检验方法验证标准操作规程(最新整理)

标准操作规程

STANDARD OPERATING PROCEDURE

标题检验方法验证标准操作规程共7页第1页

制定人颁发部门GMP办公室编号： SOP--F—004

分发部门质量验证小组、质量保证部新订√替代

审核人批准人生效日期年月日

目的：建立检验方法验证标准操作规程，规范验证操作。

适用范围：所有检验方法的验证。

责任者：质量保证部、质量控制部

程序：

1、检验方法验证的基本内容

检验方法验证的基本内容包括方案的起草及审批，检测仪器的确认．适用性验证(包括准确度试验、精密度测定．线性范围试验、专属性试验等)和结果评价及批准四个欠的方面。它的基本内容可以用下图表示。

2、检验方法验证的基本步骤

首先是制定验证方案，然后对大型精密仪器进行确认，最关键的一步是检验方法的适用性试验，最后是检验方法评价及批准。

2．1验证方案的制定

检验方法的验证方案通常由质量验证小组提出。根据产品的工艺条件、原辅料化学结构、中间体、分解产物查阅有关资料，提出规格标准，确定检查项目，规定杂质限度，即为质量标准草案。根据质量标准草案确定检查和试验范围，对检验方法拟定具体操作步骤，最后经有关人员审批方可实施。

2．2大型精密仪器的确认

分析测试中所用的检测仪器一般可分为三类

(1)普通仪器：崩解仪，折光仪、分析天平、酸度计、溶点测定仪、电导仪等：

(2)较精密仪器：旋光仪、永停滴定仪、费休氏水分测定仪、自动滴定仪、药物溶出度仪、可

共7页第2页见分光光度计、电泳仪等；

(3)大型精密仪器：紫外分光光度计、红外分光光度计、气相色谱仪、高效液相色谱仪、薄层扫描仪等。

为了保证分析测试数据准确可靠，每台检测仪器在投入正式使用之前都应进行确认。检测仪器的确认是检验方法验证的基础，应在其它验证试验开始之前首先完成。检测仪器确认工作内容应根据仪器类型。技术性能而定，通常包括：安装确认、校正、适用性预试验和再确认。2．2．1安装确认

同工艺验证中机械设备一样，仪器安装确认的土要内容包括如下各点：

(1)要登记仪器名称．型号。生产厂商的编号、生产日期．生产厂商名称，企业内部的固定资产设备登记号及安装地点；

(2)收集汇编和翻译仪器使用说明书和维修保养手册；

(3)检查并记录所验收的仪器是否符合厂方规定的规格标准：

(4)检查并确保有该仪器的使用说明书。维修保养手册和备件清单：

(5)检查安装是否恰当，气、电及管路连接是否符合要求；

(6)制定仪器标准操作规程(SOP)和维修保养制度，建立使用记录和维修记录；

(7)制定清洗规程；．

(8)明确仪器设备技术资抖(图纸，手册，备件清单、各种指南及该机器设备有关的其它文件)的专管人员及存放地点。

除上面提到的内容外，在安装确认方案中对仪器的性能用途应有一概述并记录维修服务单位名称。联系人、电话号码、传真号、银行帐号等，以利于日后的维修保养活动，这对大型精密仪器尤为重要。对于仪器来说，安装确认中的一项重要内容是功能试验。这项工作在安装结束，检查合格后即可着手进行。仪器功能试验足在不使用样品的前提下，确认仪器达到设计要

求，也可认为是空载试验。例如气相色谱仪的程序升温设定后能否按设定程序执行，溶出仪转速能否达到规定的性能要求。紫外分光光度计的吸收度与透光率的转换是否符合要求。高效液相色谱仪高压泵过压保护是否起作用等，这是检查仪器安装后能达到规定的性能指标。对普通仪器进行的功能试验比较简单，有的除仪器校正外，没有其它特殊的功能试验要做，如酸度计，电导仪，折光仪等。不同的仪器有不同的技术标准，应根据仪器使用说明书的要求进行试验。 2．2．2校正

校正是仪器确认及检验方法验证中的一个重要环节，应当在验证试验以前进行校正。紫外分光光度计校正包括波长校正、吸收度测试、准确度测试、杂散光检查。

气相色谱仪与高效液相色谱仪均要求做系统适用性试验。在规定的色谱条件下测定色谱柱的最小理论塔板数。分离度和拖尾因子，并规定变异系数应不大于2％。

对于化学检验中使用的计量仪器包括容量瓶、移液管、滴定管、分析天平亦均应校正。

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2．2．3适用性预试验

仪器的安装确认完成以后，-在其功能试验符合要求的情况下，应用标准品或对照品对其进行适用性检查，以确认仪器是否符合使用要求。例如对熔点测定仪的适用性预试验是采用已知溶点的甲硝唑做试验，测试结果与已知熔点比较。紫外分光光度计可用已知含量的某标准品试验，测得结果与已知数值对比，确定仪器是否符合使用要求。

