生物物质分离工程
生物物质分离工程实验
李菊娣 编
辽宁石油化工大学环境工程系
二○○七年三月
生物物质的分离、提取实验是以实验操作为主的技能课程，是生物工程专业学生的必修课，是在学习《分析化学》、《生物化学》《微生物学》、《发酵工程》、《生物分离工程》等专业基础课及专业实验课的基础上开设的课程。目的在于通过本课程的实验训练，使学生对整个生物工程下游生产过程有一个全面的认识和理解，既可培养他们实际操作的技能，又可达到提高他们理论联系实际能力的目的。通过学习，使学生能够掌握物质分离常用的纯化方法和常见的分离设备，为以后的学习和科研工作打下良好的基础。
实验一、微生物细胞的破碎及分离
实验二、青霉素的萃取及萃取率的计算
实验三、醋酸丁酯萃取红霉素
实验四、牛奶中酪蛋白和乳蛋白素粗品的制备
实验五、胰凝乳蛋白酶的制备
实验六、薄层色谱法鉴定果汁中的糖
实验七、离子交换法提取L-精氨酸
备注：实验二、三选作其一；实验五、六选作其一。
实验一 微生物细胞的破碎及分离
一、实验目的与要求
实验目的：
1、掌握超声波细胞破碎的原理和技术，学习细胞破碎率的评价方法。
2、通过本试验使学生复习以前所学的分离知识及掌握微生物学实验、发酵工程实验技能，同时通过本试验使学生掌握超声波破碎仪的使用。
3、通过按照给定的研究题目，独立的进行试验，并观察试验中的各种现象，分析总结实验得出的各种数据并撰写相应的研究及实验报告等各过程，来培养学动手能力和独立分析问题的能力，并了解学习科学研究的基本过程与要求，提高科学研究的素质，为将来从事科学研究打好基础。
实验要求：
1、复习生物物质分离课程所学到的微生物细胞的分离方法，了解影响微生物细胞的破碎因素。
2、独立查阅相关资料，设计实验方案，并对实验所需的各种药品、玻璃仪器及分析设备列出清单，写出详尽的试验过程及需要。
3、三人一组，互相配合，开展实验，动手完成实验，并记录并分析实验中的实验现象、数据，必要时及时修改试验计划。
4、总结试验数据，经教师认定后，撰写实验报告。
二、实验原理、内容
频率超过15-20 kHZ的超声波，在较高的输入功率下（100-250W）可破碎细胞。其工作原理是：超声波细胞粉碎机由超声波发生器和换能器两个部分组成。超声波发生器是将220V、50Hz的单相电通过变频器件变为20-25Hz、约600V的交变电能，并以适当的阻抗与功率匹配来推动换能器工作，做纵向机械振动，振动波通过浸入在样品中钛合金变副杆对破碎的各类细胞产生空化效应，从而达到破碎细胞的目的。
三、实验主要仪器设备和材料
超声波细胞破碎机、显微镜、酒精灯、载玻片、血球计数板
接种所需材料
1、酵母细胞悬浮液：0.2g/ml 的啤酒酵母溶于50mmol/L乙酸钠-乙酸缓冲溶液（pH=4.7）。
2、土豆培养基：土豆（去皮切块）200g；琼脂20g；蔗糖20g；蒸馏水1000ml。选优质土豆去皮切块，加水煮沸30min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补充加水至1000ml,粉状，115℃灭菌20min。
四、实验方法、操作步骤
1、啤酒酵母的培养：
菌种纯化：酵母菌种转接至斜面培养基上，28-30℃下，培养3-4d，培养成熟后，用接种环取一环酵母菌至8ml液体培养基中，28-30℃下，培养24h。
扩大培养：将培养成熟的8ml液体培养基中的酵母菌全部转接至含80ml液体培养基的三角瓶中，28-30℃下，培养15-20h。
2、取1ml酵母细胞悬浮液经适当稀释后，用血球计数板在显微镜下计数。
将80ml酵母细胞悬浮液放入100ml容器中，液体浸没超声发射针1cm，打开开关，将频率钮设置至中档，超声破碎1min，间歇1min,破碎20次。
取1ml破碎后的细胞悬浮液经适当稀释后，滴一滴在血球计数板上，盖上盖玻片，用显微镜进行观察、计数。计算细胞破碎率。
3、破碎后的细胞悬浮液，于12000r/min、4℃离心30min，去除细胞碎片。用Lowry 法检测上清液蛋白质含量（具体方法见附件一）。
五、实验结果与讨论
用显微镜观察细胞破碎前后的形态变化。
用两种方法对细胞破碎率进行评价：一种是直接计数法，对破碎后的样品进行适当稀释后，通过在血球计数板上用显微镜观察来实现细胞的计数，从而计算出破碎率；另一种是间接计数法，将破碎后的细胞悬浮液离心分离掉固体（完整细胞和碎片），然后用Lowry法测量上清液中的蛋白质含量，也可以评价细胞的破碎程度。
六、实验报告记载要求
1、姓名、班级、学号、小组编号、试验开始日期/时间
2、实验报告包括实验目的、实验原理、实验步骤、注意事项、试验结果、误差分析、思考题等。
实验二 青霉素的萃取与萃取率的计算
一、实验目的与要求
实验目的：
1、掌握有机溶剂萃取抗生素的原理和技术，学习液液萃取设备的结构和特点，掌握碘量法测定青霉素含量的方法，并能够计算出青霉素的萃取率。
2、通过本试验使学生复习以前所学的萃取知识及分析化学知识、掌握分离工程实验技能，同时通过本试验使学生熟练掌握萃取设备的使用。
3、通过按照给定的研究题目，独立的进行试验，并观察试验中的各种现象，分析总结实验得出的各种数据并撰写相应的研究及实验报告等各过程，来培养学动手能力和独立分析问题能力，并了解学习科学研究的基本过程与要求，提高科学研究的素质，为将来从事科学研究作好基础。
实验要求：
1、复习生物物质分离课程所学到的萃取分离方法，了解影响萃取过程中的因素。
2、独立查阅相关资料，设计实验方案，并对实验所需的各种药品、玻璃仪器及分析设备列出清单，写出详尽的试验过程及需要。
3、三人一组，互相配合，开展实验，动手完成实验，并记录并分实验中的实验现象、数据，必要时及时修改试验计划。
4、总结试验数据，经教师认定后，撰写实验报告。
二、实验原理、内容
萃取过程是利用混合物在两种不相混溶的液相中各种组分溶解度的不同，从而达到分离的目的。当pH=2.3时，青霉素在乙酸乙酯中比在水中溶解快，因而可以将乙酸乙酯加到青霉素混合液中，并使其充分接触，从而使青霉素被萃取浓集到乙酸乙酯中，达到分离提纯的目的。青霉素分子本身不消耗碘，其降解产物消耗碘，青霉素经碱水解生成的青霉噻唑酸可与碘作用，根据消耗的碘量可计算青霉素含量，条件是pH=4.5，温度在20-25度之间。
三、实验主要仪器设备和材料
分液漏斗、电子天平、酸式滴定管、碘量瓶、pH试纸
硫代硫酸钠、碘化钾、醋酸缓冲液、淀粉指示剂、乙酸乙酯、K2Cr2O3
四、实验方法、操作步骤
1、硫代硫酸钠的标定
取K2Cr2O3 0.15g于碘量瓶中，加入50ml水，使之溶解，再加入碘化钾2g，溶解后加入稀硫酸40ml，摇匀，密塞，在暗处放置10分钟。取出后再加水250ml稀释，用硫代硫酸钠
滴定临近终点时，加淀粉指示剂3ml，继续滴定至蓝色消失，记录硫代硫酸钠消耗的体积。
2、青霉素的萃取
用电子天平称取0.12g青霉素钠，溶解后定容到100ml。
取15ml乙酸乙酯，用稀硫酸调节pH在2.3-2.4之间，准确移取10ml青霉素钠溶液与乙酸乙酯混合，置分液漏斗中，摇匀，静置30分钟。
溶液分层后，将下方萃余相置于烧杯中备用，将上方萃取液回收。
3、萃取率的计算
（1）取5ml 定容好的青霉素钠溶液于碘量瓶中，加氢氧化钠（1mol/L）1mL后放置20分钟，再加1ml盐酸（1mol/L）与5ml醋酸缓冲液，精密加入碘滴定液（0.1mol/L）5ml，摇匀，密塞，在20-25℃时暗处放置20分钟，用硫代硫酸钠滴定液（0.1mol/L）滴定，临近终点时加淀粉指示剂3ml，继续滴定到蓝色消失，记录硫代硫酸钠消耗的体积（V对照） （2）另取5ml定容好的青霉素钠溶液于碘量瓶中，加入5ml醋酸缓冲液，再精密加入碘滴定液5ml，用硫代硫酸钠滴定液滴定至蓝色消失，记录硫代硫酸钠消耗的体积（V空白）。
（3）取萃余相5ml于碘量瓶中，按步骤（1）中的方法进行测定，记录硫代硫酸钠消耗的体积（V样品）。
五、实验结果与讨论
1、数据处理
硫代硫酸钠：碘=2：1，青霉素：碘=1：8，青霉素：碘：硫代硫酸钠=1：8：16
青霉素的含量=（总碘-余碘-杂）/8
2、讨论pH的调节在提高青霉素萃取效率方面的重要性。
六、实验报告记载要求
1、姓名、班级、学号、小组编号、试验开始日期/时间
2、实验报告包括实验目的、实验原理、实验步骤、注意事项、试验结果、误差分析、思考题等。
实验三 醋酸丁酯萃取红霉素
一、实验目的与要求
实验目的：
1、掌握有机溶剂萃取抗生素的原理和技术，学习液液萃取设备的结构和特点，掌握液液萃取的方法。
2、通过本试验使学生复习以前所学的萃取知识及生物化学实验知识、分离工程实验技能，同时通过本试验使学生熟练掌握萃取设备、分光光度计的使用。
3、通过按照给定的研究题目，独立的进行试验，并观察试验中的各种现象，分析总结实验得出的各种数据并撰写相应的研究及实验报告等各过程，来培养学动手能力和独立分析问题能力，并了解学习科学研究的基本过程与要求，提高科学研究的素质，为将来从事科学研究作好基础。
实验要求：
1、复习生物物质分离课程所学到的萃取分离方法，了解影响萃取过程中的因素。
2、独立查阅相关资料，设计实验方案，并对实验所需的各种药品、玻璃仪器及分析设备列出清单，写出详尽的试验过程及需要。
3、三人一组，互相配合，开展实验，动手完成实验，并记录并分实验中的实验现象、数据，必要时及时修改试验计划。
4、总结试验数据，经教师认定后，撰写实验报告。
二、实验原理、内容
根据红霉素在有机溶剂和水溶液中溶解度的不同，将醋酸丁酯加到含有红霉素的水溶液中，通过混合、分离操作，使红霉素从水相转到有机相，从而达到分离和浓缩红霉素的目的。分配定律是表征溶剂萃取性能的重要指标，它与多种因素有关，如弱电解质、溶液pH的大小等，对分配系数的影响较大。
三、实验主要仪器设备和材料
分光光度计、分液漏斗
红霉素碱、无水酒精、碳酸盐缓冲溶液、醋酸丁酯
四、实验方法、操作步骤
1、分别称取0.1259红霉素碱两份，先用少量无水酒精溶解，然后一份用蒸馏水稀释到30ml，另一份用pH为10的碳酸盐缓冲溶液稀释到30ml，分别取样测定原液的效价；
将上述溶液取25ml放入两只125ml分液漏斗中，然后各加入25ml醋酸丁酯，盖好塞子，震荡15min，静止分层，测定操作温度并作记录，然后放下水层即萃余相，取样分析残液效价并测量其pH；
