结缔组织多色染色法
第一节结缔组织多色染色法
一、Mallory三色染色法
1. 试剂配制
（1）重铬酸钾液重铬酸钾2.5g，醋酸5ml，蒸馏水95ml
（2）苯胺蓝桔黄G液苯胺蓝0.5g，桔黄G2g，磷钨酸1g，蒸馏水100ml
（3）酸性复红液酸性复红0.5g，蒸馏水100ml
2.染色步骤
（1）中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。
（2）重铬酸钾液10min。
（3）蒸馏水冲洗2min，蒸馏水2次。
（4）酸性复红液2min，蒸馏稍洗。
（5）苯胺蓝液20min，95%乙醇快速分化。
（6）直接用无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
3.结果
胶原和网状纤维呈蓝色，软骨、粘液、淀粉样变物质呈淡蓝色，神经胶质纤维、肌纤维和酸性颗粒呈红色，髓鞘和红色呈桔红色。
4.注意事项
（1）酸性复红液易溶解于水，肉眼观察切片上保留一定的红色。
（2）苯胺蓝液染色后，用95%乙醇分化时，须用显微镜观察掌握。
（3）对陈旧的固定标本，其染色效果较差，可增加染色时间。
（4）另张切片，可同时作胶原纤维对照染色而进行鉴别组织成分。
二、Masson三色染色法
1.试剂配制
（1）Masson复合染色液酸性复红1g，丽春红2g，桔黄G2g，0.25%醋酸300ml。
（2）亮绿染色液高绿SF0.1g，0.2%醋酸100ml。
2.染色步骤
中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。
（1）Masson复合染色液5min。
（2）0.2%醋酸水溶液稍洗。
（3）5%磷钨酸5-10min。
（4）0.2%醋酸水溶液浸洗2次。
（5）亮绿染色液5min，0.2%醋酸水洗2次。
（6）无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
3.结果
胶原纤维呈绿色，肌纤维呈红色，红细胞呈桔红色。
4.注意事项
（1）Masson复合染色液，经磷钨酸分化时须用显微镜控制肌纤维清晰为止。
（2）亮绿染料可用苯胺蓝替换，可用来作为对比观察染色的效果。
三、显示胶原纤维、网状纤维和弹力纤维的三联染色法（1993年）
1.试剂配制
（1）高锰酸钾硫酸液0.5%高锰酸钾水溶液中加入5ml的硫酸。
（2）维多利亚蓝染色液维多利亚蓝2g，糊精0.5g，间苯二酚4g，蒸馏水200ml。将上述物质混合后加热煮沸，边煮边搅拌，约5min。然后用另一容器取30%三氯化铁水溶液25ml，另行加热煮沸后慢慢倒入上述混合液中继续煮沸3min，不断搅拌溶液呈胶体状。去火冷却过滤，将滤纸上的残渣连同滤纸放在60℃
恒温箱中烤干。残渣呈深蓝色细颗粒状粉末，再溶于400ml的70%乙醇液中。然后加浓盐酸4ml和苯酚5g放置至成熟后使用。
（3）丽春红染色S染色液0.5%丽春红S水溶液15ml，苦味酸饱和水溶液85ml。
（4）Gomori氨性银改良液取5%硝酸银水溶液5ml，滴加浓氨水由棕黑色变清为止，再加入3%氢氧化钠水溶液5ml，此时该液突变紫黑色，这时再加入氨水使之变清晰为止。最后用蒸馏水补足至50ml，盛棕色试剂瓶中，置于冰箱中备用较长时间。
2.染色步骤
（1）中性甲醛液固定组织，石蜡切片，常规脱蜡至水。
（2）高锰酸钾硫酸液氧化3min后，自来水浸洗后，用2%草酸漂白2min。
（3）5%硫酸铁铵1min。
（4）Gomori氨性银改良液染1min。
（5）蒸馏水洗2次，用15%甲醛液还原1min。
（6）蒸馏水洗2次，0.2%氯化金30s，蒸馏水洗1次。
（7）70%乙醇浸一次，再浸入维多利亚蓝液中染30min-1h。
（8）95%乙醇分化1min左右。
（9）浸入蒸馏水中1min后，用丽春红S染色液染色2min。
（10）直接用无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
3.结果
胶原纤维呈红色，网状纤维呈黑色，弹力纤维呈绿色，肌肉和红细胞呈淡黄色。
4.注意事项
氨性银液滴染时，要用干净吸管，防止银液污染而发生沉淀。氨性银液作用后的切片不能倾倒，应将蒸馏水冲洗切片上的银液，这样就不会使银液表面挥发的银颗粒而沉积在组织上。
第二节胶原纤维
一、胶原纤维的分布和组成成分
胶原纤维是结缔组织中的三种纤维之一，分布最为广泛，含量最多。主要分布于真皮、键、韧带、骨、透明软骨、动脉、肠壁、子宫和基底膜等，胶麻纤维具有韧性大，抗拉力强的特点。在弱酸或沸水中可慢慢溶化成胶水，称白明胶。胶原纤维和网状纤维的基本构造相似，都以胶原单位(蛋白质为主的大分子)为基本单位。胶原单位接连和融合形成网状纤维;它是粗约1μm左右的分支状纤维，形成全身组织的支架，在HE染色中看不清楚。但其外面裹着的一层类蛋白，凭借镀银法可以清楚地显示出来，故又称为嗜银纤维。胶原纤维单位主要由纤维母细胞合成。其他如平滑肌细胞等也能产生。胶原单位的形成开始于细胞的粗面内质网，合成比构成胶原单位的α肽链更长的前α肽链，经高尔基体分泌出细胞，在细胞外液的内切肽酶作用下，切去前α肽链的附加肽段而形成胶原单位；再经细胞外液的赖氨酰氧化酶作用使两条肽链通过醛醇或醛胺缩合构成共价交联。这样胶原单位分子之间就形成了稳定的联系，形成胶原微纤维，然后再聚合而成胶原纤维。
二、胶原纤维染色的应用
胶原纤维染色在病理诊断上主要用于鉴定梭形、纤维形细胞肿瘤的组织来源：常常要在纤维、平滑肌和神经三者之中作出选择。还能使用于其他的情况下，如观察动脉硬化的心脏，在HE切片中，心肌内散在的小疤痕灶和心肌均被染作红色，而作胶原纤维染色可将胶原组织和心肌组织明显地区分开来。早期肝硬化用胶原纤维染色，也可使小叶之间少量增生的胶原纤维突出地显示出来。由干胶原纤维是由成纤维细胞产生的一种纤维蛋白成分，常常被酸性染料染色。
l. Van Gieson苦味酸酸性复红法(1889年)
[试剂配制]
(l) Van Gieson液l%酸性品红水溶液10ml，苦味酸饱和水溶液(约l.22%)90ml。
(2)Weigert铁苏木素溶液甲液：苏木素lg,95%或无水乙醇100ml；乙液：29%三氯化铁水溶液4ml，蒸
馏水95ml，盐酸l ml。
临用时取甲液和乙液等量混合即可。铁苏木素不能像明矾苏木素一样配制后放置，因铁与染色剂的色素可引起化合而形成不溶性沉淀。所以，以铁作为媒染液时，必须与染液分别配制、分别应用或临时混合应用。[染色方法]
(1)组织固定于10%甲醛液，常规脱水包埋。
(2)组织切片脱蜡至水。
(3)用Weigert苏木素液染5~l0min。
(4)自来水冲洗数分钟。
(5)根据染色的深浅可用0.5%盐酸乙醇分化。
自来水洗至变蓝；用蒸馏水洗。
(7)用Van Gieson液染1~5min。
倾去染液，直接用95%乙醇分化和脱水。
(9)无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
[结果] 胶原纤维呈红色，肌纤维、胞质及红细胞黄色，胞核呈黑色。
[注意事项]
(1)目前以苦味酸、复红的Van Gieson染液直接染此一种溶液即可。
(2)Weigert铁苏木素分甲、乙两液，应于临用前将两液等量混合使用，而不宜预先混合，否则易氧化沉淀而逐渐失其染色能力。
(3) Van Gieson染色液分别在临用时混合，防止放置时间长，则酸性品红不易着色。
2. Siriured染色法
这种方法可使胶原纤维长期保存，是不易褪色的一种好方法。
[试剂配制]
(l)Siriusred 饱和苦味酸液0.5%Siriured l0ml，苦味酸饱和液90ml。
(2)天青石蓝液天青石蓝B1?25g，铁明矾1.25g，蒸馏水250m1。
溶解煮沸，待冷过滤后，加入甘油30m1，然后再加入浓盐酸5ml。
[染色方法]
(1)组织固定于10%甲醛液，常规脱水包埋。
(2)切片脱蜡至水。
(3)入天青石蓝液染5~10min，
(4)蒸馏水洗多次。
(5)Siriured饱和苦味酸液染15~30min。
无水乙醇直接分化与脱水。
(7)二甲苯透明，中性树胶封固。
[结果] 胶原纤维呈鲜红色，细胞核绿色，其他为黄色。
3. Lillie改良Van Gieson法(1965年)
[试剂配制]
A. 用1%醋酸配成0.1%快绿FCF 液，或为得到较蓝的绿色用3%毛绿S(Wool greenS )。
B. 且0.2%酸性复红，0.2%紫胺(Violamine)或用0.1%~0.5%丽春红S(ponceau S) 溶于饱和的苦味酸水溶液。
[染色方法]
(1)按常规将切片脱蜡至水。
(2)用Harris明矾苏木素液染3min。
(3)自来水洗，盐酸乙醇分化数秒钟。
(4)自来水洗至显蓝，蒸馏水洗。
(5)在A溶液中染4min。
在1%醋酸中洗2次。
(7)在B溶液中染l0~l5min。
在1%醋酸中洗2min。
(9)无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
[结果] 结缔组织红色，肌肉、胞质灰绿色，红细胞绿色，核蓝黑色。
4. Clark改良Van Gieson台盼蓝法(1971年)
用于胶原纤维、包括非常细的纤维，以及肌肉角化上皮的染色。
[固定] 甲醛固定液。
[试剂配制]
(l)A液0.3g萘酚黄S（naphthol yellow S）溶窜犯100mI蒸馏水。
(2)B液0.2g酸性复红溶于100ml蒸馏水中。
(3)C液0.2g台盼蓝溶于100ml 蒸馏水中。
染色液由40份A溶液，2.5份B溶液和2份C溶液组成。每40分A溶液加入，0.4ml浓盐酸。[染色方法]
(1)石蜡切片，脱蜡至水
(2)在Weigert铁苏木素中5ml。
(3)自来水洗。
(4)在染色液中染l0min。
