最新小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定

小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定

摘要：

过氧化氢酶(Catalase) 是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶，是过氧化物酶体的标志酶尤其在动物的肝脏、肾脏、红细胞中含量较多，其生物学功能是催化细胞内H2O2分解，防止过多H2O2 对细胞的危害。人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业，造纸与印染业，农业与环保业，以及医疗卫生业等多领域。

过氧化氢酶分子量约为238KD，结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成，是以铁卟啉为辅基的结合酶，在407nm波长下有特征性的吸收。溶于水,几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂，酸性环境下溶解度低易析出，最适温度为37℃，最适pH值约为7.8。本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶。建立了一套适合一般实验室分离纯化过氧化氢酶的方法，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。

现报告如下：

一、实验器材

1、实验动物：成年雄性小鼠（河北医科大学实验动物中心提供）

2、主要器材：托盘天平，组织捣碎机，离心管，H2050R高速冷冻离心机，

CU600型电热恒温水箱，DYY-8L型电泳仪（北京市六一仪器厂），H2S-H水浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司），垂直板型电泳装置，制冰机，4℃冰箱

二、实验方法

●匀浆

是根据过氧化氢酶的性质，利用有机溶剂将组织细胞捣碎，使其释放出来的方法。

小鼠肝脏匀浆液制备：用颈椎脱臼法处死小鼠，取出肝脏，称重 6g；按1：8.5的比例加入匀浆缓冲液51ml（0.05mol/L醋酸-23.5%乙醇缓冲液，

pH4.0）,匀浆机捣碎3-5min；缓慢滴加匀浆液体积0.5倍的氯仿（边加边快速搅拌）再次匀浆1min；匀浆液离心（4℃, 6500rpm, 30min）后保留上清液备用。

●盐析

是在过氧化氢酶中加入适当浓度的中性盐溶液，破坏其水化膜，使其成盐析状态而沉淀下来，离心后可除去部分杂蛋白。

盐析法粗提过氧化氢酶：缓慢加入上清液体积0.06倍的0.5mol/L的硫酸钠溶液，冰浴搅拌1h，离心（4℃, 6500rpm, 10min），保留离心沉淀；加入4

倍肝重（0.1mol /L pH7.8）的磷酸缓冲液手动玻璃匀浆器使沉淀溶解,离心（4℃, 4000rpm, 10min）,保留上清备用。

●透析

是利用透析袋的半透过性，在一定透析条件下，使过氧化氢酶以不变性的沉淀形式析出，复溶后，可除去部分杂蛋白。

透析法纯化过氧化氢酶：将上清液置于透析袋，透析两周（透析液：20%乙醇，0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/L氯化钠）中途更换一次透析液；透析后取出浊溶液，离心（4℃, 6500rpm, 10min），取沉淀，溶于0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液中,离心（4℃,4500rpm, 10min）收获上清，得到小鼠肝脏过氧化氢酶溶液。将收获的上清液（3组合并为一组）放入处理过的透析袋中，置于50%的甘油中包埋浓缩24小时后放冰箱保存，

制备过程中各阶段产物用比色测定法测定酶活，分析制备效率。分离纯化产物酶活性回收率用各步产物的酶活占匀浆上清液酶活的百分比来表示。

●层析

是根据混合物中各种物质分子大小不同，在凝胶层柱的扩散移动速度不同使混合物分离的方法。

分别在280nm和407nm波长下测光吸收值，合并收集峰值重合管，得到纯化过的过氧化氢酶。

取出装柱好的层析柱，打开出口使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床面平齐时，沿柱口旋转加样，同时开始收集层析柱的流出液，每管收集约25滴，一次在407nm和280nm波长下，测定各管吸光度值。并绘制曲线。

2、过氧化氢酶的性质测定

●电泳

电泳是根据带电颗粒在电场作用下向着预期与其电荷相反的电极移动的现象，蛋白质电泳迁移率主要取决于它的相对分子量。所以用电泳法可测定过氧化氢酶的分子量。

用定量移液器把样品和MAKER加在配好的SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板的样品槽内，接上电源开始电泳（55min），取出凝胶，用考马斯亮蓝R-250染色

15min；脱色后放置一周后观察蛋白质条带情况，并计算相对迁移率

●lowry法测定纯化的过氧化氢酶浓度

是根据蛋白质中的酪氨酸与酚试剂之磷钼酸、磷钨酸作用产生蓝色化合物，其颜色深浅与蛋白含量成正比的方法。作出标准曲线的到过氧化氢酶的浓度

制作标准蛋白的选择：选择与待测样品相同组成的蛋白质作为标准蛋白溶液。

标准蛋白溶液的配制：将标准蛋白经凯式定氮法准确测定其蛋白含量，再用无离子水配成0.1mg∕mL储存液。

按照表（如下）配成不同浓度的标准蛋白组，编上号码，以第一管为空白管，在分光度计上测定650mn处的光密度值。

以各标准浓度为横坐标，各管密度值为纵坐标作图，绘制标准曲线。

米式常数值测定

滴定法：以H2O2 为底物，用过氧化氢酶催化其分解10min，加入硫酸终止催化反应，并用已知浓度高锰酸钾滴定剩余的H2O2，换算出减少的H2O2的量，进而计算出酶的活力。在Km值测定中采用此法测定酶活力。