用吸管吸取10ml上层醋酸丁酯（萃取相），放入60ml分液漏斗中，然后放入等体积0.1mol/L HCL溶液，盖好塞子，震荡半分钟，静止分层，放下水相，取样分析溶液浓度并换算成萃取相单位体积的浓度值。
2、红霉素化学效价测定
红霉素经硫酸水解后生成黄色，于483nm有极大的吸收值，可用以定量。
吸取实验样品，用缓冲溶液稀释到5ml，加入8mol/L 硫酸5ml摇匀，于50±1℃水浴中保温3min后取出冷却至室温。以721型分光广度计于483nm波长处进行比色，并以蒸馏水为空白对照。记下消光值，在标准曲线上查找相应的浓度，乘以稀释倍数即得样品的效价；
发酵液中红霉素效价测定，发酵液经过滤后，根据确定好的倍数，吸取溶液一定毫升数用0.35g/100ml 碳酸钾溶液稀释，取稀释液20ml于分液漏斗中，加入醋酸丁酯20ml，震荡30s，静止分层，弃去下层液(水相)加无水硫酸钠1g左右于醋酸丁酯中震荡30s（脱水完全）,以液体透明为准。吸取此脱水液10ml于另一个干燥分液漏斗中，准确加入0.1mol/L HCL 10ml 震荡30s，静止分层，将下层HCL 溶液放入试管中，取5ml于另一个试管中，加入8mol/L 硫酸溶液5ml，摇匀，于50±1℃水浴30min,然后取出冷却至室温，以721型分光光度计于483nm 波长处进行比色，并以蒸馏水为空白；
标准曲线的制备：精确称取样品10-12mg于称量皿中，加乙醇（10mg左右加1ml乙醇）后，加水稀释成1000u/ml。吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml于试管中加水至5ml ，摇匀，再加8mol/L硫酸溶液5ml摇匀，于50±1℃水浴保温30min,取出冷却于721型分光光度计483nm波长处闭塞，空白为蒸馏水，以光密度为纵坐标，相应含量为横坐标作标准曲线图。
五、实验报告记载要求
1、姓名、班级、学号、小组编号、试验开始日期/时间
2、实验报告包括实验目的、实验原理、实验步骤、注意事项、试验结果、误差分析、思考题等。
六、注意事项
1、更换8mol/L 硫酸溶液必须重新制作标准曲线；
2、温度一定要严格控制在50±1℃，否则影响结果；
3、严守规定的水浴保温时间。
实验四 牛奶中酪蛋白和乳蛋白素粗品的制备
一、实验目的与要求
实验目的：
1、掌握掌握盐析法和等电点沉淀法的原理和基本操作。
2、通过本试验使学生复习以前所学的等电点和盐析法沉淀物质的知识，及掌握物物质分离工程实验技能，同时通过本试验使学生熟悉两种沉淀方法的操作过程。
3、通过按照给定的研究题目，独立的进行试验，并观察试验中的各种现象，分析总结实验得出的各种数据并撰写相应的研究及实验报告等各过程，来培养学动手能力和独立分析问题能力，并了解学习科学研究的基本过程与要求，提高科学研究的素质，为将来从事科学研究作好基础。
实验要求：
1、复习生物物质分离课程所学到的沉淀分离方法，了解影响沉淀过程中分离物质的因素。
2、独立查阅相关资料，设计实验方案，并对实验所需的各种药品、玻璃仪器及分析设备列出清单，写出详尽的试验过程及需要。
3、三人一组，互相配合，开展实验，动手完成实验，并记录并分实验中的实验现象、数据，必要时及时修改试验计划。
4、总结试验数据，经教师认定后，撰写实验报告。
二、实验原理、内容
乳蛋白素广泛存在于乳品中，是乳糖合成所需要的重要蛋白质。牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白，酪蛋白在pH为4.8左右会沉淀析出，但乳蛋白素在pH为3左右才会沉淀，利用此性质，可先将pH降至4.8，或是在加热至40℃牛奶中加硫酸钠，将酪蛋白沉淀出来，酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中除去脂类杂质。将去除掉酪蛋白的滤液的pH调至3左右，能使乳蛋白素沉淀析出，部分杂质可随着澄清液除去。再经过一次pH 沉淀后，即可得粗乳蛋白素。
三、实验主要仪器设备和材料
烧杯、玻璃试管（10mm×10mm）、离心管（50ml）、磁力搅拌器、pH计、离心机 脱脂或低脂牛乳、无水硫酸钠、0.1mol/L HCL、0.1mol/L 氢氧化钠、0.05mol/L碳酸氢铵、滤纸、pH试纸、浓盐酸、乙酸钠缓冲溶液0.2mol/L（pH=4.6）、乙醇
四、实验方法、操作步骤
1、盐析或等电点沉淀制备酪蛋白
（1）将50ml 牛乳倒入250ml烧杯中，于40℃水浴中隔水加热并搅拌；
（2）于步骤（1）的烧杯中缓缓加入(约10min内分次加入)10g无水硫酸钠，之后再继续搅拌10min（或加热到40℃，再在搅拌下慢慢加入50ml40℃左右的乙酸缓冲液，直到pH 达到4.8左右，可以用酸度计调解。将上述悬浮液冷却至室温，然后静止5min）；
（3）将步骤（2）的溶液用细布过滤，分别收集沉淀和滤液。将上述沉淀悬浮于30ml 乙醇中后，倾于布氏漏斗中，过滤除去乙醇溶液，抽干。将沉淀从布氏漏斗中移出，在表面皿上摊开以除去乙醇，干燥后得到酪蛋白，准确称量。
2、等电点沉淀法制备乳蛋白素
将操作步骤（1）所得滤液置于100ml烧杯中，一边搅拌，一边利用pH计以浓盐酸调整至3±0.1；
将步骤1倒入离心管， 6000r/min离心15min,倒掉上层液；在离心管内加入10ml 去离子水，震荡，使管内下层物质重新悬浮，并以0.1mol/L氢氧化钠溶液调整pH至8.5-9.0（以pH试纸或pH计判定），此时大部分蛋白质均会溶解；
将上述溶液以6000r/min离心10min后，将上层液倒入50ml烧杯中；
将烧杯置于磁搅拌加热板，一边搅拌，一边利用pH计以0.1mol/L盐酸调整pH至3±0.1；
将上述溶液以6000r/min离心10min后，倒掉上层液。沉淀取出干燥，并称量。 五、实验结果
计算出每100ml牛乳所制备出酪蛋白数量，并与理论产量（3.5%）相比较，求出实际获得百分数；计算出每100ml牛乳所制备出的乳蛋白数量。
六、实验报告记载要求
1、姓名、班级、学号、小组编号、试验开始日期/时间
2、实验报告包括实验目的、实验原理、实验步骤、注意事项、试验结果、误差分析、思考题等。
七、思考题
影响得率的因素。
实验五 胰凝乳蛋白酶的制备
一、实验目的与要求
实验目的：
1、掌握盐析法分离酶的基本原理和操作，掌握结晶的基本方法和操作，了解胰凝乳蛋白酶的制备原理和方法。
2、通过本试验使学生复习以前所学的盐析和结晶知识及掌握分离工程的实验技能，同时通过本试验使学生熟练掌握离心机、透析袋的使用。
3、通过按照给定的研究题目，独立的进行试验，并观察试验中的各种现象，分析总结实验得出的各种数据并撰写相应的研究及实验报告等各过程，来培养学动手能力和独立分析问题能力，并了解学习科学研究的基本过程与要求，提高科学研究的素质，为将来从事科学研究作好基础。
实验要求：
1、复习生物物质分离课程所学到的盐析和结晶分离方法，了解影响蛋白酶在分离提取过程中的因素。
2、独立查阅相关资料，设计实验方案，并对实验所需的各种药品、玻璃仪器及分析设备列出清单，写出详尽的试验过程及需要。
3、三人一组，互相配合，开展实验，动手完成实验，并记录并分实验中的实验现象、数据，必要时及时修改试验计划。
4、总结试验数据，经教师认定后，撰写实验报告。
二、实验原理、内容
蛋白质分子表面含有带电荷的基团，这些基团与水分子有较大的亲和力，故蛋白质在水溶液中能形成水化膜，增加蛋白质水溶液的稳定性，如果在蛋白质溶液中加入大量中性盐，蛋白质表面的电荷被大量中和，水化膜被破坏，于是蛋白质分子相互聚集而沉淀析出，此现象称为盐析，不同的蛋白质由于分子表面电荷多少不同，分布情况也不一样，因此不同的蛋白质盐析出来的盐浓度也各异。盐析法就是通过控制盐的浓度，使蛋白质混合液中各个成分分步析出，达到粗分离蛋白质的目的。到目前为止，已知的酶大部分都是蛋白质，因此一般提纯蛋白质的方法也适用于酶的提纯。
三、实验主要仪器设备和材料
高速组织捣碎机、镊子、剪刀、离心管、漏斗、纱布 、透析袋、分析天平、离心机 新鲜猪胰脏、硫酸、固体硫酸铵、酪蛋白溶液、磷酸盐缓冲液、三氯乙酸、氯化钡、氢
氧化钠
四、实验方法、操作步骤
整个操作过程在0-5℃下进行。
1、提取：取新鲜猪胰脏，放在盛有0.125mol/L冷硫酸的容器中，保存在冰箱中待用。去除胰脏表面的脂肪和结缔组织后称量。用组织捣碎机绞碎，然后混悬于2倍体积的0.5mol/L冷硫酸中，放在冰箱中过夜。将上述混悬液离心10分钟，上层液经2层纱布过滤至烧杯中，将沉淀再混悬于等体积的冰冷0.125mol/L硫酸中，再离心，将两次上层液合并，即为提取液。
2、分离：提取液10ml，加固体硫酸铵1.14g达0.2饱和度，放置10分钟，离心（3000r/min）10分钟。弃去沉淀，保留上层液。在上层液中加入固体硫酸铵1.323g达0.5饱和度，放置10分钟离心（3000r/min）10分钟。弃去上层液，保留沉淀。将沉淀溶解于3倍体积的水中，装入透析袋中，用pH为5.0、0.1mol/L乙酸缓冲液透析，直至1%氯化钡检查无白色硫酸钡沉淀产生，然后离心5分钟（3000r/min），弃去沉淀（变性的酶蛋白），保留上清液。在上清液中加硫酸铵（0.39g/L）达到0.6饱和度，放置10分钟，离心10分钟（3000r/min）。弃去清夜，保留沉淀（即为胰凝乳蛋白酶）。
3、结晶：取分离所得的胰凝乳蛋白酶溶于3倍体积的水中。然后加硫酸铵（0.144g/ml）至胰凝乳蛋白酶溶液达0.25饱和度，用0.1mol/L氢氧化钠调节pH至6.0，在室温（25-30℃）放置12h即可出现结晶。
五、实验结果与讨论
在显微镜下观察胰凝乳蛋白酶结晶形状。
计算胰凝乳蛋白酶得率。
讨论影响胰凝乳蛋白酶得率的因素。
六、实验报告记载要求
1、姓名、班级、学号、小组编号、试验开始日期/时间
2、实验报告包括实验目的、实验原理、实验步骤、注意事项、试验结果、误差分析、思考题等。
实验六 薄层色谱法鉴定果汁中的糖
一、实验目的与要求
实验目的：
1、掌握薄层色谱法的分离原理，掌握用薄层色谱法鉴定果汁中糖的操作技术。
2、通过本试验使学生复习以前所学的薄层色谱知识，掌握分离工程实验技能，同时通过本试验使学生熟练掌握薄层板的涂布方法。
