PI染色检测细胞周期

1、离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞两次。

2、加入预冷70%乙醇，于4℃固定过夜，或-20℃长期固定（4℃过夜一般隔天就进行检测，如果想推迟几天测，那就保存在-20℃，有资料说-20℃可以保存一个月，个人建议尽量在最短时间内检测，有些实验是在不同时间点上收细胞，这时我就等最后一次固定完了一块测，基本上也多在一周内检测完毕，没有特地去比较保存时间对检测结果的影响）。

3、细胞染色

离心收集细胞，以1mL的PBS洗细胞一次，加入500uLPBS含50ug/mL溴化乙锭（PI），100ug/mL RNase A，0.2% Triton X-100，4℃避光孵育30分钟（PI我是直接用PBS配成工作浓度，然后加入细胞沉淀混匀，RNA酶现加，但有时不加发现对实验结果也没太大的影响）。

4、流式分析

以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。

分析时，使用FL2-w和FL2-A显示，去除联体细胞，具体如下图。

细胞周期流式后一般分为G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有个凋亡峰(也称sub-G0期),而如果分析时细胞窗口没设置好，可能在最前面还有细胞碎片峰。

结果解读

G0/G1期细胞占总的61.2%，峰位于横座标的45.76

G2/M期占13.07，峰位于横座标的91.43

S期占25.73

G2/G1为2.0（即G2期为4倍体细胞，而G1期为2倍体细胞，比值为2）

峰的变异系数为4.54%（好）

细胞碎片为0.48%，细胞聚集体有0.06%。

总的细胞数（仪器检测到的）为17525个，

在细胞周期中分析的细胞数为17431个（即排除了碎片及聚集体后）

CV是变异系数。一般CV越小，峰形越好，越尖锐。能控制在5%左右是比较好的结果，一般小于10%就可以认可了。

PI单染检测细胞周期和细胞凋亡(Apoptosis)

PI（碘化丙啶）染色特点：一是能够与双链DNA/RNA螺旋的大沟部位结合，二是不能通过功能正常的完整细胞膜。基于以上特性，目前主要有两大方面的应用，配方也不同：

一方面的应用是检测细胞周期，检测细胞周期时，为了保证所有的细胞都能染上PI，因此要将细胞用乙醇固定，并加入Triton X-100 ，以增加膜的通透性；同时由于DNA使细胞的粘附性增大，加入EDTA以降低细胞粘附性；为了消除RNA的干扰，要加RNAase。由于要鉴定DNA含量，因此PI染料必须过饱和，所以PI 终浓度很高，一般50ug/mL。由于晚期凋亡细胞DNA断裂形成亚二倍体峰，因此可同时检测凋亡。

另一方面的应用是检测膜通透性（凋亡），由于PI不能进入完整的活细胞膜，因此一般认为PI染色阳性的细胞是死细胞。Annexin V/PI凋亡检测试剂盒中就是这种染液，它的作用是鉴定死细胞，从而与凋亡细胞区分开来。它的配制就是将PI溶于PBS，终浓度较低，一般2.5ug/mL。

所需试剂：

1、PI染液：

用于检测细胞周期的PI配制如下：

方法一：10×PI配制方法, 用时用PBS稀释至工作液：

5mg-----PI

0.1ml---Triton X-100

3.7mg--EDTA

10ml----PBS

2、RNaseA——2mg

方法二, 直接配制PI工作液：

PI -----5mg

RNaseA——2mg

1.0%Trition X-100——0.25ml

枸椽酸钠——100mg

生理盐水——65ml

调pH值至7.2-7.5

加蒸馏水至100ml, 棕色瓶分装，保存在4℃

操作步骤

1.细胞培养

铺细胞至6孔板或者35mm 培养皿，约4－5*10e5 cells/well, 如果要加药物，在此时可以加以不同种或不同浓度的药物。流式侧细胞周期对细胞的种板密度非常讲究，如果密度过高就会出现接触抑制，所以建议刚开始做预试验时可以种个细胞密度梯度。

