病毒学实验技术

实验一鸡胚接种

器材：鸡胚打孔器注射器针头照蛋灯蛋座病毒液石蜡碘酊棉球酒精棉球鸡胚孵化→病毒接种（NDV、EDS—76、IBV→效价测定（HA、HI）

一．精卵的选择、孵育和检卵

1.受精卵的选择

1）最好来自SPF鸡群，以降低母源抗体的影响

2）最好是白克蛋

3）受精卵必须新鲜，保存在5—20℃不要超过10天，保存一个月的受精卵，孵化率将近于零。

2.孵育

1）孵箱温度保持37.5—38.5℃

2）相对湿度：50-60%

3）保证新鲜空气流通，尤孵化5-6天后

4）孵育后第三天开始，每天翻卵一次

3.检卵

孵育后第4天开始，每天检卵一次。4日卵可见血管。未受精卵不见血管鸡胚。死胚血管模糊，无胎动。

二．鸡胚的结构

1．卵壳上有细孔，以行气体交换

2．壳膜行气体和液体分子交换，故须一定湿度和气流

3．气室呼吸和调节压力

—卵壳孔交换

4．绒毛尿囊腔胚胎呼吸器官，膜血管—O

5．尿囊腔胚胎排泄器官，尿囊液初为通明，12-13天后因尿酸盐增多而渐浑浊。

6．羊膜腔胚胎浸泡于其中羊水

7．卵黄早期养分

8．卵白晚期养分

三．接种前处理

1．做接种记号

2．消毒

四．接种途径

卵黄囊、尿囊腔、绒毛尿囊膜、羊膜腔、静脉、胚体

1．卵黄囊接种法虫媒披膜病毒、衣原体、立克氏体等分离和增殖

方法一：1）6-8日龄胚，画出气室和胚位，大头朝下

2）碘及酒精消毒气室端

3）钢锥在气室中央锥一小孔

4）注射器吸取病毒液，沿小孔垂直刺入3cm，0.1-0.3ml/胚

5）熔蜡封孔，续孵，弃24H内死胚

方法二：1）2）同一

3）卵横放，胚朝下，卵长1/2处消毒

4）钢锥锥一小孔，注射器吸取病毒液，沿小孔垂直刺入1.5CM，0.1-0.5ml/胚

5）封孔，续孵，弃24h内死胚

2．绒毛尿囊膜接种法痘病毒和疱疹病毒分离和增殖

方法一：1）10-12日龄胚，画气室，消毒

2）在气室端开一1.5×1.5口

3）灭菌镊子撕去一小片内壳膜

4）滴入接种物

5）胶布或透明纸封口

方法二：（人工气室）

1）在胚胎附近近气室处，选血管少处，烙一直径3-4mm的烤焦圈]

2）消毒，刀撬起卵壳造成卵窗

3）在气室端中央钻一个小孔

4）用针尖挑破卵窗中心的壳膜，勿损伤其下的绒毛尿囊膜，滴加生理盐水于刺破出

5）橡皮乳头于小孔上吸气，形成人工气室，可见绒毛尿囊膜上滴加的生理盐水下渗

6）用1mlL注射器滴2-3滴接种物于绒毛尿囊膜上

7）胶布或透明纸封口，熔蜡封孔

8）鸡胚横卧孵育，勿翻动，卵窗向上

3．尿囊腔接种法用于正粘病毒，副粘病毒分离和增殖

1）选10-12日龄胚，画气室胚位，消毒

2）钢锥锥一小孔

3）注射器吸取病毒液，沿小孔刺入0.5-1cm，0.1-0.2/胚

4）熔蜡封孔，续孵，检卵1次/天，弃24h内死胚

静脉接种：蓝舌病毒；脑内接种：狂犬病毒

实验二原代细胞培养（鸡胚成纤维细胞）

器材：鸡胚碘酊棉球，酒精棉球照蛋灯蛋座大剪子眼科剪镊子平皿培养基胰酶水浴锅大青霉素瓶吸管吸球细胞瓶瓶塞

一．实验目的：了解原代细胞培养的一般方法和用途

二．实验步骤：

1.取9-12日龄鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒

2.无菌夹起鸡胚置于无菌平皿

3.眼科剪镊去头、四肢及内脏，Hank’S洗液两次

4.剪碎近于乳糜状

5.将剪碎组织倒入锥形瓶或烧杯或大青霉素瓶，Hank’S两次，然后加入4倍量的（5ml）

5.6%、7.5%、8.8%），混匀后置37℃水浴20-30分钟，0.25%胰酶，调PH值7.6-7.8（NaHCO

期间每10min摇动一次，使细胞消化完全（组织块变松散，沉降变缓慢时表示消化足够）

6.消化好后，取出瓶子，静置几分钟，洗去胰酶液，加含有犊牛血清的Hank’S液生长液约10ml，轻摇后吸去，重复一次，目的洗去残留的胰酶和抑制其消化作用

7.加入生长液10ml，以粗口吸管吹吸数次，使细胞脱落分散，静置1-2分钟，使组织块下降，轻吸出细胞悬液于离心管中

8.平衡后以2000r/min10min，弃上清，用10ml Hank’S液生长悬浮沉淀，分装于两个细胞瓶中，2ML/瓶。使细胞量约为50万个/ml，再补加Hank’S生长液至10ml，37℃培养

实验三传代细胞培养

（传代细胞=遗传突变/理化学物质作用/致瘤病毒作用=异倍体癌变细胞；多来自动物或人的肿瘤组织及部分来自突变的正常细胞。成长旺盛，繁殖快速，但易遭支原体和病毒污染—细胞源性/非-细胞源性如毒种、血清、胰酶、操作人员口鼻手等）

一、试剂

1．细胞分散剂：0.25%胰酶，250ML装，4℃保存胰酶 2.5g NaCl 8.0g KCL 0.2g

2HPO

·12H

0 2.89g

2PO

0.2g

加ddH20至 1000ml

加压过滤除菌，分装于小瓶备用。（细胞消化液：将胰酶2.5g、NaCl 80.0g、KCL 4.0g、

葡萄糖10.0g、NaHCO

3 5.8g依次溶于900.0ml ddH

O中，待完全溶解后，定容至1000.0ml，

过滤除菌，分装后置-20℃保存备用）

2．培养基

DMEM培养液：1袋DMEM干粉溶于950ml ddH2O中，加入3.7g NaHCO

，用1mol/l HCL 调PH值至6.8-7.0，定容至1000ml，0.22μm滤膜过滤除菌，室温保存备用。

生长液：含10%犊牛血清的DMEM培养液（可室温保存）。（细胞生长液：在DMEM培养液中加入10%的新生牛血清，100IU/mL青霉素、100μg/ml链霉素，4℃保存备用）

3．双抗：母液20000u（ug）/ml，用量：500ml DMEM 加入5ml，可4℃保存。

4．血清：500ML装，用前在56℃水浴灭活30MIN，每500MLDMEM加入50ML。

5．器材：吸管（5、10ml）、细胞瓶、胶塞（含盐水瓶塞）、吸球、75%酒精棉球等。

二．操作步骤

1.先配置生长液（500ml DMEM加入50ml血清和5ml双抗，混匀）

2.取长满单层的细胞一瓶，倾去培养液，可用适量生长液冲洗。

3.吸弃，加入3-4ml胰酶/10ml 细胞浸没细胞层，亦可先洗涤细胞层后弃之），于37℃培养箱放置几分钟或室温3-5min（PK-15）（7-8min，Marc-145），镜下观察至细胞间出现空隙或稍松动或稍变圆或稍拉网（PK-15）或细胞变圆（Marc-145）后，尽弃胰酶消化液（注意：时间要掌握好，勿消化过头，如拉网状或脱落）。

4.加入生长液（约6-7-9ml/10ml瓶），反复吹打几次，（先正面吹打，在反面吹打）使细胞分散成游离单个细胞（镜检，细胞呈单个，成双、3-4个团块即可），然后分装于3个小瓶中（PK-15），补足生长液至10ml（或吹散成单个细胞后，加入3个细胞瓶所需生长液30ML 再分装，10ml/瓶，要利用原瓶，其生长较好），37℃培养箱培养1-2天即可长成单层。如是分装6孔细胞板，每孔加入3-4ml，用吸管抽吸一下孔内细胞悬液使之均匀不成团生长。24孔板，1ml/孔。96孔板，一般将病毒与细胞同时接入，详见毒价测定法。细胞长好后，接毒前可用维持液洗涤并吸弃。接毒量根据病毒浓度而定，一般100-200ul/孔，吸附45-60min，然后加入维持液。37℃培养30-40h（PRV），观察CPE，出现70-80%CPE时可收获，不论如何，病毒于40h前收获，以免病毒释放到细胞外。对于污染孔，小心吸弃，加入适量双抗，首次作冲洗，二次作抗菌。对可能污染孔，加入适量双抗如10ul/24孔。

