大肠杆菌耐热性肠毒素_ST_的分子生物学研究进展_王玉炯
第22卷第3期 宁夏大学学报(自然科学版)2001年9月 Vol.22No.3 Journal of Ningxia Uni versity(Natural Science Edi tion)Sep.2001文章编号:0253-2328(2001)03-0331-06
大肠杆菌耐热性肠毒素(ST)的分子生物学研究进展
王玉炯, 许崇波
(宁夏大学生物工程系,宁夏银川 750021)
摘 要:大肠杆菌的耐热性肠毒素(ST)在产肠毒素性大肠杆菌引起的腹泻中扮演重要的角色,对人类和家畜的健康构成很大的威胁.文章从ST的理化特性、致病机理等一般生物学特性到基因克隆、定点突变以及分子结构与功能的关系等分子生物学特征,全面概述了ST的分子生物学研究进展,对于从分子水平全面了解S T的结构、性质、致病机理以及免疫原性等生物学性状具有重要意义.
关键词:大肠杆菌;耐热性肠毒素;分子生物学
分类号:(中图)R378 2 文献标识码:A
产肠毒素性大肠杆菌(Escherichia coli,E TEC)是引起幼畜腹泻的主要病原菌.ETEC具有两类致病因子:一类为肠毒素,另一类为粘着素(或称定居因子),已知的粘着素有K88,K99,F41和987P等.ETEC 借助这些粘着素定居于宿主肠道粘膜的上皮细胞上,从而大量繁殖,产生大量肠毒素,由肠毒素造成肠粘膜上皮细胞的病理性变化,导致幼畜腹泻[1].
ETEC产生两种肠毒素:一种为不耐热性肠毒素(LT),它由一个分子量为28kD的A亚单位结合5个分子量为11.5kD的B亚单位组成,全LT或B亚单位具有良好的免疫原性[2];另一种为耐热性肠毒素(ST),成熟的ST为18或19个氨基酸组成的小肽,有很强的毒素活性,而免疫原性极差.Rebertson 综合研究的资料表明,20%~30%的ETEC为LT+/ ST-;30%~40%的E TEC为LT+/ST+;而ST-/ST+接近50%.由于E TEC产生的ST在ETEC性腹泻中扮演重要角色,对人类和家畜健康有很大威胁,因此从分子水平研究ST的各种性质、致病机理和免疫原性等,对控制由ST引起的腹泻性疾病具有重要意义.
1 S T的一般生物学特性
1.1 ST的分类
根据ST的生物学特性及致病性,将其分为ST (又称ST a)和ST (又称ST b)两类[2].ST 可溶于甲醇,可引起乳鼠和乳猪肠积水;ST 不溶于甲醇,对乳鼠不引起肠积水,而对断乳小猪可致肠积水.ST
可根据它的来源不同及核苷酸序列的差异分为ST a与ST b,ST a为牛源或猪源(又称ST p),ST b为人源(又称ST h),ST 则为猪源性[3].
1.2 ST的理化性质
不同来源的ST 其理化性质相同.ST 分子呈中酸性,疏水性氨基酸比例高,在低离子强度时易与碱性疏水性多肽聚合.ST 分子量较小,为2000D 左右,也有报道为4000D和5000D.18肽的小分子具有3个链内二硫键,因该键属于共价键,键能高,不易破坏,故分子结构高度稳定,因而耐热(在100 30min和121 15min不失活)、耐酸碱(在pH=2~10稳定)、耐多种有机溶剂和表面活性剂;抗各种蛋白酶水解,为肽类毒素中最特殊者;不被淀粉酶、胰蛋白酶、脂酶、链霉蛋白酶、糖化酶等失活.但ST 对可破坏二硫键的氧化剂和还原剂高度敏感,0.1mol/L的2 巯基乙醇、4 10-5mol/L的二硫苏糖醇和过甲酸均可使其失活.可溶于甲醇、丙酮等有机溶剂.经等电聚焦测定,ST的等电点为4.3左右.ST纯化后为白色粉末,其最大吸收波长为275nm,最小吸收波长为255nm.ST 单独不具免疫原性,但与大分子偶联可产生免疫原性.J.C.Frantz[4]将人工合
收稿日期:2000-06-12
基金项目:国家自然科学基金资助项目(39660060)
作者简介:王玉炯(1963-),男,教授,博士,研究微生物学、分子生物学及基因工程等.
成的ST a连接到载体蛋白上,加上福氏佐剂免疫动物(母猪、母牛)后可产生抗体,且抗体高峰能维持数周,使出生的新生动物对产肠毒性大肠杆菌的攻击有保护作用.
1.3 ST的检测
对ST 的检测广泛应用的是乳鼠试验,即先将过液培养物(或离心后的上清液)经口灌入2日至4日龄的乳鼠,4h后剖腹取出全部肠管称重,计算肠管与剩余尸体重量的比率,此法简单易行,重复性较好.对ST 的检测是用断乳小猪肠环结扎试验[2],即将4~9周龄断乳小猪麻醉,取其肠段扎成6cm肠环,每环注入5mL菌液或上清液,然后计算肠环中液体与肠段长度的比率(m L/cm).检测ST的免疫学反应主要有放射免疫测定法(RIA)和E LISA等.随着分子生物学的发展,近年来建立了ST基因探针检测方法[3,5~6],应用结果表明,敏感性和准确性俱佳. 1.4 ST 的作用机理
业已证实,ST 能激活颗粒性鸟苷酸环化酶(GC)[7],而二硫化合物能抑制此酶,从而使ST 无作用.ST 的生物活性具有组织特异性,可使回肠上皮细胞内cGMP(环磷酸鸟苷)增高10倍而结肠下段仅增高1.8倍,对其他组织、器官无活性,此特异性可能与受体分布有关.Mg2+,Mn2+等可增强ST 的作用.
ST 的激活作用具有专一性,这是由于ST 对小肠粘膜颗粒性酶比可溶性酶具有更高的亲和力,同时小肠粘膜本身以颗粒性酶为主.有关ST 激活酶的作用机理主要有两种学说:一是 瀑布 学说,认为ST 结合到细胞膜表面,打开钙离子能道,钙摄取增加,激活调钙蛋白,触发磷酸酯酶A2,膜磷脂释放花生四烯酸,后者的过氧化物及过氧化氢代谢物使GC激活,但有的学者认为,ST 并不引起小肠细胞花生四烯酸的释放及改变膜脂成分;二是 直接偶联 学说,该学说认为ST 激活GC是直接的,不需要介导酶,即与已知腺苷酸环化酶激活机理相似,依靠ST受体复合物系统激活.
近来,S.A.Waldman研究发现了小肠粘膜颗粒性GC与ST受体偶联的新模式[8],即两者可能通过细胞骨架成分紧密相连.这种偶联可抵抗各种离子、非离子去垢剂、盐及尿素等的溶解,而其他组织上的酶可被上述物质所溶解,但ST受体抵抗溶解作用,说明其他组织中酶与受体无特殊偶联关系.S.A. Waldman观察到GC只有与细胞骨架成分、ST受体结合在一起才被ST 所激活.
ST受体及GC定位于细胞膜刷状缘的亚细胞结构中,其中含有丰富的细胞骨架成分,包括肌纤蛋白等不受去垢剂溶解的物质,这些骨架成分提供基质使GC定位于此,并与受体偶联.有趣的是小肠粘膜细胞膜上的c GMP依赖性蛋白激酶也与受体及GC 位于相同位置,并与骨架成分紧密相连.进一步研究发现,位于刷状缘的25kD蛋白磷酸化后,在小肠可介导ST 毒素诱导的离子转移.据以上资料推测, ST 引起水和电解质分泌是由刷状缘上ST 受体, GC,cGMP依赖性蛋白激酶,25kD底物蛋白形成一个功能性复合物所介导,这些成分可以共价键形式紧密连接于细胞骨架成分上,并保持一种有利于各种成分相互作用的适当的空间排列结构,从而发挥各自的功能.