2细胞收集，细胞培养至一定时间后，如果是贴壁培养的细胞，常规胰酶消化，PBS洗2-3次，制成单细胞悬液，并调整细胞数量至1－5*106 cells/ml。

3.细胞固定

3.1.加入3ml 预冷PBS重悬细胞，800 rpm×5 min，吸净上清。

3.2.加入500ul PBS，轻轻重悬细胞，使细胞分离为单个，逐滴加入预冷的100% 乙醇（-20℃）1.5 ml，使其终浓度为75% ，-20℃放置过夜固定，最长可以放置1周左右。

注意：固定细胞时，确保PBS悬浮细胞为单个，加入无水乙醇的时候要慢速，保证逐滴。细胞保存在4℃也可以。

4.细胞标记

4.1.取出固定的样品，800 rpm×5 min，弃上清。

4.2.加入3 ml预冷PBS重悬细胞，800 rpm×5 min，离心收细胞。

注意：可重复1-2次，以除去乙醇

4.3.加入150 ul RNaseA（250-500 ug/ml PBS稀释）重悬细胞，37℃消化30分钟。注意：做细胞周期时，RNaseA加与否对结果影响不大；如果要同时测凋亡，尽

量加入RNaseA。另外，在做这步之前，可用200目滤网过滤

4.4.加入150 ul PI工作液，4℃避光染色30分钟。

注意：如果用方法二配制的直接PI工作液，其已含有RNaseA，因此4.3步应省略。PI染液的量可根据细胞的多少来加，比如说有的人喜欢加500ul或1ml，其实只要和细胞完全孵育就可以，量多量少对结果不会影响太大。

4.5.转至流式检测管，上机检测，PI用488nm氩离子激光器激发，由630带通滤光片接收，通过FSC/SSC散点图收集10000个细胞，采用设门技术排除粘连细胞和在碎片，分析PI荧光直方图上细胞各周期的百分率和凋亡细胞百分率。

5、细胞周期分析：

正常人静止体细胞有46条染色体，为二倍体细胞，而正常增殖细胞则存在不同的DNA含量。在细胞周期的各个时期（G0、G1、S、G2、M）中DNA含量随各时相呈现出周期性变化，在G1期细胞开始合成RNA和蛋白质，但DNA含量仍保持二倍体，进入S期后开始合成DNA，此时细胞核内DNA的含量介于G1和

G2期之间。当DNA复制成4倍体时细胞进入G2期并继续合成RNA和蛋白质，直到进入M期，因此单纯从DNA含量无法区分G2期和M期，一旦有丝分裂分裂成2个细胞，同样G0和G1期的DNA含量也无法区分。PI荧光染料与DNA结合，其结合量与DNA含量成正比。因此，通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA 含量进行检测时将细胞周期各时相区分为G1 /G0期,S期和G2 /M期。G1 /G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N) ,而G2 /M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N) ,而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。

如何看这个图：横坐标表示荧光强度，纵坐标表示细胞数量。在每个图的旁边都会配有一些这个图的相关说明，如此图中我们看到Dip G1: 57.46 % at 48.73，表示G1/0期的细胞占总细胞的57.46，荧光强度在48.73；Dip G2: 10.49 % at 94.96同理表示：G2/M0期的细胞占总细胞的10.49%，荧光强度在94.96；大家可以算一下，二者之间荧光强度的比94.96/ 48.73应该是约等于2的，这就是说G2/M 期DNA含量为G1/0期的2倍，又验证了理论的推断。同样S期所占百分比也会体现出来。

在肿瘤病理学中，通常以S期细胞数量来判断肿瘤增殖状态。细胞增殖指数是指S期和G2/M期细胞之和占总细胞数的百分比，它反映细胞的增殖能力。

6、调亡的结果判定

在FSC/SSC散点图上显示凋亡细胞比正常细胞小（FSC小），在PI荧光图上，G0/G1期峰前出现亚二倍体峰。

从这个图，我们可以看到在G0/G1期峰前出现了亚二倍体峰（绿色），右边有各项参数，其意义上文我已讲述过，大家可以仔细看一下，上文没讲过的地方，相信大家一看就明白了。比如在右侧最后一行，写了Apoptosis:36.76% Mean:34.12,就指的是凋亡细胞占36.76%，其荧光强度在34.12。