(5)在水中迅速洗一下即经过50%、70%与95%乙醇，无水乙醇两次。
二甲苯透明，中性树胶封固。
[结果] 核-蓝黑色；胞质-黄色，胶原纤维-粗纤维红色，细纤维蓝色。
[说明] 本法中的Weigert铁苏素液染色，可改用棓花青-铬矾溶液中染16 h。
5 . Biebric猩红染色法Lillie，1965年
[显示目的] 胶原纤维、网状纤维、肌肉、胞质。
[固定] 甲醛液，Orth液。
[试剂配制]
(l)A液Weigert铁苏木精，见苦味酸酸性复红法。
(2)B液0.2gBiebrich猩红溶于100ml1%醋酸。
(3)C液0.1g苯胺蓝溶示100ml饱和苦味酸水溶液。
[染色方法]
(1)常规脱蜡至水。
(2)在A溶液中染5min。
(3)自来水冲洗。
(4)在B染液中染4min。
(5)自来水洗。
在C染液中染5min。
(7)直接移入1%醋酸中3min。
无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
[结果] 结缔组织蓝色，肾小球基质蓝色，网状纤维蓝色，红细胞橙红至猩红色，肌肉粉红色，胞质粉红色至灰色，核黑蓝色，粘液浅蓝色。
6. 苦味酸氨基黑染色法L i1lie，1965年
[显示目的] 胶原纤维、网状纤维、基膜、肾小球基质。
[固定] 任何固定剂均可。
[试剂配制]
(l)A液煌紫素R(Brilliant purpurin R)0.6g；偶氮复红G(azo-fuchsin G)0.4g；冰醋酸1ml，蒸馏水加至100m1，上述两种染料先各自用1%醋酸配成1%溶液，以6﹕4比例混合后再用。
(2)B液氨基黑10B，5~100mg；苦味酸饱和水溶液100m1。同样浓度的苯胺蓝或甲基蓝均可用来代替氨基黑(又称蔡酚蓝黑)，粘液可得到较好的显示。
[染色方法]
(1)切片常规脱蜡至水。
(2)在Weigert铁苏素中染6min。
(3)自来水洗。
(4)在A染液中染5min。
(5)流水中洗。
在B染液中染1~5min。
(7)在1%醋酸中分色2min。
无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
[结果] 胶原纤维、网状纤维和基膜深绿色；粘液深绿色，上皮细胞胞质棕色，肌肉浅绿色，红细胞红色。
7. Petersen 酸性茜蓝改良法
[显示目的] 胶原与网状组织、骨铬肌、心肌横纹、心肌间板。
[固定] Zenker液，Helly液、Bouin液或甲醛液。
[试剂配制]
(1)A液即缓冲的酸性茜蓝溶液。酸性茜蓝2B，0.25g；硫酸铝5g；蒸馏水50m1。煮沸5min。冷却，过滤，再补足到原来的体积。然后加20ml的Sorensen柠檬酸盐溶液(柠檬酸晶体21g，lN NaOH，200m1。加蒸馏水至1000ml)和30ml 0.lN盐酸缓冲到pH为2.25。
(2)B液即苯胺蓝橘黄G溶液。苯胺蓝0.5g; 橘黄G，2g；蒸馏水100ml，冰醋酸8ml，煮沸，冷却，过滤。
[染色方法]
(1)常规石蜡切片，脱蜡至水。
(2)在A液中染3min。
(3)在蒸馏水中快速洗2次。
(4)在5%磷钨酸液中分色并媒染2~3min。
(5)蒸馏水洗。
在未经稀释的B液中染2~3min。如染色结果太深，可用1、2或3倍体积的蒸馏水稀释。
(7)蒸馏水中略洗。
先用95%乙醇后用无水乙醇脱水。
(9)二甲苯透明，中性树胶封固。
[结果] 胶原与网状结缔组织蓝色，染色质砖红色，肌组织根据所用不同品种的固定剂染色从深品红色至亮橙色，红细胞橙红色，粘液淡蓝色，神经节细胞淡品红色，腺细饱根据其组成从浅蓝色至品红色。
8. 显示胶原纤维、细胞和肌肉的新染法
[固定]中性甲醛液，石蜡切片。
[试剂配制]
(1)Ponceau's染色液0.5%Pohceau's(丽春红S，上海试剂三厂)水溶液l0~15ml，苦味酸饱和水溶液85~90ml。
(2)Victoria blue'B 染色液Victoria blue'B(维多利亚蓝，B，上海试剂三厂) 0.5 g，70%乙醇100m1。[染色方法]
(1)组织切片脱蜡至水。
(2)70%乙醇稍洗后，入Victoria blue'B染色液中l5min。
(3)95%乙醇中分化数秒钟。
(4)用蒸馏水洗2次。
(5)用Ponceau's染色液滴染2min。
直接用无水乙醇分化与脱水。
(7)二甲苯透明，中性树胶封固。
[结果]胶原纤维呈鲜红色，细胞核和血细胞呈绿色，肌肉呈黄色。
。
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作者: appo 发布日期: 2005-12-12
第三节网状纤维
网状纤维是网状结缔组织内的一种纤维。它由网状细胞所产生。网状细胞是一种星状多突的细胞，核大，着色较浅，核仁明显，胞质较丰富，胞突彼此连接形成细胞网架。网状纤维纤细而有分支，穿行于细胞体和突之间，共同构成网状支架。这种纤维用HE染色一般不易辨识。若用银氨溶液浸染能使纤维变成黑色，如又称为嗜银纤维。
网状纤维纤细，直径约0.2-1um，没有弹性，而有韧性，能抵抗胃液的消化和弱酸的腐蚀。
一、网状纤维染色的应用
1.用于显示和鉴别肿瘤的性质和来源
（1）显示和区分癌和肉瘤
（2）显示和区分血管内皮瘤与血管外皮瘤
（3）用以鉴别淋巴细胞肉瘤与网状细胞肉瘤
（4）区分骨尤文氏肉瘤与骨网状细胞肉瘤
（5）显示与鉴别骨异质增生与骨化性纤维瘤
（6）区分软骨粘液纤维瘤与粘液肉瘤
（7）鉴别脑膜瘤与星形细胞瘤
2.用于某些肿瘤的诊断
（1）平滑肌肉瘤
（2）纤维肉瘤
（3）滑膜肉瘤
（4）恶性神经鞘瘤
3.用于观察和研究癌组织的发生、发展及其恶性程度。
4.显示与观察基底膜的变化。
5.用于识别坏死组织的结构及类型
（1）凝固性坏死
（2）肺结核干酪样坏死
6.用于显示和研究肝组织病变。
二、网状纤维染色的原理
1. 氧化
2. 感应
3. 浸银
4. 还原
三、网状纤维染色方法
1.Wider染色法
（1）固定甲醛液或其他固定液
（2）试剂配制氧化银溶液：40%氢氧化钠1滴半
10%硝酸银2.5ml
取40%氢氧化钠滴入10%硝酸银溶液中立即产生棕褐色沉淀，逐次滴入28%氨水恰好溶化沉淀（一般3滴为宜），用蒸馏水补足20ml。
（3）染色次序
1）组织切片脱蜡至水。
2）10%磷钼酸，2-5min。
3）蒸馏水冲洗，5min。
4）1%硝酸铀，5s。
5）蒸馏水冲洗，10s。
6）氧化银溶液，5-10min。
7）95%酒精速洗，1-2s。
8）还原液还原，1-2s。
9）蒸馏水冲洗，2min。
10）0.2%氯化金调色，2-20s。
11）蒸馏水冲洗，5min。
12）5%次亚硫酸钠，2min。
13）蒸馏水冲洗，2min。
14）核固红染细胞核，5-10min。
15）水稍洗。
16）常规无水乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。
（4）染色结果
网状纤维呈黑色、细胞核呈红色。
第四节弹力纤维
一、弹力纤维的形态特点和组成成分
弹力纤维由糖蛋白构成，富含亲水性的极性氨基酸。弹性蛋白提供弹力纤维的弹性，它是一种不溶性蛋白质，当用弱碱处理纤维结缔组织时，其仍然存在。三分之一为甘氨酸，11% 为脯氨酸。与胶原纤维不同处为其氨基酸组成中约95%属于非极性疏水氨基酸，锁链赖氨酸(Desmosine)和异锁链赖氨素(lsodesmosine)是弹性蛋白所特有，它们起着共价交联的作用。
近年来，电镜下看到组织培养的平滑肌细胞可以合成弹力纤维的两种成分。在没有平滑肌细胞存在时，可
能由纤维母细胞形成。弹力纤维广泛分布于身体各处，特别是在皮肤、血管、壁、韧带、气管、支气管、肺泡、耳廓和腺体的导管处等最为丰富。弹力纤维由两种成分组成，即集合束的弹力微纤维(由糖蛋白形成)和均质状的弹力蛋白。
弹力纤维在常规染色中难以区别于其他纤维，只有用特殊染色方法，才能清晰地显示出来。近来学者研究认为，弹力纤维系统是由弹力纤维、前弹力纤维和耐酸纤维等三种纤维构成，这三种纤维的分布、走行和组织化学均不相同。耐酸纤维用一般的弹力纤维染色法其着色很淡，前弹力纤维着色也不够深，但如经强氧化后醛品红或间苯二酚品红法则可把弹力纤维系统中的三种纤维同时显示出来。
二、弹力纤维染色的应用
(一)显示皮肤组织中弹刀纤维的变化在皮肤组织病变中，特别是真皮内的弹力纤维，时常发生改变，出现增生、卷曲、变性、崩解等，做弹力纤维形成聚集成堆的束状、团块状及不规则状。见于以下病变①弹力纤维病；②弹力纤维增多症；③弹力过度性皮肤；④皮肤疏松；⑤皮肤环状肉芽肿；⑥肢端角化的弹力纤维变性；⑦硬皮病。
(二)显示与判定心血管疾病弹力纤维是心脏和血管的主要成公之一。
(1)显示及鉴别心内膜弹力纤维增生症与心内膜心肌纤维化。这两种病变时心内膜中的弹力纤维和胶原纤维会出现异常增多，在HE-染色中两者的病理变化甚为相似。因此，需要特殊染色加以显示与鉴别。
(2)显示动脉粥样硬化时硬化斑块底部的内弹力板崩解，断裂乃至消失情况。
(3)显示与观察梅毒性主动脉炎时动脉中层弹力纤维发生灶性破坏的程度。
(4)显示高血压时小动脉弹力纤维显著增生以及形成多层的病变特点。
(5)用于无脉症，显示在大动脉血管申层弹力纤维密集排列，弹力层增厚。
显示老年人动脉变性：动脉的弹力板变性、增厚、断裂、崩解等现象。
（三）视察某些病变中的弹刀纤维是否增生与破坏如慢性支气管炎、肺气肿、原发性或继发性肾固缩等，均可导致弹力纤维纵行。散乱、断裂、破坏和增生，形成碎片或颗粒。
(四)显示与鉴别肿瘤组织
(1)弹力纤维瘤在弹力纤维瘤体的纤维组织中，有许多球状或颗粒状变化的弹力纤维。在HE染色中容易忽略，但用弹力纤维染色，能清晰见到瘤体内丰富的弹力纤维球。
(2)乳腺癌见于导管和血管壁周围，这种现象多合并在硬癌和浸润性小叶癌上。如弹力纤维染色法证明在导管癌上，伴随出现弹力纤维增生，可证明是早期浸润癌。