上皮细胞c GMP增多而引起肠液潴留致泻已予公认,但对其中的机理尚不明了.业已发现,cGMP和cAMP一样,能使电泳性质相似的刷状缘膜和basola teral膜蛋白磷酸化,小肠绒毛上皮细胞内cGMP含量增高,Cl-主动吸收受抑制,跨膜电位和短环路电流增加,8 溴cGMP模拟的短环路电流增加约为8 溴cAMP的1/3,推测ST的作用可能与霍乱肠毒素通过c AMP升高使Na泵磷酸化、Na+吸收障碍导致水泻的机理相似,即cGMP使Cl-转运蛋白磷酸化, Cl-主动转运受抑制,进而肠腔内电解质与水潴留引起腹泻.
2 ST的分子生物学研究
2.1 ST基因的位点
编码ST的基因位于产肠毒素性质粒(Ent)上.含有ST 基因的质粒多是接合性质粒,分子量为46~97MD,与编码性菌毛的F质粒有一定的同源性.含有ST 基因的质粒分子量为21~80MD,至少一部分质粒是接合性质粒.ST 常与定居因子在同一大质粒上,ST 常与LT在同一大质粒上[9].某些ST基因位于转座子上,两端有反向重复序列,称为Tn1681.
2.2 ST基因的克隆和表达
M.H.W.So等[10]首先报道成功地克隆了ST基因,即将带有ST毒性决定簇的牛源大肠杆菌ESF0041的质粒用EcoR 切出8.9kb的片段,然后与载体pSC101连接,转化到非产肠毒素性大肠杆菌,使ST的产量大约增加3倍,然后又将这一杂种质粒进行亚克隆,用Ba mH 酶切产生2个片段,大小分别为5.6kb和3.4kb,再分别与pBR322重组,转化后进行筛选检测,发现只有3.4kb片段产生ST.以此再用Pst 消化产生1.7kb,1.4kb和0.3kb
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片段,将1.7kb片段再克隆后可产生ST,命名此克隆为pMS3.后来作者又对pMS3进行了亚克隆,用Taq 与Hind 酶切,连接转化后得到了T C1,并确定T C1就是质粒ESF0041含ST 基因的最小DNA片段,大小约473bp[11].S.L.Moseley等[3]用人源ETEC 的Ent质粒,经BamH 酶切,把1.9kb的片段克隆到pBR322中,得到重组菌株pSLM003,把pSLM003经Taq 酶切的840bp片段再克隆到pBR322上,构建出高产毒株pSLM004.
ST在致病过程中起着非常重要的作用,几乎所有重症腹泻患者的样本中,只要分离到ETEC,大都产生ST.如何增强ST的免疫原性,是当前大肠杆菌肠毒素研究的热门课题之一.L.M.Guzman Verduzco 等[12]用EcoRI t和Hpa 酶切pRI T10250质粒,加入linker后,重组到pUC13上,构建出重组质粒pGK26,再对pGK26进行Hind 和Sst 双酶切后,作为载体分子,把编码LT B的基因片段连在ST下游上,构建出重组质粒pGSK51.J.D.Clements[13]把编码ST的基因片段连在LT B基因的下游,构建出3种不同的ST LT B融合基因.ELISA检测表明,当LT B基因和ST 结构基因之间插入一段7个氨基酸(Asp Pro Arg Val Pro Ser Ser)的linker时,ST的表达水平最高;当两者之间有3个氨基酸(Ile Pro Gly)时,ST表达次之;当两者之间不插入氨基酸时,ELISA没有检测到ST的存在.张兆山等[14]采用不耐热肠毒素LT B亚单位基因作为载体分子,将编码ST抗原决定簇的寡核苷酸连接在消除了终止密码子的LT B基因下游,并使之处于同一开放阅读框架中,构建了3种不同的ST LT B融合基因.核苷酸序列分析证实该融合基因有正确的阅读框架;ELISA检测表明,这些融合基因既能表达LT B,也能表达ST.当LT B基因和ST结构基因之间插入21bp的寡核苷酸时,ST的表达水平最高,比野生菌株高8倍以上;当两者之间插入9bp 的linker时,ST表达次之,是E.coli H10407菌株的3倍左右;二者相隔33bp时,ST的表达水平与野生菌株相近.Westrn blotting试验显示了ST LT B融合蛋白的存在,但该融合蛋白依然还具有ST毒性.许崇波等[15~16]将ST前体蛋白基因(pro ST )与 半乳糖苷酶基因融合在一起,结果表达的融合蛋白具有良好的免疫原性,且失去了ST 本身的生物学毒性.王玉炯等[17~19]将pro ST 基因融合在产气荚膜梭菌 毒素基因的下游,其表达产物具有2种抗原的免疫原性,免疫动物后产生了具有中和活性的抗体,且已失去ST 本身的生物学毒性.目前已用该基因工程菌株制备出双价基因工程灭活苗,在市场上应用效果良好,取得了良好的社会和经济效益.
https://www.360docs.net/doc/1d2562447.html,wrence等[20]用EcoR 和Hind 双酶切pUC9ST b质粒,用Kleno w片段补平末端,再用BamH 酶切,然后重组到pKC30上,构建出重组质粒pKC30ST b,这使ST b的产量比其他野生菌株高10~ 20倍.R.Urban等[21]把编码pho A的基因片段重组到编码ST b的质粒pT7 ST73上,构建成pST phoA融合基因,其产生的融合蛋白分子量为50000D,具有类似ST b的生物学活性,为进一步研究ST b提供了很好的材料.
2.3 ST核苷酸序列分析
对ST a,ST b,ST 不同基因的DNA序列分析有助于阐明E TEC的ST群结构.ST a和ST b的基因有70%的DNA序列同源,其基因产物C端的18个氨基酸序列是高度保守的,其他序列有68%的氨基酸同源[3].ST 类的毒素基因编码成一条有71个氨基酸的多肽,核苷酸序列不同于ST 基因,这为ST 毒素组成一个不同类群提供了依据[22].从ETEC培养的上清液中已分离出具有ST活性、含18个氨基酸的肽链.对纯化的ST 肽链作序列分析,表明它是由ST 基因的54~72密码子进行编码.在ST a和ST b之间,ST肽链18个氨基酸的序列十分恒定[23].
A.M.K.Saeed等[24]报道了从牛中分离的 E.coli M490,B41,M524产生的ST具有完全相同的氨基酸顺序.这些结果表明了编码ST 的基因是高度保守的,广泛分布于不同寄主来源的大肠杆菌中.
M.So等[11]将编码ST 的转座子样片段Tn1681进行亚克隆和插入突变,正确确定了ST 基因在该转座子中的位置,测定了Tn1681中心部分的全部核苷酸序列,从中可以看到这一基因具有在细菌中单独表达所必需的全部特征:-10序列的同源性,16S 核糖体结合位点,转译开始、终止信号,转录停止信号.由此核苷酸序列推算出该基因产物是72个氨基酸,氨基端前18个氨基酸多数是亲水的,表明这一区域的多肽起ST 毒素信号序列的作用.该氨基酸序列的另一个特征是半胱氨酸占有很大比例(18%),它们可能形成3对二硫键,使ST 具有非常紧密的构象,从而解释了ST 对热、对酸的稳定性及对氧化剂和还原剂的敏感性.R.A.Houghten等[25]通过测定人工合成的线型ST 分子中二硫键形成的先后顺序,间接测定了3对二硫键的位置,分别为5-10,6-14及9-17.经氧化剂或还原剂处理,ST的生物活性消失,表明二硫键对于ST的生物活性是必需的.
