统性免疫抑制疾病如霍启金病、白血病和胶原血管疾病都与HPV相关疾病的发病率增高和难治性有关。

四、遗传因素

目前尚未发现宫颈癌有家族聚集现象。研究表明某些HLA基因型在宫颈癌患者中较正常更为常见，说明宫颈癌易感性可能部分由调节对HPV免疫反应的先天遗传因素所决定。在间变细胞及癌细胞中HLA-1类抗原下调，而HLA-1对于识别病毒抗原十分重要，相反正常宫颈上皮细胞不表达的HLA-1类抗原在宫颈癌细胞表面都可发现病变部位的角化细胞与抗原呈递细胞相似，说明他们可能直接参与免疫监视，但宫颈癌是否具有遗传易感性尚不确定。

HPVDNA基因组及其致癌机制

（一）HPVDNA基因组

HPV是一组无包膜的小型双链环状DNA病毒，属于乳多空病毒A亚群。病毒有蛋白衣壳和DNA核心组成。蛋白衣壳有主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白组成。DNA基因组为环状双链DNA，约含7900个碱基对。按照功能将基因组分成3个区：即长控制区、早期区和晚期区。LCR是位于上游的非编码区，含400~1000个碱基对，该区域包含一个p97核心启动子、增强子和沉默子，主要通过控制开放阅读架的转录调节病毒DNA的复制。早期区，长约4500bp，包含E1、E2、E4、E5、E6和E7，其编码蛋白主要参与病毒的复制、转录和细胞转化。E1和E2蛋白通过结合LCR上特定的DNA序列，调节其他基因的转录。环状HPV病毒在整入到宿主细胞的基因组时，E1和E2间的开放阅读架断开，致使E2基因丢失或灭活，继而出现E6和E7编码蛋白持续表达和过度表达。E4编码蛋白主要调节病毒的复制和成熟，并具有破坏宿主细胞骨架的作用。E6和E7基因参与病毒复制的调控及细胞恶性转化。晚期区约长2500个碱基对，主要编码L1和L2两个结构蛋白组成病毒的外壳。病毒基因组的变异主要发生于该区域。[3]

（二）病毒的复制和转录

病毒在进入上皮的基底层细胞后即开始复制，并随着宿主细胞的分化和移性而不断增殖。在基底层细胞中，每个细胞周期病毒只复制一次；而在上层的角化细胞中，病毒复制拷贝数明显增加并合成病毒外壳。病毒基因组和宿主基因组的相互作用首先启动E6好E7蛋白的转录合成。E6和E7蛋白产物通过和宿主抑癌基因蛋白p53和pRB，细胞周期因子和细胞周期素依赖激酶的相互作用而影响宿主细胞的增殖。E5蛋白的合成促使与有丝分裂相关的蛋白激酶的活性增加，致使宿主细胞不断增殖而延缓细胞分裂。随后E1和E2蛋白产物合成，E2蛋白阻止E6和E7蛋白的转录，并促使E1蛋白和位于LCR 的病毒复制起始点结合。E2蛋白降调节E6和E7蛋白的表达，是p53和pRB 蛋白释放，从而使宿主细胞恢复正常的分裂。最后病毒外壳蛋白合成，E4蛋白在促使病毒成熟和释放中起重要作用。

（三）病毒的致癌机制

HPV的致癌作用主要和E6和E7蛋白有关。E6蛋白结合p53蛋白，并通过细胞泛素结合连接酶降解p53蛋白。使p53蛋白的正常功能受损，后者参与细胞凋亡、DNA的修复剂细胞周期G1期的抑制。E7蛋白产物和pRB的去磷酸化型结合，结果影响pRB和细胞转录因子E2F-1复合物的形成，E2F-1的游离促使进入S期必必需基因的转录，结果促进细胞中DNA的合成、细胞增殖，而使DNA修复受损。这些受损的DNA将导致癌基因的活化、染色体的不稳定、DNA的甲基化和端粒体酶的活化等，最后基因组突变的不断积累将促使细胞的转化。