在完成上述各项试验工作的同时，应做好相应的文件记录等资料归档工

作，每一台仪器均应有一套完整的档案资料。

2．2．4再确认

为了确保仪器处于良好的使用状态，对于一台新购买的仪器在确认工作结束以后，应根据仪器的类别。确认的经验制定再确认的计划。再确认的时间间隔和内容要根据仪器类别和使用情况决定，一般是3个月、6个月或1年。仪器再确认的内容通常包括线路连接、附件备品消耗晶检查、清洁工作、功能试验、工作日记等，其中重点足安装确认中的功能试验。

3、检验方法的适用性验证

药品质量标准分析方法验证的目的是证明采用的方法适合于相应的检测要求。在起草药品质量标准时，分析方法需经验证：在药物生产方法变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，则质量标准分析方法也需进行验证。方法验证过程和结果均应记载在药品标准起草或修订说明中。

根据《中国药典》 (2000版)附录XIXA的原则要求，检验方法的验证可分为三种情况处理；

(1)无需验证的方法。如药典(包括USP、EP、CP、JP等各国药典)的方法，一般只做系统适用性试验，以确认系统是否符合要求(主要指仪器稳定性及柱的分离度是否达标)。

(2)对比法。已在参比实验室验证过的分析方法，可用对比试验的方法来确认方法的可靠性，即将本实验室与参比实验室用同一方法对同批样品所测数据进行比较(如至少取五个批号，每批重复测定五次)，判断方法在本实验室的可行性。如有差异需查明原因或设计方案，对方法进行再验证。

(3)需进行系统验证的方法。可按下表要求进行验证试验：

检验方法验证要求

类型

验证项目

类型Ⅱ

类型I定量测定限度试验类型Ⅲ类型IV

准确度要求要求**不要求

精密度要求要求不要求要求不要求

专属性要求要求要求*要求

检测限不要求不要求要求*不要求

定量限不要求要求不要求*不要求

线性要求要求不要求*不要求

范围要求要求**不要求

共7页第4页注：*表示需根据实验特性决定是否作要求。

其中：

类型I：指用于测定原料药中主要成分或制剂中活性组份(包括防腐剂)的定量分析方法。

类型Ⅱ：指用于测定原料药中杂质或制剂中降解产物的分析方法，包括定量分析和限度试验。

类型Ⅲ：用于测定性能特性(如溶解度、溶出度)的分析方法。

类型Ⅳ：鉴别试验。

专属性试验如一种方法不够专属，可用其它分析方法予以补充。

在仪器确认的基础上，应着手验证检验方法的适用性。适用性验证内容包括准确度试验、精密度测定、线性范围试验、专属性试验四个方面。

3．1准确度试验

准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般以回收率(％)表示，也可用平均值与真值间的差异及其可信限表示。测量值与真值愈接近，测量值的误差愈小，测量就愈准确。

准确度的测定至少要取方法范围内的3个浓度级别。每个浓度级别至少要3个结果。9个结果的精密度应符合要求，回收率均应在限度内。对于常量分

析，回收率至少应在95%～105％之间；对于微量或半微量分析，回收率可根据

仪器本身条件适当放宽。准确度应在规定的范围内建立。

在准确度试验中有三种试验方法即对照试验、回收试验，空白试验。

(1)对照试验：把标准样品或纯净物质作样品，以所用的方法对它进行定量分析，从分析结果与标准样品或纯净物的含量差值就可知道误差，这种试验叫对照试验。

(2)回收试验：在样品中加入已知含量的被测组分，用同一方法进行定量分析，由分析结果中被测组分的增大值与加入量之差就可知道误差，这种试验叫做回收试验。

(3)空白试验：用空白代替样品，以所用方法进行定量分析，从分析结果减去空白值以提高其准确度，这样的试验叫做空白试验。

在检验方法验证中，方法的准确度通常用回收率(％)表示。原料药用已知含量的对照品或标准品作样品，以所用的方法进行检验。而制剂是用已知含量的原料和处方中相应的辅料按比例模拟配制成制剂后做试验，取样量应在标示量的90．0％～110．0％范围内。