细胞板的处理：胰酶处理—自来水冲净—用镊子夹棉球擦洗掉上面的细胞残留物—浸泡酸液过夜—自来水冲洗—用双蒸水洗涤—控干—将细胞板和板盖正象平铺于干净或消毒过的报纸紫外灯下照射消毒杀菌过夜—次日将盖合上—用下面的报纸包好—近期使用。

常用传代细胞：

1．IBRS-2（仔猪肾上皮传代细胞株）；

2．Vero（非洲绿猴肾细胞）；

3．Marc-145（MA-104进一步克隆而来）；

4．BHK-21（乳仓鼠上皮传代细胞株）；

5.MDCK（犬肾上皮细胞）；

6.F81（猫肾细胞）；

7.PK-15（仔猪肾上皮传代细胞株）；

8.Hela（人子宫颈癌细胞）；

9.PAM（肺泡巨嗜细胞）；

10.CL2621（猴肾细胞系）

实验四细胞的冻存与复苏

器材：吸球离心管细胞吸管胰酶血清二甲基亚砜细胞冻存管

一．细胞的冻存（缓慢的冰冻和迅速的融解）

1．细胞冻存液

A液：含40%血清的DMEN培养液

B液：含20%二甲基亚砜（DMSO，低温保护剂）的DMEN培养液

2．操作：取刚长满单层的细胞，加入胰酶消化后，用DMEN培养液吹散后装入离心管中，500-3000r/min 5-10min，用适量的A液悬浮，再加入等体积的B液，分装于细胞冻存管中，置4℃或液氮气相中，按5min 1cm的速度逐渐往下降直至液氮中长期保存。

或：配制含10%DMSO和20%血清的DMEN培养液，按10ml细胞瓶制备1-2个冻存管计，一般配制10ml，取刚长满单层的细胞，加入胰酶消化后，先加入生长液终止胰酶作用，去掉首瓶生长液，加入冻存液吹散后，移入第二瓶吹打，依此类推，处理完所有细胞瓶，分装于细胞冻存管中，1.8ml/管，置-40℃过夜或置液氮中长期保存。

二．细胞的复苏

将冻存于液氮中的细胞取出，迅速置于37-40℃左右水浴中，并不停地摇动，使其快速解冻融解（40-60秒内），然后加入10倍量营养液后，500r/min离心10min，去掉上层冻存保护液，用生长液悬浮（由10ml细胞培养物制成的冷冻细胞，在融解和离心沉淀后可再悬浮于10ml营养液中），再置于细胞瓶中培养（可预先用成长液洗涤一下）。或不离心直接转移到细胞培养瓶中，每毫升细胞悬液加入10倍量预热至37℃的培养液（血清量可提高至10-15%）。等其贴壁几小时后（4-12小时，一般6小时左右贴壁），再换入新的生长液继续培养至长成单层后换液，并考虑传代。

附：细胞室温保存：将已长成单层的细胞于换液后（维持液含血清5-10%），置室温或20-22℃避光保存，一般可保持细胞的生活力达半个月以上（但BHK-21最多能保存7天左右）。不宜在4℃保存，因4℃保存易发生退化，并较快从培养瓶壁脱落；继续传代培养时，细胞活力也明显降低。

三．细胞的保存：

1．细胞培养物的常温短期保存

1）实验室中细胞短期保存

①将已长成单层的细胞换液后置室温或20-22℃下避光保存，可达15天以上。

②将细胞培养温度由37℃降至32℃甚至30℃，可隔15-30天传代一次。

2）长途运送细胞培养物的保存

取刚刚长成单层的细胞培养物，弃去营养液，加入维持液至满瓶，勿使培养瓶内存留空气，随后用橡皮塞紧瓶口，并作适当的包扎。运输途中的温度应保持在15-25℃左右，到达目的地后，置37℃培养一天，再行传代。

2．细胞培养物的长期保存

将刚长满单层的细胞，按细胞传代方法消化吹散后，装入离心管中，1500-3000rpm 5-10min，用适量含有20%犊牛血清、10%二甲亚砜的DMEM悬浮，分装于细胞冻存管中，置4℃2h，-20℃ 2h，-70℃过夜，然后置于液氮中长期保存。或置于液氮气相中按5min 1cm的速度逐渐往下降直至液氮中长期保存。

实验五病毒在细胞中的的培养

1.取长满单层的细胞一瓶（100ml），倒去培养液。加入适量液冲洗并吸弃。

2.加入2ml的病毒液，使铺满细胞单层，37℃感作45-60min

3.取出，加入维持液至10ml，然后再置37℃培养箱培养

4.待75-85%以上细胞出现病变时，收毒（一般于40h前收毒，以免病毒释放出细胞外）

实验六病毒感染力（TCID50）的测定

器材：细胞胰酶培养基吸管吸球 96孔细胞培养板移液器吸头青霉素瓶

一．实验步骤

1.在青霉素瓶中将病毒作连续10倍的稀释，从10-1-10-10

2.将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度作8孔，每孔接种100UL

3.然后在每孔加入细胞悬液100ul，使细胞量达到3*105个/ml

4.设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排

5.逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天

6.结果的计算，按Reed-Muench两氏法或KABER法进行

二．计算方法

1．Reed-Muench两氏法

距离比例= 高于50%病变率的%-50% = 91.6-50 0.8

高于50%病变率的%-低于50%病变率的% 91.6-40

=距离比例*稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数=0.8×（-1）IgTCID

+（-3）=-3.8

=10-3.8/0.1ml （10-4.8/ml）

TCID

2．Karber法

病毒稀释度出现CPE孔的比率

10-1 8/8=1

10-2 8/8=1

10-3 7/8=0.875

10-4 3/8=0.375

10-5 1/8=0.125

10-6 0/8=0

IgTCID

=L-d（s-0.5）

L=最高稀释度的对数；D=稀释度对数之间的差；S=阳性孔比率总和

IgTCID

50=-1-（-1）×（3.375-0.5）=-3.875 TCID

=10-3.875/0.1ml 实验七中和实验（固定病毒——稀释血清法）

器材：细胞胰酶培养基吸管吸球 96孔细胞培养板移液器吸头青霉素瓶病毒液被检血清标准阳性（阴性）血清

一．原理动物感染病毒后，体内能产生抗病毒抗体，抗体能与病毒粒子特异性的结合，使病毒丧失感染力。

二．步骤

1.将测好TCID

50病毒稀释成200个TCID

病毒悬液

2.在96孔微量培养板中将灭活作连续倍比稀释（在96孔微量培养板中先加入50ul的生长液，再加入50ul待检血清，混匀后，吸50ul至下一孔，如此直至（1∶256）每个稀释度作4孔

3.在上述各孔中加入50ul稀释好的200个TCID

50D的病毒悬液，混匀后放入37℃5%CO

培养箱中作用45-60MIN

4.同时设待检血清毒性对照，阴、阳性血清对照，病毒对照（0.2 TCID

50，2 TCID

，20

TCID

50，200 TCID

）和正常细胞对照

5.感作完成后每孔加入100ul细胞悬液，放入37℃5%CO

培养箱中培养，逐日观察并记录结果

6.结果计算，按Reed-Muench两氏法或Kaber法进行

距离比例= 高于50%保护率的%-50% =83-50/83-40=0.7

高于50%保护率的%-低于50%保护率的%

高于50%的保护率血清稀释度的对数+距离比率*稀释系数的对数=-1.2+0.7×（-0.6）=-1.66 -1.66的反对数=1/46

即：1∶46稀释的待检血清可保护50%的组织培养免于CPE。

用途：中和实验用于

1.疾病诊断

2.病毒分离株的鉴定

3.不同病毒分离株的抗原关系研究

4.疫苗免疫原性的评价

5.免疫血清的质量评价

6.测定实验动物血清中抗体的存在

例：PRV中和实验

培养箱，倒1.材料准备 0.25%胰酶、BHK-21细胞、微量移液器、96孔细胞培养板、CO

置显微镜

2.操作步骤

测定

2.1TCID

2.1.1 病毒培养和收获PRV接种于长成单层的BHK-21细胞，接种量为培养液的10%，37℃培养，待出现CPE后，冻融，收获病毒

2.1.2 病毒的测定DEME 10倍稀释病毒，每个稀释度取100ul加入96孔细胞培养板中然后加入经0.25%胰酶的BHK-21细胞100ul（细胞含量以105/ml左右为宜），每个稀释度作8个