从拮抗抗凋亡Bcl-2蛋白表达的角度治疗宫颈癌

自从1972年Kerr提出细胞凋亡的概念至今，人们对细胞凋亡现象进行了广泛、深入的研究。但是，凋亡的分子和生化机制迄今尚未彻底明了；而已形成的初步认识大多源于对Bcl-2基因家族的研究。已知，凋亡进程可分为三个时相：诱导期、效应期和降解期。在诱导期，细胞接受各种信号从而

引发各种不同的效应；进入效应期后，经过一些决定细胞命运的分子调控点，细胞进入不可逆的程序化死亡，这些调控分子包括一系列原癌基因和抑癌基因的产生，其中Bcl-2家族起着决定性作用；降解期则产生可见的凋亡现象。

Bcl-2基因（即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因）是一种原癌基因，它具有抑制凋亡的作用，并用近年来的一些研究开始揭示这一作用的机制。目前已经发现的Bcl-2蛋白家族按功能可分为两类：一类是像Bcl-2一样具有抑制凋亡作用，如哺乳动物的Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1、A1、线虫ced-9、牛痘病毒E1B119kD等；而另一类具有促进凋亡作用，如Bax、Bcl-xs、Bad、Bak、Bik/Nbk、Bid和Harakiri等。[1]

最初在血液淋巴细胞中发现Bcl-2能抑制细胞死亡，然后陆续在其他一些细胞中也发现Bcl-2的这种作用。但是近年来的研究发现，除此之外尚存在Bcl-2不敏感的凋亡途径。[1]

一、作用机制

（一）Bcl-2敏感的凋亡途径

Bcl-2可以抑制由多种细胞毒因素所引起的细胞死亡。Bcl-2的过度表达能增强所观察细胞对大多数细胞毒因素的抵抗性。这一发现使人们认识到凋亡的各种信号转导途径有一个共同的通路或交汇点，而该通路或交汇点手Bcl-2调节。实验表明，Bcl-2可增强细胞对大多数DNA损伤因子的抵抗性，抑制大多数化疗药物所引起的靶细胞凋亡，但其本身并不能抑制这些因素对细胞的损伤；同样地，它也不能促进DNA修复。P53蛋白是DNA损伤的一个分子传感器，已证实Bcl-2能抑制p53介导的凋亡，但不能抑制p53向核内转位或者p53介导的生长停滞，可能Bcl-2的作用是在DNA损伤后，阻止激活凋亡机制的信号到达其靶分子；在细胞毒性T细胞中，有颗粒酶B激活Caspases家族的一个或多个半胱氨酸蛋白酶所诱导的凋亡不依赖于Bcl-2，颗粒酶B可能仅作用于凋亡途径中Bcl-2调节位点的下游。以上结果表明在调节途径中Bcl-2的作用位点在信号分子和效应蛋白酶之间的位置。

Bcl-2抑制细胞凋亡可能与以下几种作用有关：

1.催抗氧化作用以往研究表明，在去除生长因子所诱发的凋亡中，活性氧

损伤是促发细胞死亡的主要因：Bcl-2的过度表达可减少氧自由基产生和脂质过氧化物的形成。实验研究表明Bcl-2的抗氧化作用是间接的，即可能在于抑制超氧阴离子的产生而不是直接清除活性氧。细胞色素C作为呼吸链中重要的电子传递体，它从线粒体内膜上的释放会阻断电子向下游传递，危及呼吸链的功能并导致超氧阴离子的加速产生；而Bcl-2可以抑制Cyt C的释放，从而抑制了超氧阴离子的产生。此外，Bcl-2还可以增加胞内谷胱甘肽（GSH），升高NAD/NADH的比值，抑制和凋亡相联系的GSH降低，促进GSH 进入核内，从而影响细胞的氧化还原状态。但也有证据表明，在没有自由基的情况下Bcl-2也能抑制凋亡。因此，Bcl-2的性质远非仅仅是一种抗氧化剂。