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第3期 王玉炯等:大肠杆菌耐热性肠毒素(ST)的分子生物学研究进展
S.L.Moseley等[3]以从孟加拉国腹泻病人分离到的产ST菌株153837 2为出发菌株,构建了含ST b的基因工程菌株pSLM003和pSLM004,然后用Maxa m,Gilbert和Sanger方法对ST b进行核苷酸序列分析,并与ST a作比较.发现在72个密码的216个核苷酸中有76个不同,序列差异31%,这一差异产生29个氨基酸的变化,其中多数(16/29)改变是非保守的.ST a与ST b尽管有这些差异,但它们在结构上仍有很大的相似性.对ST a基因产物的分析表明,起始部分的蛋白质是用于转膜转移的,ST a的核苷酸序列分析支持这一解释.前18个氨基酸有13个是亲水的,这一部分与转膜转移蛋白的其他信号肽有关;而ST b基因产物前19个氨基酸有13个是亲水的,并且半胱氨酸的数量和位置相同.ST a与ST b基因产物有7个氨基酸位置相同,表明这两种分子都可以发生相同的分子间关系,产生相同的二级结构.此外,这两种基因之间大部分同源性在密码53~68之间,表明这一区域在分子功能方面起决定性作用.冯书章等[26]对ST b进行了亚克隆和核苷酸序列分析,结果显示pBST2 6重组质粒中ST b基因序列第133位与S.L.Moseley等[5]报道的序列出现了T A置换,使ST b基因的编码氨基酸由Cys向Ser变化.
2.4 ST基因探针
S.L.Moseley等[6]首次用基因探针对临床腹泻分离的大肠杆菌检测ETEC,这是基因探针首次用于临床细菌学诊断.研究者用pRI TI0036质粒的157bp Hinf ST p片段和pSLM质粒215bpHpa ST h片段以32P标记作为ST 基因探针,用菌落原位杂交法检测了产生ST 的ETEC.近几年国内外对ST 的探针检测大多源于该法,并用它对临床腹泻粪便、水源和食品中的ETEC污染情况进行了大量分子流行病学调查[27].
其他用于ST 检测的探针还有Hanna等使用的PNG10质粒的510bp EcoR ST h探针,该探针不与ST p杂交.以上的基因片段ST探针,特异性高,但制备时需经多次酶切和PAGE分离,故难于大量制备探针.冯书章[28]对pSLM004质粒进行Taq 一次酶切,2%琼脂糖凝胶电泳分离,收集其840bp的Taq ST 片段,缺口翻译法(NT)标以32P后作为探针,对不同来源的大肠杆菌进行检测,阳性结果与乳鼠试验符合率为70%.P.Echeverria等[29]采用从质粒pC HL6的460bp Hind Hinf 片段制备探针对猪源E TEC进行了ST 检测,结果表明,该探针不与ST 探针杂交.
虽然随着PCR技术的应用,大量小片段基因探针的获得已不再是难题,但是标记酶切片段制备探针,易受载体质粒DNA的污染,有时会出现杂交阳性而乳鼠试验阴性的假阳性结果,因此需要进一步提高探针的特异性.而人工合成的片段更短的寡核苷酸探针,其特异性可以检出单个碱基的错配.在已知编码ST基因的基础上,人们合成22~32个左右的ST寡核苷酸,利用随机引物法、T4多核苷酸激酶法以及缺口翻译法标记,以标记物作为寡核苷酸探针,其特异性和敏感性都不亚于克隆基因片段制备的探针.
2.5 ST 的分子结构与功能
ST 在菌体内首先合成72个氨基酸的前体, ST 前体由1~19氨基酸前区、20~54氨基酸后区和55~72氨基酸成熟ST 区组成.前区为ST 类保守的领头肽,在ST mRNA翻译开始时便为信号肽酶所切割;后区在ST 通过内膜进入细胞间质过程中有重要作用.要成为成熟ST ,转运后的后区ST 必须经过加工和在分子内形成正确的二硫键[30].
成熟的大肠杆菌ST 为18~19氨基酸的多肽,与其他肠杆菌ST一样,ST 含有13个高度保守的氨基酸序列(5~17氨基酸),这段氨基酸小肽保留了ST 的完全毒性,为一毒性区,具有与天然毒素相似的受体蛋白结合能力[31].保守区内的6个Cys组成Cys5 C ys10,Cys6 Cys14和Cys9 Cys173个分子内二硫键,其中Cys6 Cys14组成的二硫键与ST 毒性有关而最为重要,其他2个二硫键在维持分子结构上起作用,从而使ST 成为完整的结构[32].用人工合成的全毒性ST 类似物Mpr5 ST p[33](Mpr 巯基丙酸)的晶体X射线衍射分析ST 的三维结构,从N 端Mpr5 Cys17的C端,3个 转角右手螺旋结构通过整个分子组合而成3个转角,位于沿由Cys5 Cys9,Asnll Cys14,Cys14 Cys17组成的螺旋构成的V 形结构处,并且通过3个二硫键将它们紧密连接,其中第二个转角与ST 毒性关系最大.所有组成氨基酸的侧链都面向分子的外面,说明ST 具有疏水特性,Asn11 Ala13侧链形成一个特殊的突起凸出分子表面.除Cys7/Glu7,Ala15和Gly16外,所有NH基团都包埋在分子内,与分子内或转角内氢键有关.总体来说,整个细胞表面为一亲水脂特性,第二转角区的疏水特性Pro12 Ala13侧链可能作用于位于肠壁细胞疏水区的受体蛋白,所以ST 的第二 转角区是受体的主要结合部.对其他二转角区氨基酸替代结果表明毒性有些下降.C端对毒性作用影响较小,但
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保留它也是必需的,因为缺失最后3个氨基酸的ST 类似物活性完全丧失.C端的可能功能是离子携带者,一些金属离子如Na+,K+或Ca2+可结合在Pro12,Cys14和C ys17等碳酰基团上,使C端区成为离子携带肽.ST 也是一种阳离子结合肽,但目前对于由膜结合鸟苷酸环化酶C(GC C)受体蛋白介导的信号传导途径与Ca2+刺激液体分泌的关系还不清楚,也未阐明ST 是如何作为一种离子携带者的.同样从以上ST 第二 转角区侧链在毒性作用中的重要作用可知,受体表面疏水区与ST ,Ala11侧链紧密结合以及毒素分子与受体蛋白的结合主要都是通过相互疏水作用完成的.ST 三维结构中间区形成疏水核心以及胆盐可解离ST 受体复合物而不使受体蛋白结合能力下降的事实都支持上述毒素 受体的结合是相互疏水作用完成的推论[31].
ST 的毒性与其分子内的3个二硫键紧密相关,破坏任一个二硫键,其毒性至少降低250倍以上,而两个分子内二硫键被破坏,ST 的毒性可能丧失殆尽[32].已知一种称为DsbA的胞膜间隙蛋白在大肠杆菌间隙和外膜蛋白的二硫键形成中起关键作用.H.Yamanaka等[33]揭示DsbA在ST 的成熟和分子内二硫键形成中起主要作用,这可能是由于DsbA 改变胞膜间隙内氧化还原电位而有利于分子内二硫键形成或DsbA直接催化ST 分子内二硫键的形成.当ST 基因中的编码第14位Cys的TGT置换为AGT时,ST的毒性作用明显减弱,可见ST 结构中的Cys在ST 的活性中不可缺少.