三、各种染色方法
l、Verhoeff铁苏木素染色法媒染剂三氯化铁和碘配成的苏木素染色液，即Verhoeff铁碘苏木素对弹力纤维有染色力，但没有选择性，它既可染弹力纤维，也可染细胞核和胶原纤维等。通过“染料的分散度和组织的结构密度”以达到分辨不同组织的目的。如弹力纤维和细胞核的结构密度都是比较致密的，铁苏木素染液的粒子比较容易地分散到狭孔的弹力纤维或细胞核的间隙中，苏木素粒子在狭孔的弹力纤维中比较密集，所以染色也比较深；而分散到宽孔的胶原纤维间隙中较稀疏，所似染色也比较浅。
[固定] 105甲醛溶液或其他固定液。
[试剂配制] 铁碘苏木素液：先将苏本素1g，无水乙醇20ml，进行加温溶解后加入10%三氯化铁水溶液8m1，最后再加入Lugol碘液8ml即可（Lugol液：碘化钾2g，碘结晶lg，蒸馏水100ml）。
[染色方法]
(1)石蜡切片，脱蜡至水。
(2)铁碘苏木素液染15~30min，至颜色呈深黑色。自来水洗。
(3)2%三氯化铁水溶液分化10~20s，至弹力纤维清晰为止。如果分化过度，可再返回第2步重染铁碘苏木素液。
(4)充分水洗。
(5)用95%乙醇去碘2~Smin，使黑色纤维更为清晰。
水洗，VG复染5min。
(7)95%乙醇急速分化。
无水乙醇脱水，二甲苯透明，申性树胶封固。
[结果]弹力纤维黑色或黑蓝色，胞核黑色，校原纤维呈红色。
2、Weigert间苯二酚复红染色法三苯甲烷系碱性染料与雷锁辛和三氯化铁组成一种带有弱正电荷的染料，与结构致密的、富于内表面的弹性纤维通过非极性吸着而完成染色。非极性吸着，是染料不具有强电荷时和组织成分间的结合。就是说雷锁辛复红液对弹力纤维的染色。间苯二酚复红液实际上是由碱性品红的铁间苯二酚色淀（Lake)形成的一种复合物，这种复合物与弹力纤维结合，并使弹力纤维着色。其结合的原理不清楚，可能是弹力纤维某些部分与间苯二酚的基团形成氢键。
[固定] 10%甲醛液及其他固定液。
[试剂配制] 间苯二酚复红液：碱佳品红1g，间苯二酚2g，蒸馏水200m1，30%三氯化铁1.25ml，浓盐酸2ml。
取一个300ml烧杯，放入碱性品红、间苯二酚和蒸馏水，用玻璃棒搅拌，加热煮沸。再慢慢加入30%三氯化铁液，在搅拌下继续煮沸3~5min。冷却后过滤，倾去滤液。将滤纸和沉淀物一同放入烧杯内，置于干燥箱内烘干。取出后加入95%乙醇100ml，在水锅内加热，并不断搅拌至沉淀物完全溶解，取出滤纸，冷却后过滤。补足因蒸发失去的乙醇至100ml。最后加浓盐酸2ml，混合后即可使用。
[染色方法]
(1)石蜡切片，脱蜡至水。
(2)在95%乙醇液中浸2min。
(3)间苯二酚复红液染1~2h。
(4)用95%乙醇液洗去多余染液。如果染色较深可用0.2%盐酸乙醇分化。
(5)自来水冲洗2min。
用VanGieson液复染lmin。
(7)95%乙醇急速分化。
无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
[结果] 弹力纤维深蓝黑色，胶原纤维红色，背景黄色。
3、Hart改良间苯二酚复红染色法此法由Weigert法经过改良后发展而来。特点是将Weigert染液用1%盐酸乙醇溶液配制成稀释溶液，进行过夜染色，可显示出较细的弹力纤维。
[固定] 甲醛固定液和其他固定液。
[试剂配制]
(1)酸性高锰酸钾水溶液0.5%高锰钾水溶液50m1，3%硫酸水溶液2.5m1。此液分别配制，临用时按比例混合使用。
(2)Weigert稀释液Weigert原液l0ml，1%盐酸乙醇溶液90ml。此液可保留一定时间。
[染色方法]
(1)石蜡切片，脱蜡至水。
(2)酸性高锰酸钾水溶液氧化5min。
(3)自来水洗2~3min。
(4)用1%草酸水溶液漂白至无色。
(5)充分水洗2min。
用70%乙醇液略洗。
(7)直接用Weigert稀释液浸染过夜。
用1%盐酸乙醇分化数秒钟或直接入95%乙醇液中稍分化。
(9)充分水洗5~l0min。
(l0)用Van Gieson液、1%中性红或HE进行对比染色。
(11)95财乙醇及无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
[结果] 弹力纤维呈蓝黑色，其他组织呈复染的颜色。
4、Gomori醛复红染色法醛复红染色液是Gomori在Schiff试剂的使用和实验期间偶然发现的。醛复红是碱性品红加入三聚乙醛和盐酸配制而成，作为一种酸性催化剂，可使三聚乙醛逐渐解聚产生乙醛。乙醛有较高的活性，释出后与碱性品红染料外露的氨基起反应而产生偶氮甲碱，这时颜色转变为深紫色，是谓成熟，称为醛复红染液。这秧成熟的醛复红对特殊的蛋白质及含硫酸根的粘多糖具有很强的亲合力，和弹力纤维结合很紧。另外，对肥大细胞颗粒、脂褐素、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、胃主细胞、胰岛的?细胞和脑垂体的嗜碱细胞，也能很好着色。
[固定] 各种固定液，但以甲醛生理盐水液固定的染色效果最佳。
[试剂配制]
(1)醛复红染液碱性复红0.5g，浓盐酸1m1，70%乙醇100ml，三聚乙醛1m1。将碱性复红溶于70%乙醇，然后加入浓盐酸和三聚乙醛，轻轻摇动使混合均匀，于室温下静置1~2日，待变为紫色即为成熟。过滤于小口砂塞瓶，置冰箱内保存备用。
(2)橘黄G染色液橘黄G2g，蒸馏水100m1，磷钨酸5g。
[染色方法]
(1)切片脱蜡至水。
(2)用Lugol碘液处理5min。
(3)稍水洗。
(4)5%硫代硫酸钠液处理5min。
(5)流水冲洗5min。
70%乙醇稍洗。
(7)入醛复红液l0min。
70%乙醇浸洗2次，每次约30s，至切片不再脱色为止。
(9)稍水洗。
(10) 橘黄G液滴染约1s。
(11)蒸馏水洗1~2min。
(12)95%乙醇无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
[结果] 弹力纤维呈深紫色，其他为复染色。
[说明]还可用淡绿橘黄G液、Masson三色液、Van Gieson液等复染，但不宜过深。
5、Pinkus酸性地衣红-姬姆萨染色法
[固定] 10%甲醛液、Helly液或Zenker液均可。
[试剂配制]
(1)地衣红染色液地衣红1g，70%乙醇100m1，浓盐酸0.6m1。地衣红溶于乙醇内然后再加入浓盐酸。
(2)姬姆萨液取姬姆萨原液5滴，加蒸馏水100ml。
(3)伊红乙醇液伊红Y59，95%乙醇100m1，混合后不停搅拌。溶解后即可使用。
[染色方法]
(1)切片脱蜡至水。
(2)经70%乙醇漂洗。
(3)地衣红液染30~60min。
(4)95%乙醇分化，洗去多余染液。
(5)用1%盐酸乙醇处理2~5min，直至背景无色为止。需镜下控制。
流水冲洗5~l0min。
(7)姬姆萨稀释液浸染2h~过夜。
用95%乙醇分化，伊红乙醇液(95%乙醇中滴数滴)中染色，直到大量的蓝色从结缔组织中脱掉为止。
可在镜下控制。
(9)无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
[结果) 细胞核深蓝色，弹力纤维深棕到黑色，胶原纤维粉红到浅蓝色，黑色素呈绿色到棕色，嗜伊红颗粒呈红色至紫色，细胞核呈深蓝色。
6、Uana地衣红染色法
[固定] 甲醛液或其他固定液。
[试剂配制] Uana地衣红染色液：地衣红lg , 70%乙醇99ml，浓盐酸1m1。将地衣红溶于乙醇内，然后加入浓盐酸。放置冰箱中保存备用。
[染色方法]
(1)组织切片，脱蜡至水。
(2)在70%乙醇中2min。
(3)置Uana地衣染色液中15~30min(系温箱内所需时间，室温中浸染过夜)。
(4)70%乙醇液分化至无多余染液脱下为止。
(5)可用Van Gieson液复染。
95%乙醇、无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
[结果] 弹力纤维呈棕红色至暗棕色，其他组织呈复染的颜色。
7、Gomori改良醛复红-阿尔辛篮染色法
[固定] 各种固定液，但以乙醇或Bouin固定液固定效果最佳。
[试剂配制] 醛复红-阿尔辛蓝染液：盐基性复红0.5g，阿尔辛蓝0.6g，70%乙醇98m1，浓盐酸1ml，三聚乙醛1m1。将复红和阿尔辛蓝依次溶于乙醇内，然后加入盐酸和三聚乙醛，充分混合摇匀，放置室温中24h，使其自然成熟后即可使用。该液用后须贮存于冰箱中可保存2~3个月。
[染色方法]
(1)石蜡切片，脱蜡至水。
(2)用醛复红-阿尔辛蓝液染1~2h。
(3)70%乙醇液漂洗2次，约3~5min。
(4)蒸馏水稍洗。
(5)用焰红B液染色10~l5min。
直接用无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
[结果] 弹力纤维呈深紫色，背景呈蓝绿色或其他复染的颜色。
8、Darrow合成地衣红改良法(1952年)
[固定] Zenker液、Bouin液、10%甲醛均可。
[试剂配制]
(1)A液0.4g合成地衣红溶于100m1含有1%浓盐酸的70%乙醇中。
(2)B液即Mallory硼砂亚甲蓝液，其贮存原液为1g亚甲蓝与1g硼砂溶于100m1蒸馏水中。用时将此原液l ml加蒸馏水至9 ml即可。
[染色方法]
(1)按常规将切片脱蜡。
(2)在A液中染30min。
(3)在70%乙醇中稍洗2次。
(4)蒸馏水中洗2次。
(5)在稀释的B液中染5min。
蒸馏水洗。
(7)在含有0.5%透明松香(Colophony，rosin)的95%乙醇中分色并脱水2min。切片要经常摇动，在镜检下掌握染色结果。
在无水乙醇中快速完成脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
[结果] 弹力纤维呈深紫色或红紫色，核蓝色。