2.抑制钙离子跨膜流动 Lam等曾报道钙泵特异性抑制剂Thapsigargen

（TG）诱导的WEH17.2等细胞的凋亡可被Bcl-2所抑制，其原因是Bcl-2抑制了钙离子的跨膜流动，提示Bcl-2可通过调节胞内钙离子浓度来调节凋亡。然而，Wei等在神经元细胞GT1-7发现Bcl-2中可抑制由TG所诱导的

凋亡，但并不能抑制TG诱导的胞内钙离子浓度升高；同时Jason等在中国仓鼠卵巢细胞5AHSmyc中去除细胞内贮存的钙离子后发现过度表达的Bcl-2仍可抑制凋亡，提示Bcl-2对胞内钙离子浓度的调节作用也只能是其抑制凋亡的机制之一。

3.离子通道蛋白和吸附/锚定蛋白最近Reed发现Bcl-2蛋白可能具有双重

功能：离子通道蛋白和吸附/锚定蛋白，提出Bcl-2抑制凋亡的部分新机制。

离子通道蛋白体外实验证实，Bcl-2、Bcl-xl和Bax能在线粒体上形成离子通道，提示它们可能参与调节一些与凋亡相关的细胞现象，如线粒体通透性改变（巨孔形成）和线粒体释放凋亡蛋白酶激活因子——CytC和凋亡诱导因子（AIF）。过度表达的Bcl-2能抑制线粒体通透性改变，并影响巨孔的形成，从而抑制凋亡。但也有实验发现即使线粒体通透性未改变，CytC 等凋亡蛋白酶激活因子也可以释放到胞液中从而诱发细胞凋亡，因此这一观点还有待进一步证实。

在所观察的细胞系及多种情况下，凋亡的发生都伴有CytC从线粒体释放，继而伴有Caspases激活，而活化的Caspases降解底物后，其代表降解产物有引起线粒体通透性改变，并最终导致凋亡发生。Yang等与Kluck等发现Bcl-2可以通过抑制线粒体释放CytC来抑制凋亡，继而Rosse等和Zhivotovsky等用两种不同的方法证明了即使CytC已经释放入胞浆，Bcl-2仍能延迟细胞死亡，这是由于Bcl-2抑制活化的Caspases对线粒体释放的上游和下游都有Bcl-2调节凋亡的作用点。

AIF作为一种线粒体来源的效应蛋白酶，在分离的胞核中能诱导凋亡，同时还能激发线粒体通透性改变，诱导线粒体释放CytC和Caspase-9，并在体外切割和激活其底物——半胱氨酸蛋白酶CPP32。体外研究发现，Bcl-2过度表达可能阻止AIF从分离的线粒体上释放，但它并不能影响AIF的产生，同时也不能影响AIF促凋亡的功能。

此外，吸附/锚定蛋白在正常情况下Bcl-2通过其C端疏水残基的伸展而锚定在细胞内膜上，作为吸附/锚定蛋白，可把胞液蛋白固定在膜边，或是引导胞液蛋白与别的膜蛋白相互作用。

Bcl-2可与Bcl-2家族的Bcl-xl、Bcl-xs、Bax、Bcl-2、Bad和Mcl-1形成同源的蛋白二聚体，而特定的蛋白二聚体则可作为在细胞死亡信号通路商的分子开关。例如，Bcl-2可与促凋亡Bax形成二聚体，如果Bax相对量高于Bcl-2，则Bax同二聚体的数量增多，从而促进细胞死亡；而如果Bcl-2的相对量高于Bax，则促进形成Bcl-2/Bax异二聚体，并使Bcl-2同二聚体的量增多，从而抑制细胞死亡；而促凋亡分子和Bad和Bcl-ss则竞争结合细胞死亡抑制分子如Bcl-xl或Bcl-2，由此替换了Bax并促进Bax同二聚体形成，诱导凋亡。