由于E TEC产生的ST在E TEC性腹泻中扮演重要的角色,对人类和家畜的健康构成很大威胁,而天然ST的免疫原性又很差,所以从分子水平研究ST 的结构、性质、致病机理和免疫原性改造等,对控制由ST引起的腹泻性疾病具有重要意义.
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Research progress in molecular biology
on the heat stable enterotoxin of Escherichia coli
WANG Yu jiong, XU Chong bo
(Department of Biotechnology,Ningxia Universi ty,Yinchuan750021,China)
Abstract:It is the heat stable enterotoxin of Escherichia coli that plays an important role in the diarrhea caused by entero toxigenic E.coli,the health of human beings and domestic animals is under great threat of it.This article summarizes all round research progress in molecular biology on ST,including the aspects of physical and chemical characteristics, pathogenic mechanism,gene cloning,gene mutation,as well as the relationship between its molecular struc ture and func tion.It means much for grasping the significance comprehensively of ST,with its biological nature,such as structure,char ac teristics,pathogenic mechanism as well as immunogenicity.
Key words:Escherichia coli;heat stable enterotoxin;molecular biology
(责任编辑、校对 南凤仙) 336 宁夏大学学报(自然科学版) 第22卷
大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系及介绍[1]
大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌的从属关系及介绍 相互关系 大肠菌群（总大肠菌群） >粪大肠菌群&耐热大肠菌群> 大肠杆菌 一、大肠菌群介绍 大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。 大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。 大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。 大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。 二、总大肠菌群
所谓总大肠菌群系指一群在37℃培养24小时能发酵乳酸、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 三、耐热大肠菌群与粪大肠菌群的比较 北美国家一般使用“粪大肠菌群”概念，如AOAC、FDA。SN中的“粪大肠菌群”概念为等同采用AOAC方法，故而使用粪大肠菌群概念；而欧洲使用“耐热大肠菌群”概念，较少使用“粪大肠菌群”。一般欧洲学者认为，“粪大肠菌群”的提法不太科学，耐热大肠菌群的范围比粪大肠菌群范围大。 耐热大肠菌群的卫生学意义 作为一种卫生指标菌，耐热大肠菌群中很可能含有粪源微生物，因此耐热大肠菌群的存在表明可能受到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。但是，耐热大肠菌群的存在并不代表对人有什么直接的危害。 作为粪便污染指标菌，耐热大肠菌群与大肠菌群、大肠杆菌相似，主要以其检出情况来判断食品是否受到了粪便污染。粪便是肠道排泄物，有健康者，也有肠道病患者或带菌者粪便，所以粪便中既有正常肠道菌，也可能有肠道致病菌（如沙门氏菌、志贺式菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌等）和食物中毒者。因此，食品既然受到粪便污染就有可能对食用者造成潜在的危害。
大肠杆菌的研究与应用
大肠杆菌的研究与应用 中文摘要：大肠埃希氏菌(E.coli)通常称为大肠杆菌，是Escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。直到20世纪中叶，才认识到一些特殊血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜（禽），常引起严重腹泻和败血症。本文通过对大肠杆菌的结构及其致病机理等进行分析描述，以供大家参考学习。 关键词：大肠杆菌；致病性；危害；预防 The English abstract：Escherichia coli (E.c oli) are usually called escherichia coli, Escherich is found in 1885, in a long period of time, has been regarded as the normal bowel flora, that is part of the pathogen. Until the 20th century, realized some special type of escherichia coli serum of people and animals, especially for the infants and young (birds), often cause severe diarrhea and sepsis. Based on the structure and pathogenic escherichia coli mechanism analysis of reference, the study. Keywords：escherichia coli；The pathogenicity；Hazards；prevent 一、结构特征 大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，周身鞭毛，能运动，无芽孢。主要生活在大肠内。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素b和k，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。正常栖居条件下不致病。它侵入人体一些部位时，可引起感染，如腹膜炎、胆囊炎、膀胱炎及腹泻等。人在感染大肠杆菌后的症状为胃痛、呕吐、腹泻和发热。感染可能是致命性的，尤其是对孩子及老人。其主要具有以下一些特征： 1、大肠杆菌是细菌，属于原核生物；具有由肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，没有细胞核有拟核；细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。 2、大肠杆菌的代谢类型是异养兼性厌氧型。 3、人体与大肠杆菌的关系：在不致病的情况下（正常状况下），可认为是互利共生（一般高中阶段认为是这种关系）；在致病的情况下，可认为是寄生。 4、培养基中加入伊红美蓝遇大肠杆菌，菌落呈深紫色，并有金属光泽，可鉴别大肠杆菌是否存在。 5、大肠杆菌在生物技术中的应用：大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济,倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。 6、大肠杆菌在生态系统中的地位，假如它生活在大肠内，属于消费者，假如生活在体外则属于分解者。[1]
pET-32b(+)大肠杆菌表达载体说明
pET-32b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT5030 pET--‐32b(+) pET32b载体基本信息 别名: pET32b, p et 32b 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5899bp 5' 测序引物: T7或者Trx--‐F 5' 测序引物序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3'; Trx--‐F: 5' T TCCTCGACGCTAACCTG 3' 载体标签: thioredoxin (N端); H is (中间和C端) 载体抗性: Ampicillin 备注: Production of soluble, active target proteins; N--‐term thrombin cleavage s ite; Nterm e nterokinase c leavage s ite; a,b,c v ary b y M CS 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pET32b载体质粒图谱和多克隆位点信息