3、通过按照给定的研究题目，独立的进行试验，并观察试验中的各种现象，分析总结实验得出的各种数据并撰写相应的研究及实验报告等各过程，来培养学动手能力和独立分析问题能力，并了解学习科学研究的基本过程与要求，提高科学研究的素质，为将来从事科学研究作好基础。
实验要求：
1、复习生物物质分离课程所学到的薄层分离方法，了解影响果汁糖在分离提取过程中的因素。
2、独立查阅相关资料，设计实验方案，并对实验所需的各种药品、玻璃仪器及分析设备列出清单，写出详尽的试验过程及需要。
3、三人一组，互相配合，开展实验，动手完成实验，并记录并分实验中的实验现象、数据，必要时及时修改试验计划。
4、总结试验数据，经教师认定后，撰写实验报告。
二、实验原理、内容
硅胶是吸附剂，适用于酸性和中性物质的分离，在一定条件下，硅胶对各种糖分的吸附机理不同。同时，选择适当的展开剂，利用各种糖分的分配系数的差异，从而达到分离。显色后得到色谱图，与在相同条件下已知糖分的色谱图比较就能鉴定果汁中的糖分。
三、实验主要仪器设备和材料
玻璃板、研钵、层析缸、烘箱、吹风机、喷雾器、离心机
硅胶G、磷酸氢二钠溶液、丙酮、苯胺-二苯胺磷酸、无水乙醇、葡萄糖、果糖、乳糖、异丙醇、羧甲基纤维素钠
四、实验方法、操作步骤
1、制作薄层板：用0.3mol/L磷酸氢二钠溶液把硅胶G调成浆状，立即倒入干净的玻璃板上铺涂成0.25mm厚的薄层（必要时可在溶液中加的羧甲基纤维素钠作粘合剂，加热充分溶解过滤后备用，1g硅胶约加3ml溶液），在空气中干燥，使用前在105℃烘箱，烘烤30
分钟使其活化。
2、提取果汁：取新鲜水果在研钵中或榨汁机种榨取果汁，离心5分钟除去残渣，取1ml 果汁加3ml乙醇，用3000r/min的速度离心30分钟，取上 清液。
3、点样：在薄层一端约2厘米处用铅笔画一横线，用毛细管将新鲜果汁及标准糖液点在薄层板上，每个样品点3-4次，每次点样后用冷风机或间隔一定时间让其自然干燥。
4、展开：在层析缸内倒入展开剂（深1厘米左右），把点过样的薄板放入层析缸内，进行展开，直到展开剂前沿接近薄层板顶端为止，取出薄层板，在溶剂前沿处画一条线，然后用冷风吹干（注意不能把薄层吹坏）。
5、显色：在通风橱中，在薄层板上喷显色剂，随即在100℃下烘烤10-20分钟，注意观察各种糖的颜色和计算Rf，并以此鉴定果汁中的糖分。
五、实验结果与讨论
判断果汁中是否含有乳糖、葡萄糖、果糖。
计算出果汁中所含糖的R f。
六、实验报告记载要求
1、姓名、班级、学号、小组编号、试验开始日期/时间
2、实验报告包括实验目的、实验原理、实验步骤、注意事项、试验结果、误差分析、思考题等。
实验七 离子交换法提取L-精氨酸
一、实验目的与要求
实验目的：
1、掌握离子交换树脂的处理方法和操作，掌握离子交换法静态吸附和洗脱的基本操作。熟悉从胱氨酸母液中提取L-精氨酸的原理和操作。
2、通过本试验使学生复习以前所学的离子交换法、结晶法知识及掌握分离工程实验技能。
3、通过按照给定的研究题目，独立的进行试验，并观察试验中的各种现象，分析总结实验得出的各种数据并撰写相应的研究及实验报告等各过程，来培养学动手能力和独立分析问题能力，并了解学习科学研究的基本过程与要求，提高科学研究的素质，为将来从事科学研究作好基础。
实验要求：
1、复习生物物质分离课程所学到的离子交换树脂方法，了解影响离子交换树脂分离提取物质过程中的因素。
2、独立查阅相关资料，设计实验方案，并对实验所需的各种药品、玻璃仪器及分析设备列出清单，写出详尽的试验过程及需要。
3、三人一组，互相配合，开展实验，动手完成实验，并记录并分实验中的实验现象、数据，必要时及时修改试验计划。
4、总结试验数据，经教师认定后，撰写实验报告。
二、实验原理、内容
L-精氨酸化学名称为α-氨酸δ-胍基戊酸，L-精氨酸容易吸水，为了便于贮存和运输，通常将它制成盐酸盐。L-精氨酸盐酸盐呈白色结晶性粉末，无臭，苦涩味，容易溶于水，0℃和5℃时在水中的溶解度分别为83g/L和400g/L，水溶液呈碱性，等电点pH为10.76，极微溶于水，不溶于乙醚，熔点为224℃。
离子交换法从蛋白质水解液中提取L-精氨酸的基本原理是利用氨基酸的两性电解质的性质，当溶液pH低于氨基酸等电点时，氨基酸以阳离子形式存在，能被阳离子交换树脂吸附；当溶液pH高于氨基酸等电点时，氨基酸以阴离子形式存在，能被阴离子交换树脂吸附。
精氨酸与苯甲醛在碱性和低温条件下，形成溶解度较小的苯亚甲基精氨酸而沉淀，实现精氨酸与其他组分的分离。
三、实验主要仪器设备及材料
回流装置、蒸发装置、磁力搅拌器、干热灭菌箱、水浴锅、抽滤装置、层析缸、毛细管
毛发、活性炭、732树脂
四、实验方法、操作步骤
1、毛发的处理：先用水洗净毛发的污垢、油脂，用水冲洗晒干备用。
2、水解：安装一回流装置，在冷凝管上端接一弯玻璃管，下连一小漏斗，用水封住，避免氯化氢气体自仪器中逸出到空气中。注意小漏斗要刚好接触水面，不伸到水，以免倒吸。称取50g毛发于500ml短颈圆底烧瓶中，加入100ml30%盐酸，并加几小块沸石以避免水解过程中暴沸。在沙浴上（或石棉网上）加热回流3-4小时，其间要保持混合物缓缓沸腾，水解3小时后用双缩尿反应检查蛋白质是否水解完全，如果不呈现双缩尿反应时，则停止加热，否则，仍需继续加热水解至不呈现双缩尿反应为止。
3、胱氨酸母液与处理：利用L-精氨酸极容易溶于水，而氯化铵或氯化钠及部分中性氨基酸在水中溶解度较小的特点，将胱氨酸母液pH调解至7。减压浓缩，0℃下结晶沉淀，过滤，如此反复进行，直至将大部分氯化铵或氯化钠结晶沉淀除去，将最后的滤液稀释3-5倍，加入料液质量1%的活性炭，80-100℃搅拌30分钟，得脱色液。
4、吸附：按原料液体及与732离子交换树脂以5：1的比例装在三角瓶中，搅拌至吸附达到平衡，约搅拌4小时，弃去溶液。
732树脂处理：732树脂在用于氨基酸分离前，先以8-10倍于树脂体积的1mol/L盐酸搅拌浸泡4小时，反复水洗近中性后用8-10倍体积的1mol/L盐酸搅拌浸泡4小时，最后水洗至中性备用。
5、洗脱：加入树脂质量3倍的3mol/L氨水的洗脱液，搅拌约2小时，过滤，得滤液。
6、提取精制：将滤液减压浓缩，在0℃以下，洗脱浓缩液pH至8以上，强烈搅拌下缓慢加入同质量的苯甲醛，待反应完全后，用磁力搅拌器搅拌30分钟以上，至呈白色乳浊液状，于低温下放置24小时，溶液分为两层，上层为清液，下层为油状液，去上清液。下层液用4倍量的6mol/L盐酸酸解，减压蒸馏，除去苯甲醛，得L-精氨酸溶液。
7、浓缩结晶：利用氨基酸在等电点时溶解度最小的特点，调节精制后的L-精氨酸溶液的pH为10.7，减压下浓缩至即将有结晶析出，缓慢搅拌冷却，再缓慢加入4倍量的95%乙醇，于0℃放置24小时，过滤，得L-精氨酸盐酸盐。
8、鉴定 取精制后的L-精氨酸和精氨酸标准品分别配制1%的溶液，做纸层析鉴别。
展开剂为正丁醇-乙酸-乙醇-水（8：2：2：5）。
五、实验结果与讨论
根据纸层析图谱，分析所得成品是否为L-精氨酸，纯度如何。
计算L-精氨酸得率并讨论影响L-精氨酸得率的因素。
六、实验报告记载要求
1、姓名、班级、学号、小组编号、试验开始日期/时间
2、实验报告包括实验目的、实验原理、实验步骤、注意事项、试验结果、误差分析、思考题等。
附录
蛋白质含量的测定:Lowry法(劳里法)
一、原理
Lowry法是双缩脲法(BIure T)和福林酚法(FolIn－酚)的结合与发展。其原理是蛋白质溶液用碱性铜溶液处理后，碱性铜试剂与蛋白质中的肽键作用产生双缩脲反应，形成铜—蛋白质的络合盐。再加入酚试剂后，在碱性条件下，这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，使之生成磷钨蓝和磷钼蓝的混合物。这种溶液蓝色的深浅与蛋白的含量成正相关，所以可以用于蛋白质含量的测定。Lowry法除了使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键的显色效果更强烈，其显色效果比单独使用酚试剂强3-15倍，约是双缩脲法的100倍。由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类不同引起的偏差。Lowry法适于微量蛋白的测定，对多个样品同时测定较为方便。但对不溶性蛋白和膜结合蛋白必须进行预处理(如加入少量的SDS)。
1、双缩脲法的原理：
双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)在碱性溶液中可与铜离子产生紫红色的络合物，这一反应称为双缩脲反应。因为蛋白质中有多个肽键，也能与铜离子发生双缩脲反应，且颜色深浅与蛋白质的含量的关系在一定范围内符合比尔定律，而与蛋白质的氨基酸组成及分子量无关，所以可用双缩脲法测定蛋白质的含量。
双缩脲反应主要涉及肽键，因此受蛋白质特异性影响较小。且使用试剂价廉易得，操作简便，可测定的范围为1-10mg蛋白质，适于精度要求不太高的蛋白质含量的测定，能测出的蛋白质含量须在约0.5mg以上。双缩脲法的缺点是灵敏度差、所需样品量大。干扰此测定的物质包括在性质上是氨基酸或肽的缓冲液，如Tris缓冲液，因为它们产生阳性呈色反应，铜离子也容易被还原，有时出现红色沉淀。
2、福林-酚法的原理:
该方法是双缩脲法的发展，包括两步反应：
(1)在碱性条件下，蛋白质与铜作用生成蛋白质—铜络合物。
(2)此络合物将试剂磷钼酸—磷钨酸(FolIn试剂)还原，混合物呈深蓝色(磷钼蓝和磷钨蓝混合物)，颜色深浅与蛋白质含量成正比。此方法操作简便，灵敏度比双缩脲法高100倍，定量范围为5-100μg蛋白质。FolIn试剂显色反应由酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸引起，因此样品中若含有酚类、柠檬酸和巯基化合物，均有干扰作用。此方法的缺点是有蛋白质的特异性影响，即不同蛋白质因络氨酸、色氨酸含量的不同而使显色强度稍有不同，标准曲线也不是严格的直线形式。
二、仪器与试剂
试管若干；刻度移液管0.5ml 1支，1ml 1支，10ml 1支；定量加样器；圆底烧瓶；冷凝管1套(带橡胶管)；微量滴定管；小烧杯；微量进样器50μl 1支；721分光光度计；恒温水浴器；研钵；玻棒；离心机；离心管。