9、Fraenkel多色染色法(Lillie，1965年)
[显示目的] 弹性硬蛋白、胶原纤维、肌肉和核。
[固定] 任何固定剂。
[试剂配制]
A溶液：地衣红1.5g，95%乙醇120ml，蒸馏水60ml，硝酸6 mI。向含有3%HCl的70%乙醇加入足量的上述贮存液，使溶液呈棕色。
B溶液，在饱和的苦味酸水溶液中溶以0.25%的靛姻脂红(Indigo carmine)。
C溶液，即Orth锂烟脂红染色液。将2.5~5g烟脂红溶于饱和碳酸锂水溶液中(约1.25%)，煮沸10~15min，冷却过滤并加lg百里蚕粉。
[染色方法]
(1)按常规切片脱蜡至水。
（2）用C液染2~5min，使核虽红色。
(3)在1%，盐酸乙醇中分色。
(4)在A液中染24h。
(5)在80%乙醇中分色。
在B液中染10~l5min。
(7)在3.5%醋酸中洗。
在95%与100%乙醇中快速脱水。
(9)二甲苯透明，中性树胶封固。
[结果]核红色，弹性硬蛋白深棕色，胶原纤维蓝绿色，肌肉黄色。
10、碱性蓝B染色法
[固定] 10%甲醛液、乙醇液或Zenker液均可。
[试剂配制]
(1)碱性蓝B乙醇溶液碱性蓝B 0.6~0.8g，70%乙醇100ml。
(2)氢氧化钾乙醇液氢氧化钾0.05g，70%乙醇100ml。
[染色方法]
(1)石蜡切片，脱蜡至水。
(2)在70%乙醇中lmin，入碱性蓝B乙醇液5~10min。
(3)蒸馏水速洗。
(4)用4%铁明矾溶液处理2~3min。
(5)蒸馏水速洗。
入50%乙醇内1~2min。
(7)用0.05%氢氧化钾乙醇液分化3~5s。
蒸馏水速洗2次。
(9)用0.5%荧光桃红液染3~5min。
(10)蒸馏水略洗。
(11)用95%乙醇及无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
[结果] 弹力纤维呈蓝色，胶原纤维及背景呈红色，红细胞呈紫红色。
11、显示弹力纤维的VBM染色法
[固定] 中性甲醛固定，石蜡包埋切片。
[试剂配制]
(l)Martius yellow染色液马休黄0.5g，95%乙醇98m1，磷钨酸0.5g。
(2)Victoria blue染色液详见显示弹力、胶原纤维的双重组合染色法。
[染色方法]
(1)组织切片脱蜡至水。
(2)切片入70%乙醇中洗2min。
(3)将切片浸入Victoria blue染色中2h。
(4)用95%乙醇分化l min。
(5)浸入蒸馏水中洗2次。
用马休黄染色液染l min。
(7)快速用无水乙醇冲洗2次。
二甲苯透明，中性树胶封固。
[结果] 弹力纤维呈蓝色，背景黄色。
12.显示弹力、胶原纤维的双重组合染色法(1992年)
[固定] 中性甲醛液，石蜡包埋切片。
[试剂配制]
(1)维多利亚蓝染色液维多利亚蓝(Victoria blue)2g，糊精0.5g，间苯二酚4g，蒸馏水200m1。将上述物质混合后加热煮沸，边煮边搅拌，约5min。然后用另一容器取30%三氯化铁水溶液25ml，另行加热煮沸后慢慢倒入上述混合液中，继续煮沸3min，不断搅拌溶液呈胶体状。去火冷却过滤，将滤纸上的残渣连同滤纸一起放在60℃恒温箱中烤干。残渣呈深蓝色细颗粒状粉末，再将其溶于400m1的70%乙醇液中。然后加浓盐酸4ml和苯酚5g，放置至成熟后使用。
(2)丽春红S染色液0.5%丽春红(ponceau's-上海试剂三厂出品)l5ml，加苦味酸饱和水溶液(1.22%)85m1。[染色方法]
(1)组织切片脱蜡至水。
(2)切片入70%乙醇中洗2min。
(3)将切片浸入盛有维多利亚蓝液中染0.5~2h。
(4)直接入95%乙醇中分色数秒钟。
(5)用蒸馏水洗2min。
用丽春红S液滴染切片2min。
(7)直接用无水乙醇冲洗多余染色液2次。
将切片在空气申或冷风干燥。
(9)二甲苯透明，中性树胶封固。
[结果] 弹力纤维呈蓝绿色，胶原纤维呈红色，背景呈淡黄色
实验二+细菌的简单染色和革兰氏染色及其形态观察
实验二细菌的简单染色和革兰氏染色及其形态观察 1. 目的要求 （1）学习细菌涂片、染色的基本技术及无菌操作技术。 （2）掌握细菌的简单染色法，初步认识细菌的形态特征。 （3）了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。 2. 基本原理 （1）简单染色法 用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观 察。 常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱碱性溶液中，细 菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。 （2）革兰氏染色法 革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为 两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类
物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现 红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革 兰氏染色的初染液一般是结晶紫。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或 附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。 脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱 色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精。复染液也是一种碱性染料，其颜色不 同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色 的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。 3. 材料及器材 (1) 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌 (2) 革兰氏染色液，载玻片，显微镜等 4. 方法与步骤 Ⅰ涂片取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌 操作分别从培养14～16h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。 载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。 Ⅱ干燥室温自然干燥。 Ⅲ固定固定时通过火焰2～3次即可。此过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。
革兰氏染色的实验原理
革兰氏染色的实验原理 ●G＋细胞壁的网状结构致密，交联度高，用乙醇处理后，发生脱水作用，肽聚糖层孔径缩小，透性降低，故细菌仍保留初染时的紫色。 ●G－肽聚糖层较薄，交联度低，含较多类脂质，故用乙醇处理后，类脂质被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，细胞被脱色，经沙黄复染呈红色。 涂片固定→结晶紫初染（碱性）→碘液媒染→乙醇（丙酮）脱色→番红复染（碱性）
◆◆◆原理： 当用结晶紫初染后，所有细菌都被染成初染剂的兰紫色，碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫-碘复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要有舦聚糖形成的网状结构组成，壁厚，类脂含量低，用酒精脱色时细胞壁脱水，使舦聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫碘复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的兰紫色。革兰氏阴性细菌则不同，由于其细胞壁舦聚糖层较薄，类脂含量较高，，所以当脱色处理时，类脂质被酒精溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 ◆◆实验步骤： 1、制片 涂片——干燥——固定 2、初染 滴加结晶紫染色1——2分钟，水洗； 3、媒染 用碘液冲去残水，并用碘液覆盖1分钟； 4、脱色 滴加95%酒精脱色，25-30秒，立即水洗； 5、复染 用番红液复染约2分钟，水洗； 6、镜检 干燥后，用油镜观察。 细菌：细菌是一种具有细胞壁的单细胞微生物，在适宜条件下，能进行无性二分裂繁殖，其形态和结构相对稳定。一般体积微小，通常需要借助光学显微镜才能看到，其测量单位用微米表示。
常见的微生物检测方法
常见的微生物检测 方法
摘要：微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义，本文分生长量测定法，微生物计数法，生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量，体积，大小，生理代谢物等指标的二十余种常见的检测方法，简要介绍了这些方法的原理，应用范围和优缺点。 概述： 一个微生物细胞在合适的外界条件下，不断的吸收营养物质，并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量，体积，大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其它生物的生长，微生物的个体生长在科研上有一定困难，一般情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的，因此，微生物的生长一般指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同