过氧化氢酶活力单位定义为：以每分钟催化1μmolH2O2减少所需的过氧化氢酶的量作为一个酶活性单位（U）。样品的比活以每毫克样品蛋白所含的酶活性单位数表示。

三、实验结果

层析后蛋白吸光度变化曲线图

图如下：

SDS-PAGE测定过氧化氢酶分子量

小鼠肝脏过氧化物酶制备与测定

摘要目的分离纯化过氧化氢酶，测定其相关性质。方法采用匀浆、盐析、透析、层析等方法分离纯化过氧化氢酶，采用Lorry 法测定蛋白含量，SDS-PAGE法测定蛋白质相对分子质量，双倒数法测定酶的米氏常数。结论相对分子质量为60.25kD，以过氧化氢为底物时酶的Km值为0.133mol/L，酶层析后的比活为0.686IU/mg。关键词小鼠过氧化氢酶纯化米氏常数SDS-PAGE 前言过氧化氢酶(Hydrogen Peroxidase)又名触酶(Catalase，CAT),是一种广泛存在于生物组织的氧化还原酶[1]。过氧化氢酶是一种四聚体血晶素酶, 由四个相同四面体排列的亚基组成,每一个亚基相对分子质量约60000，每一个分子都包含有四个高铁血红素基团,分子量在240000左右[2]。在人体内以肝和肾脏所含过氧化氢酶活性最高, 结缔组织活性最弱,其它组织如红细胞、脾、小肠、肌肉等均含有过氧化氢酶。过氧化氢酶在细胞内主要与线粒体及过氧化物酶体结合, 在红细胞内呈溶解状态。过氧化氢酶是一种与D－氨基酸氧化酶等一系列需氧脱氢酶相偶联的酶, 具有重要的生理功能。过氧化氢酶能将细胞代谢所产生的毒性物质迅速加以清除, 从而起到和谷胱肽过氧化酶共同保护琉基酶、膜蛋白和解毒的作用。近年来, 过氧化氢酶的活性测定被作为与肿瘤和抗衰老有关的酶学指标而受到关注。[3] 近年来，过氧化氢酶活性的测定被作为与肿瘤和抗衰老有关，蛋白质的分离纯化方法是生命科学领域关注的热点之一。[4] 1实验器材 1.1实验动物昆明小鼠6只，雌雄不限，由河北医科大学动物实验中心提供。 1.2主要仪器 5200型紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司），UV-5200 冷冻离心机(湖南相依实验仪器开发有限公司)，BCD-185冰箱（青岛海尔公司），微量移液器，40W匀浆器（江苏国华仪器厂），电泳仪（北京六一） 2实验方法

小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察实验报告

姓名班级 13级生命基地班学号同组者：科目细胞生物学实验实验题目小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察【实验题目】小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察【实验目的】 1、掌握线粒体的超活染色原理及方法。 2、观察动物肝细胞内线粒体的形态、数量与分布。【实验材料与用品】 1. 试剂：0.02%的詹纳绿B染液、Ringer试剂 2. 器具：解剖盘、镊子、剪刀、双凹片、小烧杯、载玻片、盖玻片、胶头滴管、显微镜等 3. 材料：小鼠【实验原理】 I.线粒体线粒体是一种存在于大多数细胞中的由两层膜包裹的细胞器，直径在0.5-10微米左右；线粒体是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷的主要场所，为细胞的活动提供了能量，有“细胞动力工厂”之称。线粒体在代谢活动旺盛的细胞，如肌肉细胞，肝细胞，神经细胞等中大量存在；线粒体的数量差异巨大，如在肝脏细胞中有1000-2000个线粒体，而有些细胞只有一个线粒体，如酵母菌细胞的大型分支线粒体，大多数哺乳动物成熟红细胞不具有线粒体。线粒体分布方向与微管一致，通常分布在细胞功能旺盛的区域：如在肾脏细胞中靠近微血管，呈平行或栅状排列；在肠表皮细胞中呈两极分布，集中在顶端和基端，在精子中分布在鞭毛中区。

姓名班级 13级生命基地班学号同组者：科目细胞生物学实验实验题目小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 II.超活染色实验原理超活染色也称活体染色，是指对生命有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法；超活染色的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞死亡。应用活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理病理状态。活体染色根据染色剂的性质和染色方法不同分为：体内活染（注入、固定、堆积）、体外活染（分离、浸染、固定） 1）体内活染：是以胶体状的染料溶液注入动植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的作用。 2）体外活染：又称超活染色，它是由活的动植物分离出的细胞或组织小块，以染料溶液浸染，燃料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染色之所以能固定，堆积在细胞内某些特殊部分，主要是染料的“电化学”特性起到重要作用；碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染液的胶粒表面带阴离子，被染的部分本身也是具有阳离子或阴离子，这样它们彼此之间就发生了吸引作用，从而使样品着色。不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料。活体染色剂的选择原则： 1、对细胞无毒性或毒性极小的染剂 2、具有电化学特性 3、配成稀淡的溶液来使用 4、具有专一性（特异性） 5、一般是以碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。本实验采用的活体染色剂---詹纳斯绿B 詹纳斯绿B是毒性较小的碱性染料，可专一性的对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态--蓝绿色）；而线

肝切片的实验报告

肝切片的实验报告篇一：肝切片实验报告？实验九显微摄影――小鼠肝脏结构年级专业 *班 *组学号姓名αβ 500μm 1 m 2 100μm i 100μm 4 50μm 图版说明：图1：小鼠肝脏横切部分结构，示肝小叶（a），静脉血管（b）。图2：图1（α部位）的放大，示肝小叶（c）。图3：示肝小叶（d）。图4：示静脉血管（e）。图5：示肝细胞（f），肝细胞细胞核（g）。图6：图2（β部位)的放大，示上皮细胞（h），上皮细胞细胞核（i），肝血窦（j），中央静脉（k），肝动脉（l），血细胞（m）。结构说明：肝脏是脊椎动物身体内以代谢功能为主的一个器官，并在身体里面扮演着氧化，储存肝糖，解读等功能。肝脏由肝小叶组成，肝小叶是肝脏的基本组成成分，它来执行肝脏的基本职能。而肝小叶又是由肝细胞组成，当肝细胞大量损坏时，肝小叶不能正常工作，影响肝脏正常生理功能，而出现各种各样的症状。肝小叶成棱柱状，中央有一条中央静脉穿过，肝细胞围绕中央静脉成放射状排列。肝细胞是一种高度分化并具有多种功能的细胞，胞质内各种细胞器丰富而发达，并