试剂：Na2WO4·2H2O；Na2MoO4·2H2O；85％H3PO4；浓HCl；Li2SO4·H2O；溴水；酚酞
指示剂；Na2CO3；NaOH；CuSO4·5H2O；酒石酸钾钠；牛血清白蛋白。所用试剂均为化学纯或分析纯。
1、试剂的配制
(1)碱性铜试剂(相当于双缩脲试剂)的制备：首先配制A液：4％碳酸钠溶液与0.2Mol/L氢氧化钠溶液等比例混合(2％Na2CO3，0.1mol NaOH)；B液：1％硫酸铜溶液与2％酒石酸钾钠溶液等比例混合(0.5％CuSO4·5H2O，0.1％酒石酸钾钠)。在使用前将A液与B液按50∶1的比例混合即成。此为FolIn—酚试剂甲液，此试剂只能使用1天。
酚试剂(相当于FolIn试剂)的配备：称取钨酸钠100g、钼酸钠25g，加蒸馏水700ml溶解于1500ml的圆底烧瓶中。之后加入85％的H3PO450ml，浓HCl 100ml，安上回流装置(使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来)，使其慢慢沸腾10h。冷却后加入硫酸锂150g，水50ml，溴水2-3滴，不用回流装置开口煮沸15min，以释放出过量的溴。待冷却后稀释至1000ml，并过滤入棕色瓶中，密闭于冰箱中保存(冷却后溶液呈黄色，倘若仍呈绿色，须再滴加数滴液体溴，继续煮沸15min)。使用时用标准NaOH溶液滴定，以酚酞作为指示剂，滴定终点由蓝变灰，滴定后算出酸的浓度。使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1mol／L H＋酸，此为FolIn－酚试剂乙液。
在测定时要注意，因为酚试剂仅在酸性条件下稳定，但此实验的反应只在pH值为10的情况下发生，所以当加酚试剂时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏前即能发生还原反应，否则会使显色程度减弱。
（2）标准蛋白质溶液的配制：称取25mg牛血清白蛋白，溶于100ml蒸馏水中，使最终浓度为250μg／ml。
三、测定步骤
标准曲线的绘制
(1)取7支试管，编号后，分别加入0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml 标准蛋白质溶液，用蒸馏水补足1ml，使每管含蛋白量分别为0μg、25μg、50μg、100μg、150μg、200μg、250μg(必要时可做重复)。
(2)在每支试管中用定量加样器加入5ml甲液，混匀，于30℃下放置10min。
(3)在每支试管中喷射加入0.5ml乙液，立即振荡混匀，在30℃下保温30min。
(4)准确到30min后，以不加标准蛋白试管中的溶液为空白，在500nm下用1cm光径的比色杯对系列标准蛋白溶液进行比色，测定光密度值。以蛋白浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。
样品的测定
（1）样品的提取：称取鲜样0.5g，用5ml蒸馏水或缓冲液研磨提取。
（2）取1.0ml(视蛋白质含量适当稀释)样液加入试管中，然后重复步骤2的(2)、(3)、(4)，以标准曲线中的0管为空白，测定吸光值。
(3) 根据吸光值查标准曲线，求出比色液中的蛋白质含量。
四、实验结果
样品中蛋白的含量(Mg/g)＝C×V T V1×F W×1000
式中C:查标准曲线值(μg)； V T:提取液总体积(Ml)；
F W:样品鲜重(g)； V1:测定时加样量(Ml)。
五、注意
还原物质，其他酚类物质及柠檬酸对此反应有干扰。
主要参考书
《生物工艺学》，俞俊棠主编，华东理工大学出版社，1992年。
《生物分离与纯化技术》，辛秀兰主编，科学出版社，2005年。
《生化分离技术》，于文国主编，化学工业出版社，2006年。 附录：
生物分离工程期末考试试卷B
试卷编号： 一、名词解释题（本大题共3小题，每小题3分，总计9分） 1.Bioseparation Engineering：回收生物产品分离过程原理与方法。 2.双水相萃取：某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可形成两相， 并且在两相中水分均占很大比例，即形成双水相系统(two aqueous phase system)。 利用亲水性高分子聚合物的水溶液可形成双水相的性质，Albertsson于50年代 后期开发了双水相萃取法(two aqueous phase extraction)，又称双水相分配法(two aqueous phase partitioning)。 3.电渗：在电场作用下，带电颗粒在溶液中的运动。 二、辨别正误题并改正，对的打√，错的打×（本大题共15小题，每小题2分，总计30分） 1.壳聚糖能应用于发酵液的澄清处理是由于架桥作用。错（不确定） 2.目前国内工业上发酵生产的发酵液是复杂的牛顿性流体,滤饼具有可压缩性。错 3.盐析仅与蛋白质溶液PH和温度有关，常用于蛋白质的纯化。错 4.超临界流体是一种介于气体和液体之间的流体，可用于热敏性生物物质的分离。 对 5.膜分离时，当截留率δ=1时,表示溶质能自由透过膜。错 6.生产味精时，过饱和度仅对晶体生长有贡献。对 7.阴离子纤维素类离子交换剂能用于酸性青霉素的提取。对 8.卡那霉素晶体的生产可以采用添加一定浓度的甲醇来沉淀浓缩液中的卡那霉 素。 9.凝胶电泳和凝胶过滤的机理是一样的。错 10.PEG-硫酸钠水溶液能用于淀粉酶的提取。对 11.乙醇能沉淀蛋白质是由于降低了水化程度和盐析效应的结果。对 12.冷冻干燥一般在-20℃—-30℃下进行，干燥过程中可以加入甘油、蔗糖等作为保 护剂。对 13.反相层析的固定相和流动相都含有高极性基团，可用来分离生物物质。错 14.大网格吸附剂由于在制备时加入致孔剂而具有大孔径、高交联度，高比表面积 的特点。错（不确定） 15.PEG沉淀蛋白质是基于体积不相容性。错 三、选择题（本大题共10小题，每小题2分，总计20分） 1.对于反胶束萃取蛋白质，下面说法正确的是：A A 在有机相中，蛋白质被萃取进表面活性剂形成的极性核里 B 加入助溶剂，可用阳离子表面活性剂CTAB萃取带正电荷的蛋白质 C 表面活性剂浓度越高越好 D 增大溶液离子强度，双电层变薄，可提高反胶束萃取蛋白质的能力 2.能进行海水脱盐的是：C A 超滤 B 微滤
生物分离工程答案1
《生物分离工程》练习题一（第1~3章） 一、选择题 1、下列物质不属于凝聚剂的有（ C ）。 A、明矾 B、石灰 C、聚丙烯类 D、硫酸亚铁 2、发酵液的预处理方法不包括（C ） A. 加热B絮凝 C.离心 D. 调pH 3、其他条件均相同时，优先选用那种固液分离手段（B ） A. 离心分离B过滤 C. 沉降 D.超滤 4、那种细胞破碎方法适用工业生产（ A ） A. 高压匀浆B超声波破碎 C. 渗透压冲击法 D. 酶解法 5、为加快过滤效果通常使用（ C ） A.电解质B高分子聚合物 C.惰性助滤剂 D.活性助滤剂 6、不能用于固液分离的手段为（ C ） A.离心B过滤 C.超滤 D.双水相萃取 7、下列哪项不属于发酵液的预处理：（ D ） A.加热 B.调pH C.絮凝和凝聚 D.层析 8、能够除去发酵液中钙、镁、铁离子的方法是（ C ） A．过滤B．萃取C．离子交换D．蒸馏 9、从四环素发酵液中去除铁离子,可用（ B ） A．草酸酸化B．加黄血盐C．加硫酸锌D．氨水碱化 10、盐析法沉淀蛋白质的原理是（ B ） A.降低蛋白质溶液的介电常数 B.中和电荷，破坏水膜 C.与蛋白质结合成不溶性蛋白 D.调节蛋白质溶液pH到等电点 11、使蛋白质盐析可加入试剂（ D ） A：氯化钠；B：硫酸；C：硝酸汞；D：硫酸铵 12、盐析法纯化酶类是根据（ B ）进行纯化。 A.根据酶分子电荷性质的纯化方法 B.调节酶溶解度的方法 C.根据酶分子大小、形状不同的纯化方法 D.根据酶分子专一性结合的纯化方法 13、盐析操作中，硫酸铵在什么样的情况下不能使用（ B ） A.酸性条件B碱性条件 C.中性条件 D.和溶液酸碱度无关 14、有机溶剂沉淀法中可使用的有机溶剂为（ D ） A.乙酸乙酯B正丁醇 C.苯 D.丙酮 15、有机溶剂为什么能够沉淀蛋白质（ B ） A.介电常数大B介电常数小 C.中和电荷 D.与蛋白质相互反应 16、蛋白质溶液进行有机溶剂沉淀，蛋白质的浓度在（ A ）范围内适合。 A. 0.5％～2％B1％～3％ C. 2％～4％ D. 3％～5％ 17、生物活性物质与金属离子形成难溶性的复合物沉析，然后适用（ C ）去除金属离子。 A. SDS B CTAB C. EDTA D. CPC 18、单宁沉析法制备菠萝蛋白酶实验中，加入1%的单宁于鲜菠萝汁中产生沉淀，属于( D )沉析原理。 A盐析B有机溶剂沉析C等电点沉析D有机酸沉析 19、当向蛋白质纯溶液中加入中性盐时，蛋白质溶解度（ C ）
生物分离工程期末复习
生物分离工程复习题 第一章绪论 简答题： 1、简述生物分离技术的基本涵义及内容。 答：基本涵义：生物分离技术是指从动植物与微生物的有机体或器官、生物工程产物（发酵液、培养液）及其生物化学产品中提取、分离、纯化有用物质的技术过程。 内容主要包括：离心分离、过滤分离、泡沫分离、萃取分离、沉淀（析）分离、膜分离、层析（色谱）分离、电泳分离技术以及产品的浓缩、结晶、干燥等技术。 2、物质分离的本质是有效识别混合物中不同溶质间物理、化学和生物学性质的差别，利用能够识别这些差别的分离介质和扩大这些差别的分离设备实现溶质间的分离或目标组分的纯化。请从物质的理化性质和生物学性质几个方面简述生物活性物质分离纯化的主要原理。 答：生物大分子分离纯化的主要原理是： 1）根据分子形状和大小不同进行分离，如差速离心与超离心、膜分离、凝胶过滤等； 2）根据分子电离性质（带电性）差异进行分离，如离子交换法、电泳法、等电聚焦法； 3）根据分子极性大小及溶解度不同进行分离，如溶剂提取法、逆流分配法、分配层析法、盐析法、等电点沉淀及有机溶剂分级沉淀等； 4）根据物质吸附性质的不同进行分离，如选择性吸附与吸附层析等； 5）根据配体特异性进行分离，如亲和层析法等。 填空题： 1.为了提高最终产品的回收率：一是提高每一级的回收率，二是减少操作 步骤。 2、评价一个分离过程效率的三个主要标准是：①浓缩程度②分离纯化程