时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和她们的生长抑制紧密相关。因此有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，因此测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，能够从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。 生长量测定法 体积测量法：又称测菌丝浓度法。 经过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。 称干重法：
革兰氏染色的机理和步骤.
1. 革兰氏染色的机理和步骤 机理：G+、G-主要由其CW化学成分的差异而引起对乙醇的通透性，抗脱色能力的差异。主要有肽聚糖的厚度和结构所决定。 G+的CW:肽聚糖层厚，脂质含量低。乙醇脱色时CW脱水，孔径减少，透性降低，不易脱色，呈初染得蓝紫色。 G-的CW：肽聚糖层薄，脂质含量高。乙醇脱色时，类脂被乙醇溶解，透性升高，细胞被复染显红色。 步骤：①涂片：在干净的载玻片上滴一滴水，用接种环挑取菌体均匀涂布于水中。 ②固定：将玻片靠近酒精灯火焰，蒸干水分，但不要烤焦。 ③初染：用碱性颜料结晶紫对菌液涂片进行初染。 ④媒染: 以碘液媒染1min，水洗，吸干水分。(细胞内形成结晶紫与碘的复合物，增强相互作用） ⑤脱色(关键步骤）：以95%的乙醇脱色30s，应适当振荡均匀，是乙醇脱色完全。 ⑥水洗，吸干。 ⑦复染：??(第2张）复染30s，水洗吸干。 ⑧干燥镜检。 2、用渗透皮层膨胀学说解说芽孢耐热机制。 芽孢的耐热性在于芽孢衣对多价阳离子和水分的透性很差，以及皮层的离子强度很高，这就使皮层产生了极高的渗透压去夺取芽孢核心中水分，其结果造成皮层的充分膨胀和核心的高度失水，正是这种
失水的核心才赋予芽孢极强的耐热性。 3、引起微生物培养过程中PH变化的几种可能反应，并说明如何能够维持微培PH稳定。 答：培养过程中，由于营养物质被分解利用，代谢产物的形成与积累，会导致PH变化。 （第2张中的图） 还与培养基的C/N比有关，C/N高，经培养基后PH显著下降，C/N 低，经培养基后PH明显上升。 PH调节：①加入缓冲剂--------常用:一氢二氢磷酸盐，K2HPO4 呈碱性，KH2PO4 酸性，只在一定的PH范围内调节（6.4--7.2） ②大量产酸的菌株，加CaCO3调节，CaCO3难溶于水，不会使培养液的PH过度增加，但可不断中和微生物产的酸。 ③培养液中存在天然的缓冲系统，如AA，肽，Pr均属两性电解质，也起缓冲的作用。 ④过酸：治标------加NaOH、Na2CO3中和，治本-----加适量氮源：NaNO3、Pr、NH3·H2O；增加通风量。 ⑤过碱：治标-----H2SO4、HCl中和，治本----加适量碳源:G类，脂类;减小通风量。 3、抗生素法和菌丝过滤法为何能浓缩营养缺陷型突变株？ 抗生素法（青霉素法）：适用于细菌。原理：青霉素抑制肽聚糖链间的交联，组织了合成完整的CW，野生型B处于正常生长繁殖，所以对青霉素敏感，可被抑制或杀死；营缺B在基本培养基上休眠状态
结缔组织练习题含答案
结缔组织 一、填空题 1、疏松结缔组织中，能合成分泌基质和纤维的是细胞，脱颗粒后能引起过敏反应的是细胞。 2、疏松结缔组织中，有强大吞噬功能的是______________________细胞，能合成分泌免疫球蛋白的是_______________________细胞。 3、白纤维是指；网状纤维又称。 4、软骨组织的分类是根据所含的不同；透明软骨的纤维成分为，分布于（举一例）。位于椎间盘、耻骨联合的软骨为，含纤维成分 为；弹性软骨含纤维成分为。 5、在长骨骨干的内、外环骨板间，存在和两种结构。 6、红细胞呈形状，无核、无细胞器，胞质内充满。 7、血液有形成分中，体积最大的是细胞，体积最小的是_____________________；数量最多的是______________________细胞，数量最少的是细胞。 二、选择题 1．下列哪种细胞能产生抗体 A．T淋巴细胞B．浆细胞C．B淋巴细胞D．肥大细胞E．成纤维细胞 2．关于疏松结缔组织的特征哪项有错误 A．细胞数量少，细胞外基质多B．细胞外基质包括纤维和基质 C．细胞有极性，分散于细胞为基质中D．基质的化学成分主要是蛋白多糖 3．下列哪种细胞在疏松结缔组织中最常见 A．巨噬细胞B．肥大细胞C．浆细胞D．脂肪细胞E．成纤维细胞 4、新鲜时黄色，H.E染色粉红色，折光性强的纤维是 A 胶原纤维 B 弹性纤维 C 网状纤维 D 神经纤维 E 肌纤维 5、韧性大抗拉力强 A.胶原纤维B弹性纤维C网状纤维D肌原纤维E神经原纤维. 6．具有很强吞噬作用的细胞是 A成纤维细胞B巨噬细胞C未分化间充质细胞D肥大细胞E脂肪细胞 7、HE染色的透明软骨中看不见纤维是由于： A、纤维太少 B基质中不含纤维 C 纤维为嗜银性 D.纤维的嗜色性与基质相同 E.纤维的折光率与基质相同 8、相邻骨细胞突起间有 A 桥粒 B 连接复合体 C 缝隙连接 D 中间连接 E 紧密连接 9．弹性软骨见于 A. 关节盘 B. 椎间盘 C. 耳廓 D. 气管 E. 关节软骨 10、白细胞分类的主要依据是： A 核的形态 B 胞质有无特殊颗粒及嗜色性 C 胞质的嗜色性 D 胞质的嗜色性和核的形态 E 胞质内有无颗粒 11、关于红细胞，下列哪一项是错误的？ Ａ呈双凹圆盘状，中央较薄，周边较厚，直径约为7.5um B 成熟红细胞无核、无细胞器Ｃ红细胞胞质内充满大量的血红蛋白 Ｄ红细胞的细胞膜中一种镶嵌蛋白质，即血型抗原Ａ和血型抗原Ｂ Ｅ红细胞内残留部分核糖体，经甲苯氨蓝染色后呈兰色细网状，此类细胞为网织红细胞。
微生物的革兰氏染色实验报告
微生物的革兰氏染色 一、实验目的： 1、学习并初步掌握革兰氏染色法； 2、了解革兰氏染色的原理； 3、巩固显微镜的使用。 二、实验原理： 革兰氏染色是细菌学中最重要的鉴别染色法。染色步骤分为四个部分： 1、初染：加入碱性染料结晶紫固定细菌图片； 2、媒染：加入碘液，碘与结晶紫形成一种不溶于水的复合物； 3、脱色：利用有机溶剂乙醇或丙酮进行脱色； 4、复染：复红配成碳酸复红作为复染剂。 成分占细胞壁干重的% 革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌肽聚糖含量很高（50~90）含量很低（~10） 磷壁酸含量较高（<50）无 类脂质一般无（<2）含量较高（~20） 蛋白质无含量较高G-和G+细胞壁的比较： 1、阳性（G+）菌细胞壁特点：细胞壁厚，只有一层，主要由肽聚糖构成，肽聚糖含量高，结构紧密，脂类含量低。当乙醇脱色时，细胞壁肽聚糖层孔径变小，通透性降低，结晶紫和碘的复合物被保留在细胞壁内，复染后仍显紫色（如芽孢杆菌）。 2、阴性（G-）菌细胞壁特点：细胞壁薄，由两层构成，内壁层和外壁层，细胞壁中脂类中脂类物质含量较高，肽聚糖含量较低，网状结构交联程度低，乙醇脱色时溶解了脂类物质，通透性增强，结晶紫与碘的复合物易被乙醇抽提出来，因此，革兰氏阴性菌细胞被脱色，当复染时，脱掉紫色的细胞的细胞壁又着上红色（例如大肠杆菌）。 三、实验步骤： 1、取一个载玻片，将其洗净并沿一个方向擦拭干净，直至液体不再其上收缩为止；将接种环整平，用灼烧过的接种环在混匀的菌种中取菌，按常规方法图片，应涂大，不宜过厚。 2、将涂片用火焰固定，不宜烤得太狠，否则菌种呈假阳性。 3、滴加1滴结晶紫染液，染色1min，水洗。 4、滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗 5、滴加脱色乙醇，脱色30~40s，不宜脱色太狠，否则菌种呈假阴性。 6、水洗，滴加番红复染液，复染1min，水洗，晾干 7、镜检并拍照。 四、注意事项： 1、选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。 2、涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。 3、脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。实验结果与讨论： 1、结果： 高倍镜下观察的菌体图像：
(推荐)革兰氏染色法的过程及原理