含有糖原，脂滴等内涵物。细胞器和内涵物的含量与分布常因细胞的功能状况或饮食变化而变动。一般肝细胞里线粒体含量都比较多，遍布于胞质内，为肝细胞的功能活动不断提供能量。肝细胞核大而圆，居中央，染色质丰富色浅，核膜清楚，核仁1至数个。部分肝细胞（约 25%）有双核，有的肝细胞的核体积较大，为多倍体核。肝血窦位于肝板之间，互相吻合成网状管道。血窦腔大而不规则，血液从肝小叶的周边经肝血窦流向中央，汇聚到中央静脉。 5 50μm篇二：实验报告(一) 实验名称：实验性空气栓塞实验时间：成绩：实验目的：了解空气栓塞对机体的影响实验材料：家兔，20ml注射器及针头，解剖刀，剪，镊子，面盒，浸有二甲苯的棉球若干等实验方法（简要说明）： 1. 先观察家兔的一般状况：活动状态、呼吸频率、嘴唇颜色及瞳孔大小等。 2. 用浸有二甲苯的棉球涂擦一侧耳廓，使局部血管扩张，便于穿刺注射。 3. 用注射器经耳缘静脉注入空气10～15ml，记录时间，

小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察-实验报告

取小鼠脑组织

丁香园上面总结的方法，排版有点乱。其实过程与大鼠近似，我的经验是： 1. 材料准备；大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等； 2. 步骤：处死小鼠，取头颅；剪开皮肤，漏出颅骨；用大尖镊子夹住两侧眼眶，用眼科剪稍剪除颅骨中线；再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹，从下向上逐步去除颅骨；当全脑露出时，再用眼科镊去除脑膜和血管；然后用竹签从嗅球处向下取出全脑，即可。 3. 注意事项：用力轻柔，否则容易弄破脑部；用剪刀剪颅骨时，一定要贴壁向上剪，否则容易剪破脑部；去除脑膜时，不能硬拉，否则容易弄破大脑；取出全脑时应把头顶朝下，用竹签轻轻取出，离桌面也不要太远、高；若留病理，建议一定要取完整无损的大脑。做免疫组化的话，稍微麻烦一点儿，因为脑组织含水量多，要固定的好，就需要先灌注。先麻醉小鼠剪开胸腔，找到心脏，从心尖入针，剪开右心耳先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了再改用固定液（一般是4%多聚甲醛）灌注至小鼠四肢僵硬小鼠只需要用注射器就行了，我做的25～35g的小鼠一般用50mLNS+30mL多聚甲醛。具体步骤：常规麻醉小鼠，将其固定，用剪刀剪开胸部皮肤，暴露出皮下组织，剪开时注意钝性分离，以免误伤。然后用镊子提起剑突，用剪刀剪开胸腔，剪断两侧肋骨，暴露整个胸腔，小心误伤肺及心脏、大血管。用镊子撕开心包膜，暴露心脏，用眼科剪剪开右心耳，然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室，注射，注射时小心针头滑脱。生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。然后用多聚甲醛灌流，针孔最好是同一个，多聚灌流时小鼠四肢会抽搐，待抽搐结束，小鼠僵硬即可。取下小鼠，用剪刀在颈部离断头颅，用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀，将两边皮肤向下翻用手捏住，暴露整个颅骨，用眼科剪从脊髓端插入椎孔，沿着颅正中线剪开颅骨，注意剪刀向上翘一些，以免误伤脑组织，剪开后用弯眼科镊分离颅骨，小心分离，直至暴露整个大脑，然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经，就可以取出整个脑子了。放多聚里固定24h后包埋切片即可。具体操作如下：实验操作步骤： 1) 小鼠称重，以每克小鼠0.0025ml 4%戊巴比妥钠剂量的实施腹腔麻醉。也可以用10%的水合氯醛，3-5ul/g腹腔注射麻醉。 2) 将麻醉的小鼠仰放在操作台上，去毛。 3) 解剖小鼠，暴露心脏。 4) 找到心尖部，左手用镊子提起心尖部，右手或左手将灌流针刺破心尖部进针约0.5cm（最好是用小点的针头，用止血钳固定针尖，剪开右心耳。 5) 将灌流器的导管部开口放到生理盐水中里，打开灌流器灌流，直到从右心耳流出的液体为无色，同时小鼠肝脏色淡，肠管肿胀为止，停止灌流。没有灌流器的用注射器或者吊瓶都可以。

