我的细胞培养计划作业

我的细胞培养计划

1、培养目的：肺上皮细胞原代培养是研究肺组织形态结构和功能及其在病毒感染等各种损伤条件下的病理变化的重要方法之一。建立一种操作简便、重复性好的体外培养BALB/c小鼠原代肺上皮细胞（AEC）的方法，探究不同发育阶段小鼠AEC中腺病毒受体（CAR）表达量的变化，及其对小鼠原代AEC贴壁的作用。进而研究腺病毒引起肺上皮病毒感染的机制。

2、实验室条件：

超净工作台、培养箱、倒置显微镜、冰箱、冷冻保存装置、细胞计数板和电子细胞计数仪、离心机、PH计、天平、水纯化装置、高压蒸汽消毒装置、电热干燥箱、过滤除菌装置、手术器械、培养器皿、移液器、特殊用具、杂用品

3、培养方法：

1）培养基的选用（含应补充的附加成分）及培养所需的其它用液；

胎牛血清（FBS）、改良型RPMI-1640培养基、Ⅰ型鼠尾胶原蛋白、链霉蛋白酶（pronase）、DnaseⅠ、胶原酶Ⅰ、D- Hank's平衡液（含Ca2+、Mg2+，不含酚红）、Hank's平衡液（不含Ca2+、Mg2+、酚红）、山羊血清、CAR（H300）Rabbit Polyclonal IgG2a、IgG- HRP、Goat anti-Rabbit IgG-、DAPI

2）具体操作方法及步骤（按实际操作分步列出）；

1 接种原代细胞的培养板使用前用0.01

2 mg/mL Ⅰ型鼠尾胶原蛋白溶液包被处理。按照2μg/cm2 包被浓度包被培养板，6孔培养板每孔底面积95cm2加0.012 mg/mLⅠ型鼠尾胶原蛋白溶液1580μL，24孔板加300μL，确保溶液铺满器皿表面，开盖在超净工作台上过夜晾干（也可在室温放置1 h，用PBS缓冲液洗3~4次后直接使用），4℃无菌保存。

2 颈椎脱臼法处死小鼠，无菌条件下用75%酒精棉消毒手术区域剖取肺组织；肺组织置于预冷的PBS溶液中漂洗，去除（支）气管、结缔组织等非肺组织，清洗数次去血。

3 用眼科手术剪将肺组织剪成1 mm3大小的肺组织块，用预冷的PBS溶液轻轻混悬，于4℃、1500 r/min离心5 min，轻轻吸弃上清，重复 3~4次至上清澄清。

4 加入1 mL 0.15%链酶蛋白酶溶液（含0.02 g/L DNaseⅠ），用37℃、5% CO2培养箱中消化15~20 min，期间不断搅拌或振荡使消化充分，此时大部分肺组织块被消化为细胞悬液；加入与消化液等量的10% FBS-RPMI1640培养基终止消化，轻柔并充分吹打均匀，100目不锈钢筛网过滤细胞悬液，去除组织块；滤液于4℃、1000 r/min离心 8 min，弃上清，所得沉淀即为总细胞，主要为AEC 和成纤维细胞；

5 沉淀用1 mL 0.1%胶原酶Ⅰ溶液重悬，37℃、 5% CO2培养箱中消化15 min；加入等量的10% FBS-RPMI1640培养基终止消化，充分吹打均匀， 4℃、1000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀（主要为AEC，极少量为成纤维细胞）用10% FBS- RPMI1640培养基重悬，37℃、5% CO2培养箱中培养。

6 在37℃、 5% CO2培养箱中培养1h后，贴壁的为纯成纤维细胞，未贴壁的大部分为上皮细胞，轻柔吸出培养基，4℃、1000 r/min离心5min，沉淀重悬接种至新的细胞板孔中；1h后反复上述步骤，37℃、5% CO2培养箱中培养，24h