革兰氏染色法的过程及原理 一，过程 1 ．涂片 将培养的不同菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰l 一2 次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 2 ．染色 ( 1 ）初染加草酸铰结晶紫一滴，约一分钟，水洗。 ( 2 ）媒染滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。 ( 3 ）脱色将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95 ％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20 一30 秒钟，立即用水冲净酒精。 ( 4 ）复染用番红液染1 一2 分钟，水洗。 ( 5 ）镜检干燥后，置油镜观察．革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。( 6 ) 同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。 二，原理 革兰氏染色法（Gram stain ）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G＋表示：染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G 一表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肤聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫一碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肤聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫一碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌：而脱色，不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。 青霉素作用机制 干扰细菌细胞壁的合成。青霉素你的结果与细胞壁的成分粘肽结构中德D-丙氨酰-D-丙氨酸近似，可与后者竞争转肽酶，阻碍你粘肽的形成，造成细胞壁的缺损，使细菌失去细胞壁的渗透屏障，对细菌起到杀灭作用。 溶菌酶与青霉素对细菌细胞壁的作用 溶菌酶作用机制：是一种能水解致病菌种黏
免疫组织化学及其应用
免疫组织化学及其应用 浙江大学病理学与法医学研究所 周韧 1．免疫组织化学的历史、现状和发展 1．1．历史 ●人类的历史有多长，医学的历史也就有多长.医学的任何一个进步都是建立在当 时科学与技术发展的相应水平上的. ●医学的目的: 解除人体的病痛 ●核心: 诊断和治疗。 任何疾病的有效治疗均来源于正确的诊断。●疾病的诊断手段准确性，首推病理诊断准确性高，即病理组织学诊断。更准确、 更可信、更有权威性。 ●免疫组织化学（以下简称免疫组化）已成为病理诊断中的一种常用手段。 病理诊断发展过程的主要事件 年代作者事件 1632年 Severino 肿瘤切开后观察的书 1661年 Malpighi 放大镜观察后的报告 1761年 Morgagni 肿瘤与外科方面的书 1829年 Horner 首篇病理论文 1832年Hodgkin 报告7例尸检结果的论文 1858年Virchow 发表《细胞病理学》 1863年 Paget 发表《外科病理学》 1897年 Mallory和Wright 发表组织学技术的书 1914年 Mallory 发表《细胞组织学原则》 1919年 Ewing 发表《肿瘤病》 1924年 McFarland 发表《外科病理学》 1926年 Karsner 发表《人体病理学》 1928年 Papanicolaou 发表细胞学方面的书 1951年电镜应用于病理诊断 1974年免疫组化用于病理诊断 ●诊断病理学开始于19世纪 ●20世纪的第二个25年中达到光学显微镜诊断的辉煌。随之而起的电子显微镜 ●20世纪第三个25年中成为诊断病理的发展高峰。
●进入20世纪最后25年，取而代之的便是免疫组化了。 1．2．免疫组织化学的发展 1．2．1．免疫学的发展 1．2．2．单克隆技术的出现 ●病理诊断的确立：是找到“特征性”形态表现。 常规苏木素伊红（HE）染色 几百种的“特殊染色” ●免疫组织化学产生： 抗原抗体结合原理 ●从组织细胞水平进行抗原抗体反应，于是就了免疫组织化学技术。 主要的发展过程 年代研究者事件 1941年 Coons 实用免疫荧光技术 1948年 Fagraeus 进一步发展免疫荧光技术 1970年 Sternberger 抗体酶标记技术 1974年 Taylor 证实组织中的浆细胞免疫 1975年 Kohler和Milstein 单克隆抗体技术 1981年 Hsu ABC法 90年代以来 SP法，原位杂交及原位PCR免 疫组化法
结缔组织
结缔组织由细胞和大量细胞间质构成，结缔组织的细胞间质包括液态、胶体状或固态的基质、细丝状的纤维和不断循环更新的组织液，具有重要功能意义。细胞散居于细胞间质内，分布无极性。广义的结缔组织，包括液状的血液、淋巴，松软的固有结缔组织和较坚固的软骨与骨；一般所说的结缔组织仅指固有结缔组织而言。结缔组织在体内广泛分布，具有连接、支持、营养、保护等多种功能。 结缔组织是人和高等动物的基本组织之一。由细胞、纤维和细胞外间质组成。细胞有巨噬细胞、成纤维细胞、浆细胞、肥大细胞等。纤维包括胶原纤维、弹性纤维和网状纤维，主要有联系各组织和器官的作用。基质是略带胶粘性的液质，填充于细胞和纤维之间，为物质代谢交换的媒介。纤维和基质又合称“间质”，是结缔组织中最多的成分。结缔组织具有很强的再生能力，创伤的愈合多通过它的增生而完成。结缔组织又分为疏松结缔组织（如皮下组织）、致密结缔组织（如腱）、脂肪组织等。 它们都起源于胚胎性结缔组织——间充质。在它们的组成成分中除细胞外，还有大量非细胞物质（无定形基质和纤维）。 结缔组织均起源于胚胎时期的间充质（mesenchyme）。间充质由间充质细胞和大量稀薄的无定形基质构成。间充质细胞呈星状，细胞间以突起相互连接成网，核大，核仁明显，胞质弱嗜碱性（图3－1）。间充质细胞分化程度低，在胚胎时期能分化成各种结缔细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等。成体结缔组织内仍保留少量未分化的间质细胞。 中文名 结缔组织 外文名 connective tissue 构成 细胞和大量细胞间质 功能 连接、支持、营养、保护 固有组织（connective tissue proper），按其结构 (一)细胞 和功能的不同分为疏松结缔组织、致密结缔组织、脂肪组织和网状组织。 结缔组织疏松组织 疏松结缔组织（loose connective tissue）又称蜂
微生实验报告 2012.10.10 实验一 细菌的简单染色和革兰氏染色
微生实验报告 姓名： xx 专业年级：2011级生物技术 学号：1032 实验二细菌的简单染色和革兰氏染色 一、实验目的 学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法的实验原理和实验操作。 二、实验原理 用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电何，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红、或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物，又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。 简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法，简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法之所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多的易被乙醇溶解的类脂质，增加了细胞壁的通透性，使处染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔
径缩小，通透性降低，草酸铵结晶紫与碘的复合物不易被脱掉，因此细菌仍保留处染时的紫色。 三、实验器材 1、菌种： 金色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌。 2、染色剂和试剂： 草酸铵结晶紫染液，卢哥氏碘液，95%酒精，番红复染液，复红染液，吕氏美蓝染液，显微镜擦拭液（乙醚： 乙醇=7:3），xx柏油。 3、器材： 废液缸，洗瓶，载玻片，接种环，酒精灯，擦镜纸，双层瓶，显微镜。 四、实验方法 （一）简单染色 1．涂片： 取干净载玻片一片，在载玻片的左右各加一滴生理盐水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂金黄色葡萄球菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌悬液。再取干净载玻片一块将刚制成的金黄色葡萄球菌浓菌悬液挑1~2环涂在左边制成薄的涂片，将大肠杆菌的浓菌悬液取1~2环涂在右边制成薄涂片。亦可直接在载玻片上制薄的涂片，注意取菌不要太多。 2．晾干： 让涂片自然晾干。 3．固定：
纤维结缔组织是什么
如对您有帮助，可购买打赏，谢谢 纤维结缔组织是什么 导语：纤维结缔组织，是脊椎动物内最广泛存在的结缔组织，但是很多人对它的一些常识并不了解，所以会在无形当中，让这些部位受到一些不利因素的影 纤维结缔组织，是脊椎动物内最广泛存在的结缔组织，但是很多人对它的一些常识并不了解，所以会在无形当中，让这些部位受到一些不利因素的影响和危害，因此想要更好的保护这些部位的健康，大家就应该知道这些纤维结缔组织的一些组成，还有各种常识保健。 纤维性结缔组织fibrillar connective tissue 脊椎动物体内最广泛存在的结缔组织，是以纤维为主体的细胞间质成分。除大部分上皮组织外，介在于其它各种组织基本成分之间，成为这些组织组成成分之一。此组织的特点是，一般缺乏细胞成分，而有大量的细胞间质，其基本细胞称为成纤维细胞。这种细胞在细胞间制造胶原纤维、网状纤维、弹性纤维等的纤维成分和以粘多糖的透明脂酸为主体的糖蛋白质形成的细胞间质。 所以除了结合、支持组织之外，同时还具有贮存水分和防御细菌侵入等功能。在这种组织中，除成纤维细胞之外，还有巨噬细胞、浆细胞、肥大细胞，所以这种组织还具有从这些细胞发生而来的机能。疏松结缔组织是这种组织的代表，此外还有有形结缔组织（致密纤维性结缔组织）、脂肪组织、弹性组织、色素组织等，可认为是这种组织特殊分化而形成的。 想要更好的保证我们的身体健康，那么以上所介绍的这些常识问题，大家就应该注重了，在生活当中关注这些常识，才可以有效的避免一些不利因素产生的影响，而身体出现一些异常状况的时候，要注意积极的接受治疗和检查。 预防疾病常识分享，对您有帮助可购买打赏