原代小鼠肝细胞制备

细胞培养室肝细胞原代培养标准操作规程实验试剂培养基：William’s E Medium(GiBCO 12551-032), 谷氨酰胺(GiBco 21051-024-100g)292mg/L，双抗（GiBco 15140-122 penicillin +10,000Units/mL, streptomycin +10,000μg /mL）5mL/500mL, 胰岛素(GiBCO 12585-014 4 mg/mL)8μg/mL, 地塞米松（中国药品生物制品检定所）5mg/L。 D-Hanks’液（CaCl2 0.55g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, Na2HPO4?7H2O 0.06g/L, NaHCO3 0.35g/L, 三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2-7.4, 4℃保存） 0.05%胶原酶Ⅳ溶液(（Sigma C5138-1G） D-Hanks’液溶解, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌, -20℃ 保存）) PBS预灌流溶液（NaCl 8.0g/L, KCl 0.2g/L, KH2PO40.2g/L, Na2HPO4?7H2O 1.56g/L, EDTA 0.1mM, 三蒸水溶解, NaHCO3调pH 7.2-7.4, 0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存）鼠尾胶原（GiBCO A10483-01 20mL/ 瓶）（0.05 mg/ mL）用0.02M 的醋酸稀释,临用现配） 0.02M 的醋酸：115μL的醋酸(大于99%)用水稀释至100mL 0.05 mg/ mL-200μL鼠尾胶原（5 mg/ mL）用0.02M的醋酸稀释至20 mL Overlay(0.25 mg/ mL的Matrigel（BD 356237）(用William’s E Medium稀释，视具体批号而定稀释倍数，临用现配） Hanks’液（CaCl2 0.14g/L, NaCl 8.0g/L, KCl 0.4g/L, KH2PO4 0.06g/L, MgCl2?6H2O 0.10g/L, MgSO4.7H2O 0.10g/L, Na2HPO4?7H2O 0.09g/L, NaHCO3 0.35g/L, D-葡萄糖 1.0 g/L，三蒸水溶解，NaHCO3调pH 7.2附近，4℃保存）实验仪器 CO2 恒温培养箱（日本SANYO 公司）； Sigma高速离心机； IX-51 型荧光倒置显微镜（日本尼康公司）； DHL-A电脑恒流泵（上海青浦沪西仪器厂）；液相-质谱联用分析系统（LC/MS/MS）由美国Thermo系列四元泵、在线脱气机、自动进样器、以及Thermo Finnigan LTQ线性离子阱质谱检测器，系统工作软件为XcaLibur（美国）； Sigma5310离心机； ZHWY-103B多振幅轨道式恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）。实验方法实验准备

小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定

小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定摘要：过氧化氢酶(Catalase) 是一种广泛存在于生物体内的氧化还原酶，是过氧化物酶体的标志酶尤其在动物的肝脏、肾脏、红细胞中含量较多，其生物学功能是催化细胞内H2O2分解，防止过多H2O2 对细胞的危害。人工制备的过氧化氢酶可广泛应用于食品与乳制品业，造纸与印染业，农业与环保业，以及医疗卫生业等多领域。过氧化氢酶分子量约为238KD，结构上由4个具有相同多肽链的亚基组成，是以铁卟啉为辅基的结合酶，在407nm波长下有特征性的吸收。溶于水,几乎不溶于乙醇、氯仿、乙醚等有机试剂，酸性环境下溶解度低易析出，最适温度为37℃，最适pH值约为7.8。本实验以小鼠肝脏为原料，根据过氧化氢酶溶解性和大分子等特性，通过组织匀浆、盐析、透析、分子筛层析等步骤，提取纯化过氧化氢酶。建立了一套适合一般实验室分离纯化过氧化氢酶的方法，并对制备的过氧化氢酶进行蛋白浓度、分子量、米氏常数等测定。现报告如下：一、实验器材 1、实验动物：成年雄性小鼠（河北医科大学实验动物中心提供） 2、主要器材：托盘天平，组织捣碎机，离心管，H2050R高速冷冻离心机，CU600型电热恒温水箱，DYY-8L型电泳仪（北京市六一仪器厂），H2S-H水浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司），垂直板型电泳装置，制冰机，4℃冰箱二、实验方法来 6g；按1： pH4.0）,

是在过氧化氢酶中加入适当浓度的中性盐溶液，破坏其水化膜，使其成盐析状态而沉淀下来，离心后可除去部分杂蛋白。盐析法粗提过氧化氢酶：缓慢加入上清液体积0.06倍的0.5mol/L的硫酸钠溶液，冰浴搅拌1h，离心（4℃, 6500rpm, 10min），保留离心沉淀；加入4倍肝重（0.1mol /L pH7.8）的磷酸缓冲液手动玻璃匀浆器使沉淀溶解,离心（4℃, 4000rpm, 10min）,保留上清备用。 ●透析是利用透析袋的半透过性，在一定透析条件下，使过氧化氢酶以不变性的沉淀形式析出，复溶后，可除去部分杂蛋白。透析法纯化过氧化氢酶：将上清液置于透析袋，透析两周（透析液：20%乙醇，0.1mol/L pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/L氯化钠）中途更换一次透析液；透析后取出浊溶液，离心（4℃, 6500rpm, 10min），取沉淀，溶于0.1mol/L pH7.8磷酸缓冲液中,离心（4℃,4500rpm, 10min）收获上清，得到小鼠肝脏过氧化氢酶溶液。将收获的上清液（3组合并为一组）放入处理过的透析袋中，置于50%的甘油中包埋浓缩24小时后放冰箱保存，制备过程中各阶段产物用比色测定法测定酶活，分析制备效率。分离纯化产物酶活性回收率用各步产物的酶活占匀浆上清液酶活的百分比来表示。 ●层析是根据混合物中各种物质分子大小不同，在凝胶层柱的扩散移动速度不同使混合物分离的方法。分别在280nm和407nm波长下测光吸收值，合并收集峰值重合管，得到纯化过的过氧化氢酶。取出装柱好的层析柱，打开出口使缓冲液缓缓流出，当液面与凝胶床面平齐时，沿柱口旋转加样，同时开始收集层析柱的流出液，每管收集约25滴，一次在407nm和280nm波长下，测定各管吸光度值。并绘制曲线。 2、过氧化氢酶的性质测定制作标准蛋白的选择：选择与待测样品相同组成的蛋白质作为标准蛋白溶液。标准蛋白溶液的配制：将标准蛋白经凯式定氮法准确测定其蛋白含量，再用无离子水配成0.1mg∕mL储存液。