pET32b载体简介 The pET--‐32a--‐c series is designed for cloning and high--‐level expression of peptide sequences fused with the 109aa Trx?Tag? thioredoxin protein (1). Cloning sites are available for producing fusion proteins also containing cleavable His?Tag? and S?Tag? sequences for detection and purification. Unique sites are shown on the circle map. Note that t he s equence i s n umbered b y t he p BR322 c onvention, s o t he T7 e xpression r egion i s reversed on the circle map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA polymerase is shown below. The f1 origin is oriented so that infection with helper phage will produce virions containing single--‐stranded DNA that corresponds to the coding strand. Therefore, single--‐stranded sequencing should be performed u sing t he T7 t erminator p rimer . pET32b载体序列 ORIGIN 1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA 61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT 121 TGTTAGCAGC CGGATCTCAG TGGTGGTGGT GGTGGTGCTC GAGTGCGGCC GCAAGCTTGT 181 CGACGGAGCT CGAATTCGGA TCCGATATCG CCATGGCCTT GTCGTCGTCG TCGGTACCCA 241 GATCTGGGCT GTCCATGTGC TGGCGTTCGA ATTTAGCAGC AGCGGTTTCT TTCATACCAG 301 AACCGCGTGG CACCAGACCA GAAGAATGAT GATGATGATG GTGCATATGG CCAGAACCAG 361 AACCGGCCAG GTTAGCGTCG AGGAACTCTT TCAACTGACC TTTAGACAGT GCACCCACTT 421 TGGTTGCCGC CACTTCACCG TTTTTGAACA GCAGCAGAGT CGGGATACCA CGGATGCCAT 481 ATTTCGGCGC AGTGCCAGGG TTTTGATCGA TGTTCAGTTT TGCAACGGTC AGTTTGCCCT 541 GATATTCGTC AGCGATTTCA TCCAGAATCG GGGCGATCAT TTTGCACGGA CCGCACCACT 601 CTGCCCAGAA ATCGACGAGG ATCGCCCCGT CCGCTTTGAG TACATCCGTG TCAAAACTGT 661 CGTCAGTCAG GTGAATAATT TTATCGCTCA TATGTATATC TCCTTCTTAA AGTTAAACAA 721 AATTATTTCT AGAGGGGAAT TGTTATCCGC TCACAATTCC CCTATAGTGA GTCGTATTAA 781 TTTCGCGGGA TCGAGATCGA TCTCGATCCT CTACGCCGGA CGCATCGTGG CCGGCATCAC 841 CGGCGCCACA GGTGCGGTTG CTGGCGCCTA TATCGCCGAC ATCACCGATG GGGAAGATCG 901 GGCTCGCCAC TTCGGGCTCA TGAGCGCTTG TTTCGGCGTG GGTATGGTGG CAGGCCCCGT 961 GGCCGGGGGA CTGTTGGGCG CCATCTCCTT GCATGCACCA TTCCTTGCGG CGGCGGTGCT 1021 CAACGGCCTC AACCTACTAC TGGGCTGCTT CCTAATGCAG GAGTCGCATA AGGGAGAGCG 1081 TCGAGATCCC GGACACCATC GAATGGCGCA AAACCTTTCG CGGTATGGCA TGATAGCGCC 1141 CGGAAGAGAG TCAATTCAGG GTGGTGAATG TGAAACCAGT AACGTTATAC GATGTCGCAG 1201 AGTATGCCGG TGTCTCTTAT CAGACCGTTT CCCGCGTGGT GAACCAGGCC AGCCACGTTT 1261 CTGCGAAAAC GCGGGAAAAA GTGGAAGCGG CGATGGCGGA GCTGAATTAC ATTCCCAACC 1321 GCGTGGCACA ACAACTGGCG GGCAAACAGT CGTTGCTGAT TGGCGTTGCC ACCTCCAGTC 1381 TGGCCCTGCA CGCGCCGTCG CAAATTGTCG CGGCGATTAA ATCTCGCGCC GATCAACTGG 1441 GTGCCAGCGT GGTGGTGTCG ATGGTAGAAC GAAGCGGCGT CGAAGCCTGT AAAGCGGCGG 1501 TGCACAATCT TCTCGCGCAA CGCGTCAGTG GGCTGATCAT TAACTATCCG CTGGATGACC 1561 AGGATGCCAT TGCTGTGGAA GCTGCCTGCA CTAATGTTCC GGCGTTATTT CTTGATGTCT 1621 CTGACCAGAC ACCCATCAAC AGTATTATTT TCTCCCATGA AGACGGTACG CGACTGGGCG 1681 TGGAGCATCT GGTCGCATTG GGTCACCAGC AAATCGCGCT GTTAGCGGGC CCATTAAGTT 1741 CTGTCTCGGC GCGTCTGCGT CTGGCTGGCT GGCATAAATA TCTCACTCGC AATCAAATTC
大肠杆菌表达系统的研究进展综述
基因工程制药综述 班级：生技132 ： 学号：
大肠杆菌表达系统的研究进展综述 自上世纪 70 年代以来, 大肠杆菌一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统。尽管基因工程表达系统已经从大肠杆菌扩大到酵母、昆虫、植物及哺乳动物细胞,并且近年来出现了很多新型的真核表达系统, 但是大肠杆菌仍然是基因表达的重要工具。尤其是进入后基因组时代以来, 有关蛋白结构以及功能研究的开展 ,对基因表达的要求更高,这时大肠杆菌往往是表达的第一选择。文章综述了近年来有关大肠杆菌表达载体及宿主细胞的改造工作。 1 表达载体 1. 1 表达调控 构建有效的表达载体是表达目的基因的基本要求, 同时也是影响基因表达水平以及蛋白活性的重要因素。标准的大肠杆菌表达载体的主要组成: 启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始区、多克隆位点、终止子、复制起点以及抗性筛选因子等。理想的表达载体要求在转录和翻译水平上可以控制目的基因的表达 ,然而目的基因在宿主体过分表达(选用较强的启动子等)会对宿主造成压力, 引起相关的细胞应答反应, 影响蛋白的活性等。基因组、RNA 转录组、蛋白质组、代调控组等领域的研究成果给我们提供了大量关于基因表达调控的信息[ 1]。现已能从基因和细胞的整体水平来方便地选择合适的启动子或合理开发新的载体系统。譬如 Lee 等利用二维凝胶电泳法比较了重组载体和空载体被分别转入宿主细胞后蛋白组学的差异,发现两者都产生了大肠杆菌热休克蛋白并引起了 cAMPCRP 调节蛋白的应答, 其中重组子的影响更为强烈；另外, 还发现外源基因的表达使宿主核糖体合成速率、翻译延长因子和折叠酶表达水平、细胞生长率下降 , 而使细胞呼吸活力上升[ 2]。目前应用的表达载体主要问题是表达过程中出现的全或无的情况, 通常表达的培养物都是非纯种的细胞群, 其中有一些细胞可以最大限度地被诱导,而另一些细胞在诱导后基因的表达被关闭。分离具有合适强度启动子及翻译速率的载体变种可以优化表达水平,说明启动子的选择对于基因的诱导表达非常重要。 Deborahat 提出在芯片上排列具有不同强度级别启动子的载体进行互补分析, 可能有助于筛选最为适合的启动子[3]。开发非 IPTG 或阿拉伯糖诱导的载体也可以提高基因表达水平, Qing 等利用 cspA 基因的独特性开发了一系列冷休克表达载体pCold, 使目的基因在低温下(<15℃) 诱导表达,提高了产物的溶解性和稳定性[4]。 1. 2 融合表达载体 除了表达载体的调控性,为了提高蛋白产物的活性以及简化下游纯化的操作等 ,往往在表达载体上插入其它辅助的基因序列与目的基因构成融合蛋白表达。融合信号肽(PelB、Om pA 、MalE、PhoA 等)表达可以使融合蛋白通过经典的 Sec 途径分泌到周质或胞外表达, 有利于形成二硫键以及避免胞质蛋白酶的水解和 N 端甲硫氨酸的延伸。另外,最近开发的双精氨酸转运体系(Tat)可以有效分泌正确折叠的重组蛋白[5]。常见的纯化标签多根据亲和层
大肠杆菌文献综述