原料药的含量分析：通过分析已知含量的参比标准来确定此方法的准确度。或者把此方法的分析结果与另一有确定准确度的方法的分析结果进行比较来确定准确度。

制剂中各组份的含量分析：按制剂处方取适量各组份进行有机混合得一混合物，在方法的范围内，往此混合物中加入己知量的被分析物进行分析，从而确定方法的准确度。若不可能得到制剂中所有组份的样品，可用以下方法确定准确度：

a．往制剂中加入巳知量的被分析物；

b.将此方法的分析结果与另一有确定准确度的方法的分析结果进行比较。

杂质的定量分析：通过往样品中加入已知量的杂质来确定。

共7页第5页若不可能得到某种杂质或降解产物的参比标准品，可把此方法的分析结果与另一已验证的

方法的结果进行比较来确定。

若杂质为未知物，可通过计算杂质与主药响应值的比值来确定：若响应因子(等量的杂质和主药的响应比值)是已知的，应使用响应因子进行计算。

3．2精密度测定

待验证的检验方法还必须通过精密度测定试验。精密度系指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度，即一组测量值彼此符合的程度。测量值彼此愈接近，测量值的偏差愈小，测量就愈精密。所以也称为重现性，亦称为变异系数，一般可用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。但是测量的精密度不能说明测量值与真值的关系，亦即精密度高并不等于准确度就一定高。精密的测量值不一定是准确的，因为引起测量值远离真值的误差会对一系列的测量发生相同的影响，因而不影响精密度。

对常用的检验方法来说，至少应使用样品(每个样品均应经过从样品制备到最终测定的过程)测定6次。一般地，对于化学分析方法，相对标准差(RSD)应不大于1．0％；对于仪器分析方法，RSD应不大于2．0％或根据仪器自身参数确定。不仅要测定一天内的相对标准差，而且还应测定不同测定日之间的相对标准差，一般要求做平行试验4次以上，进行计算。日内、日间相对标准差应接近。在不同实验室，用不同厂商牌号的仪器(仪器性能试验均达到某一规定指标)，以同一检验方法分析同一样品，从分析结果采比较它们相互一致的程度称之为再现性试验(协作分析测试)，这是以往法定检验方法常用的复核检验方法。例如紫外分光光度法中吸收系数E1cm1%的确定，通过5个以上实验室分析，测定结果符合数理统计要求，才能采纳使用。

3．3线性范围试验

线性是指所用分析方法在给定范围内获取与样品中供试物浓度成正比的试验结果的能力。所谓范围是指利用给定分析方法取得精密度、准确度、线性均符合要求的供试物浓度的变化范围(最大值与最小值间的间隔)，通常用百分数或mg／ml表示。

在检验过程中取样量或样品浓度是允许在一定范围内变化的，测定的结果也应随着取样量或样品浓度成正比的变化，这样的检验方法才能达到准确度和精密度的要求。取样量在一定范围内变化时，测定含量的结果也成正比的变化，这样的取样范围称之为线性范围。在紫外分光光度法中样品浓度与吸收度成正比关系，线性范围宽，用重铬酸钾溶液作仪器吸收度的准确度检查中采用与规定吸收系数比较。绝大多数的品种含量测定中也采用吸收系数法计算含量。气相色谱和高效液相色谱分析中进样量与峰面积的线性范围视检测器的种类和具体品种而异。

检验方法的准确度是随着所测定的含量范围而发生变化的。超过一定的范围，准确度就受影响。线性的确定要在标准的0～150％范围内至少使用5个浓度。浓度与其对应的测定值经二次回归得到相关系数r，对于化学分析，相关系数r应不小于0．9990；对于仪器分析，相关系数值不小于0．990．对此的任何偏离都将说明这一检验方法在这一浓度范围是不适用的，在这种情况下，应该修改检验方法。线性范围是用实验证实样品中含有此范围内浓度的样品时，

共7页第6页能符合规定的准确度、精密度和线性的要求。具体要求如下：

项目含量测定杂质测定含量均匀度溶出度

范围(相对于样品标准)80％～120％50％～120％70％～130％ 20%

3．4专属性试验．

专属性是指在样品介质中有其它组份共存时，检验方法对供试物准确而专属的测定能力。

定吐分析(鉴别试验)：需证明(可与一已知参比物进行对照)当样品中含有被分析物时呈阳性反应，不含被分析物时呈阴性反应。必要时，要证明与被分析物结构相似或相近的物质不呈阳性反应。