细胞生物学小鼠细胞培养实验报告

广州大学综合设计性实验报告学院生命科学学院课程细胞生物学实验实验项目细胞培养实验题目小鼠肝细胞的原代培养专业生物技术年级、班别生技142 姓名徐嘉宽学号 1414300030 任课教师陈鲲

细胞培养 ——小鼠细胞的原代培养摘要目的探讨体外分离和培养小鼠肾、脑、心肌细胞的方法。方法采用脱臼法处死新生小鼠，结合酶消化法和组织块法对新生小鼠肾、脑、心肌细胞进行了体外分离、培养。（用眼科剪把新生小鼠心肌细胞组织剪成小于1mm3大小的植块，然后用胰蛋白酶消化5~10min，最后将心肌组织块接种于培养瓶中进行体外培养。脑和肾直接进行组织块培养。）结果比较成功地进行了原代肾、脑、心肌细胞培养，并进行了形态学观察。结论采用该方法能够实现对小鼠心肌、肾、脑细胞的体外原代培养，较好观察到心肌、脑、肾细胞的形态。关键词原代培养小鼠细胞组织块法酶消化法 1前言初步了解动物细胞原代培养的基本方法、原理和基本操作过程，初步掌握无菌操作方法。学习植块培养法、营养液的配置及酸碱度的调节。细胞培养是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验技术。当前，细胞培养技术广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，已发展成为一种重要的生物技术。了解动物细胞培养的技术的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，并对原代培养有一个基本概念。结合酶消化法和组织块法通过无菌操作培养新生小鼠细胞。 2实验原理原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），用植块培养法或酶解法，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要是细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 3实验用品 3.1器材解剖剪、镊1套；眼科剪7把、眼科镊6把；吸管直、弯头各7支，2 ml刻度吸管5支；吸管胶头：小18个、大6个；细胞培养瓶5个；青霉素瓶及瓶塞：6个（其中一个用于分装胰酶液）；培养皿(用于解剖取材)：大、小各1套。烧杯：5～10ml 2个、100 ml 1个。用于无菌操作：解剖镊1把，广口瓶大、小各1个（装消毒棉球），医用棉花、纱布，有盖白瓷盘1个、消毒盒3个、牛皮纸、棉绳。小培养皿(装盖玻片)1个。

过氧化氢酶产生菌的研究

过氧化氢酶产生菌的研究摘要：过氧化氢酶一类以过氧化氢为专一底物，通过催化一对电子的转移而最终将其降解为水和氧气的酶。关键字：过氧化氢酶发酵调控过氧化氢酶简介过氧化氢酶(Hydrogen peroxide oxidoreductase，catalase EC 1.11.1.6.) 是一类以过氧化氢为专一底物，通过催化一对电子的转移而最终将其降解为水和氧气的酶。研究表明几乎所有的需氧微生物中都存在过氧化氢酶，只有少数好氧菌如过氧化醋杆菌Acetobacter peroxydas 不存在过氧化氢酶。除谢氏丙酸杆菌Propionibacterium shermanji 和巨大脱硫弧菌Desulfovibrio gigas 等微生物外，绝大多数厌氧微生物体内不存在过氧化氢酶。根据过氧化氢酶在结构和序列水平上的异同将其划分为 3 个亚群，即单功能过氧化氢酶(Monofunctional catalase or Typicalcatalase)、双功能过氧化氢酶(Catalase-peroxidase) 和假过氧化氢酶(Pseudocatalase or Mn-catalasee)。大多数的过氧化氢酶由4 个相同的亚单位组成，分子量在240 kDa 左右，在亚基的活性部位各含一个血红素基团。来自哺乳动物以及某些真菌和细菌的过氧化氢酶还含有 4 个紧密结合的NADPH 分子。过氧化氢酶可被氰化合物、苯酚类、叠氮化物、过氧化氢、尿素及碱等物质所阻抑。过氧化氢酶主要集中存在于细胞的过氧化物酶体中，另外线粒体和细胞质中也含有少量的过氧化氢酶。过氧化氢酶能及时分解细胞内产生(主要为SOD 歧化产物) 或由胞外进入细胞的过氧化氢。避免了过氧化氢通过Fenton 和Harber-weiss 反应产生·OH。同时过氧化氢酶还能对血红蛋白及其他含巯基蛋白质起到保护作用，使它们不被氧化。人们研究过氧化氢酶的历史可追溯到100 多年前，早在1811 年就已发现动植物组织可以分解过氧化氢产生氧气，到1892 年Jacobson 证明了在动植物组织内有专一分解过氧化氢的酶，即过氧化氢酶的存在。1901 年Loew 第一次报道了过氧化氢酶的生物化学特性。到1937 年，Sumner 和Dounce 首次从牛的肝脏中分离得到过氧化氢酶的结晶，这是最早分离得到的高纯度酶之一。随后相继报道了哺乳动物的肝脏、红细胞及大多数微生物体内均含有此酶，其中哺乳动物组织中过氧化氢酶的含量差异很大，肝脏中含量最高，