另外，Bcl-2还可与Bcl-2家族外的11种蛋白质结合，包括蛋白激酶Raf-1、蛋白磷酸酶Calcineurin、GTP酶、R-Ras和H-Ras、p53-BP2、腕蛋白Pr-1、Ced-4、BAG-1、Nip-1、Nip-2和Nip-3，并由此形成其抗凋亡作用。

（二）Bcl-2不敏感的凋亡途径 Bcl-2抑制凋亡的作用并不是万能的，例如在细胞毒T细胞杀伤作用中，特定的淋巴因子撤离以及某些TNF受体家族介导的凋亡途径中Bcl-2不能抑制凋亡，其原因可能是这些凋亡诱导剂作用于Bcl-2下游或是独立于Bcl-2的其他凋亡途径。

二、Bcl-2在宫颈癌组织中的表达

研究显示：在多种组织来源如乳腺、脑、肺、胃、膀胱及卵巢等的良恶性肿瘤中，存在着Bcl-2的不同表达且肿瘤的发生发展及预后密切相关。Bcl-2在宫颈癌组织中非正常表达的原因尚不清楚。实验中Bcl-2在宫颈炎组阳性细胞均位于基底细胞层，棘细胞偶呈弱阳性。宫颈癌组织中Bcl-2阳性率为43.13，且与分化程度呈正相关，无淋巴结转移组Bcl-2高表达，提示Bcl-2基因参与宫颈癌的发生发展过程，并可能在宫颈癌早期起作用。至于Bcl-2在临床各期表达的不同，推测可能与不同并且肿瘤组织内细胞凋亡的发生率有关。由于引起肿瘤组织凋亡的因素很多，除肿瘤组织会自发性产生细胞凋亡之外，肿瘤放疗、化疗、激素和某些细胞因子均可引起肿瘤细胞的凋亡。Bax基因是近年来新发现的一种凋亡促进基因，属Bcl-2同一家族，Bax 蛋白的氨基酸序列有21与Bcl-2同源。Bax有三种不同的编码蛋白，相对分子质量分别为2kD、24kD和5kD。Bax基因不但拮抗Bcl-2的抑制凋亡作用，而且有直接促进细胞凋亡的功能。BcL-2和Bax是一对正负调节基因，Bcl-2和Bax蛋白都是均一的二聚体，反应时需一个分子Bcl-2及一个分子Bax结合形成异二聚体Bax/Bcl-2的比值，对于觉得细胞接受刺激信号后存活与否有关键作用，Bcl-2过量表达，细胞存活；Bax过量表达，细胞死亡。在Brambilla的研究中显示，在肺癌的低分化组织中Bax表达增强，而在高分化组Bcl-2过度表达。