培养箱中

重复，设空白细胞对照。37℃5%CO

测定逐日观察CPE，并记录CPE孔数，直到对照细胞老化脱落为止，按1.1.3TCID

Reed-Muench法计算

2.2中和实验

将无菌采集的待检血清56℃水浴灭活30min，用DMEM作倍比稀释，在96孔微量培养板中先加入50ul的生长液，再在第一孔加入待检血清50UL，吸50UL至下一孔，如此直至（1：

的病毒悬液，256）每个稀释度作2-4重复。在上述各孔中加入50ul稀释好多200个TCID

培养箱中作用1小时，同时设待检血清毒性对照，阴、阳性血清对照，混匀后放入37℃5%CO

病毒对照和正常对照，感作完成后每孔加入经0.25%胰酶消化的BHK-21细胞悬液，放37℃培养箱中培养，逐日观察并记录结果

5%CO

2.3计算抗体中和效价逐日观察CPE，并记录CPE孔数，直到对照细胞老化脱落为止。按Reed-Muench 法计算抗体中和效价。如抗体中和效价为1∶2及1∶2以上，则判为PRV抗体阳性。

值，分例：微量中和实验（改良法）首先在MARC-145细胞上增殖病毒，并测定其TCID

离被检血清，56℃灭活30MIN后在96孔细胞培养板中将血清作连续倍比稀释，从1∶2到1∶256，每个稀释度作4个重复，每孔50.0μl ，37℃5%CO

培养箱中作用1h，再于每孔中滴加

2-5×105个/ml的Marc-145细胞悬液100.0μl，轻轻摇匀后，放回培养箱中继续培养4-6天，观察细胞病变情况，按Reed-Muench两氏法计算被检血清中抗PRRSV的特异性中和抗体的滴度。同时设有血清毒性对照，标准阴、阳性血清对照以及病毒和正常细胞对照。

——中和实验测血清效价鸡胚孵化——鸡胚成纤维细胞制备——病毒接种（PRV）TCID

实验八乳胶凝集实验

一．乳胶的处理

（一）乳胶的预处理

1．将10%空白乳胶轻轻摇匀，吸取2ml于试管内，加PBS 8ml使乳胶浓度为2%

2．在2%空白乳胶内加入10%胰蛋白酶1.1ml，充分混合均匀，置56℃水浴18h，其间摇动5-6次，使其作用完全。

3．取出乳胶，4℃保存备用

（二）乳胶的致敏

1．吸取经预处理的2%空白乳胶9.6ml于小玻璃瓶内

2．用微量移液管吸取150ul 40倍浓缩的PRV-Ag溶液滴加到盛有等量（9.6ml）2%空白乳胶的小玻璃瓶内，边滴边摇动，使其充分混合均匀，置37℃作用15-30min或室温2h，即为乳胶抗原。可分装于小离心管，4℃保存备用，切勿冻结

二、乳胶凝集实验操作方法

1．定性实验

用微量移液器吸取待检材料、阳性血清、阴性血清各20（约1滴）分别滴于载玻片不同位置上，然后在各液滴旁加量（20ul）乳胶抗原（如乳胶抗原出现分层，轻摇匀即可使用），用牙签将其搅匀，摇动载玻片1-2min，3-5min内观察结果，但有些弱阳性反应者需在20min 时再观察一次，如不凝集，判为阴性。

如待检材料为新鲜血液，为防止血液凝固，应先滴加乳胶抗原于载玻片上，然后吸取血液与乳胶抗原迅速混匀，摇动玻片观察结果

如待检材料为乳汁，最好先离心，去沉淀，吸取上清作LAT检测

2．定量实验

先将血清在微量反应板或小试管内做倍比稀释，吸取各稀释度血清1滴（约20ul）于载玻片上，各滴加等量（20ul）乳胶抗原于一旁，如上述方法进行，判定，以出现“++”以上凝集者为阳性

++++ 全部乳胶凝集，颗粒聚于液滴边沿，液滴完全透明

+++ 大部分乳胶凝集，颗粒明显，液滴稍浑浊

++ 约50%乳胶凝集，但颗粒较浑浊

+ 有少许凝集，液体仍浑浊

乳胶致敏（PRV）——乳胶凝集实验测血清效价并与中和效价进行比较

实验九 HA、HI实验

器材：血凝板吸头青霉素瓶吸管吸球红细胞离心管

一．蚀斑技术

V蚀斑，即空斑，指病毒在已长成的单层细胞上形成的局限性病灶。原理：将病毒作10倍连续的倍比稀释，随后各取定量，接种于已长成的单层的敏感细胞上，并覆盖一层固体介质中性红琼脂糖，则当病毒在最初感染的细胞内增殖后，由于固体介质的限制，只能感染和破坏附近的细胞。经过几个增殖周期后，形成肉眼可见的变性细胞内即蚀斑后计数，即可计算出每毫升病毒悬液中所含的蚀斑单位

用途：1）病毒纯化（克隆）；2）测定病毒悬液中感染病毒的含量（蚀斑减数实验）；3）检测不产生CPE的病毒，因有的在一般单层细胞上不形成CPE，但可以在加入覆盖层后形成可见的蚀斑。

二．蚀斑减数实验

将病毒——正常血清混合物以及病毒——待检血清混合物分别接种到单层的敏感细胞上，随后覆盖营养琼脂或甲基维数，进行蚀斑测定，比较病毒——正常血清组以及病毒——待检血清组产生的蚀斑数，两者的差数表示待检血清的中和能力。以实验组的蚀斑数比对照组减少50%作为判定的依据，血清稀释度就是其蚀斑减数实验效价。

三．交叉保护实验

先将实验动物进行主动或被动免疫，然后以待检病毒进行攻击，根据实验动物被保护的情况，判定待检病毒的种类或类型。但周期长，需大量实验动物。应用：用已知病毒/已知血清鉴定未知血清（未知病毒）/未知病毒。

实验动物：家兔、小白鼠、大白鼠、豚鼠、仓鼠

注意：选择对目的病毒敏感的实验动物品种品系、以及适宜的接种途径和剂量。

用途：

1）分离病毒，并借助干扰那范围实验鉴定病毒

2）培养病毒，制造抗原和疫苗

3）测定各毒株之间的抗原关系（中和实验和交互保护实验）

4）制备高免血清和单克隆抗体

5）作V感染的实验研究，包括V毒力测定、建立病毒病模型动物

测定；中和实验；免疫荧病毒的分离和鉴定：（方法途径）细胞病变；电镜观察；TCID

光实验；对理化学因子的敏感性；核酸类型测定；PCR；核酸杂交；动物实验。

病毒材料的准备

1.脑、肝、肌肉等器官或组织

充分研磨后加入5倍量的Hank’S液（含P.S各200/ml），冻融3次，2000rpm 10min，取上清作接种物

2.鼻液、乳汁、浓汁等分泌物或渗出物：Hank’S液（含P.S）各100/ml）稀释3-5倍，混匀后，4℃感作2-4h或过夜，2000rpm 10min取上清作接种物。

3.咽喉拭子或鼻拭子：冻融3次，收集液体部分，用棉拭子查擦拭咽喉部，速泡入盛有2-5mlHank’S液（含P.S各200-500ul/ml）试管内，涮洗之，2000rpm 10min，取上清作接种物