小鼠原代肝细胞培养

一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法 1材料与方法 1.1动物 2～4周龄BALB/C小鼠，雌雄不限（湖北省防疫站动物房提供）。 1.2试剂 D-hank's液；消化液Ⅰ：含1 g/L胰蛋白酶、10 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyroli done, PVP)及0.3 g/L EDTA(武汉中健公司提供)；消化液Ⅱ：含2 g/L胶原酶Ⅳ（上海华美生物工程公司提供）及10 g/L PVP；基础培养液为DMEM，另含青霉素100u/ml、链霉素100 μg/ml、50 mmol/L HEPES、30 g/L谷氨酰胺（武汉中健公司提供）；小牛血清（BS，GIBCO公司提供）；培养基内其他因子：胰岛素5 μg/ml 、转铁蛋白5 μg/ml (上海华美生物工程公司产品)、促甲状腺素释放因子10－6 mol/L（Sigma公司产品）、促肝细胞生长因子20 μg/ml、氢化可的松10－6 mol/L（广东阳江制药厂产品）。 1.3鼠肝组织块培养 1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分； 3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清， 4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育12 min，再用培养液洗3次以清除胰酶。5）将消化好的肝组织块贴于25cm2培养瓶中，加少许含100 ml/L BS培养液置37℃、5% CO2条件下2～3h后再补充6 ml含100 m l/L BS培养液。待细胞长出生长晕后改为50 ml/L BS培养液。 1.4鼠肝细胞单层培养动物和肝组织处理同上，加入消化液Ⅱ，置4℃过夜消化，去除消化液加含100 ml/L BS培养液，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，经200目尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，4 ℃50 g离心4 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>80%,按5×105/ml密度接种，于37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁生长后改为50ml/L BS培养液。或者： 1）断头处死动物，置于75%酒精浸泡2-3分钟，无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。2）肝组织用4℃D-hank's液（PBS）或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分； 3）将肝组织切为约1mm3小块，再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800r/min离心4 min，弃上清， 4）加入消化液Ⅰ（5-6倍体积），37℃孵育20 min，每隔5min振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离； 5）加入3-5mL含血清培养液以终止胰酶消化作用； 6）用100目筛网过滤，除去未消化的大组织块； 7）再次离心5min，弃上清； 8）加入无血清培养液5mL，冲散细胞，再离心一次，弃上清； 9）加入含血清培养液1-2mL（视细胞数量），血球计数板计数； 10）将细胞调整到5*105/mL左右，转移至6孔培养板中，37℃、5% CO2条件下培养。

小鼠肝脏取材步骤

小鼠肝脏组织取材步骤小鼠肝脏组织取材步骤，并列出完成此次实验所需要的试剂、仪器、材料等相关物品及实验人员安排情况。材料：小鼠试剂：DMEM 戊巴比妥钠 75%酒精 PBS 器械消毒液戊二醛仪器：解剖台备皮刀弯盘组织剪眼科剪手术刀柄刀片血管钳眼科镊培养皿无菌手套实验人员安排：小鼠养殖管理组准备工作组实验操作组实验步骤: 1. 取材前夜禁食，自由饮水。 2. 小鼠称重，按照50mg/kg的比例用5ml的注射器配合针头抽取戊巴比妥钠备用。 3. 正左手的小指和无名指抓住大鼠的尾巴，另外三个手指抓住大鼠的颈部，使大鼠头部向向下。这样腹腔中的器官就会自然倒向胸部，防止注射器刺入时损伤大肠、小肠等器官。右手持注射器，从腹部近腿根处刺入后再腹部皮下穿行深入，动作轻柔，缓慢注射。注射完药物后，缓缓拔出针头，手指按住针口对小鼠腹部轻柔按摩，促进麻醉药物的吸收，掐小鼠尾部检测小鼠麻醉程度。 4.将小鼠四肢固定于解剖台上，暴露小鼠整个胸部和腹部，修剪去腹部毛发，75%酒精消毒。 5.沿腹侧正中线自阴茎上源由下而上剪开腹部皮肤直至剑突，向两侧钝性剥开皮肤与皮下组织，暴露腹壁浅肌层。沿白线钝性分离腹壁肌肉，剪开腹膜，暴露腹腔，将肝脏向上翻起，显露肝门，眼科剪剪除肝脏周围结缔组织和血管。 6.结扎剪断肝门管道系统，钝锐结合完整取出大鼠肝脏，放置于无菌培养皿，生理盐水冲洗，称重并记录。①切取肝左叶约1mm×1mm×1mm组织3块，3-戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/LP pH 7.4)或4-戊二醛固定；②左叶肝组织浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定；③右叶肝组织称重记录分装后全部放置于无菌冻存管液氮冰冻保存备用。 7.切取肝左叶约1mm×1mm×1mm组织3块，3-戊二醛磷酸盐缓冲液(PBS0.01mol/LP pH7.4)或4-戊二醛固定；左叶肝组织浸入多聚甲醛或福尔马林液中固定；右叶肝组织称重记录分装后全部放置于无菌冻存管液氮冰冻保存备用。

原代细胞培养：原代肝细胞

【嘉美生物】肝是生物转化和蛋白质合成的主要器官，也是药物毒性作用发挥的主要场所。因此许多的体外测试都选用肝细胞来研究药物间的相互作用和其他一些生化过程。嘉美生物用于培养原代细胞的组织采集于各大医院（包括协和医院、301医院、北三医院等），采集根据美国IRB 和HIPAA批准的方案进行。这些原代细胞均来自新鲜组织，并采用公司专利的技术来优化目的细胞生长条件，降低杂细胞（如脂肪细胞、纤维细胞等）的污染。分离的细胞经过短暂培养、传代，然后迅速冻存。这些保持分化状态的细胞可以用于评估体外药物模型系统和调节特定基因的遗传功能。嘉美生物原代肝细胞产品均经过严格的QA/QC检测，可以直接用于药物优化和筛选、基因克隆、表达图谱分析以及各种分子生物学和药物学实验的研究。凭借着先进的技术设备和资深的专业经验，嘉美生物能为您提供高品质的原代细胞产品和特殊的定制服务： 1、各种新鲜原代肝细胞嘉美生物除提供多种人、小鼠、大鼠、猴等新鲜肝细胞产品外，嘉美生物还可以为您提供特定动物、特定组织、特定年龄的新鲜肝细胞定制服务。 2、各种原代细胞提取物嘉美生物除提供的人、小鼠、大鼠、猴等四大类的肝微粒体、肝S9、CYP450酶和其他亚细胞提取物外，嘉美生物还可以为您提供专业的原代细胞提取物定制服务。嘉美生物可以同时提供高质量的原代细胞产品和专业的个性化定制服务，为您的研究提供最新鲜优质的实验材料，提供其他原代细胞相关专业服务（原代肝细胞靶药分析服务、原代细胞靶药优化服务和原代细胞药物筛选等）。嘉美生物能完美整合各类原代细胞类服务，是原代细胞分离，原代细胞提供，原代细胞实验课题服务中的佼佼者。