杂质：取含一定杂质量的样品进行分析，证明其具有适宜的准确度和精密度。

含量分析：加入一定量的杂质或赋形剂至产品中，通过分析证明结果不受影响。若杂质或降解产物为未知物，可将样品在一定的光、热、湿度、酸碱度或氧化剂等条件下存放，而后将此分析方法与药典方法或经验证的方法的结果进行比较。含量分析可比较结果数据，谱图可比较图谱的形状及结构。

检验方法的专属性试验应根据被测样品中主药的中间体或可能的分解产物以及所用的辅料对检验方法验证的影响进行试验。为排除主药的中间体或可能的分解产物、辅料对主药测定的干扰，定量测定分解产物或杂质时用气相色谱法或高效液相色谱法已成为常用的测定方法。这足因为气相色谱、高效液相色谱可利用不同填料，选择不同的流动相，采用程序升温或梯度淋洗，把分解产物或杂质分离出来，气相色谱和高效液相色谱对分解产物或杂质有很好的选择性，其原因也在于此。

3．5检测限

检测限用以表示测量方法在所达条件下对样品中供试物的最低检出浓度，无需定量测定只需指出高于或低于该规定浓度即可，常用百分数，mg／ml或mg／L表示。

非仪器分析方法：通过已知浓度的样品分析来确定可检出的最低水平作为检测限。

仪器分析方法：可用已知浓度的样品与空白试验对照，以信噪比为2：l或3：l来确定检测限的最低水平；也可通过多次空白试验，求得其背景响应的标准差，乘以2或3，作为检测限的估计值。不论用哪种方法，均需制备相应检测限浓度的样品，反复测试来进行确定。

3．6定量限

定量限是指在样品介质中可定量测得的某一物质的最低水平的参数，例如原料药中的杂质或制剂中的降解产物等。定量限规定的最低测得浓度应符合一定的精密度和准确度的要求。定量限用百分数、mg／m1或μg／m1表示。

对于非仪器分析方法，与检测限的非仪器分析方法所用方法相同，只足所得结果需符合一定的准确度和精密度；对于仪器分析方法，将多次空白试验测得的背景响应的标准差，乘以

共7页第7页10，作为定量限的估计值，然后配制相应定量限浓度的样品，反复测试来进行确定。

3．7应注意的几个问题

在检验方法的适用性验证中，最重要的是准确度、精密度。为了顺利完成验证试验，还应注意以下几点：

(1)取样和称量。分析检验所使用的部分样品应该代表整个抽取样品，理想的样品能代表整个批，即样品的这一部分和其它部分应具有同一性，样品和相应的批也应该具有同一性，这就是我们常说的样品的代表性。

可以用这样的方法来检查样品的代表性。将某一样品测定得到的精密度与同一批号其它样品测得的精密度数据加以对比，不相符合表示样品的代表性存在问题，需进一步调查原因。

称量的准确与否对分析检验的成败起着决定性的作用，为保证称量的准确，除了定期检查校验分析天平外，应考虑称量使用的天平等级，称取几毫克的样品或对照品，必须用十万分之一的分析天平。

(2)分析检验中对照试验、空白试验应同时进行；在复核测定中，分析检验人员要更换，再复测回收率。

(3)试剂、试药的纯度直接影响到测定数据，有的对分析试剂有特殊要求，如分光光度法中对溶剂有吸收度的规定，在测定样品前应先检查所用溶剂在测定波长附近的吸收度是否符合要求，并不得有干扰吸收峰。在中国药典中规定用1cm石英池，以空气为空白，测定其吸收度，在220～240nm范围内，溶剂和吸收池的吸收度不得超过0．4；在241～250nm范围内不得超过0．20；在251～300nm范围内不得超过0．10；在300mn以上不得超过0．05。在检查铁盐时，使用的盐酸不得含有铁盐，应该使用超纯盐酸。在高效液相色谱中所用的流动相应该用色谱级试剂。

现代实验室相当一部分仪器的通用性很强。一台仪器可用于鉴别、杂质限度检查和含量测定等多种检验方法来测定多种产品的同一项目或不同项目。一个使用大型精密仪器的复杂检验方法的验证必须经过上述步骤。但对一些检验方法比较简单，所使用仪器足实验室中已验证过的仪器，检验方法验证的计划和实施办法应因地制宜，决不可死搬硬套，只要做到检验方法验证有据可查即可。

4、检验方法的评价及批准

安装确认及适用性试验结束后，应将试验数据资料进行汇总分析。对检验方法作出正确的评价，验证报告的说明及结论部分应简明扼要。试验中的主要偏差应有适当解释。然后，报主管领导审批。检验方法验证的最终产物是一个经过验证的方法—根据验证的结果制订的由有关领导批准的检验方法。