三、小分子Bcl-2抑制剂的临床研究

（一）HA-14-1及其类似物 HA-14-1是第一个被报道的小分子Bcl-2抑制剂。2000年，Wang等运用DISCOVER软件建立了Bcl-2蛋白结构模型，并对MDL数据库中的19万余个化合物进行虚拟筛选，结构显示，HA-14-1与Bcl-2抗凋亡蛋白有着良好的形状互补性、高的虚拟亲和力和潜在的氢键作用。荧光偏振竞争性结合(FP)实验表明，HA-14-1可直接与Bcl-2抗凋亡蛋白结合，抑制了Bcl-2抗凋亡蛋白与用荧光标记的Bak-BH3小肽的作用，其将Bak-BH3小肽从Bcl-2/Bak-BH3复合物中解离出来的解离常数（kD）约从0.2微摩尔每升，从Bcl-X/Bak-BH3复合物中解离出来的kD约为0.34微摩尔每升。在细胞培养实验中，依托泊苷与人类髓细胞性白血病HL-60细胞株共培养4小时亦不能引起细胞凋亡，而用加50微摩尔每升的HA-14-1继续作用3小时可有效地引起细胞凋亡，说明HA-14-1的使用可克服HL-60细胞株对依托泊苷的耐药问题。通过DNA梯度跟踪发现，HA-14-1会引起HL-60细胞线粒体膜电位下降，激活Caspase-9及随后的Caspase-3。另外，HA-14-1可迅速引起Apaf-1阳性的NIH3T3成纤维细胞株凋亡，而不能引起Apaf-1阴性的小鼠胚胎纤维原细胞株凋亡，这都说明了HA-14-1引起细胞凋亡与线粒体通路有关。HA-14-1也可引起MDA-MB-468乳腺癌、PCB和LNCaP前列腺癌、原发急性骨髓内产生的非白血性白血病等多种细胞株凋亡，与丝裂原蛋白激酶（MEK）抑制剂PD-184352和BMS-247550联用都显示了良好的协同治疗作用；HA-14-1和蛋白酶体抑制剂bortezomibi联合治疗多发性骨髓瘤时，表现出协同诱导细胞凋亡的作用，效果大大优于单独用药。[1]

Doshi等对HA-14-1的构效关系进行研究，合成了一系列6位取代的苯并吡喃化合物，对这些化合物的体外拮抗Bcl-2抗凋亡蛋白活性和细胞毒性进行评估后发现，HA-14-16位的溴取代不是其拮抗活性所必需。可用一些适当的烷基替代，其中化合物1h活性最好，与HA-14-1相比，它对Bcl-2的亲和力增加了3倍，对肿瘤细胞的杀伤活性增加了13倍；而NBcl-2和BcL-X 蛋白过表达的Jurkat细胞株会对通常的癌症疗法产生耐药性，HA-14-1及其类似物则可引起该细胞凋亡。这些研究都支持了HA-14-1及其类似物对Bcl-2蛋白抑制的作用机制，同时也表明小分子Bcl-2抑制剂可以单独或同抗癌药物联合治疗Bcl-2抗凋亡蛋白过表达的癌症。[1]

（二）抗酶素A 是从链霉菌属中得到的抗生素，最初被认为是位于线粒体内膜的辅酶Q-细胞色素C氧化还原酶抑制剂，影响线粒体的电子转移。Tzung 等在一项对线粒体呼吸复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和ATP合成酶抑制剂的筛选实验中发现，抗霉素A可同Bak-BH3小肽竞争结合Bcl-2和Bcl-xl蛋白的疏水口袋，特异性地诱导Bcl-xl蛋白过表达的TAMH鼠肝细胞株凋亡，且DOCK软件演示也证实了抗霉素A和天然的BH3小肽与Bcl-xl蛋白上的结合位点是一致的。研究者们又继续对Bcl-xl上结合位点的4个氨基酸进行定点突变，发现抗霉素A与突变后的蛋白亲和力降低了7/8~19/20。Kim等在对抗霉素A 及其相似物与Bcl-2和Bcl-xl的特异性作用进行研究时发现，抗霉素A苯环上2位甲氧基取代的化合物不仅显示了对Bcl-xl蛋白过表达细胞的显著的特异性抑制作用，还避免了对电子转移的抑制作用，说明以抗霉素A及其衍生物为先导物可以设计出高特异性的、并且不引起线粒体毒性的小分子Bcl-2抑制剂。[1]