细胞生物学实验六小鼠肝细胞线粒体的超活染色山东大学实验报告

细胞生物学实验六小鼠肝细胞线粒体的超活染色 13生物基地 201300140059 刘洋 2015-05-11 同组者：吕赞孙佳孟何娟一、实验目的 1．掌握线粒体的超活染色原理及方法。 2．观察动物肝细胞内线粒体的形态、数量与分布。二、实验原理线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿B（Janus green B）是线粒体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶系使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。不同细胞中线粒体的形态和数目不同。在电子显微镜下，线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。线粒体的细胞色素氧化酶能使詹纳新绿染料始终保持在氧化状态而呈蓝色，周围细胞内的染料却被还原成无色的色基，在进行细胞的体外染色时，至少要使材料在詹纳斯绿染料中染色15min后再盖上盖玻片，以使材料充分氧化。活体染色是指用燃料标记生活有机体的细胞或组织但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示活细胞内的某些结构，同时即不影响细胞的生命活动也不会产生任何物理、化学变化导致细胞的死亡。活染技术可用来研宄生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。活体染色之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学”特性起作用。碱性燃料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子；而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们被此就发生了吸引作用。但不是任何染料都可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料配成稀的溶液来使用。一般以碱性染料最为常用，因为碱性染料具有溶解在类脂质的特性，易于被细胞吸收，如中性红、詹钠斯绿、次甲基蓝、甲苯胺蓝、亮焦油紫等。其中詹钠斯绿和中性红两种碱性染料是活体染色剂中最常用的染料，分别对线粒体和液泡系有特异性的染色。詹纳斯绿B这种碱性染料是活体染色中重要的材料，对线粒体的染色有专一性，可专一性地对线粒体进行活染，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原成无色的色基。三、实验器材 1.器材：小白鼠，解剖盘，镊子，剪刀，载玻片，盖玻片，滴管，双凹片，小烧杯，显微镜； 2.试剂： 1/500詹纳绿B染液；Ringer试剂

小鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察实验报告

细胞生物学实验报告题目：小鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察姓名：刘恋学号：201000140049 系年级：10级生科2班一、【实验目的】 1．掌握线粒体的超活染色原理及方法。 2．观察动物肝细胞内线粒体的形态、数量与分布。二、【实验原理】 1．线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿B（Janus green B）是线粒体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶系使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。不同细胞中线粒体的形态和数目不同。在电子显微镜下，线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。线粒体的细胞色素氧化酶能使詹纳新绿染料始终保持在氧化状态而呈蓝色，周围细胞内的染料却被还原成无色的色基，在进行细胞的体外染色时，至少要使材料在詹纳斯绿染料中染色15min后再盖上盖玻片，以使材料充分氧化。 2．活体染色是指用燃料标记生活有机体的细胞或组织但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示活细胞内的某些结构，同时即不影响细胞的生命活动也不会产生任何物理、化学变化导致细胞的死亡。活染技术可用来研宄生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。活体染色之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学”特性起作用。碱性燃料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子；而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们被此就发生了吸引作用。但不是任何染料都可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料配成稀的溶液来使用。一般以碱性染料最为常用，因为碱性染料具有溶解在类脂质的特性，易于被细胞吸收，如中性红、詹钠斯绿、次甲基蓝、甲苯胺蓝、亮焦油紫等。其中詹钠斯绿和中性红两种碱性染料是活体染色剂中最常用的染料，分别对线粒体和液泡系有特异性的染色。詹纳斯绿B这种碱性染料是活体染色中重要的材料，对线粒体的染色有专一性，可专一性地对线粒体进行活染，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原成无色的色基。

原代肝细胞培养

原代肝细胞培养原代肝细胞培养 1．实验材料灌流液：NaCl、KCl、NaH2PO4.2H2O、Na2HPO4.H2O、NaHCO3、HEPES、EDTA、Glucose （国药或阿拉丁）。消化液：Collagenase IV（Yeasen，翊圣生物，产品货号：40510ES60，100 mg ，279￥）、CaCl2。 Percoll：Percoll（GE Healthcare，17-0891-02）我买的是分装的100ml，450￥的17-0891-01-1。麻醉剂：10%水合氯醛。实验器材：200目细胞筛、20ml 注射器、头皮针、手术剪3把、手术镊3把（实验前灭菌），细胞培养皿2个，离心机，实验前备冰盒及水浴锅，鼠板及大头针（实验前酒精及紫外消毒）。 2. 实验前准备 1) 灌流液 Perfusion Solution NaCl KCl NaH2PO4.2H2O Na2HPO4.H2O NaHCO3 HEPES EDTA Glucose 离子）。用前37℃温育。每只老鼠消耗15ml灌流液。 2）消化液 100× CaCl2：560mg CaCl2，加入10 ml PBS/ ddH2O，分装-20℃保存。10× CollagenaseIV：100 mgCollagenaseIV粉末溶于20 mlDMEM（无血清），0.22 uM滤膜过滤除菌，每管1.5ml分装。消化液：13.5 mlDMEM（无血清）加入150 μl100× CaCl2（终浓度5 mM），再加入1.5 ml10× CollagenaseIV（终浓度0.5 mg/ml），于37℃温育。每只老鼠消耗15ml消化液。 3）40%Percoll g/L 8.0 0.4 0.078 0.151 0.35 2.380 0.19 0.9 调节pH 7.2-7.4，配好后过滤除菌。（不能高压灭菌，其中含葡萄糖及HCO3- 16.2 ml 100%percoll原液，加入1.8 ml10×PBS，再加入27ml 1×PBS，得45 ml。（等渗溶液）每只老鼠消耗5-6 ml40%Percoll。