度③回收率。 判断并改错： 原料目标产物的浓度越高，所需的能耗越高，回收成本越大。(×)改：原料目标产物的浓度越低。 选择题： 1. B 可以提高总回收率。 A.增加操作步骤 B.减少操作步骤 C.缩短操作时间 D.降低每一步的收率2．分离纯化早期，由于提取液中成分复杂，目的物浓度稀，因而易采用（ A ） A、分离量大分辨率低的方法 B、分离量小分辨率低的方法 C、分离量小分辨率高的方法 D、各种方法都试验一下，根据试验结果确定 第二章细胞分离与破碎 概念题： 过滤：是在某一支撑物上放多孔性过滤介质，注入含固体颗粒的溶液，使液体通过，固体颗粒被截留，是固液分离的常用方法之一。 离心过滤：使悬浮液在离心力作用下产生离心压力，使液体通过过滤介质成为滤液，而固体颗粒被截留在过滤介质表面，从而实现固液分离，是离心与过滤单元操作的集成，分离效率更高。 填空题： 1.在细胞分离中，细胞的密度ρ S 越大，细胞培养液的密度ρ L 越小，则细 胞沉降速率越大。 2.过滤中推动力要克服的阻力有介质阻力和滤饼阻力，其中滤饼占主导作 用。 3.重力沉降过程中，固体颗粒受到重力，浮力，摩擦阻力的作用，当 固体匀速下降时，三个力的关系重力=浮力+摩擦阻力。 4.区带离心包括差速区带离心和平衡区带离心。
生物物质分离工程
生物物质分离工程实验 李菊娣 编 辽宁石油化工大学环境工程系 二○○七年三月
生物物质的分离、提取实验是以实验操作为主的技能课程，是生物工程专业学生的必修课，是在学习《分析化学》、《生物化学》《微生物学》、《发酵工程》、《生物分离工程》等专业基础课及专业实验课的基础上开设的课程。目的在于通过本课程的实验训练，使学生对整个生物工程下游生产过程有一个全面的认识和理解，既可培养他们实际操作的技能，又可达到提高他们理论联系实际能力的目的。通过学习，使学生能够掌握物质分离常用的纯化方法和常见的分离设备，为以后的学习和科研工作打下良好的基础。 实验一、微生物细胞的破碎及分离 实验二、青霉素的萃取及萃取率的计算 实验三、醋酸丁酯萃取红霉素 实验四、牛奶中酪蛋白和乳蛋白素粗品的制备 实验五、胰凝乳蛋白酶的制备 实验六、薄层色谱法鉴定果汁中的糖 实验七、离子交换法提取L-精氨酸 备注：实验二、三选作其一；实验五、六选作其一。
实验一 微生物细胞的破碎及分离 一、实验目的与要求 实验目的： 1、掌握超声波细胞破碎的原理和技术，学习细胞破碎率的评价方法。 2、通过本试验使学生复习以前所学的分离知识及掌握微生物学实验、发酵工程实验技能，同时通过本试验使学生掌握超声波破碎仪的使用。 3、通过按照给定的研究题目，独立的进行试验，并观察试验中的各种现象，分析总结实验得出的各种数据并撰写相应的研究及实验报告等各过程，来培养学动手能力和独立分析问题的能力，并了解学习科学研究的基本过程与要求，提高科学研究的素质，为将来从事科学研究打好基础。 实验要求： 1、复习生物物质分离课程所学到的微生物细胞的分离方法，了解影响微生物细胞的破碎因素。 2、独立查阅相关资料，设计实验方案，并对实验所需的各种药品、玻璃仪器及分析设备列出清单，写出详尽的试验过程及需要。 3、三人一组，互相配合，开展实验，动手完成实验，并记录并分析实验中的实验现象、数据，必要时及时修改试验计划。 4、总结试验数据，经教师认定后，撰写实验报告。 二、实验原理、内容 频率超过15-20 kHZ的超声波，在较高的输入功率下（100-250W）可破碎细胞。其工作原理是：超声波细胞粉碎机由超声波发生器和换能器两个部分组成。超声波发生器是将220V、50Hz的单相电通过变频器件变为20-25Hz、约600V的交变电能，并以适当的阻抗与功率匹配来推动换能器工作，做纵向机械振动，振动波通过浸入在样品中钛合金变副杆对破碎的各类细胞产生空化效应，从而达到破碎细胞的目的。 三、实验主要仪器设备和材料 超声波细胞破碎机、显微镜、酒精灯、载玻片、血球计数板 接种所需材料 1、酵母细胞悬浮液：0.2g/ml 的啤酒酵母溶于50mmol/L乙酸钠-乙酸缓冲溶液（pH=4.7）。 2、土豆培养基：土豆（去皮切块）200g；琼脂20g；蔗糖20g；蒸馏水1000ml。选优质土豆去皮切块，加水煮沸30min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补充加水至1000ml,粉状，115℃灭菌20min。
生物分离技术题库(带答案)
题库名称:生物分离技术 一、名词解释 1.质量作用定律:化学反应得速率与参加反应得物质得有效质量成正比。 2.凝聚:在电解质作用下,破坏细胞菌体与蛋白质等胶体粒子得分散状态,使胶体粒子聚集得过程。 3.分配系数:在一定温度、压力下,溶质分子分布在两个互不相溶得溶剂里,达到平衡后,它在两相得浓度为一常数叫分配系数。 4.干燥速率:干燥时单位干燥面积,单位时间内漆画得水量。 5.CMSephadex C50:羧甲基纤维素、弱酸性阳离子交换剂,吸水量为每克干胶吸水五克。 6.絮凝:指在某些高分子絮凝剂存在下,在悬浮粒子之间发生架桥作用而使胶粒形成粗大得絮凝团得过程 7.过滤:就是在某一支撑物上放过滤介质,注入含固体颗粒得溶液,使液体通过,固体颗粒留下,就是固液分离得常用方法之一。 8.萃取过程:利用在两个互不相溶得液相中各种组分(包括目得产物)溶解度得不同,从而达到分离得目得 9.吸附:就是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择性吸附得能力,使其富集在吸附剂表面得过程。 10.反渗析:当外加压力大于渗透压时,水将从溶液一侧向纯水一侧移动,此种渗透称之为反渗透。 11.离心沉降:利用悬浮液或乳浊液中密度不同得组分在离心力场中迅速沉降分层,实现固液分离 12.离心过滤:使悬浮液在离心力场作用下产生得离心力压力,作用在过滤介质上,使液体通过过滤介质成为滤液,而固体颗粒被截留在过滤介质表面,从而实现固液分离,就是离心与过滤单元操作得集成,分离效率更高 13.离子交换:利用离子交换树脂作为吸附剂,将溶液中得待分离组分,依据其电荷差异,依靠库仑力吸附在树脂上,然后利用合适得洗脱剂将吸附质从树脂上洗脱下来,达到分离得目得。 14.固相析出技术:利用沉析剂(precipitator)使所需提取得生化物质或杂质在溶液中得溶解度降低而形成无定形固体沉淀得过程。 15.助滤剂:助滤剂就是一种具有特殊性能得细粉或纤维,它能使某些难以过滤得物料变得容易过滤 16.沉降:就是指当悬浮液静置时,密度较大得固体颗粒在重力得作用下逐渐下沉,这一过程成为沉降 17.色谱技术:就是一组相关分离方法得总称,色谱柱得一般结构含有固定相(多孔介质)与流动相,根据物质在两相间得分配行为不同(由于亲与力差异),经过多次分配(吸附解吸吸附解吸…),达到分离得目得。 18.有机溶剂沉淀:在含有溶质得水溶液中加入一定量亲水得有机溶剂,降低溶质得溶解度,使其沉淀析出。 19.等电点沉淀:调节体系pH值,使两性电解质得溶解度下降,析出得操作称为等电点沉淀。 20.膜分离:利用膜得选择性(孔径大小),以膜得两侧存在得能量差作为推动力,由于溶液中各组分透过膜得迁 移率不同而实现分离得一种技术。 21.化学渗透破壁法:某些化学试剂,如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等,可以改变细胞壁或细胞膜得通透性,从而使胞内物质有选择地渗透出来。 22.超临界流体:超临界流体就是状态超过气液共存时得最高压力与最高温度下物质特有得点——临界点后得流体。 23.临界胶团浓度:将表面活性剂在非极性有机溶剂相中能形成反胶团得最小浓度称为临界胶团浓度,它与表面活性剂种类有关。 24.反渗透:在只有溶剂能通过得渗透膜得两侧,形成大于渗透压得压力差,就可以使溶剂发生倒流,使溶液达到浓缩得效果,这种操作成为反渗透。 25.乳化液膜系统:乳化液膜系统由膜相、外相与内相三相组成,膜相由烷烃物质组成,最常见得外相就是水相,内相一般就是微水滴。 26.树脂工作交换容量:单位质量干树脂或单位体积湿树脂所能吸附得一价离子得毫摩尔数称为树脂交换容量,在充填柱上操作达到漏出点时,树脂所吸附得量称为树脂工作交换容量。 27.色谱阻滞因数:溶质在色谱柱(纸、板)中得移动速率与流动相移动速率之比称为阻滞因数,以Rf表示。 28.胶团:两性表面活性剂在非极性有机溶剂中亲水性基团自发地向内聚集而成得,内含微小水滴得,空间尺度仅为纳米级得集合型胶体。 29.膜得浓差极化:就是指但溶剂透过膜,而溶质留在膜上,因而使膜面浓度增大,并高于主体中浓度。 30.超滤:凡就是能截留相对分子量在500以上得高分子膜分离过程称为超滤,它主要就是用于从溶剂或小分子溶质中将大分子筛分出来。 31、生物分离技术:就是指从动植物与微生物得有机体或器官、生物工程产物(发酵液、培养液)及其生物化学产品中提取、分离、纯化有用物质得技术过程。 32、离心分离技术:就是基于固体颗粒与周围液体密度存在差异,在离心场中使不同密度得固体颗粒加速沉降得分离过程。 33.物理萃取:即溶质根据相似相溶得原理在两相间达到分配平衡,萃取剂与溶质之间不发生化学反应。 34.化学萃取:则利用脂溶性萃取剂与溶质之间得化学反应生成脂溶性复合分子实现溶质向有机相得分配。 35.盐析:就是利用不同物质在高浓度得盐溶液中溶解度得差异,向溶液中加入一定量得中性盐,使原溶解得物质沉淀析出得分离技术。
《生物分离工程》复习内容提要
2009级《生物分离工程》复习内容提要 第一章绪论：重点节：第二节、第三节 1、生物分离工程的一般流程Page4 2、生物分离纯化工艺过程的选择依据Page5 3、生物分离过程的特点Page6 第二章发酵液的预处理：重点节：第一节 1、发酵液的一般特性Page9 2、发酵液预处理的要求Page10-11 3、发酵液预处理的方法Page11-16 4、凝集&絮凝Page11-12 5、转筒真空过滤机的结构和工作原理Page27-28 第三章细胞分离技术：重点节：第二节