革兰氏染色法的步骤
革兰氏染色法的步骤 详细阐叙革兰氏染色法的步骤 浏览次数:174次悬赏分:0 |解决时间:2011-5-25 17:44 |提问者:肖箫 2011shaw 最佳答案 革兰氏染色 一、目的:在细胞发放之前,利用标准的革兰氏染色法对即将发放的细胞悬液进行检测,判断细胞悬液中是否含有革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。 二、原理: 通过结晶紫初染和碘液媒染后,在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物,革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密,故遇乙醇脱色处理时,因失水反而使网孔缩小,再加上它不含类脂,故乙醇处理不会出现缝隙,因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内,使其仍呈紫色;而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差,在遇脱色剂后,以类脂为主的外膜迅速溶解,薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出,因此通过乙醇脱色后仍呈无色,再经沙黄等红色染料复染,就使革兰氏阴性菌呈红色。 三、实验用品准备: 灭菌玻片、10-100ul移液器、10-100ul灭菌移液吸头、100ul-1000ul移液器、100ul-1000ul移液吸头、接种环、酒精灯、打火机、革兰氏染色液、吸水纸、显微镜、香柏油、擦镜纸、计时器 四、操作: 1 涂片:取灭过菌的载玻片于实验台上,用移液枪吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央,用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层,涂布面不宜过大。 2 干燥:将标本面向上,手持载玻片一端的两侧,小心地在酒精灯上高处微微加热,使水分蒸发,但切勿紧靠火焰或加热时间过长,以防标本烤枯而变形。 3 固定:固定常常利用高温,手持载玻片的一端,标本向上,在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次,共约2-3秒种,并不时以载玻片背面加热触及皮肤,不觉过烫为宜(不超过60℃),放置待冷后,进行染色。 4 初染:在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴,使染色液覆盖涂片,染色约 1min。 5 水洗:斜置载玻片,在自来水龙头下用小股水流冲洗,直至洗下的水呈无色为止。 6 媒染:用100-1000ul移液枪吸取约300ul碘液滴在涂片薄膜上,使染色液覆盖涂片,染色约1min。
实验动物组织切片免疫组织化学染色方法
ICS65.020.30 B44 中国实验动物学会团体标准 T/CALAS x-201x 实验动物组织切片免疫组织化学染色 方法 Laboratory animals-Immunohistochemical procedures for paraffin embedded tissues （征求意见稿） 201x-xx-xx发布201x-xx-xx实施中国实验动物学会发布
前言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则编写。 本标准由中国实验动物学会归口。 本标准由全国实验动物标准化技术委员会（SAC/TC281）技术审查。 本标准由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草。本标准主要起草单位：浙江大学动物科学学院、浙江省医学科学院。 本标准主要起草人：吴旧生、刘月环。
实验动物组织切片免疫组织化学染色方法 1范围 本标准规定了实验动物组织切片的免疫组织化学染色方法。 本标准适用于实验动物组织切片的免疫组织化学检测。 2术语和定义 以下术语和定义适用于本标准。 2.1 免疫组织化学immunohistochemistry,IHC 用已知的抗原或者抗体去检测待检组织中的抗原或抗体，根据其结合后经一系列方法的处理，呈色反应，在光镜下确定组织的来源属性和部位，对靶抗原进行定性、定位和定量的方法。 2.2 抗原antigen,Ag 一类可以刺激机体的免疫系统并促进其发生免疫应答，与免疫应答产物即抗体和效应细胞，在体内或体外发生特异性结合的物质。 2.3 抗体antibody 机体的免疫系统受到抗原刺激后，通过机体一系列的化合作用：即体液免疫应答、B 淋巴细胞活化、增殖、分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性反应的球蛋白的物质称为抗体。 2.4 抗原修复antigen repair 利用化学试剂和热的作用将这些抗原重新暴露出来或修正过来的过程。 3主要试剂 3.10.01M 磷酸盐缓冲液（Phosphate buffer solution.PBS） 先配成A 液和B 液，其中A：0.2M Na H 2PO 4贮存液（PH7.6）：15.60g 磷酸二氢钠 （NaH 2PO 4﹒2H 2O）溶解于少量水，加蒸馏水定容至500ml，放于4℃冰箱保存。B：0.2M Na 2HPO 4贮存液(HP7.6)：将35.82g 磷酸氢二钠（Na 2HPO 4﹒12H 2O）溶解并定容至500ml，贮存于4℃
实验二 革兰氏染色法
实验二革兰氏染色法 【实验目的】 1.学习并初步掌握革兰氏染色法。 2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 3.巩固显微镜油镜的使用方法。 【实验仪器、材料】 1.菌种：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌菌液。 2.染色剂：革兰氏染色试剂盒（结晶紫染色液、碘液、脱色液（95%乙醇）、复红染液）。 3.仪器及其他物品： 显微镜、香柏油、无水乙醇、载玻片、擦镜纸、滤纸、酒精灯、试管架、废液缸、记号笔、接种环、镊子、打火机等。 【实验内容】 革兰氏染色法 一、染色标本制备 1.涂片取一张洁净的载玻片，滴加少许生理盐水，用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，与生理盐水研磨均匀，做一薄而均匀、直径约1cm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。（事先在载玻片的反面滴加菌液的相应位置做好标记） 2.干燥于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥。(温度不宜过高) 3.固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常
用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。 二、染色 l.初染滴加结晶紫覆盖菌膜，染lmin，自来水缓缓冲洗，甩去积水。 2.媒染滴加卢氏碘液，染lmin，水洗，甩去积水。 3.脱色滴加95%乙醇数滴，20s~30s，见紫色脱下立即用水冲洗，甩去积水。 4.复染滴加石炭酸复红液，染lmin，水洗，甩去积水，标本片用滤纸吸干。 三、镜检 待染色片充分干燥后，用油镜观察。 【实验结果】 葡萄球菌呈葡萄状排列，呈紫色，为革兰氏阳性菌； 大肠杆菌为散在的短小杆菌，呈红色，为革兰氏阴性菌。 注：绘图展示染色结果 【结果分析、讨论（结论与评价）】 注：分析你的染色结果是否正确？如果不正确，请分析原因。
免疫组织化学实验之常用染色方法 百度文库