4.粪便：Hank’S（含P.S 各100ml）液稀释10-20倍，4℃感作2-4h，2000rpm 10min，取上清作接种物

5.无菌的体液或鸡胚：直接接种用

接种方法

1、实验动物

2、鸡胚正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、脑炎病毒及禽类V

3、细胞培养

病毒增殖的判定

1、CPE

2、抗原的测定

3、中和试验

4、病毒间的干扰现象（乙脑V和脊髓灰质炎V，流感V和西方马脑炎V，TGEV和牛病毒性黏膜V）

5、EM观察

6、实验动物或鸡胚接种

病毒理化学特性的测定

1．毒核酸型的测定

原理：FUDR、ICDR、BRUDR是嘧啶的卤化物，进入细胞后发生磷酸化，掺入新合成的DNA 以代替胸腺嘧啶，从而抑制DNA的合成。常用浓度为50ul/ml。

2．脂溶剂敏感试验

1）、乙醚敏感试验

取同批病毒分状分装于两个青霉素瓶中，16ml/瓶，1瓶加入麻醉用乙醚至终浓度为20%，橡皮塞紧，4℃24h，期间不时摇动，2000rpm 20min。用毛细管吸取病毒液至另一个小瓶内，

。

适当吹打使残余*醚挥发尽，然后测定两组病毒的TCID

2）、氯仿敏感性试验

向病毒液内加入分析纯氯仿，浓度为4.8%，4℃震荡混合10min。然后500rpm 5min，吸取上层液体，滴定病毒TCID

。对照组病毒加入终浓度为4.8%的生理盐水，同样自理和滴定。

3）胰蛋白酶敏感试验

脊髓灰质炎病毒、TGEV抵抗胰酶，痘病毒、呼肠孤病毒、疱疹病毒易被胰酶灭活。取病毒液两瓶，每瓶，其中1瓶加入1%的trypsin至终浓度为0.5%，加一瓶加入1ml培养基，橡皮塞紧瓶口，倒转混合，37℃1h，随即加入灭活血清8ml，混匀，终止胰酶的作用。测定两。

瓶的TCID

4）耐酸性试验

PH3.0 2h或PH5.0 1h

取等量病毒液两瓶，用0.1MHCL将1瓶病毒液调PH值3.0/5.0，另1瓶加入等量培养基做对照，37℃2h/1h，再用5.6%NaHCO

调PH值回7.2左右，对照组加入等量的培养基，测定

两瓶的TCID

。

5）耐热性试验

将病毒液分成等量的11个小瓶，其中4瓶分别置50℃、60℃、70℃、80℃水浴1h，另6瓶置50℃水浴分别感作5、10、15、30、60和180min，然后测定病毒的感染力

6）病毒粒子大小测定

1）EM（透射EM、鳞钨酸负染） 2）超速离心 3）滤过试验

例：PRV的分离鉴定

1．材料准备DMEM培养基、BHK-21细胞、新生犊牛血清、青链霉素溶液、微孔滤膜、细胞

培养瓶、CO

培养箱、倒置显微镜。

2．操作步骤

2.1病料的采集对于刚死亡或活体送检并处死的动物，无菌采取肝、脾、肺、肾、脑，尤其三叉神经节、嗅球，4℃送检

2.2样品处理于灭菌乳钵内剪碎，加入灭菌玻璃沙研磨，用生理盐水或DMEM 1∶5稀释，-70℃反复冻融，3000rpm 30min，取上清经0.22um微孔滤膜过滤后，加入青链霉素溶液至终浓度为100u/ml，-70℃保存作为接种材料

2.3病料接种将病料滤液接种已长成单层的BHK-21细胞，接种量为培养基量的10%，吸附后，加入含新生犊牛血清（经过56℃水浴灭活30min，过滤除菌，无支原体）的DMEM培养基，37℃温箱培养。

2.4观察结果接种后24-48小时，BHK-21细胞应出现典型CPE，表现为细胞变圆、脱落。如第一次接种不出现CPE，应将细胞培养物冻融后盲传3代，如仍无CPE，则判为PRV阴性。

2.5病毒的鉴定将出现CPE的细胞培养物反复冻融后，用PCR、荧光抗体试验等两种方法中的任一种方法作进一步鉴定。

ELISA

1）间接法：检测Ab。用Ag包被板子+Ab（未知）+抗Ab+酶底物显色

2）双抗体夹心法：检测Ag。用Ab（已知）包被板子+Ag(未知)+抗Ab+酶底物显色操作步骤

1.预备试验：确定酶结合物、包被抗原/抗体的最适浓度，底物的最适反应时间

2.包被（载体、包被液ph9.5-9.6、吸附4℃过夜/37℃1-5h、Pr浓度）

3.洗涤

4.封闭1%-3%牛血清白蛋白，3%-5%脱脂奶，10%牛/马血清

5.判定目色比色----定性，光电比色----P/N≥2.0为阳性

例：猪瘟病毒强毒强弱毒鉴别诊断ELISA/PRV-ELISA（间接法）

1、材料准备：抗原、酶标抗体、底物（OPD-H

）、酶联检测仪

2、操作步骤

2.1包被：将PPV抗原加入酶标板孔内，每孔100ul，37℃作用1h后置4℃冰箱过夜

2.2洗涤：弃去孔内液体，用洗涤夜洗3次，每次3分钟，用吸水纸拍干

2.3封闭：各孔加入封闭液100ul。37℃1h按2.2

2.4加入待检血清：待检血清经56℃ 30分钟灭活后用洗涤液稀，每孔加入100ul，37 1h 重复2.2

2.5加入酶标抗体：用洗涤液将酶标抗体按工作浓度稀释，每孔100ul，37 1h，重复2.2

2.6加入底物（OPD-H

）：每孔100ul室温避光显色25分钟

2.7终止反应：每孔加50ul终止液反应终止反应2.8测定OD值：在上酶联检测仪490nm波长处读数

2.9血清阴阳性判定标准的确定取60份经中和实验检测为PRV抗体阴性的猪血清，按1∶

20稀释后作间接ELESA实验，测定490nm波长处OD值，规定以60 份血清的平均OD值加上3倍标准差作为判定阴阳性的临界值IFA

将分离毒第5代毒接种于Marc-145，培养，培养48h，冷丙酮固定10min，分别加入1∶20的PRRSV\HCV、PPV\PRV高免血清，PRRSV阴性血清，37℃1h，0.01mPH7.2 PBS洗涤3次，再加入1∶40莹光标记兔抗猪IgG，37℃ 1h,0.01m PH7.2PBS洗涤3次，甩干，荧光显微镜下观察。设PRRSV美洲株和未接毒细胞对照

病毒的粗提纯浓缩（中性盐沉淀法）（以伪狂犬病病毒为例）

原理：病毒在45%以上饱和的硫酸铵溶液中沉淀，且保持其感染性。

一．实验步骤：将病毒液反复冻融3次——按42.5g硫酸铵/100ml病毒液的量加入硫酸铵，于4 ℃冰箱搅拌沉淀过夜——离心沉淀——弃上清——用适量的水或（PBS）悬浮——装透析袋透析以除去硫酸铵---再浓缩到原液的40倍。

1．病毒材料：

将伪狂犬病病毒接种于BHK-21细胞，病变后收集细胞培养物，反复冻融3次，即为样品材料。2．病毒提纯浓缩

先将细胞培养物3000rpm离心30min(4℃)，弃去细胞碎片及杂质，收集上清夜，按100ml 病毒液42.5g硫酸铵的量加入硫酸铵，搅匀后置4℃冰箱搅拌沉淀过夜。然后5000rpm离心40min

（4℃），去上清，沉淀用适量的灭菌ddH

2O悬浮（如原体积的20%），装与透析袋中，于ddH

O中

搅拌透析，每半个小时换一次液，共换5次，第5次透析过夜，透析完成后，取出，用聚乙二醇或蔗糖将病毒浓缩至原体积的1/40，即得初步提纯的病毒液。

分子病毒实验技术

一．PCR

(一)PCR步骤：

1）变性加热至90-95℃，氢键断裂，双链解离成单链。

2）复性降温至42-55-62℃，使引物与其互补的摸板在局部形成杂交DNA双链。

3）延伸 72℃，在DNA聚合酶、4种dNTP、Mg+2存在条件下，引物延长，新链合成。（二）几种PCR摸板的处理方法

1）细菌：挑细菌于离心管中，加适量ddH

O，涡悬，于沸水浴中变性10min（电炉，饭盒，带孔泡沫块）速置冰浴中，12000rpm 离心数秒，取上清作模板。或取细菌培养液200ul，12000rpm 2min去上清，加80-100ul水悬浮，于沸水浴中变性10min，迅速置冰浴中，12000rpm 离心数秒，取上清作模板。