文献综述 禽大肠杆菌病的研究进展 郑琳红 西南大学荣昌校区动物医学系，重庆荣昌402460 摘要：禽大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起各种禽类的一种急性或慢性传染病，主要侵害鸡、鸭、鹅，以及各类珍、特禽，临床上有多种表现形式，其中以急性败血型、卵黄性腹膜炎和生殖器官损害较常见，危害性也最为严重。本文主要在病原学、流行病学、临床症状、病理变化和诊断与防治等方面对禽大肠杆菌病进行了综述。 关键词：禽大肠杆菌；流行特点；疫病防治；研究进展 禽大肠杆菌病（colibacillosis）是由致病性大肠埃希氏菌( E. coli )引起禽类的一种急性、慢性传染病的总称。其病型和病变复杂多样。本菌抗原结构复杂，血清型多，变异菌株不断出现，分布极广，不同地区有不同血清型，同一地区不同养殖场甚至同一养殖场同一种群也可能有多个血清型。本病的普遍性，给养禽业造成严重威胁和重大经济损失[1,2]。 禽大肠杆菌病常继发于其他致病因子或与其他致病因子一同作用，使其表现得复杂多变，往往使真正的罪魁祸首得以掩盖。禽大肠杆菌病发病频繁，容易反复发作，加上用药较乱，病原菌血清型多、抗原结构复杂，极易产生耐药性，使其防不胜防。1976年Smits等发现新城疫疫苗、传染性支气管炎疫苗免疫，支原体感染与大肠杆菌感染之间的关系，气雾免疫法及支原体感染大幅提高大肠杆菌感染率[3]。 1．病原学 大肠杆菌是人和动物肠道中的常见菌，多为条件性致病菌，当机体健康，抵抗力强时，这些菌株不表现致病性，当机体健康状况下降，特别是在应激情况下，其致病性增强，引起发病。致病性大肠杆菌在自然界中广泛存在，凡有哺乳动物和禽类活动的环境空气、水源和土壤中均有本菌存在。当禽舍通风不良、饲养密度大、卫生条件差、饲料质量不好、禽舍污染严重时，该病传播途径可经过消化道、呼吸道、交配等途径水平传播，还可通过其它多种途径，使种蛋被污染而进行垂直传播[1]。 禽大肠杆菌病病原是革兰氏阴性、非抗酸性、染色均一，不形成芽孢，两端钝圆的短杆菌，需氧或兼性厌氧。有时大小和形态可能是多变的，许多菌株有运动性，有周身
pET-48b(+)大肠杆菌表达载体说明
pET-48b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4670 pET--‐48b(+) pET48b载体基本信息 别名: pET48b, p ET 48b 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5605 b p 5' 测序引物序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3'; Trx--‐F: 5'--‐TTCCTCGACGCTAACCTG--‐3' 3' 测序引物序列: T7t: 5'--‐TGCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: N--‐Trx, N--‐His,N--‐HRV 3C, C--‐S, C--‐Thrombin 载体抗性: Kanamycin (卡那霉素) 备注: Same as pET47 but also has Nterm Trx Tag; contains HRV 3C Protease cleavage site for fusion tag removal at low temperatures; Cterm thrombin c leavage s ite. 稳定性: 瞬时表达 组成型: 组成型 病毒/非病毒: 非病毒 pET48b载体质粒图谱和多克隆位点信息
pET48b载体简介 pET--‐48b载体含有N端Trx和His标签，在标签后面紧跟着的是HRV 3C蛋白酶切位点。HRV 3C蛋白酶能够高特异性的识别LEVLFQ↓GP蛋白序列，能够在低温下高效切割掉融合标签序列。pET--‐48b载体还含有一个可选择的C端Thrombin蛋白酶切位点，紧接着位点后是S标签。 pET48b载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。 T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够
pET-22b(+)大肠杆菌表达载体说明
pET-22b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT5200 pET--‐22b(+) pet22b载体基本信息 别名: pET22b, p et 22b, p ET--‐22b(+) 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5500bp 5' 测序引物及序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3' 3' 测序引物序列: T7t: 5'--‐GCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: N--‐pelB; C--‐His 载体抗性: 氨苄 备注: pET22b载体含有PelB信号肽序列， 能够将表达的目的蛋白定位在细胞外周质腔。 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pet22b载体质粒图谱和多克隆位点信息
pet22b载体简介 pET--‐22b(+)载体携带有一个N端的pelB信号肽序列，能够将表达的目的蛋白定位于外周质腔，同时载体含有C端His标签。载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。 T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够产生，并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被T7终止子序列的作用下终止蛋白翻译。 pet22b载体序列 ORIGIN 1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA 61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT 121 TGTTAGCAGC CGGATCTCAG TGGTGGTGGT GGTGGTGCTC GAGTGCGGCC GCAAGCTTGT 181 CGACGGAGCT CGAATTCGGA TCCGAATTAA TTCCGATATC CATGGCCATC GCCGGCTGGG 241 CAGCGAGGAG CAGCAGACCA GCAGCAGCGG TCGGCAGCAG GTATTTCATA TGTATATCTC 301 CTTCTTAAAG TTAAACAAAA TTATTTCTAG AGGGGAATTG TTATCCGCTC ACAATTCCCC 361 TATAGTGAGT CGTATTAATT TCGCGGGATC GAGATCTCGA TCCTCTACGC CGGACGCATC 421 GTGGCCGGCA TCACCGGCGC CACAGGTGCG GTTGCTGGCG CCTATATCGC CGACATCACC 481 GATGGGGAAG ATCGGGCTCG CCACTTCGGG CTCATGAGCG CTTGTTTCGG CGTGGGTATG 541 GTGGCAGGCC CCGTGGCCGG GGGACTGTTG GGCGCCATCT CCTTGCATGC ACCATTCCTT 601 GCGGCGGCGG TGCTCAACGG CCTCAACCTA CTACTGGGCT GCTTCCTAAT GCAGGAGTCG
大肠杆菌耐药性研究进展
大肠杆菌耐药性研究进展 教郁，高维凡，胡彩光 (沈阳农业大学，辽宁省沈阳市，110000) 摘要：大肠杆菌是典型的革兰氏阴性杆菌，其引起的大肠杆菌病是一种常见疾病，在治疗过程中 容易产生耐药性，且耐药谱广，耐药机制复杂，给养鸡业预防和治疗该病带来很大困难。大肠杆茵对抗生素的耐药问题是当前国内外研究的热点。本文对大肠杆菌耐药的现状以及产生耐药性机制的研究进行了综述，以便正确理解大肠杆菌耐药性的特点及其规律，从而为防治大肠杆菌耐药性的产生及合理用药提供理论依据。 关键词：大肠杆菌；耐药性；作用机制 The research progress on mechanism of Drg-resistance of Escherichia coli Abstract: E.coli is gram-negative bacteria, colibacillosis is a kind of common disease. Escherichia coli strains showed high levels of resistance, resistance spectrum to expand, and multiple drug resistance. The drug resistant gene is complex and diverse. So the prevention and treatment of the disease bring a lot of difficulties. Antibiotic resistance is the current domestic and international research hot spot. The advances on mechanism of resistance and the present situation of E coli resistance are summarized．Thus the trend of the drug-resistance on the E coli resistance can be understood better and the basis for preventing the production of the resistant stains and using drugs reasonablely can be furtherly provided． Keywords: Eescherichia coli; resistance; resistance mechanism 致病性大肠杆菌为医学和兽医学临床感染中最常见的病原菌之一。