免疫组化的相关知识！ 一、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC) 免疫组织化学是利用抗原抗体的特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。免疫组织化学染色技术不仅有较高的敏感性和特异性，其特点是将形态学改变与功能、代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质和多肽类物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚集显微术等技术，对被检物质进行定量分析。 二、免疫组化实验所用的组织和细胞标本有哪些？ 实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片(病理大片和组织芯片)和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。 三、石蜡切片为什么要做抗原修复？有哪些方法？ 石蜡切片标本均用甲醛固定，使得细胞内抗原形成醛键、羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇，同时蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。所以要求在进行IHC染色时，需要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态。 常用的抗原修复方法有微波修复法，高压加热法，酶消化法，水煮加热法等，常用的修复液是pH6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液。 四、免疫组化实验用抗体的选择 1、一抗选择要点 (1)选择单克隆还是多克隆抗体。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体，单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对较低；而多克隆抗体特异性稍弱，抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色(可以通过封闭等有所避免)。 (2)种属来源。一般家兔来源的抗体多是多克隆；而小鼠来源的抗体多是单克隆，但也有另外。这条主要要与后面的二抗来源相匹配。 (3)实验目的是检测什么种属的抗原，即species reactivity。这一点很重要，一般说明书
革兰氏染色的机理和步骤
1.革兰氏染色的机理和步骤 机理：G+、G-主要由其CW化学成分的差异而引起对乙醇的通透性，抗脱色能力的差异。主要有肽聚糖的厚度和结构所决定。 G+的CW:肽聚糖层厚，脂质含量低。乙醇脱色时CW脱水，孔径减少，透性降低，不易脱色，呈初染得蓝紫色。 G-的CW：肽聚糖层薄，脂质含量高。乙醇脱色时，类脂被乙醇溶解，透性升高，细胞被复染显红色。 步骤：①涂片：在干净的载玻片上滴一滴水，用接种环挑取菌体均匀涂布于水中。 ②固定：将玻片靠近酒精灯火焰，蒸干水分，但不要烤焦。 ③初染：用碱性颜料结晶紫对菌液涂片进行初染。 ④媒染: 以碘液媒染1min，水洗，吸干水分。(细胞内形成结晶紫与碘的复合物，增强相互作用） ⑤脱色(关键步骤）：以95%的乙醇脱色30s，应适当振荡均匀，是乙醇脱色完全。 ⑥水洗，吸干。 ⑦复染：??(第2张）复染30s，水洗吸干。 ⑧干燥镜检。 2、用渗透皮层膨胀学说解说芽孢耐热机制。 芽孢的耐热性在于芽孢衣对多价阳离子和水分的透性很差，以及皮层的离子强度很高，这就使皮层产生了极高的渗透压去夺取芽孢核心中水分，其结果造成皮层的充分膨胀和核心的高度失水，正是这种
失水的核心才赋予芽孢极强的耐热性。 3、引起微生物培养过程中PH变化的几种可能反应，并说明如何能够维持微培PH稳定。 答：培养过程中，由于营养物质被分解利用，代谢产物的形成与积累，会导致PH变化。 （第2张中的图） 还与培养基的C/N比有关，C/N高，经培养基后PH显著下降，C/N 低，经培养基后PH明显上升。 PH调节：①加入缓冲剂--------常用:一氢二氢磷酸盐，K2HPO4 呈碱性，KH2PO4 酸性，只在一定的PH范围内调节（6.4--7.2） ②大量产酸的菌株，加CaCO3调节，CaCO3难溶于水，不会使培养液的PH过度增加，但可不断中和微生物产的酸。 ③培养液中存在天然的缓冲系统，如AA，肽，Pr均属两性电解质，也起缓冲的作用。 ④过酸：治标------加NaOH、Na2CO3中和，治本-----加适量氮源：NaNO3、Pr、NH3·H2O；增加通风量。 ⑤过碱：治标-----H2SO4、HCl中和，治本----加适量碳源:G类，脂类;减小通风量。 3、抗生素法和菌丝过滤法为何能浓缩营养缺陷型突变株？ 抗生素法（青霉素法）：适用于细菌。原理：青霉素抑制肽聚糖链间的交联，组织了合成完整的CW，野生型B处于正常生长繁殖，所以对青霉素敏感，可被抑制或杀死；营缺B在基本培养基上休眠状态
免疫组织化学染色
免疫组织化学染色（IHC） 定义： 免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。 免疫组化原理 抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原-一抗-二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。 免疫组化检测标本 1、组织标本：石蜡切片（病理切片和组织芯片）、冰冻切片； 2、细胞标本：组织印片、细胞爬片、细胞涂片。 免疫组化操作步骤 ①石蜡切片制作 1、固定：取组织，用PBS冲洗，放入4% 多聚甲醛溶液内固定12 h。 2、脱水：倒去固定液，用蒸馏水冲洗3次，再用50%酒精冲洗2次，用酒精逐级脱水，
免疫组织化学(荧光)方法及问题详解
目录： 1.常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素 (1) 2.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染色 (2) 3.免疫荧光组织化学技术的荧光…………………………………….3,4 4.免疫组织化学染色结果评价 (4) 5.免疫组织化学对照实验 (5) 6.免疫组织化学技术应用的基本原则……………………………….5,6 7.SABC法与其他免疫组织化学染色方法比较…………………….6,7 8.免疫组织化学技术疑难问题剖析………………………………….7,8 9.免疫荧光组织化学基本原理及荧光抗体再染色…………………8,9 10.非特异性荧光染色的消除 (9) 11.荧光显微镜的基本操作及注意事项……………………………..9,10 12.补体法免疫荧光组织化学染色步骤……………………………11,12 13.双重染色法免疫荧光组织化学染色步骤 (11) 14.间接法免疫荧光组织化学染色步骤 (12) 15.双重免疫荧光标记法 (13) 16.免疫荧光组织化学直接法 (13) 17.免疫荧光组织化学间接法 (14)
1.常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素 常用于免疫荧光组织化学染色的荧光素有：异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothioeyanate，TRITC)、四乙基罗丹明(tetraethyl rhodamine B200，RB200)、得克萨斯红(Texas red)、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)、花青类(cyanine，如Cy3、Cy5)等。此外还有一些新型荧光染料，如量子点。 (1)异硫氰酸荧光素(FITC)：FITC性质稳定，易溶于水和乙醇，能与蛋白质结合，是检测组织细胞内蛋白质最常用的荧光探针。它还能标记抗体，可用于免疫组织化学单染或多重染色。缺点是在光照下易淬灭，易受自发荧光影响。最大激发光波长为490nm；最大发射光波长为525nm，呈现黄绿色荧光。 (2)四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)：该荧光素能与细胞内蛋白质结合，比FITC稳定性好，在生理条件下对pH值变化不敏感，荧光强度受自发荧光干扰小。最大激发光波长为550nm；最大发射光波长为 620nm，呈橙红色荧光，与FITC发出的黄绿色荧光对比鲜明，常用于免疫荧光组织化学双重染色。 (3)四乙基罗丹明(RB200)：能与细胞内蛋白质结合，不溶于水，易溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可长期保存，广泛应用于双标记示踪染色。最大激发光波长为570nm，最大发射光波长为595-600nm，呈橙红色荧光。 (4)花青类染料：常用的有Cy3、Cy5等，能与细胞内蛋白质结合。这类染料的荧光特性与传统荧光素 类似，但水溶性和对光稳定性较强，荧光量子产率较高，对pH等环境不敏感。常用于多重染色。Cy3最大激发光波长为570nm，最大发射光波长为650nm，呈绿色荧光。但是，在绿光光谱波长激发下，Cy3也可出现红色荧光。Cy5的最大激发光波长为649nm，最大发射光波长为680nm，呈红色荧光。由于Cy5的最大发射波长为680nm，很难用裸眼观察，而且不能使用高压汞灯作为理想的激发光源，因此，使用普通荧光显微镜时，不推荐使用Cy5。通常观察Cy5时需使用激光扫描共聚焦显微镜。 (5)乙酸甲酯：其本身不发荧光，但透膜进入细胞质后，在酯酶的作用下转变为具有荧光特性的乙酸甲酯。其激发光谱有pH依赖性，是使用最多的细胞内pH荧光指示剂。最大激发光波长为505nm，最大发射光波长为530nm，呈绿色荧光。 (6)Indo-1：是典型的双发射荧光探针。无钙时在485nm左右有发射峰，结合钙后，则在405nm处有发射峰，两者的比值与细胞内游离钙离子浓度成线性关系，将此比值与标准曲线相比即可得出细胞内游离钙浓度，因此，可利用此探针定量检测细胞内游离钙离子浓度。最大激发光波长为330/346nm，最大发射光波长为405/485nm，呈紫色(405nm)或青色(485nm)荧光。 (7)量子点(quantum dot)：是近年来研制的一种新型荧光染料，又称半导体纳米晶体(semiconductor nanocrystal)，是由几百或几千个纳米级颗粒构成的半导体材料，性质稳定，溶于水，细胞本身不能合成和组装。量子点具有荧光时间长、产生多种颜色、检测方便和应用范围广等优点。当某一波长的激发光对多种大小不同的量子点进行照射时，可以同时观察到多种颜色，因而可同时进行多个目标的观察和检测。量子点可与抗体、链霉亲和素等多种分子进行耦联，检测靶分子的分布和功能。