2）细胞培养物：收集病变细胞（勿冻融）悬液，10000rpm离心数秒，取细胞沉淀用适量sample Buffer 悬浮(也可用472.5 ulTEN或生理盐水悬浮，后同病料处理)，加入蛋白酶K 至终浓度为100ug/ml，37℃1h，取出于沸水浴中变性10min，迅速置冰浴中，3000rpm离心数秒，取上清作模板。

Sample Buffer 终浓度

KCL 50mM

Tris-HCl(PH9.0) 10mM

明胶 0.01%

Triton x-100 0.1%

NP-40 0.45%

Tween 20 0.45%

3) 质粒、病毒基因组DNA沸水浴中变性10min，迅速置冰浴变性10min,迅速置冰浴中备

用

4）料与鼻拭子

（1）匀浆器将病料组组织充分匀浆，用TEN缓冲液/生理盐水按1:5稀释

（2）收集悬液于离心管内，-20℃冻融3次

（3）5000rpm5min

（4）取472.5ul上清液于另一离心管内，加入25ul的10%SDS（终浓度为0.5%，破外细胞组分）和2.5ul20mg/ml蛋白酶K（终浓度为100ug/ml，消化去掉蛋白质，尤其是与DNA 给合的组蛋白），混匀。

（5）50℃水浴过液

（6）用等体积（500ul）的苯酚：异戊醇、苯酚：氯仿：异戊醇、氯仿：异戊醇名抽提一次（去掉蛋白质和细胞膜组分）

(7) 吸取上清，加倍量无水乙醇、0.1倍的3M NaAc于-20℃沉淀30min，10000rpm 10min,

（8）沉淀用70%洗一次，真空干，用20ul ddH

O溶解，-20℃保存备用

注：快速简便的方法：检测样品可为纯化DNA，亦可为细胞、组织、任何含病毒的样品。一般无须提取DAN,直接取少量样品（少于10ul）,高温低渗液体（如水煮沸变性10分钟后）溶解细胞制备摸板进行PCR。

（三）病料中RNA提取

1）取样品（病料上清和鸡胚液）125-250-200ul/样，加入375-750-400ulRNA 提取裂解剂（TRIZO）(1∶3)—RNA ex Reagant Ls。混匀，涡悬，静置5-10min。

2）加入氯仿100-200-200ul（5∶1），手摇颠倒混匀，涡悬静置5-10min。12000r/min 离心10-12min。

3）取上清（先调枪为100ul，共取得300-600ul）,加入等两量的冰冻的异丙醇（吸去取异丙醇时平移枪头哦，以免枪头滴液），震荡，混匀，室温5-10min 或-20℃30min(梢长无妨，如过夜)。置室温溶解，4℃12000r/min 10-12min,弃上清，吸干管口余液。4）加入适量冰冻75%乙醇或1ml 75% DEPC 水处理乙醇（750ml 无水乙醇+250DEPC水）洗涤，4℃7500-12000r/min 6-10min,弃上清。放置于平铺的一张洁净纸上，置超净台风干（约10-20min）.5）加入10-15-20ul的nuclease-free water 即DEPC水/(15ulTE PH8.0) /样品，于38-56℃水浴溶解约10min。（最佳-70℃保存）.抽吸混匀,进行下一步实验如RT-PCR。

Rnase:无处不在（如人是皮肤，故需作戴手套）及难于灭活（高压灭菌和蛋白抑制剂不能使所有的RNA完全失活）。氯仿擦拭处理的用具，通常可消除Rnase的活性。

注意：PCR产物电泳中在目标带前可可能出现引物二聚体的带，而提质粒电泳在目标带前可能出现RNA带。

准备物品：枪头（200UL/1000UL）、枪（200UL/1000UL）、RNA抽提试剂、氯仿、异丙醇、75%乙醇（用无水乙醇配制如750ML无水乙醇+250DEPC水）等。

PCR 模板的组成，欲扩增片段的长度及其不同的使用目的，对引物的要求是不一样的；基因组DNA作模板时，由于其数量的膨大及结构复杂，除特异扩增外，易产生非特异扩增产物。总原则：提高扩增效力和特异性。

（四）引物

1．据DNA（DNA-V）或CDNA（RNA-V）的已发表的相关序列（病毒独特的基因区域）来设计

2．如为诊断用PCR，直接设计即可。

3．如要酶切鉴定及克隆PCR产物，加入保护碱基和酶切位点5‘端（酶切位点的选择要考虑序列内部自身已有的酶切位点，以免多点切割基因）。

4．如要将目的序列（PCR产物）进行表达，加入保护碱基和酶切位点，起始子和终止子密码，终止子TAA、TAG、TGA，起始子：ATG

5．上游引物P1与序列5‘端序列相同（ATG），下游引物P2与序列3‘端互补且反向（TTA，

CTA，TCA）。例：PRV-EPO基因的克隆表达及序列分析

PCR扩增：据国外报道的INFH株EPO基因的核苷酸序列，设计一对能包括EPO基因完整编码区的特异性引物，上、下游引物分别设计了ECOR I和Xba I酶切为点。

：53’

上游引物P

保护碱基 EcoR I 起始子与Epo基因的核苷酸序列相同

—3’

下游引物P

保护碱基 Xba I 终止子与Epo基因的核苷酸序列互补且反向EPO序列：

53’引物设计原则：1）长度以15-30nt为宜。增加长度并提高退火温度，或选择其他DNA序列合成新的特异引物可提高特异性。2）扩增片段在300-1000bp为宜；RT-PCR以500bp为宜；过短不易检测，过长不易扩增。优化条件下，可扩增大于10Kb的片段。3）引物碱基组成随机分布，避免嘌呤或嘧啶堆聚现象。G+C含量在45-50%左右为宜；4）引物间尤其3’端不应有互补序列（4个碱基以上），以免形成二级结构；5）引物序列必须是被检病毒特异的，在待扩增区域的两边均找出约20 个核苷酸（G+C）含量相近的合适序列。引物的碱基顺序不与非扩增区域有同源性，要求用计算机进行补助检索分析。6）原则上引物3’末端碱基与模版DNA一定要配对，3’末端碱基不选A（选T、C、G）。5’端可不与模版匹配。如PCR产物用于克隆，在5’端加上单一的酶切位点。可加错配碱基，造成突变。可加ATG其使密码。最多可游离10个bp。7）退火温度（15-25bp）Tm=4（G+C）+2（（A+T），一般1Kb以内，延伸1min足够，多于1Kb，则延长时间，扩增10Kb，延伸15min。不管模版浓度多少，20-30次循环较合理。8）PCR产物bp相差不大，如26bp与71bp，可用较高浓度的琼脂糖18-20g/L 电泳分离，效果较好。

PCR反应各组分浓度：

1）MgCL

：Mg+过多则非特异扩增，过少则扩增效率较低。可预实验确定最佳Mg+浓度，终浓

度一般为1-4mmol/L，工作浓度一般为25mmol/L.（3ul）

2）引物：终浓度一般为0.1-0.5umol/L（100-500nmol/L），既100pmol或0.5ug（500ng）工作浓度一般为0 umol/L（1ul）。一般将5个OD值（33ug/OD）用400ulddH

O溶解，计算出

其浓度，一般用500ul溶解50uM，分装保存。取其一做5倍稀释（一般为10uM）作为工作浓度近期保存使用。

3）dNTP：终浓度一般为50-200umol/L工作浓度一般为2mmol/L（1ul）、1.25mmol/L 4）TaqE：终浓度一般为2.5U，工作浓度一般为5U/uL（0.5ul）

5）变性剂：加入适量者如（二甲亚砜DMSO（50ul jia 2.5ul）、5%甲酰胺、尿素等）可减少模版二级结构提高特异性尤在RT-PCR加入5%甲酰胺提高特异性且cDNA产量大增。

5）PCR的条件优化：通过改变退火温度或Mg+浓度来获得真实的扩增结果对于复杂的混合物，采用另一对嵌套引物可改善其特异性。

循环参数：变性温度92-95 ，40-60Sec，

退火温度55 ，30-50Sec，

延伸温度72 ，60-90Sec 循环次数25-40 次

注意：PCR有0.3-0.5%（250：1）左右误差，如克隆PCR片段，制备点突变或缺失突变株时，用具校对错误碱基功能的VentDNA聚合酶，合成误差比TaqE：小得多。