从发病情况看，大肠杆菌病发病率在细菌病引发的疾病中居世界首位。兽医临床上大肠杆菌造成的危害十分严重，它一年四季均可致病，一直是困扰养殖业发展的常见病、多发病，给养禽业造成了严重的经济损失；大肠杆菌病的主要防治措施是应用疫苗及抗生素。国内外已研制出多种疫苗对大肠杆菌病进行预防，但因大肠杆菌具有多种血清型，仅国内报导就有80余种，应用疫苗对大肠杆菌病进行防治尚不能满足对该病的防治要求。抗生素在大肠杆菌病预防及治疗方面有着不可替代的作用，但是随着抗生素的广泛、持续及不当使用，大肠杆菌耐药谱不断扩大和耐药水平不断提高，大肠杆菌耐药及多重耐药现象已十分严重。虽然新型抗生素不断问世，但抗生素的研制速度远远低于耐药菌的产生速度。因此了解大肠杆菌耐药状况，掌握大肠杆菌耐药趋势，研究大肠杆菌耐药机理，对控制耐药菌株的蔓延具有十分重要的意义。 1.大肠杆菌耐药性现状 近年来，随着抗生素及各种化学合成药物在我国畜牧业生产中的广泛应用，大量的抗生素、消毒剂等不断进入水、土壤、河流、沉积物等各种环境中。使得大肠杆菌耐药谱不断扩大和耐药水平不断提高，给我国畜牧业的持续发展和人类健康带来潜在的危害。国内外各地均分离得到耐药家畜源性大肠杆菌，并对这些病原菌进行了耐药谱系的检测。梅姝等[1]报道分离得到的长春地区127株鹿源大肠杆菌对5种抗菌药物呈现不同
大肠杆菌噬菌体的研究进展
龙源期刊网 https://www.360docs.net/doc/1d2562447.html, 大肠杆菌噬菌体的研究进展 作者：吴伟胜李玉保王守荣等 来源：《江苏农业科学》2015年第08期 摘要：大肠杆菌病为畜牧养殖业常见疾病之一，目前临床上主要依赖于抗生素进行控 制。随着大肠杆菌耐药性增强以及人们对食品安全意识的提高，急需寻找安全、高效的抗生素替代品。噬菌体是能够感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒总称，具有巨大的潜在应用价值。对近几年国内外有关大肠杆菌噬菌体的分布、分离纯化方法、保存方法、形态、pH值稳定性、温度稳定性、分子生物学以及应用方面作了简要概述，并对以后的科研和应用进行了思考和展望。 关键词：大肠杆菌；噬菌体；研究进展 中图分类号：S852.61+2 文献标志码： A[HK] 文章编号：1002-1302（2015）08-0008-03 近年来，由于畜牧养殖业大量使用抗生素，导致病原微生物的耐药性升高 [1]，同时，抗生素的使用对食品安全构成威胁。噬菌体作为一类能够感染和裂解大肠杆菌等微生物的病毒，具有宿主专一、不产生耐药性 [2]、使用安全 [3-4]等优势，在美国已应用于儿童腹泻疾病的治疗 [5]。因此，噬菌体有望在防控畜牧业肠道性疾病中替代抗生素。本文对近几年国内外关于大肠杆菌噬菌体的分离和保存方法、生物学特性等进行综述，希望能够对大肠杆菌噬菌体更深入的研究和应用提供思路和方法。 1 大肠杆菌噬菌体的分布 目前研究发现的病毒种类数量庞大，其中大部分是噬菌体 [6]。大肠杆菌噬菌体在我们生活的周围环境中普遍存在。到目前为止，学者们已经从不同的样品中分离出来多种大肠杆菌噬菌体，并对所分离的噬菌体进行了分类和命名。在养殖场的鸡粪 [7-8]和污水中 [9]，以不同的大肠杆菌为宿主菌分离到不同种类的大肠杆菌噬菌体；在养猪场的粪便中，以产肠毒素性大肠杆菌K88 为宿主菌分离并纯化了1株噬菌体PK88-4 [10]；在城市的污水中，以肠出血性大肠杆菌O157 ∶ H7为宿主菌分离出裂性噬菌体 [11]。此外，在医院的污水中，用大肠杆菌E1～E17共17种细菌做指示菌分离出1种广谱噬菌体IME11 [12]。 2 大肠杆菌噬菌体的分离纯化方法 对于噬菌体的分离纯化，大致可以分为采样、富集、分离、纯化4个步骤。每个步骤又包含1种或多种不同的方法，可以根据自身的试验条件和试验状况将不同方法组合，进而得到最佳的分离纯化方法。
肠道病原性大肠杆菌关系
江西农业大学学报2010，32（1）：0141－0143http：//https://www.360docs.net/doc/1d2562447.html, Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis E－mail：ndxb7775@https://www.360docs.net/doc/1d2562447.html, 肠道病原性大肠杆菌 和宿主细胞间的相互作用 李正平，杨倩* （1.南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室，江苏南京210095） 摘要：肠道病原性大肠杆菌（EPEC）属于胞外菌，主要通过粘附在肠上皮细胞上引起宿主的发病。EPEC形成基座、产生粘附和脱落（A/E）损伤的细菌因子、导致宿主信号转导改变的途径及其发病机制的遗传基础都已经得到广泛的研究。对近年来关于EPEC和宿主细胞间的相互作用的研究进展进行总结，并着重论述EPEC对于肠上皮细胞紧密连接的影响。 关键词：肠道病原性大肠杆菌；肠上皮细胞；紧密连接；肠上皮细胞屏障 中图分类号：S852文献标识码：A文章编号：1000－2286（2010）01－0141－03 The Interaction between Enteropathogenic Escherichia coli and Host Cells LI Zheng-ping，YANG Qian* （Key Laboratory of Animal Physiology and Biochemistry，Minstry of Agriculture，Nanjing Agricultural Uni-versity，Nanjing210095，China） Abstract：Enteropathogenic Escherichia coli（EPEC）is an extracellular bacteria，primarily through ad-here to host intestinal epithelial cells caused pathogenesis.EPEC can produce pedestals，and the bacterial fac-tors involved in attaching and effacing（A/E）lesion formation，modulates several signal transduction pathways within the host cells and the genetic basis of EPEC pathogenesis have been widely studied.This review de-scribes the recent studies of enteropathogenic（EPEC）interact with host cells，and intensively discusses the influence of EPEC to tight junctions between cells. Key words：EPEC；intestinal epithelial cells；tight junctions；intestinal epithelial cells barrier 肠道病原性大肠杆菌（EPEC）是引起发展中国家儿童水样腹泻的一个重要原因，目前已对人类的健康构成了一个重大的危害。EPEC虽然是胞外菌，但是可以和肠上皮细胞紧密粘附，产生特征性的粘附和脱落（A/E）损伤［1］，然后影响到上皮细胞的吸收。在体外EPEC也可以粘附宿主上皮细胞导致细胞异常［2］，包括细胞凋亡和与紧密连接损失有关的黏膜屏障的破坏。然而，一项最近的报告提出EPEC 很少在老鼠肠内定植，与致病性相比，EPEC和宿主之间更像是共生的关系［3］。 人和动物主要通过呼吸道、消化道和生殖道与外界接触。这些黏膜表面都覆盖着一层高度极化的上皮细胞，其游离面位于腔面，直接与外界环境相接触；基底面与富含肠相关淋巴样组织的固有层相接；侧面与毗邻的细胞接壤。这层上皮细胞构成了机体与外界的第一道屏障。相邻上皮细胞连接起来的紧密连接可以封闭细胞间隙，阻止管腔物质的自由进出，是上皮细胞选择性通透作用的物质基础。紧密连接也可以用来评价黏膜屏障的功能。跨肠上皮渗透的主要途径是细胞旁通路，而紧密连接是细胞旁通 收稿日期：2009－11－27修回日期：2009－01－05 基金项目：国家自然科学基金（30871858）、教育部博士点基金（B200606）和江苏省支撑计划（BE200830155）资助作者简介：李正平（1986－），女，硕士生，主要从事动物免疫和分子免疫学研究，E－mail：lizp1986@https://www.360docs.net/doc/1d2562447.html,；*通讯作者：杨倩，教授，博导，E－mail：zxbyq@https://www.360docs.net/doc/1d2562447.html,。
肠出血性大肠杆菌