1、差速离心&密度梯度离心Page31 2、比较不同细胞破碎方法（机械法、化学法、物理法和酶溶法）的原理和优缺点Page34-39 3、比较珠磨法、高压匀浆法和超声波细胞破碎法的优缺点Page34-36 4、细胞破碎的方法主要有哪些？选择破碎方法时应考虑哪些因素？（自己总结） 5、蛋白质复性及其主要复性方法（稀释与透析、色谱、反胶束）Page41-45 第四章沉淀技术：重点节：第三节 1、盐析的原理Page51 2、K s和β分级盐析法Page52 3、什么是饱和度？盐析沉淀操作曲线的制作实验步骤Page54 4、盐析操作计算Page53-54 5、主要的沉淀方法（盐析、有机溶剂、等电点、变性沉淀等）及其优缺点比较Page27-28
第五章萃取技术：重点节：第二节（二）、第三节（二、三）、第四节（一、二、四）、第六节（一、二）、第八节（一、二、三、四） 1、萃取分配系数、相比、萃取分离系数Page65 2、单级萃取、多级逆流萃取、多级错流萃取理论收率和萃余率的计算Page67-70 3、物理萃取&化学萃取Page72-73 4、水相条件如何影响有机溶剂萃取过程Page73-74 5、有机溶剂萃取剂的选择原则Page74 6、解释双水相相图Page81 7、常用的双水相系统有哪些？Page80-81 8、什么是道南电位Page82，试述道南平衡理论在双水相萃取、纳滤膜分离机制和离子交换 树脂分离机制解释中的应用。（自己总结） 9、影响双水相分配系数的主要因素有哪些？Page83-84
生物分离工程期末复习题
填空题 1. .根据吸附剂与吸附质之间存在的吸附力性质的不同，可将吸附分为物理吸附、化学吸附和交换吸附； 2. 比表面积和孔径是评价吸附剂性能的主要参数。 3. 层析操作必须具有固定相和流动相。 4. 溶质的分配系数大，则在固定相上存在的几率大，随流动相的移动速度 小。 5. 层析柱的理论板数越多，则溶质的分离度越大。 6. 两种溶质的分配系数相差越小，需要的越多的理论板数才能获得较大的 分离度。 7. 影响吸附的主要因素有吸附质的性质，温度，溶液pH值，盐的浓度和吸附物的浓度与吸附剂的用量； 8. 离子交换树脂由网络骨架（载体），联结骨架上的功能基团（活性基）和可交换离子组成。 9. 电泳用凝胶制备时，过硫酸铵的作用是引发剂（提供催化丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基）；甲叉双丙烯酰胺的作用是交联剂（丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺催化剂的作用下聚合而成的含酰胺基侧链的脂肪族长链）；TEMED的作用是增速剂（催化过硫酸胺形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合）； 10. 影响盐析的因素有溶质种类，溶质浓度，pH 和温度； 11. 在结晶操作中，工业上常用的起晶方法有自然起晶法，刺激起晶法和晶种起晶法； 12. 简单地说离子交换过程实际上只有外部扩散、部扩散和化学交换反应三步；
13. 在生物制品进行吸附或离子交换分离时，通常遵循Langmuir 吸附方程，其形式为c K c q q 0+= 14. 反相高效液相色谱的固定相是 疏水性强 的，而流动相是 极性强 的； 15. 等电聚焦电泳法分离不同蛋白质的原理是依据其 等电点 的不同； 16. 离子交换分离操作中，常用的洗脱方法有 静态洗脱 和 动态洗脱 ； 17. 晶体质量主要指 晶体大小 ， 形状 和 纯度 三个方面； 18. 亲和吸附原理包括 配基固定化 ， 吸附样品 和 样品解析 三步； 19. 根据分离机理的不同，色谱法可分为 吸附、离交、亲和、凝胶过滤色谱 20. 蛋白质分离常用的色谱法有 免疫亲和色谱法， 疏水作用色谱法 ， 金属螯合色谱法 和 共价作用色谱法 ； 21. SDS-PAGE 电泳制胶时，加入十二烷基磺酸钠（SDS ）的目的是消除各种待分离蛋白的 分子形状 和 电荷 差异，而将 分子量 作为分离的依据；加入二硫叔糖醇的目的是 强还原剂，破坏半胱氨酸间的二硫键 ； 22. 影响亲和吸附的因素有 配基浓度 、 空间位阻 、 配基与载体的结合位点 、 微环境 和 载体孔径 ； 23. 阳离子交换树脂按照活性基团分类，可分为 强酸性阳离子交换树脂 、 弱酸性 和 中强酸性 ；其典型的活性基团分别有 3 、 COOH - 、2)(OH PO -； 24. 阴离子交换树脂按照活性基团分类，可分为强碱性、 弱碱性 和 中强碱 性 ；其典型的活性基团分别有-+OH CH RN 33)(、2NH -、兼有以上两种基团； 25. 影响离子交换选择性的因素有 离子水合半径 、 离子价 、 离子强度 、 溶液pH ，温度 、溶液浓度 、 搅拌速率 、和 交联度、膨胀度、颗粒大小 ；
生物分离工程复习题一(第1-9章16K含答案)
1、下列物质不属于凝聚剂的有（C）。 A、明矾 B、石灰 C、聚丙烯类 D、硫酸亚铁 2、发酵液的预处理方法不包括（C） A. 加热B絮凝 C.离心 D. 调pH 3、其他条件均相同时，优先选用哪种固液分离手段（B） A. 离心分离B过滤 C. 沉降 D.超滤 4、那种细胞破碎方法适用工业生产（A） A. 高压匀浆B超声波破碎 C. 渗透压冲击法 D. 酶解法 5、为加快过滤效果通常使用（C） A.电解质B高分子聚合物 C.惰性助滤剂 D.活性助滤剂 6、不能用于固液分离的手段为（C） A.离心B过滤 C.超滤 D.双水相萃取 7、下列哪项不属于发酵液的预处理：（D ） A.加热 B.调pH C.絮凝和凝聚 D.层析 8、能够除去发酵液中钙、镁、铁离子的方法是（C） A．过滤B．萃取C．离子交换D．蒸馏 9、从四环素发酵液中去除铁离子，可用（B） A．草酸酸化B．加黄血盐C．加硫酸锌D．氨水碱化 10、盐析法沉淀蛋白质的原理是（B） A.降低蛋白质溶液的介电常数 B.中和电荷，破坏水膜 C.与蛋白质结合成不溶性蛋白 D.调节蛋白质溶液pH到等电点 11、使蛋白质盐析可加入试剂（D） A：氯化钠；B：硫酸；C：硝酸汞；D：硫酸铵 12、盐析法纯化酶类是根据（B）进行纯化。 A.根据酶分子电荷性质的纯化方法 B.调节酶溶解度的方法 C.根据酶分子大小、形状不同的纯化方法 D.根据酶分子专一性结合的纯化方法 13、盐析操作中，硫酸铵在什么样的情况下不能使用（B） A.酸性条件B碱性条件 C.中性条件 D.和溶液酸碱度无关 14、有机溶剂沉淀法中可使用的有机溶剂为（D） A.乙酸乙酯B正丁醇 C.苯 D.丙酮 15、有机溶剂为什么能够沉淀蛋白质（B） A.介电常数大B介电常数小 C.中和电荷 D.与蛋白质相互反应 16、蛋白质溶液进行有机溶剂沉淀，蛋白质的浓度在（A）范围内适合。 A. ％～2％B1％～3％ C. 2％～4％ D. 3％～5％ 17、生物活性物质与金属离子形成难溶性的复合物沉析，然后适用（C ）去除金属离子。 A. SDS B CTAB C. EDTA D. CPC 18、单宁沉析法制备菠萝蛋白酶实验中，加入1%的单宁于鲜菠萝汁中产生沉淀，属于(D )沉析原理。 A盐析B有机溶剂沉析C等电点沉析D有机酸沉析
生物分离技术复习题
选择题： 1．HPLC是哪种色谱的简称（）。 A．离子交换色谱 B.气相色谱 C.高效液相色谱 D.凝胶色谱 2．针对配基的生物学特异性的蛋白质分离方法是（）。 A.凝胶过滤 B.离子交换层析 C.亲和层析 D.纸层析 3．盐析法沉淀蛋白质的原理是（） A.降低蛋白质溶液的介电常数 B.中和电荷，破坏水膜 C.与蛋白质结合成不溶性蛋白 D.调节蛋白质溶液pH到等电点 4．从组织中提取酶时，最理想的结果是（） A.蛋白产量最高 B.酶活力单位数值很大 C.比活力最高 D.Km最小 5．适合于亲脂性物质的分离的吸附剂是（）。 A．活性炭 B.氧化铝 C.硅胶 D.磷酸钙 6．下列哪项酶的特性对利用酶作为亲和层析固定相的分析工具是必需的？（） A.该酶的活力高 B.对底物有高度特异亲合性 C.酶能被抑制剂抑制 D.最适温度高 E.酶具有多个亚基 7．用于蛋白质分离过程中的脱盐和更换缓冲液的色谱是（） A．离子交换色谱 B.亲和色谱 C.凝胶过滤色谱 D.反相色谱 8．适合小量细胞破碎的方法是（） 高压匀浆法 B.超声破碎法 C.高速珠磨法 D.高压挤压法 9．盐析法沉淀蛋白质的原理是（） A.降低蛋白质溶液的介电常数 B.中和电荷，破坏水膜 C.与蛋白质结合成不溶性蛋白 D.调节蛋白质溶液pH 到等电点 10．蛋白质分子量的测定可采用（）方法。 A．离子交换层析 B.亲和层析 C.凝胶层析 D.聚酰胺层析 11．基因工程药物分离纯化过程中，细胞收集常采用的方法（） A．盐析 B.超声波 C.膜过滤 D.层析 12．离子交换剂不适用于提取（）物质。 A．抗生素 B.氨基酸 C.有机酸 D.蛋白质 13．人血清清蛋白的等电点为4.64，在PH为7的溶液中将血清蛋白质溶液通电，清蛋白质分子向（） A ：正极移动；B：负极移动；C：不移动；D：不确定。 14．蛋白质具有两性性质主要原因是（） A：蛋白质分子有一个羧基和一个氨基；B：蛋白质分子有多个羧基和氨基；C：蛋白质分子有苯环和羟基；D：以上都对 15．使蛋白质盐析可加入试剂（） A.氯化钠； B.硫酸； C.硝酸汞； D.硫酸铵 16．凝胶色谱分离的依据是（）。 A、固定相对各物质的吸附力不同 B、各物质分子大小不同 C、各物质在流动相和固定相中的分配系数不同 D、各物质与专一分子的亲和力不同 17．非对称膜的支撑层（）。 A、与分离层材料不同 B、影响膜的分离性能 C、只起支撑作用 D、与分离层孔径相同 18．下列哪一项是强酸性阳离子交换树脂的活性交换基团（） A 磺酸基团（-SO3 H） B 羧基-COOH C 酚羟基C6H5OH D 氧乙酸基-OCH2COOH 19．依离子价或水化半径不同，离子交换树脂对不同离子亲和能力不同。树脂对下列离子亲和力排列顺序正确的有（）。 A、Fe3+﹥Ca2+﹥Na+ B、Na+﹥Ca2+﹥Fe3+ C、Na+﹥Rb+﹥Cs+ D、Rb+﹥Cs+﹥Na+ 20．乳化液膜的制备中强烈搅拌（）。
生物分离工程