合成的引物进行PCR反应时无目的带？

1）引物和模板是否配对，同源性有多大？

2）引物本身是否有立体结构，或两条引物间是形成高次结构？

3）PCR试剂/PCR仪是否正常？

重新合成引物一试

核酸定量：1mg./mldsDNAA

260=20； ssDNA\RNAA

260

=25

DNA纯度：如dsDNAA

260/A

280

=1.8为纯DNA；如>1.8，则RNE污染，如<1.8，则蛋白质污染

Ds DNA 10Kbp=6.60×106Dalton 1OD260nm=50ug SsDNA 10Kbp=3.30×106Dalton 1OD260nm=40ug RNA 10Kbp=3.45×106Dalton 1OD260nm=40ug 1bp=660Dalton 1nt=330 Dalton

蛋白质 BSA∶1OD

260nm =1.67mg （1mg/ml=0.6 OD

260nm

）

氨基酸平均分子量 =110Dalton

核酸-蛋白质 1Kb RNA=37k Dalton 蛋白

10 kDalton 蛋白=273Base RNA

DEPC 水；加入0.05-0.1%的DEPC（焦碳酸二乙酯），室温（37℃）处理过夜，然后高压灭菌，去除DEPC。

测序样品提供：

1.提纯质粒：说明Vector名称及结构情况，插入片段的长度及插入片段的酶切位点情况，提供3-5ug提纯的质粒DNA （浓度大于200ng/ul）

2.含有质粒的菌体；说明菌体的种类及抗生素抗性的情况，所含载体的名称及结构情况，插入片段的长度及插入片段的酶切位点情况。

3.PCR产物直接测序；提供切胶回收纯化的PCR产物1-3ug （浓度大于100ng/ul）并说明PCR产物的长度，引物的具体序列等情况。小于100bp 不能测序。

双脱氧末端终止法测序：（样品模板DNA准备）

将待测病毒DNA 或cDNA（RNA-V）重组到M13噬菌体或高拷贝质粒（如PUC系列），获得病毒核酸片段的克隆。或用PCR大量扩增待测片段。然后碱变性双链DNA为单链DNA模板。按退火，延伸标记反应（加T7测序酶聚合酶，5分钟），延伸终止（将延伸标记等份4份，加入4种ddNTP，使反应终止于所有可能发生的位置），终止反应（95-100℃），电泳分离，放射自显影条带，读出序列。

序列数据库：两个最大的DNA数据库为欧洲的EMBL和美国的GenBank

也建成了蛋白质和RNA序列的数据库

序列分析：测序所得系列用计算机和软件包来分析，如威势康星大学的GCG软件包，或PC程序如DNAstar，用Blast软件对目的基因和参照基因进行DNA核苷酸序列和编码氨基酸序列进行（同源性）分析。如两基因比较，1有19处发生了点突变，两者同源性为94%。由DNA序列推导的氨基酸序列可见，1基因编码的氨基酸在8处发生了突变，两者同源性为95%。

例：采用双脱氧末端终止法对Pmd-ORF51进行双向测序，Blast、Goldkey、Signalp、EMBoss 和Mega等软件进行同源性比较及脱水性、抗原性、潜在糖基化位点分析和绘制进化系统树。

用途：1）鉴别出重要的序列特征，如基因的大小，限制酶切位点（限制图谱），方向，可读框，起始子与终止子，潜在的启动子部位，内含子-外显子连接区等。2）将新序列与数据库内所有已知序列进行比较，以判断是否曾获得过相关序列。

病毒基因的克隆与鉴定

病毒基因组的提取：（DNA/RNA）

1.病毒提纯：

2.基因组的提取：

PCR应用实例：

物品、试剂的准备：如PCR管、托器、找齐试剂置冰浴或冰盒并计算出用量等。

1.RT-PCR检测HCV

（1）材料准备待检组织，匀浆器，氯仿、异丙醇，75%乙醇，生理盐水，RNA提取试剂盒（Omega），RT-PCR 试剂盒（TaKaRa）等。引物：扩增猪瘟病毒E

基因中585bp基因片

段，由上海生物工公司合成

序列：上游引物p

：5’——CCTGCAAGGAAGATCACACG——3’

：5’——CCGTGTAGGTCACTGGTTCA——3’

下游引物p

仪器设备：PCR扩增仪，电泳仪，凝胶电泳紫外检测仪

（2）操作步鄹：1）样品采集：动物病死或扑杀后，取和脾组织，-20℃冷藏。2）样品处理：

研磨。按1∶5盐水收集于离心管内，-70℃冻融三次，7000rpm，5min取上清液。3）RNA提取，按Omega公司RNA提取试剂（Omega）的操作程序提取总RNA 4）RT——PCR操作程序：按TaKaRa公司的一步法RT——PCR试剂盒操作程序进行。

注：一般先加水，最后加酶，这样可将后者完全吸纳不浪费。个液混合后分管（50-模板量=分管量，如50-10=40，理论上应加40，但考虑到有少量附在管壁上，故用39）），最后加入模板，离心甩一下，使管壁上所附液沉于管底。保证反应总量。扩增条件为：50℃反转录30分钟，94℃变性5分钟，进入循环，94℃50秒，56℃1min，72℃60秒，40个循环后，72℃延伸10分钟/4℃存放。

（3）RT——PCR产物检测：扩增产物（产物：加样缓冲液=6：1，如8-12ul+2ul即可），在0.8%琼脂糖胶上（一般电压8v/cm，大胶100-120v，小胶60-80v）EB染色（或制胶时加在凝胶中，4ul/100ml凝胶），在紫外光下与标准分子量比较，如见585bp片段，初步诊断为阳性。凝胶用50*TB配制，终浓度为1*TB。Marker取6ul即可。样品接负极。正极为红。选择适合观察预期片段的Marker。跑胶0.5-1h内。用电脑成相系统观察、记录并保存图象。注：EB 为强致癌物质。配母液500ul/ml终浓度为0.5ul/ml水溶液。加样后余下的20-6ul的样品置-20℃保存备用。

2.RT-PCR检测样品FMDV

（1）样品采集：水疱液和水疱皮、血液、淋巴液、肌肉等、鼻咽子

（2）样品处理：

（3）引物设计和合成：据GenBank发表的FMDV核酸序列设计合成，p1、p2分别位于FMDV 的VP1的上游和下游ZA处。大小约750bp

（4）仪器：高速台式离心机、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶电泳紫外检测仪

（5）提取RNA：

常规法提取待检测RNA（异硫氰酸胍法）

取300ul待检测样品上清，加6M异硫氰酸胍变性液300ul，混匀，冰浴10分钟，加2M醋酸钠（NaAc，PH4.0-4.5）60ul （总体积的1/10），混匀，再加等体积的氛-氯仿-异戊醇=25：24：1，混匀，冰浴10分钟，8000rpm8-10min。取上层水相至另一1.5ml离心管，加等体积的异丙醇，-30℃4h以上或过夜。12000rpm10min，弃上清留沉淀（也许管内无肉眼可见物）。加800ul75%乙醇，轻摇2-3次，12000rpm8min，弃液体，风干或抽干，沉淀溶于30-50 ul水中，用于RT-PCR或-70℃备用

RNA提取试剂盒提取：（上海生工的RNA提取试剂盒SK362）

取待检材料上清200ul，于1.5ml离心管中，加700ulRLT溶液，涡旋，再加500ul 无水乙醇混匀；将分离柱UNIQ-10放入2ml收集管，并将1.5ml离心管中的溶液移入分离柱内，10000rpm1min弃过滤液，加500ulRW溶液于分离柱内，10000rmp1min，弃过滤液，加500ul 溶液于分离柱内，10000rpm2min，取出分离柱，放入另一1.5ml离心管中，加30-50ulDEPC 处理水于分离柱中央的膜上，10000rpm1min，弃分离柱，所得RNA直接用于RT-PCR或-70℃备用