实验一小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定

实验一小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定实验方案：（一）组织匀浆法制备过氧化氢酶粗提液一、实验目的：掌握组织匀浆法和低温离心机的使用二、实验原理： 1、在肝内过氧化氢被过氧化氢酶水解为水和氧 2、组织匀浆法: 机械切碎，破碎细胞匀浆缓冲液:pH4.0醋酸缓冲液（水溶性物质），23.5%乙醇（脂溶性物质） 3、氯仿; Pr沉淀剂，CA T由于对氯仿的沉淀性大而不沉淀 4、离心：离心机分离固液三、实验步骤： 1、颈椎脱臼法处死6只小鼠，去肝脏，用滤纸洗干净血液后，每组称重6g 2、加入肝重8.5倍体积的预冷匀浆缓冲液（0.05mol/L pH4.0醋酸缓冲液，23.5%乙醇）, 组织捣碎机匀浆3-5min 3、慢慢滴加肝重0.5倍体积的氯仿（边加边搅拌），再次匀浆1min 4、匀浆夜离心，4℃6000rpm，30min后，弃沉淀，获上清液 5、【留样】取匀浆上清液60ul，加入20ul4×电泳上样Buffer，沸水浴3-5min，备SDS-PAGE 检测，-20℃冰箱保存。另取60ul匀浆后的上清液-20℃冰箱保存，用于酶活的测定和蛋白定量。（二）盐析与透析法初步纯化过氧化氢酶

一、实验目的：掌握盐析与透析法的方法与原理二、实验原理： 1、在Pr溶液中加入中性盐使Pr沉淀析出过程 2、盐酸沉淀原理：中性盐破除水化膜、中和表面电荷，Pr溶解度降低而沉淀析出 3、透析:利用具有一定孔径的高分子物质不能透过的半透膜，分离生物大分子和小分子的一种分离纯化技术三、实验步骤： 1、向肝匀浆上清液中缓慢滴加0.06倍体积的0.5M Na2SO4溶液，继续冰冰浴搅拌状态下浴搅拌1h； 2、将盐析溶液离心（4℃，6000rpm，10min）后弃上清液，保留沉淀； 3、用肝重4倍体积的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.8）溶解沉淀（用手动玻璃匀浆器助溶）10min，离心10（4℃4000rpm，10min）后，弃去沉淀，保留沉淀； 4、留样：取盐析后上清液样品60ul，用20ul4*电泳Buffer制样，备用于SDS-PGE检测，-20℃冰箱保存。 5、将透析袋（截流量10-20KD，直径2公分）置于沸水中煮5min，清洗晾凉后备用。 6、将上清液放入透析袋，（截流量10-20KD，直径2公分）内，置于透析液（20%乙醇，0.1mol/L，pH4.7醋酸缓冲液，0.1mol/LNaCl溶液）中透析一周，中途更换一次透析液； 7、一周后，取出透析袋内混浊溶液，离心（4℃6000rpm，10min）后，弃上清，收集沉淀； 8、用2ml~3ml的磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH4.8）溶解沉淀15min（用手动玻璃匀浆器助溶），离心（4℃4000rpm，10min）后，弃去沉淀，收获上清液。（测OD280，若蛋白浓度小于1mg/ml） 9、留样：取透析后上清样品60ul，用20ul4*电泳Buffer制样，备用于SDS-PGE检测， -20℃冰箱保存。 10. 将透析袋置于沸水中煮沸15min，清洗晾凉后备用 11 .将收获的样品液放入处理后的透析袋中，置于50%的甘油中包埋浓缩两个小时将样品浓缩至400-500ul收样，放置4℃ （三）凝胶层析法进一步纯化过氧化氢酶一、实验目的：二、实验原理：三、实验步骤： 1、凝胶的处理：每组取2.5g sepadexG-200葡聚糖凝胶干粉，浸泡与蒸馏水充分膨胀倾斜法除去表面的悬浮小颗粒，替换等体积磷酸缓冲液（0.1mol／L,pH7.8），继续浸泡一天 2、装柱：取层析柱一支，将层析柱出口接上乳胶管，在柱底部填上一层海绵垫。将层析柱将垂直夹与铁架上，将层析柱下端额止水架夹紧，向柱中加入约5-7cm高的缓冲液，用细玻璃棒将凝胶颗粒搅成悬液，顺玻璃棒缓缓倒入层析柱。当凝集颗粒沉积约2cm高时，开启止水夹子使缓冲液缓缓流出，同时继续倒入凝胶悬液，掌握倒入速度，使其与缓冲液流出速度大体相同，直至凝胶床高达35cm时为止。关闭止水夹子，要求凝胶床要均匀，中间要连续，不得有气泡，表面要平整。 3、平衡：打开层析柱口，控制流速为0.3-0.5mL／min（约5-10滴／min），用磷酸缓冲液（0.1mol／L,pH7.8）流洗平衡20min。凝胶管柱上端平衡液应始终不少于10cm 的

最新小鼠肝脏过氧化氢酶的制备与测定

小鼠肝脏过氧化物酶制备与测定

小白鼠肝细胞线粒体的超活染色及观察 实验报告

肝切片的实验报告

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取小鼠脑组织

原代小鼠肝细胞制备