后更换培养液，并用倒置显微镜观察其形态和基本生长情况并记录。

7 培养过程步骤繁琐容易染菌，若发现细胞染菌，可在培养基中加入1/1000的氨苄西林，即可起到灭菌作用，可继续培养。

3）培养过程的观察的注意事项；

1 实验动物为SPF级19 d BALB/c孕鼠，1、3、6~8周BALB/c 雄鼠。

2 在剪碎及消化肺组织过程中，由于机械作用和酶作用，会导致大量细胞破碎释放出DNA，与细胞外的基质作用容易形成DNA蛋白复合物，进一步将周围细胞网罗聚集在一起形成细胞团，降低酶消化液分散细胞的效果。为避免这种情况的出现，我们在消化过程中加入D-NaseⅠ来防止细胞聚集是关键之一。

3 在机体内37℃条件下细胞自身代谢非常旺盛，而分离过程中为了保证细胞活性，须降低细胞自身代谢；在整个分离过程中，除使用酶消化组织和分散细胞的步骤以外，其余过程均须将肺组织块和细胞悬液置于冰上，PBS缓冲液也需要提前预冷后使用。

4 培养板处理方法很重要:接种原代细胞的培养板使用前用0.012 mg/mL

Ⅰ型鼠尾胶原蛋白溶液包被处理。按照2 μg/cm2 包被浓度包被培养板，6孔培养板每孔底面积95 cm2加0.012 mg/mLⅠ型鼠尾胶原蛋白溶液1580μL，24孔板加300μL，确保溶液铺满器皿表面，开盖在超净工作台上过夜晾干（也可在室温放置1 h，用PBS缓冲液洗3~4次后直接使用），4℃无菌保存。

5 由于肺上皮细胞比较娇嫩,制备单细胞悬液过程中要求操作轻、稳,吹打时忌产生气泡。另外整个制备单细胞悬液过程在冰上进行,能更好地保持细胞活力。

6 整个实验过程一定要无菌操作。

4、目的细胞的鉴定方法：

1）具体方法（可列1～3种）；免疫荧光法鉴定

①选取培养好的小鼠AEC，用PBS缓冲液在板内清洗细胞2~3次，用4%多聚甲醛（PBS缓冲液配制）4℃固定1h；②将盖玻片从细胞培养板内取出，置于载玻片上，此时细胞面向上；③弃掉4%多聚甲醛，用PBS清洗2~3次，5min/次；④用5%山羊血清室温封闭1 h，倾去血清，PBS清洗2~3次，5min/次；⑤向盖玻片上滴加EP-CAM Rat Monoclonal IgG2a 和CAR（H300）Rabbit Polyclonal IgG2a；

⑥放入湿盒中，于4℃孵育过夜；⑦用PBS清洗3次，5min/次；⑧向盖玻片上滴加Goat anti-Rat IgG-PE和FITC Goat anti-Rabbit IgG；⑨放入湿盒中，室温孵育40 min；⑩用PBS清洗3次，5min/次；?向盖玻片上滴加DAPI，放入湿盒中，室温孵育20min；?用PBS清洗3次，5min/次，用50%甘油封片，此时细胞面向下，直接在荧光显微镜下观察。

2）应出现的结果：

在光学显微镜下观察细胞形态学特征，发现胎鼠、1周幼鼠原代AEC在种板24 h左右开始贴壁，约40 h左右大量贴壁生长，细胞平展成立方形或多边形，呈岛状生长，且相互连接，形成单层；3 周幼鼠、成体鼠原代AEC在体外培养24 h时还未贴壁，没有表现出上皮细胞的形态学特征。随着鼠龄的增长，细胞贴壁所需时间越来越长，成体鼠（6~8 周）AEC贴壁速度较幼鼠（1、3周）和胎鼠（孕19 d 胎鼠）慢，细胞生长速度较幼鼠和胎鼠慢，且细胞贴壁数量及增殖数量都较幼鼠和胎鼠少。

5、困难及解决办法：

1 获得较纯的肺上皮细胞：熟悉鼠的肺局部解剖，剥离气管、支气管和结

缔组织要彻底，操作过程中动作轻柔。

2 在实验准备阶段器清洗器械时要细致认真。若忽略培养瓶内的细小的杂质，可导致在培养过程中一些杂质也在瓶内生长

3 自身专业技能不熟练，吹打是过多气泡产生，无菌观念不强等原因，在培养过程中导致细胞死亡。