（最好能有时间过过ppt） 生物分离工程第一章绪论 1.定义：生产粗原料的过程及其之后的目标产物的分离纯化过程，即下游加工过程； 2.下游加工过程：目标产物的分离纯化。包括目标产物的提取、浓缩、纯化及成品化等 3.特点及其重要性：(1)发酵液或培养液是产物浓度很低的水溶液； (2)培养液是多组分的混合物；(3)生化产物的稳定性差——易引起产物失活；(4)对最终产品的质量要求很高。 4.下游加工过程的一般流程:(1)下游加工过程的一般流程;（2）初步纯化;（3）高度纯化与精制;（4）成品加工 5.分离效率的评价:目标产品的浓缩程度/分离纯化程度/回收率 6.提高回收率的方法：（1）提高每步回收率 ，（2）减少操作步骤；（3）开发新型高效的分离方法 第二章发酵液预处理和固液分离 首先要进行培养液的预处理和固液分离，才能进行后续操作： 对于胞外产物，可先将菌体或其他悬浮杂质去除，才能从澄清的滤液中提取代谢产物。 对于胞内产物，首先富集菌体，再进行细胞破碎和碎片分离，然后提取胞内产物。 1.发酵液的基本特性：发酵产物浓度较低，大多为1-10%； 悬浮物颗粒小，细胞的相对密度与培养液相似；固体粒子可压缩性大；液相粘度大，大多为非牛顿型流体，不易过滤；悬浮状态稳定：双电层、水化膜、布朗运动成分复杂，杂质较多。 2.预处理的目的：促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率：⑴改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸，降低液体黏度；⑵相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（高价无机离子和杂蛋白质），以利于后续各步操作； ⑶尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多数是液相）。 3.预处理手段：絮凝与凝聚处理过程就是将化学药剂预先投加到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使其聚集起来,增大体积以便固液分离。常用于菌体细小而且黏度大的发酵液的预处理中。其余手段：加热，调节pH。 凝聚：胶体粒子在中性盐促进下脱稳相互聚集成大粒子（1mm）， 机理：1）中和粒子表面电荷; 2）消除双电层结构;3）破坏水化膜。 胶体双电层结构：发酵液中菌体表面带有负电荷，由于静电引力使溶液中反离子被吸附在其周围，在界面上形成了双电层。正离子同时受到使它们均匀分布的热运动影响，具有离开胶粒表面的趋势。对带负电性菌体的发酵液，高价阳离子的存在，可压缩扩散层的厚度，促使ζ电位迅速降低，而且化合价越高，这种影响越显著。 电解质的凝聚能力可用凝聚价或凝聚值来表示，使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度（毫摩尔／升），称为凝聚价或凝聚值。Schulze－Hardy法则（叔采-哈代）：反离子的价数越高，凝聚价越小，即凝聚能力越强。 絮凝：使用絮凝剂（天然和合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。絮凝剂主要起架桥作用。机理：架桥作用。 4.加热作用：发酵液预处理最简单最常用的方法。加热能改善发酵液的操作特性。只适用于对热较稳定的液体。注意加热温度与时间，不影响产物活性和细胞的完整性。 5.影响发酵液固液分离的因素：1）发酵液中悬浮粒子的大小； 2）发酵液的黏度viscosity，粘度越大，固液分离越困难。 6.板框压滤机：其过滤推动力来自泵产生的液压或进料贮槽中的气压。1）广泛应用于培养基制备的过滤及霉菌、放线菌、酵母菌和细菌等多种发酵液的固液分离。适合于固体含量1-10%的悬浮液的分离。 2）板框式压滤机在过滤时，悬浮液由离心泵或齿轮泵经滤浆通道打人框内，滤液穿过滤框两侧滤布，沿相邻滤板沟槽流至滤液出口，固体则被截留于框内形成滤饼。滤饼充满滤框后停止过滤。 3）优点：过滤面积大，结构简单，价格低，动力消耗少，对不同过滤特性的发酵液适应性强。它最重要的特征是通过过滤介质时产生的压力降可以超过0.1MPa,这是真空过滤器无法达到的。 4）缺点：不能连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条件差，非过滤的辅助时间较长。 7.错流过滤原理：液体的流向和滤膜相切。在压力推动下，悬浮液以高速在管状滤膜的内壁作切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质表面的固体（滤饼）移走，而附着在滤膜上的滤饼很薄，因而能在长时间内保持稳定不变的过滤速度。目前适用于小分子的分离。 特点：收率高（97-98%）、质量好、减少处理步聚、染菌罐也能进行处理、介质阻力大、不能得到干滤饼、需要大的膜面积。
生物分离工程期末复习资料
第一章 1．生物分离工程的一般过程P4 答：①发酵液的预处理主要采用凝聚和絮凝等技术来加速固相，液相分离，提高过滤速度。过滤、离心是其最基本的单元操作。 ②产物的提取采用沉淀、吸附、萃取、超滤等单元操作。 ③产物的精制常采用色谱分离技术，有层析、离子交换、亲和色谱、吸附色谱、电色谱。 ④成品的加工处理浓缩、结晶、干燥 第二章 一、概念： 1.发酵液的预处理：指采用凝聚和絮凝等技术来加速固相、液相分离，提高过滤速度。 2.凝集（凝聚）：指在投加的化学物质（如水解的凝聚剂，铝、铁的盐类或石灰等）作用下，发酵液中的 胶体脱稳并使粒子相互凝集成为1mm大小块状絮凝体的过程。 3.絮凝：指某些高分子絮凝剂能在悬浮粒子之间产生桥梁作用，使胶粒形成粗大絮凝团的过程。 4.离心分离：指在离心场的作用下，将悬浮液中的固相和液相加以分离的方法。主要用于颗粒较细的悬 浮液和乳浊液的分离。（分为差示离心、均匀介质离心、密度梯度离心、等密度梯度离心和平衡等密度离心。） 5.等电点沉淀法：利用蛋白质等两性化合物在等电点时溶解度最低，易产生沉淀的性质，用酸化剂或碱化 剂调节发酵液的pH，使其达到菌体蛋白的等电点而产生沉淀。 二、填空： 1、按过滤时料液流动方向的不同，分为常规过滤和错流过滤。 2、可溶性杂蛋白的去除法包括：等电点沉淀法、热处理法、化学变性沉淀法和吸附法 三、问答 1、发酵液的一般特征？ ①组成大部分为水； ②发酵产物的浓度较低； ③发酵液中的悬浮固形物主要是菌体和蛋白的胶状物； ④含有培养基中的残留成分，如无机盐类、非蛋白质大分子及其降解产物； ⑤含有其他少量代谢副产物；
⑥含有色素、毒性物质。热原质等有机杂质。 2、常用的絮凝剂有什么？ 无极絮凝剂：Al2(SO4)3·18H2O (明矾)、氯化钙、氯化镁碱式氯化铝、高分子无机聚合物等。 有机絮凝剂：壳多糖及其衍生物、明胶、丙烯酰胺类、聚苯乙烯类、聚丙烯酰类聚乙烯亚胺类。 3、影响絮凝效果的因素？ 答：①絮凝剂的种类； ②絮凝剂浓度； ③ pH; 最关键因素，影响絮凝剂活性基团的解离度。 ④搅拌转速和时间。 4、发酵液预处理的方法？ 答：①凝聚和絮凝方法 ②加热法 ③调节PH法 ④加水稀释法 ⑤加入助滤剂法 ⑥加吸附剂法或加盐法 ⑦高价态无机离子去除法 Ca2+——草酸、草酸钠→形成草酸钙沉淀 Mg2+——三聚磷酸钠(Na5P3P10)→形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物 Fe3+——黄血盐(K4Fe(CN)6) →普鲁士蓝淀 ⑧可溶性杂蛋白的去除法 3、VB12发酵液絮凝预处理的研究 答：由正交试验确定影响絮凝的主要因素，结果表明，最佳絮凝条件：絮凝剂为聚合氯化铝、加入体积分数7%，pH6、搅拌速度14r/min、搅拌时间45s。通过加压过滤实验，得到絮凝后
《生物分离与纯化技术》授课教案
《生物分离与纯化技术》授课教案 第一章绪论 教学目的：熟悉生物物质的概念、种类和来源；了解分离纯化技术及其基本原理；熟悉分离纯化工艺的优化、放大和验证工作；掌握分离纯化的特点与一般步骤；了解生物分离纯化技术的发展历史；熟悉生物分离纯化技术的发展趋势。 教学重点：生物物质的概念、种类和来源；分离纯化工艺的优化、放大和验证工作；分离纯化的特点与一般步骤；生物分离纯化技术的发展趋势。 教学难点：分离纯化技术及其基本原理；分离纯化工艺的优化、放大和验证工作。教学课时：4 学时 教学方法：多媒体教学 教学内容： 第一节生物分离与纯化的概念与原理 一、生物物质的概念、种类和来源 1. 生物物质：氨基酸及其衍生物类、活性多肽类、蛋白质、酶类、核酸及其降解 物、糖、脂类、动物器官或组织制剂、小动物制剂、菌体制剂 2. 生物物质来源：动物器官与组织、植物器官与组织、微生物及其代谢产物、细胞培养产物、血液、分泌物及其代谢物 二、生物分离纯化概念 指从发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液或动植物组织细胞与体液等中分离、纯化生物产品的过程。 三、生物分离纯化技术
生物技术 上游：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程及组织工程；下游：生物产品的回收——生物分离与纯化技术，主要包括离心技术、细胞破碎技术、萃取技术、固相析出技术、色谱技术和膜分离技术等。 四、分离纯化基本原理 有效识别混合物中不同组分间物理、化学和生物学性质的差别，利用能够识别这些差别的分离介质或扩大这些差别的分离设备来实现组分间的分离或目标产物的纯化。
第二节分离纯化策略 一、生物分离纯化技术的特点 1. 环境复杂、分离纯化困难 2. 含量低、工艺复杂
生物分离工程期末复习题