肠出血性大肠杆菌 肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhage E．Coli，EHEC）是大肠杆菌的一个亚型，EHEC分为157、26、111血清型，主要致病菌株为O157∶H7，可引起感染性腹泻，因能引起人类的出血性肠炎而得名。在1982年一次出血性结肠炎流行中被分离出。 一、生物学特性 大肠杆菌是人和动物肠道中的正常菌群，一般对人无害。它有三种抗原结构，即菌体抗原（又叫O抗原）、包膜抗原（又叫K抗原）和鞭毛抗原（又叫H抗原）。 O抗原是对大肠杆菌进行分型的基础，目前已发现有170多种。其中一些特殊的血清型具有致病性，可引起人类感染性腹泻。引起人类感染性腹泻的大肠杆菌又可被分为5类，即肠致病性大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠聚集性大肠杆菌和肠出血性大肠杆菌。肠出血性大肠杆菌因能引起人类的出血性肠炎而得名。EHEC包括几种血清型，分为157、26、111。分离出的主要致病菌株为O157∶H7。还包括O26H11、O111及无动力的O157菌株O157NM等。目前不断发现其他型菌株与出血性肠炎的关系。 EHEC-O157H7为格兰氏染色阴性的、有动力、两端钝圆的短杆菌。没有芽孢、有周鞭毛，大多数菌株有荚膜。它对热敏感，最适生长温度为37℃，30-42℃时在肉汤中也生长良好，55℃经60分钟可有部分存活，在75℃水中1分钟可被杀死。迟缓发酵山梨醇-麦康凯(SMAC)培养基可作为对O157∶H7之筛选培养基。在SMAC培养基上，O157∶H7菌落无色，而发酵菌株呈粉红色，但有半数EPEC菌株有类似O157∶H7之特性，应注意EPEC与EHEC 之鉴别。大肠埃希杆菌O157∶H7抵抗力较强，耐酸耐低温。在自然界的水中可存活几周甚至几个月，在冰箱内则可长期生存。在酸性果汁（PH为2）中甚至可存活几十天。对氯敏感，在余氯为1mg/l的水中可被杀死。O157∶H7具有含60MD质粒的纤毛，此纤毛能与Henle407细胞粘附。EHEC能产生大量类志贺样毒素(Shiga-Like toxin，简称SLT)。SLT有抗原性，可被志
pMal c X大肠杆菌表达载体说明
pMal-c2X 编号 名称 北京华越洋VECT--‐570 pMal--‐c2X pMalc2x载体基本信息 载体名称: pMal--‐c2X, p Malc2X, p Mal c2X 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达载体 表达水平: 高 启动子: Tac 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 6646 b p 5' 测序引物及序列: MalE引物: 5'--‐GGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCC--‐3'; MBP--‐F: 5'--‐gatgaagccctgaaagacgcgcag--‐3' 3' 测序引物及序列: pBad--‐R: 5'--‐gatttaatctgtatcagg--‐3'; M13--‐F: 5'--‐TGTAAAACGACGGCCAGT--‐3' 载体标签: N--‐MBP, N--‐Factor X a 载体抗性: Ampicillin 氨苄 备注: 融合表达麦芽糖结合蛋白MBP，蛋白定位于细胞周质。 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 诱导表达 病毒/非病毒: 非病毒 pMalc2x载体质粒图谱和多克隆位点信息
pMalc2x载体简介 pMAL?系统是一种高效的蛋白融合表达及纯化系统。pMAL载体含有编码麦芽糖结合蛋白（Maltose B inding P rotein, M BP）的大肠杆菌malE基因，其下游的多克隆位点便于目的基因插入，表达N端带有MBP的融合蛋白。通过"tac"强启动子和malE翻译起始信号使克隆基因获得高效表达，并进一步利用MBP对麦芽糖的亲和性达到用Amylose柱对融合蛋白的一步亲和纯化。 The s ystem u ses t he p MAL v ectors w hich a re d esigned s o t hat i nsertion i nterrupts a l acZα gene allowing a blue--‐to--‐white screen for inserts on X--‐gal (5). pMAL--‐c2 series has an exact deletion of the malE signal sequence, resulting in cytoplasmic expression of the fusion protein. pMAL--‐p2 series contains the normal malE signal sequence, which directs the fusion protein through the cytoplasmic m embrane. p MAL--‐p2 f usion p roteins c apable o f b eing e xported c an b e p urified f rom the p eriplasm. B etween t he m alE s equence a nd t he p olylinker t here i s a s pacer s equence c oding for 10 a sparagine r esidues. T his s pacer i nsulates M BP f rom t he p rotein o f i nterest, i ncreasing t he chances that a particular fusion will bind tightly to the amylose resin. The vectors also include a sequence c oding f or t he r ecognition s ite o f a s pecific p rotease. T his a llows t he p rotein o f i nterest to be cleaved from MBP after purification, without adding any vector--‐derived residues to the protein (6). For this purpose, the polylinker includes a restriction site superimposed on the sequence coding for the site of the specific protease. This is where the gene of interest is inserted. An EcoR I site in the same reading frame as that of λgt11 and a number of other useful sites are present directly downstream. The vectors also include the M13 origin of DNA replication which allows the production of single--‐stranded DNA for sequencing and mutagenesis by i nfecting w ith M13KO7 h elper p hage. pMalc2x载体序列 ORIGIN 1 CCGACACCAT CGAATGGTGC AAAACCTTTC GCGGTATGGC ATGATAGCGC CCGGAAGAGA 61 GTCAATTCAG GGTGGTGAAT GTGAAACCAG TAACGTTATA CGATGTCGCA GAGTATGCCG 121 GTGTCTCTTA TCAGACCGTT TCCCGCGTGG TGAACCAGGC CAGCCACGTT TCTGCGAAAA 181 CGCGGGAAAA AGTGGAAGCG GCGATGGCGG AGCTGAATTA CATTCCCAAC CGCGTGGCAC 241 AACAACTGGC GGGCAAACAG TCGTTGCTGA TTGGCGTTGC CACCTCCAGT CTGGCCCTGC 301 ACGCGCCGTC GCAAATTGTC GCGGCGATTA AATCTCGCGC CGATCAACTG GGTGCCAGCG 361 TGGTGGTGTC GATGGTAGAA CGAAGCGGCG TCGAAGCCTG TAAAGCGGCG GTGCACAATC 421 TTCTCGCGCA ACGCGTCAGT GGGCTGATCA TTAACTATCC GCTGGATGAC CAGGATGCCA 481 TTGCTGTGGA AGCTGCCTGC ACTAATGTTC CGGCGTTATT TCTTGATGTC TCTGACCAGA 541 CACCCATCAA CAGTATTATT TTCTCCCATG AAGACGGTAC GCGACTGGGC GTGGAGCATC 601 TGGTCGCATT GGGTCACCAG CAAATCGCGC TGTTAGCGGG CCCATTAAGT TCTGTCTCGG 661 CGCGTCTGCG TCTGGCTGGC TGGCATAAAT ATCTCACTCG CAATCAAATT CAGCCGATAG 721 CGGAACGGGA AGGCGACTGG AGTGCCATGT CCGGTTTTCA ACAAACCATG CAAATGCTGA 781 ATGAGGGCAT CGTTCCCACT GCGATGCTGG TTGCCAACGA TCAGATGGCG CTGGGCGCAA 841 TGCGCGCCAT TACCGAGTCC GGGCTGCGCG TTGGTGCGGA TATCTCGGTA GTGGGATACG 901 ACGATACCGA AGACAGCTCA TGTTATATCC CGCCGTTAAC CACCATCAAA CAGGATTTTC 961 GCCTGCTGGG GCAAACCAGC GTGGACCGCT TGCTGCAACT CTCTCAGGGC CAGGCGGTGA 1021 AGGGCAATCA GCTGTTGCCC GTCTCACTGG TGAAAAGAAA AACCACCCTG GCGCCCAATA