RT-PCR操作程序：按TaKaRa公司的一步法RT-PCR试剂盒操作程序进行

模板RNA 5-10-15ul

10×RT-PCR缓冲液 5ul

25mM MgCl

10ul

10mM dNTP

5ul

RNA酶抑制剂（40u/ul 1ul（终浓度0.8u/ul）

反转录酶（AMV Rtase X I）（5u//ul） 1ul（最后加）

TaqE 1ul（同上）

引物各1ul（原状为粉状，可配成200uM原液，再配成工作液20Um）

DEPC处理水 15-20ul

总体积为50ul。据PCR仪的要求，加或不加矿物油约20ul覆盖。

RT-PCR反应程序：

50℃反转录30min，94℃变性3min（灭活反转录酶），进入循环，94℃60秒，56℃秒，

的PCR 72℃秒，35-40个循环后72℃延伸10分钟，8℃2h。（以本室构建的重组质粒pMDVP

产物作为阳性对照，用标准分子量2000bp比较，判定结果。注意：PCR产物电泳中在目标带前可能出现引物二聚体的带，而提质粒电泳在目标带前可能出现RNA带。

3、JEV RT-PCR

1、材料准备：待检组织、匀浆机、TEM缓冲液、氯仿、无水乙醇、异丙醇、75%乙醇、TRIZOL裂解液、RT-PCR试剂盒（TaKaRa）

引物：扩增乙脑病毒中447-497之间50/bp基因片段，由上海生物工程公司合成。

序列：上游引物p1：5’—TCATGTGGCTCGCGAGC—3’

下游引物p2：5’—TCTGTAAGCCGGAGCG—3’

仪器设备：PCR扩增仪、电泳仪、凝胶电泳紫外检测仪

操作步骤：1）样品采集：动物病死或扑杀后，取脑组织，脑脊髓液，血清等，活猪无菌采集血清，冷藏送检。2）病毒RNA提取：病料研磨，按1：5用TEM缓冲液悬浮收集于离心管内，冻融三次，7000rpm 5min取上清液。取待检材料上清或（血清）250ul氯仿，涡旋，室温作用10-15分钟，12000rpm15min。吸上层水相500ul，加入等体积的异丙醇，混合后置室温，沉淀。所得的RNA直接用于RT-PCR。

RT-PCR操作程序：按RT-PCR试剂盒操作程序进行。反应体系50ul，组成如下：

10×缓冲液 5ul

10ul

25mM MgCl

10mM dNTP

5ul

RNA酶抑制剂 1ul

反转录酶（AMV Rtase XI） 1ul

AmV-optimized TaqE 1ul

引物各1ul

模板RNA 10ul

灭菌DEPC处理水 13ul

反转录条件为50℃30分钟，扩增条件为94℃变性2分钟，进入循环，94℃30秒，58℃40秒，72℃2分30秒，35个循环后72℃延伸10分钟。

RT-PCR产物检测：取扩增产物5-10ul加样于0.8%琼脂糖凝胶上电泳，在紫外光下观察PCR产物在凝胶中的位置，用标准分子量比较，判定结果。

4、PCV-IIPCR

材料准备：待检组织、组织匀浆器、蛋白酶K、SDS、苯酚、氯仿、异戊醇、TEN缓冲液

引物：扩增PCV1093-1586之间494bp基因片段，用上海生物工程公司合成。

序列：上游引物p1：5‘—CACGGATATTGTAGTCCTGGT—3‘

下游引物p2：5‘—GACAGTATATCCGAAGGTGCGG—3‘

仪器设备：PCR扩增仪、电泳仪、凝胶电泳紫外检测仪

操作步骤：1）样品采集：采集病猪的淋巴结、肺置-20℃ 2）样品处理：研磨，按1：5用

TEN缓冲液悬浮收

集于离心管内，-70℃冻融三次，7000rpm，5min取上清液472.5ul，加入25ul10%SDS和2.5ul 的20mg/ml蛋白酶K，50℃水浴摇床2h后，加入等量的饱和酚500ul，涡悬20秒。离心取上清，加等量的酚；氯仿；异戊醇（25：24：1）抽提一次，再用氯仿：异戊醇（24：1）抽提

O溶解，-20℃储存备用

一次，乙醇沉淀，抽干，加入20ulddH

PCR操作程序：反应体系50ul，组成如下：

10×缓冲液 5ul

15mM MgCl

/25mM 3.0ul/3ul

dNTPs/1.25mM 1ul/8ul

引物/20pmol/ul 各2.5ul/1ul

TaqE 0.5ul

模板RNA 1.0ul/5ul

灭菌去离子水 34.5ul

扩增条件为：94℃/95℃变性3/10分钟，进入循环，94℃60秒，55℃/54℃60秒，72℃90秒，35个循环后72℃延伸10分钟

（3）RT-PCR产物检测：扩增产物在0.8%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，在紫外光下与标准分子量比较，如见494bp片段，初步诊断为阳性

5、APP-PCR

1)材料准备：待检组织、培养基

引物：预期扩增的片段大小为610bp，由上海生物工程公司合成

序列：上游引物p1：5’—CCGACTTTTAAATCCGT—3’

下游引物p2：5’—GAACAGTTGTTCGCTAAGAC—3’

培养箱

仪器设备：PCR扩增仪、电泳仪、凝胶电泳紫外检测仪、co

2)操作步骤

2.1培养基制备：PPLO巧克力培养基，取35克PPLO琼脂加热溶于1000ml水中，121℃灭菌30min，冷却至60℃左右加入10%（v/v）脱纤棉羊血和1%葡萄糖（w/v）于80℃水浴，培养基由红变巧克力色，倒平板，4℃保存

2.2 样品采集：病肺组织，低温保存

培养箱24-36h后，将菌2.3样品处理：取肺组织无菌接种于PPLO巧克力培养基，37℃10%CO

落透明，圆润，直径1-2mm的菌株刮取2个菌落洗脱于含100uml无菌水的离心管中，1000rpm5min，弃上清，无菌水悬浮沉淀，涡旋，于沸水中水浴10min后，再放置-20℃冻结。冻融后10000rpm5min，取上清作模板。

PCR操作程序总体积50ul

10×缓冲液 5ul

3.0ul

25mM MgCl

5uM/10uM引物 1ul

TaqE 0.5ul

模板DNA 7ul

灭菌去离子水 27.5ul（设一个阳性对照，即阳性模板）

2.4 PCR扩增条件为：94℃变性3分钟，进入循环，94℃60秒，50℃1分30秒，72℃1分40秒，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。

2.5 PCR产物检测：取8ul扩增产物和5ul Marker，加到含EM的0.8%琼脂糖凝胶中，电压为80v，电流为40-60mA，电泳15min左右，然后在紫外光下与标准分子量比较，如见预期片段，初步诊断为阳性

6.PPV—PCR

1、材料准备：待检组织、组织匀浆机、蛋白酶K、SDS、苯酚、氯仿、异丙醇、TEN缓冲液

序列为：上游引物p1：5’—CAGAATCAGCAACCTCAC—3’

下游引物p2：5’—TGGTCTCCTTCTGTGGTAGG—3’

仪器设备：PCR扩增仪、电泳仪、凝胶电泳紫外检测仪

2、操作步骤：

2.1样品采集：采集病猪的淋巴结、肝置-20℃低温保存

2.2样品处理：研磨病料，按1：5用TEN缓冲液悬浮收集于离心管内，-70℃冻融三次，7000 rpm，浴摇床置2h后，加入等量的饱和酚500ul，涡悬20秒。离心取上清，加等量的酚；氯仿；异戊醇（25：24：1）抽提一次，再用氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次，乙醇沉淀，抽干，加入20ul ddH

O溶解，-20℃贮存备用。

2.3 PCR操作程序：反应体系50ul，组成如下：

10×缓冲液 5ul

25mM MgCl

5.0ul

dNTPs 1.0ul

TaqE 0.5ul

模板DNA 1.0ul

灭菌去离子水 35.5ul

PCR扩增条件为：94℃变性3分钟，进入循环，94℃45秒，54℃45秒，72℃30秒，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存

2.4PCR产物检测：取8ulPCR扩增产物和5ulMarker，加到含EM的0.8%琼脂糖凝胶中，电压为80v，电流为40-60mA，15min左右，然后在紫外光下与标准分子量比较，如见预期445bp 片段初步诊断为阳性

7、PRV——PCR

1.材料准备：待检组织、组织匀浆器、蛋白酶K、SDS、苯酚氯仿、异丙醇、TEN缓冲液

引物：上游引物p1：5’—CAGGAGGACGAGCTGGGGCT—3’

下游引物p2：5’—GTCCACGCCCCCGCTTGAAGCT—3’