填空题 1. 为了提高最终产品的回收率一是（提高每步分离效率），二是（减少分离步骤）。 2. 评价一个分离过程效率的三个主要标准是：（浓缩率），（分离系数）和（产品回收程度） 3?生物产品的分离过程包括发酵液的预处理和（液固分离），（产品的提取），（产品的精制） 和（产品的加工处理）。 4?生化反应所起的作用是产生目的产物，指标是（产率）和（转化率），而生物分离解决的 是如何从反应液中获取这些物质，涉及的是（收率）和（纯度）。 5?生物分离的主要任务：从发酵液和细胞培养液中以（最高的效率），（理想的纯度）和（最小的能耗）把目的产物分离出来。 6?生物分离过程的特点包括：（生物分离过程的体系特殊），（生物分离过程的工艺流程特殊），（生物分离过程的成本特殊）。 7. 物质分离的本质是识别混合物中不同溶质间（物理），（化学）和（生物）性质的差别利用 能识别这些差别的（分离介质）和扩大这些差别的（分离设备） 8. 性质不同的溶质在分离操作中具有不同的（传质速率）和或（平衡状态） 9. 平衡分离是根据溶质在两相间（分配平衡）的差异实现分离；溶质达到分配。平衡为扩散 传质过程，推动力仅取决于系统的（热力学性质）。 10. 差速分离是利用外力驱动溶质迁移产生的（速度差）进行分离的方法。 1. 在细胞分离中，细胞的密度越（大），细胞培养液的密度越（小），则细胞沉降 2. 区带离心包括（差速）区带离心和（等密度）区带离心。
3. 为使过滤进行的顺利通常要加入（惰性助滤剂）。 4. 发酵液常用的固液分离方法有（离心）和（过滤）等。 5?常用离心设备可分为（离心沉降）和（离心过滤）两大类； 6?常用的工业絮凝剂有（无机絮凝剂）和（有机絮凝剂）两大类。 7. 工业生产中常用的助滤剂有（硅藻土）和（珍珠岩粉）。 8. 重力沉降过程中，固体颗粒受到（重力），（浮力），（摩擦阻力）的作用， 固体匀速下降时，三个力的关系（重力=浮力+摩擦阻力）。 9. 发酵液预处理的方法包括：（凝集），（絮凝），（加热法）；（调节pH法），（加水稀释法），加入（助滤剂）和（吸附剂）。 10. 发酵液中胶粒保持稳定的原因：（双电层）和（蛋白质周围水化层）结构。 11. 发酵液预处理过程中的相对纯化主要包括去除（高价态无机离子），（可溶性杂蛋白质），（色素）和（多糖类物质）。 12. 发酵液中杂蛋白的去除方法主要有（等电点沉淀法），（热处理法）和（化学变性沉淀法）。 13. 差速区带离心用于分离（大小）不同的颗粒，与颗粒（密度）无关。等密度区带离心包 括（预形成梯度密度离心）和（自形成梯度密度离心）两种方式。离心达到平衡后，样品颗粒的区带形状和平衡位置（不再发生变化）。 1?单从细胞直径的角度，细胞（直径越小），所需的压力或剪切力越大，细胞越 2. 常用的化学细胞破碎方法有（.酸碱法），（盐法），（表面活性剂处理），（有机溶剂法）和（螯合剂）。 3. 包涵体的溶解需要打断蛋白质分子和分子间的（共价键），（离子键），疏水作用及静电 作用等，使多肽链伸展。因此，包涵体的溶解需要强的变性剂，如（8mol/L尿素）和（6mol/L 盐
生物分离工程名词解释
凝聚：指在投加的化学物质（铝、铁的盐类或石灰等）作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成１mm 大小块状凝聚体的过程。PPT 电泳：荷电的胶体粒子在电场中的移动。PPT 或者：荷电溶质（电解质）或粒子在电场作用下发生定向泳动的现象P362 电泳迁移率（mobility）:在电位梯度E的影响下，带电颗粒在时间t中的迁移距离d。PPT 或者：单位电场强度下的电泳速度。P363 膜分离的概念：利用膜的选择性（孔径大小），以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的一种技术。PPT 或者：利用具有一定选择性透过特性的过滤介质进行物质的分离纯化。P56 离子交换: 在吸附剂与溶液间发生离子交换，即吸附剂吸附离子后，它同时要放出等当量的离子于溶液中。PPT 亲和层析：是利用生物分子对之间所具有的专一而又可逆的亲和力使生物分子分离纯化的技术。PPT 过滤：是在外力作用下，利用过滤介质使悬浮液中的液体通过，而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的一种单元操作。PPT 或者：利用薄片形多孔性介质（如滤布）截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法。P20 沉降：离心分离是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程，当静置悬浮液时，密度较大的固体颗粒在重力作用下逐渐下沉，这一过程称为沉降。PPT 重结晶：是利用杂质和结晶物质在不同溶剂和不同温度下的溶解度不同，将晶体用合适的溶剂再次结晶，以获得高纯度的晶体的操作。PPT 分辨率：也称分离度。它是指相邻两色谱保留值之差与两峰底宽平均值之比。PPT 晶体：形成新相（固体）需要一定的表面自由能。因此，溶液浓度达到饱和溶解度时，晶体尚不能析出，只有当溶质浓度超过饱和溶解度后，才可能有晶体析出。溶液达到过饱和状态是结晶的前提；过饱和度是结晶的推动力。PPT 分子伴侣：是一种热休克蛋白质，在体内和体外都具有抑制蛋白质伸展肽链错误折叠和聚集、促进肽链折叠成天然活性肽的作用。P394 对流干燥：对流干燥过程中载热体对对流方式与湿物料颗粒（或液滴）直接接触，向湿物料对流传热，故对流干燥又称直接加热干燥。P440
现代生物分离技术及其应用举例
现代生物分离技术及其应用举例生物物质的分离（Bioseparation）是生物工程的一个重要部分。国外文献中，常称之为下游过程（Downstream Process），国内则称之为产品的分离或回收。其目的是把生物反应液，如发酵液或酶反应液内的有用物质分离出来，获得所需的目标成品。 不同的生物产物，其溶解度、分子大小、形状、极性、电荷性质、专一结合位点等理化和生物学性质有或大或小的差异，所以采用适当的分离技术可将其分离纯化。 根据分离过程的基本原理，分离可分机械分离和传质分离两大类。机械分离的对象是非均相物系，是依据物质相态的不同（例如液体、固体），以及依据物质大小、密度的差异进行分离，如过滤、重力沉淀和离心降解等。传质分离的对象主要是均相物系，通常是溶液，可分为速度分离和平衡分离两种。速度分离根据物质溶质在外力作用下产生的移动速度的差异实现分离，亦可称为输送分离，其传质推动力主要有压力差、电位梯度和磁场梯度等，如滤超、反渗透、电渗析、电泳和磁泳等；平衡分离则根据溶质在两相中分配平衡状态的差异实现分离，又称扩散分离法，其传质推动力为偏离平衡态的活度差或浓度差，如蒸馏、蒸发、吸收、萃取、结晶、吸附和离子交换等。对于特定的目标产物，应根据其自身的性质以及共存杂质的特性，选择适宜的分离方法，以
获得最佳分离效果。即在保证目标产物的生物活性不受（或少受）损伤的同时，达到所需的纯度和对回收率的要求，并使回收过程成本最小，以适应大规模工业生产需求。 生物工艺中目前常用的生物分离提纯原理及方法如下表所示： 分离提纯原理分离纯化方法分离对象举例 溶解度的差异 分配系数的差异 分子大小和形状的差异 电荷性质的差异盐析法、等电点沉淀 法、有机溶剂沉淀法、 PEG沉淀法 有机溶剂萃取法、双水 相萃取法、反胶束萃取 法、液膜萃取法、超临 界流体萃取法 离心过滤法、离心沉降 法、超离心法、微滤法、 超滤法、纳滤法、透析 法、凝胶过滤法 离子交换层析法、电泳 法、色谱聚焦法、等电 聚焦法 蛋白质 有机酸、氨基酸、 抗生素、蛋白质、 香料、脂质 菌体、菌体碎片、 细胞、细胞碎片、 蛋白质、核酸、 糖类 蛋白质、氨基酸、 核酸
生物分离工程期末总复习
第一章绪论 一、生物分离工程在生物技术中的地位？ 二、生物分离工程的特点是什么？ 1．产品丰富产品的多样性导致分离方法的多样性 2．绝大多数生物分离方法来源于化学分离 3．生物分离一般比化工分离难度大 3.生物分离工程可分为几大部分，分别包括哪些单元操作？ 三、生物分离过程一般分四步： 1.固-液分离（不溶物的去除） 离心、过滤、细胞破碎 目的是提高产物浓度和质量 2.浓缩（杂质粗分） 离子交换吸附、萃取、溶剂萃取、反胶团萃取、超临界流体萃取、双水相萃取 以上分离过程不具备特异性，只是进行初分，可提高产物浓度和质量。 3．纯化 色谱、电泳、沉淀 以上技术具有产物的高选择性和杂质的去除性。 4．精制结晶、干燥 四、在设计下游分离过程前，必须考虑哪些问题方能确保我们所设计的工艺过程最为经济、可靠？ （1）产品价值 （2）产品质量 （3）产物在生产过程中出现的位置 （4）杂质在生产过程中出现的位置 （5）主要杂质独特的物化性质是什么？ （6）不同分离方法的技术经济比较 上述问题的考虑将有助于优质、高效产物分离过程的优化。 五、.生物分离效率有哪些评价指标？ 1.目标产品的浓缩程度——浓缩率m 2．系数α回收率REC 第二章细胞分离与破碎
1．简述细胞破碎的意义 一、细胞破碎的目的 由于有许多生化物质存在于细胞内部，必须在纯化以前将细胞破碎，使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏（增大通透性）或破碎，释放其中的目标产物，然后方可进行提取。 二、细胞破碎方法的大致分类 破碎方法可归纳为机械破碎法和非机械破碎法两大类，非机械破碎法又可分为化学（和生物化学）破碎法和物理破碎法。 1．机械破碎 处理量大、破碎效率高速度快，是工业规模细胞破碎的主要手段。 细胞的机械破碎主要有高压匀浆、研磨、珠磨、喷雾撞击破碎和超声波破碎等。 2．化学（和生物化学）渗透破碎法 （1）渗透压冲击法（休克法）（2）酶溶（酶消化）法 3．物理破碎法 1）冻结－融化法（亦称冻融法）（2）干燥法 空气干燥法真空干燥法冷冻干燥法喷雾干燥法 三、化学渗透法和机械破碎法相比有哪些优缺点？ 化学渗透破碎法与机械破碎法相比优点：化学渗透破碎法比机械破碎法的选择性高，胞内产物的总释放率低，特别是可有效地抑制核酸的释放，料液的粘度小，有利于后处理过程。 化学渗透破碎法与机械破碎法相比缺点：化学渗透破碎法比机械破碎法速度低，效率差，并且化学或生化试剂的添加形成新的污染，给进一步的分离纯化增添麻烦。 第三章初级分离 一、常用的蛋白质沉淀方法有哪些？ 盐析沉淀,等电点沉淀,有机溶剂沉淀,热沉淀 二、影响盐析的主要因素有哪些？ （1）离子强度：Ks和β值, 强度越大,蛋白质溶解度越小； （2）蛋白质的性质:因相对分子质量和立体结构而异,结构不对称、相对分子质量大的蛋白质易于盐析； （3）蛋白质的浓度：蛋白质浓度大，盐的用量小，共沉作用明显，分辨率低；蛋白质浓度小，盐的用量大，分辨率高；2.5%～3.0% 时最适合； （4）pH值：通常调整到pI附近，盐浓度较大会对等电点产生较大影响，pH对不同蛋白质的共沉影响；