（三）氧化白屈莱红碱是从Bocconia vulcanica茎部提取出来的一个天然苯并菲啶生物碱，最初被认为是蛋白激酶C的抑制剂，通过影响神经酰胺的产生途径间接地诱导细胞凋亡Chan等基于FP实验对天然产物信息库中107243个化合物进行高通量筛选，结果发现，氯化白屈莱红碱可将Bak-BH3小肽从Bak-BH3/Bcl-xl复合物中置换出来；在细胞实验中，它可诱导人类神经母细胞瘤SH-SY5Y、结肠直肠癌HCT116和乳腺癌MCF77等细胞株凋亡，其中Bcl-xl过表达的SH-SY5Y细胞株对依托泊苷和十字孢碱产生耐药性，而氧化白屈莱红碱却可诱导该细胞株凋亡；同时，另一个相关的天然产物血根碱也显示出与氧化白屈莱红碱相似的对Bcl-xl的亲和性。Zhang等运用几种不同的NMR光谱技术、定向突变及竞争结合实验研究了氧化白屈莱红碱和血根碱与Bcl-xl的结合位点，结果表明，血根碱与Bcl-xl蛋白结合在通常的BH3裂口，而氧化白屈莱红碱与Bcl-xl蛋白结合位点不在主要的疏水沟，而是在螺旋的连接螺环上。[1]

（四）Obatoclax 是首个被报道的进入临床研究的小分子Bcl-2抑制剂，是对链玉红菌素，从粘质沙雷菌中分离出的三吡啶色素，进行结构改造而得到非肽小分子化合物。Obatoclax可与Bcl-xl、Bcl-w和Mcl-1结合，直接放射配基结合试验测得其kD大约为0.5微摩尔每升，细胞毒试验通过考察细胞存活所依赖的Bcl-2蛋白的残存功能证明了该化合物对靶蛋白的特异性。2004年后期开始了Obatoclax治疗实体瘤的Ⅰ期临床实验，并在2005年初进行了针对CLL患者的Ⅰ期实验。Ⅰ期临床实验采取了周期性的给药方案（每1~3周静脉给药），对25名患者进行3.5~14和20~40毫克/平方米剂量的疗效对比，结果显示，有1例病情部分缓解，9例病情稳定；药效学研

究测定的阈效应剂量为14毫克/平方米，并且血浆组蛋白寡聚脱氧核苷酸的浓度与剂量相关；最小中毒剂量为28毫克/平方米；嗜睡、共济失调和烦躁等副作用与剂量限制毒性有关。本品的Ⅱ期临床实验致力于治疗霍奇金病和骨髓纤维化伴骨髓化生（MMM），其中用于治疗MMM的实验研究是基于Ⅰ期临床实验中CLL患者血小板计数和红细胞计数的恢复率。[1]

总而言之，Bcl-2蛋白在肿瘤细胞中的表达大大高于正常细胞的表达，也就是说以其为靶点的抑制剂几乎不会对正常细胞产生影响，通过抑制Bcl-2抗凋亡蛋白来克服肿瘤细胞对凋亡的耐受是一种基于肿瘤发病机制的新型治疗方案，比传统的细胞毒性疗法选择性好、安全性高。而许多一蛋白质为靶点的化疗药物都会影响到正常细胞，对癌症患者产生全身毒性。但是至今Bcl-2家族蛋白影响细胞凋亡的许多机制还不十分明确，弄清这些信息将有助于设计出更有效的和特异的小分子Bcl-2抑制剂，以作为单一制剂或同其他细胞毒性药物联合对抗顽固的癌症。

结语至今为止，宫颈癌仍然是威胁着全球女性健康的疾病之一，因此，找到更为有效的治疗方案是非常重要的。运用分子靶向来治疗这一疾病是一个研究点，但是也是在刚刚起步的阶段，有些机制还不很清晰，需要去进一步地研究，不过这一方法有着广阔的研究前景，在不久的将来一定会获得令人兴奋的成果，给患者带去佳音。

致谢：感谢老师的指导，感谢小组内成员黄贺、曹红的帮助与支持

参考文献：

[1]黄啸.宫颈癌综合治疗[M].江苏科学技术出版社，2009-06第一版

[2]蔡红兵，陈惠祯.子宫颈癌[M].北京：科学技术文献出版社，2009

[3]李际春，何玲.HPV感染与宫颈癌关系的研究进展[M].宁夏医学杂志，2007.29（12）：1160-1161