仪器设备：PCR扩增仪、电泳仪、凝胶电泳检测仪

2.操作步骤：

2.1样品采集：采集病死或捕杀动物，取脑组织；对于检测活猪，用灭菌棉签、伸入猪鼻腔中，采取鼻黏液，即为鼻拭子，冷藏条件送实验室检测

2.2样品处理：研磨病料，按1：5用TEN缓冲液悬浮收集于离心管内，-70℃冻融三次，7000rpm，5min，取上清液。取上清液472.5ul，加入25ul10%SDS和2.5ul的20mg/ml蛋白酶K，50℃水浴摇床置2h后，加入等量的饱和酚500ul，涡悬20秒，离心取上清，加等量的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提一次，再用氯仿：异丙醇（24：1）抽提一次，乙醇沉淀，抽干，

加入20ulddH

O溶解，-20℃贮存备用。

2.3 PCR操作程序：先将制备的模板DNA置于100℃水浴10min作变性处理，然后立即放于冰浴中不少于3min，PCR反应系为：总体积25ul/50ul，组成如下：终浓度

10×缓冲板/ 2.5ul/5.0ul

15mM MgCl

2/25mM MgCl

2.5ul/

3.0ul

/0.5mM （1-4Mm）

dNTPs/2mM dNTPs 2.0ul/1.0ul /40uM （50-200uM）

引物/P1 P2（10uM）各 2.0ul/1.0ul /200nM

（100-500nM，100pM，0.5ug，500ng）

TaqE/（5U/ul） 1.0ul/0.5ul /2.5U

DNA模板 2.0ul/5ul

灭菌去离子水 11.0ul/21ul

矿物油约20ul PCR扩增条件为：94/95℃变性3/4分钟，进入循环，94℃60/60秒，65/60℃60秒，72℃

60秒/2min，40/35个循环后72℃延伸5/10分钟，4℃保存

2.4PCR产物检测：取8ulPCR扩增产物和5ulMarker，加到含EM的1%/0.8%琼脂糖凝胶中，

电压为80v，电流为40-60mA，15m左右，然后在紫外光下与标准分子量比较，如见预期217/1.23Kb片段，初步诊断为阳性。为进一步进行PCR扩增产物的特异性鉴定，可取PCR 扩增产物用Sal I 酶切，酶切产物在2%琼脂糖凝胶中电泳，EB染色，在紫外光下观察并与标准分子量比较，可见140bp及77bp两个片段。

LB液体培养基：胰蛋白胨10.0g，酵母浸出物5.0g，NaCl 10.0g，溶于双蒸水中，完全溶解

后调PH值到7.0-7.2，定溶至1000.0mL，在15磅高压下蒸汽灭菌20min，室温保存。

LB固体培养基：在LB液体培养基中加入1.5%的琼脂，在15磅高压下蒸汽灭菌20min。待培

养基温度降至50℃左右，加入相应的抗生素后，铺制平板。待培养基凝固后，于4℃保存备

用

LB： 1%细菌培养用胰蛋白胨（bacto-tryptone） 10g

0.5%细菌培养用酵母提取物（bacto-yeast extract） 5g

0.5%NaCl 5g

加水至1000ml，容量瓶定容，分装，15磅灭菌30min

AMP：可配成50mg/ml，终浓度50ug/ml，即加1ul AMP/ml培养基

电泳缓冲液 1000ml 50*TAE： 242g Tris碱，57.1ml冰乙酸，100ml 0.5M EDTA（PH8.0）（0.04Mtris-乙酸，0.001M EDTA）

上样缓冲液（6×）：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青，40%（w/V）蔗糖水溶液

0.8%琼脂糖凝胶的配制：

称取0.8g琼脂糖粉，加入100ml 1*TAE中，加热煮沸使琼脂糖完全融化，稍冷却后，

加入5ul（10mg/ml）EB，混匀后倒入电泳槽中，制备凝胶。

Marker：-20℃保存，为含1×Loading Buffer的DNA溶液。每次取5-20（窄孔加5ul，宽孔

则适当增加加样量）。

（常用Marker DL2000. 100-250-500-750-1000-2000.

DNA Marker DL15，000. 250-1000-2500-5000-7500-10000-15000）

O：可预先将灭菌水（最好DEPC水）分装于1.5ml EP冰箱备用。

ddH

O中，容量瓶定容。充

透析液：10mM Tris Base 三（羟甲基）氨基甲烷。2.4g溶于2000mlH

分搅拌，置4℃冰箱的磁力搅拌器上搅拌，用HCl调PH值8.0

二、感受态细胞的制备（氯化钙法）

（克隆转化用：DH5ɑ；原核表达用：BL21）

1、取-20℃/-70℃保存的E.coli DH5ɑ菌种（1ml菌液加入0.5ml甘油）划线接种于LB琼脂

平板上培养（最佳，亦可直接取5ul接入3ml LB）。或于LB琼脂平板（4℃保存）上（挑菌）挑取单个DH5ɑ菌落（用灭菌牙签或枪头沾取），接种于装有2-3-4mlLB液体培养基的旋盖细菌瓶中，37℃250-300r/min摇床（摇菌）震荡培养5-6h或过夜（8-12-16h），置4℃8h使菌体处同步繁殖状态（一般可不做）。无菌转接到装有50mlLB液体培养基的500ml 盐水瓶中（按1∶100比例，即加入500ul菌液入培养基中）（接菌），继续培养约2-3-4h （一般不超过3h，以稍见浑浊为宜，呈半透明状，细菌处于对数生长期，不老化）（收菌）。

或者（急用）于LB琼脂平板上挑取单个DH5ɑ菌落，无菌转接到装有50mlLB液体培养基的500ml盐水瓶中，于37℃250-300r/min摇床震荡培养3-4h。

2、无菌将细菌转移到用冰预冷的50ml离心管中，冰浴30min，使培养物冷却到0℃。

3、4℃4000r/min离心10min，弃上清液，将管倒置1min使残留培养液流进尽。

2ml重悬沉淀冰浴25-30min。

4、沉淀中加入冰预冷的10ml 0.1mol/LCaCl

2ml重悬沉淀（视

5、4℃4000r/min离心10min，弃上清，沉淀中加入冰预冷的0.1mol/LCaCl

菌量而定，占菌液1/15-1/20体积，或占原菌液4%），悬浮菌体可马上用于转化。

6、如近期使用，将悬液分装成小份或整管，可放在4℃保存1周；如长期保存，加入无菌甘

油至终浓度为15%，分装0.1ml/管，70℃冰箱保存设备。

LM 急用法：接种于3mlLB，过夜培养，移入1.5mlEP。12000r/min4℃10min，弃上清，于沉

淀中加入冰预冷的1ml0.1mol/LCaCl

重悬沉淀，冰浴10min，11000r/min4℃10min，于沉淀

重悬沉淀作为感受态菌。每100ul/管加入10ul/样，进

中加入100ul 冰预冷0.1mol/L CaCl

行转化。

PCR产物及克隆载体的酶切：（20ul）

例 1 ：质粒 R1（PCR产物）

DNA 10ul 5ul 10ul

EcoR I 1ul 1ul 1ul

10×buffer 2ul 2ul 2ul

ddH

O 7ul 12ul

7ul

先加水（7×3），再Buffer（2×3），酶（1×3），（R1处为12可先加7后再补加5）。

将水、Buffer、酶混合分装于3个管内，10ul/管，再加入样品DNA，R补加5ul。离心甩一

下。37℃水浴1-1.5h。

例2：实验六（二）

例3：20ul（单酶切）

BamHI 1×12=24

K Buffer（10*K） 2×12=24

O 15×12=180（上述三者先混合分管，20-2=18ul/管

质粒DNA 2ul（最后加入各分管液中）

20ul（双酶切）

BamHI 0.5×6=3

EcoRI 0.5×=3

K Buffer（10*K） 2×6=12

O 15×6=90（上述三者先混合分管，20-2=18ul/管）

质粒DNA 2ul（最后加入各分管液中）

混匀，离心甩一下，使附在管壁上的液体下沉管底。37℃温箱2h（1.5-3h较好）

例：（自作）40ul

SK+载体 8ul

10×K Buffer 4ul

BamHI/EcoRI 2/2ul

O 24ul

操作：H

O—10×K Buffer—SK+载体—BamHI/EcoRI—混匀—离心甩一下—37℃温箱3h（4℃

短保，-20℃长保）。（下一步回收）

酶切产物的回收：（如无回收试剂盒，可将之抽提纯化，即酚/氯仿——氯仿（等量，吸上清