病毒分子生物学鉴定常用技术
实验二十三病毒核酸检测常用技术
（Techniques of Detecting Nucleic Acid of Viruses in
Common Use ）
近年来随着分子生物学的发展，基因检测技术在微生物学实验室诊断中也取得了长足的进展。由于部分病原微生物的基因组已成功地被克隆并进行了核苷酸序列测定，因此根据病原微生物的基因特点，应用分子生物学技术检测样品中有无相应病原微生物的核酸，从而可以特异、灵敏地判定标本中是否含有相应的病原微生物。在微生物学的研究及感染性疾病的诊断中，最常使用的微生物核酸检测技术有PCR、RT-PCR、核酸杂交等技术，现对病毒核酸（DNA、RNA）的分离、PCR、RT-PCR、核酸杂交等技术的基本原理、操作方法、应用及影响因素等进行概述。
实验 1 PCR 检测传染性喉气管炎病毒核酸
【目的要求】
通过本实验使学生初步了解和熟悉病毒核酸（DNA）的分离与PCR技术的基本原理、操作方法、影响因素和应用。
【基本原理】
鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis, ILT)是由疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科的喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis Virus, ILTV)引起的一种急性上呼吸道传染病, 常表现呼吸困难、产蛋鸡产蛋下降和死亡, 是危害养鸡业发展的重要疫病之一。但在临诊上极易与其它一些呼吸道疾病相混淆, 如禽流感、新城疫、传染性支气管炎、支原体感染等。常规检测IL TV 的方法有病原分离鉴定和血清学试验, 这些方法虽经典，但费时且敏感性差, 不能检测亚临床感染, 而传染性喉气管炎潜伏感染是疾病的一种重要表现形式。聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是目前比较快速、敏感、特异的检测手段，已被广泛应用在病毒核酸检测方面。本实验以PCR方法检测鸡传染性喉气管炎病毒核酸为例，对PCR方法进行介绍。
PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93～94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA 均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍（图23-1）。
图23-1PCR基本原理示意图
本实验是将被检样品中ILTV 颗粒经裂解、变性后，分离ILTV—DNA。选择鸡传染性喉气管炎病毒的TK基因保守序列设计引物，由于引物与鸡传染性喉气管炎病毒的TK基因存在着特异的互补性，当加入DNA聚合酶后，就会在引物的引导下合成该段基因，该基因片段通过人工扩增后，经含溴乙锭的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可显示橙红色ILTV—DNA 条带，根据片段大小来判定标本中鸡传染性喉气管炎病毒的存在。
【器材准备】
1．病毒裂解液：醋酸钠1.7g，EDTA钠盐4.65g，20mg/ml蛋白酶K 2.5ml，100g/L SDS 10ml，DEPC三重蒸馏水加至50ml。
2.3mol/L醋酸钠缓冲液(pH 5.2) ，酚/氯仿/异戊醇混合液(25：24：1) ，无水乙醇及70％乙醇。
3.2.5mmol dNTPs：含dA TP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM。
4.10×PCR Buffer，Taq DNA聚合酶。
5.DNA分子量标准。
6.上样缓冲液：2.5g/L溴酚蓝、400g/L蔗糖水溶液。10mg/ml溴乙锭(EB)(具致癌性，
操作时应戴手套)，琼脂糖。
7.50×TAE缓冲液：242g Tris，57.1mL 冰乙酸，100mL 0.5mol/L EDTA（pH8.0）加三蒸水定容到1000mL。使用液为1×。
8.ILTV北京E2 株、ILTV-DNA可疑组织样品、ILTV-DNA阴性组织样品等。
9.引物序列: 参考已发表的ILTV的TK基因序列,设计并合成了一对引物,其序列如下：引物P1：5’-TTCGAGAACGATGACTCCG-3’；引物P2：5’-ATAGTCA TCTGAACTTCCGC-3’。
10.仪器：台式高速离心机、PCR扩增仪、电泳仪、水平式电泳槽、紫外透射反射分析仪、微量加样器、Eppendorf管与吸头等。
【实验步骤】
1.病毒核酸的分离
（1）取ILTV-DNA可疑组织样品上清液200μL、病毒裂解液20μL于Eppendorf管中，60℃水浴1h，同时设ILTV北京E2 株、ILTV-DNA阴性组织样品对照。
（2）加酚/氯仿/异戊醇混合液200μL，上下颠倒混匀，14000rpm离心5min，吸上清液
于另一新的Eppendorf管中。
（3）加1/10体积的3 mol/L醋酸钠缓冲液(pH 5.2)及2倍体积的无水乙醇，-20℃过夜。14000rpm离心15min，弃上清液。
（4）加70％乙醇至Eppendorf管2/3处，混匀，洗涤沉淀。14000rpm离心15min，弃上清液，室温中使乙醇挥发。
2.加样及PCR扩增
（1）按以下次序将各成分加入0.5ml 灭菌Eppendorf管中。
10×PCR buffer 5 μl
2.5mM dNTPs 4 μl
引物P1（25pmol/μL） 2 μl
引物P2（25pmol/μL） 2 μl
Taq DNA聚合酶（5U/μl）0.5 μl
模板液（病毒核酸的分离液） 1 μl
加ddH2O至50 μl
（2）将上述混合液稍加离心，调整好反应程序，立即置PCR仪上，执行扩增。一般在94℃预变性3min，进入循环扩增阶段：94℃60s→58℃30s→72℃60s，循环30-35次，最后在72℃保温7min。
3.电泳检测
（1）将倒胶槽两端用透明胶带封闭并放置在水平的台面上，放好梳板，使梳板齿下沿距倒胶槽板1mm。
（2）配制合适浓度的琼脂糖凝胶，如配制1.2％的凝胶，则称取琼脂糖1.2g于三角瓶中，加入100ml 1×TAE电泳缓冲液，置微波炉中加热煮沸后以蒸馏水补足体积至100ml，迅速混匀，待冷至60℃左右时，加入100μL 0.5mg/ml的EB液，充分混匀。倒胶至倒胶槽内，使厚度为3～5mm，排除气泡后待胶完全凝固，撕去两端胶带。
（3）将倒胶槽置电泳槽中，加入1×TAE电泳缓冲液使其没过胶面2～3mm，轻轻拔出梳板。
（4）加样：取2μL上样缓冲液于Parafilm膜上，加入PCR产物5μL，混匀后，加入点样孔中，不要溢出孔外。同时设DNA分子量标准。
（5）电泳：样品在负极端，接通电源，5V/cm恒压电泳30～60min即可。
（6）检测：电泳结束，关闭电泳仪电源，取出倒胶槽，将电泳完毕的琼脂糖凝胶放在紫外灯300nm下观察，可见桔红色明亮带，根据电泳条带的位置判断结果。
4.结果判定
在阳性对照孔出现相应扩增带、阴性对照孔无此扩增带时判定结果。
若样品扩增带与阳性对照扩增带（约265bp）处于同一位置，则判定为ILTV-DNA阳性，否则判定为阴性。
【注意事项】
1.所有实验结果都有成功或失败，实验的失败可能是应该出结果而没有出，我们把它称作假阴性，不该出结果而出了结果我们把它称为假阳性。PCR实验中最常见的问题就是假阴性和假阳性问题。
（1）假阴性：出现假阴性结果最常见的原因有Taq DNA聚合酶活力不够，或活性受到抑制；引物设计不合理；提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统欠妥当；循环次数不够。为了防止假阴性的出现在选用Taq DNA聚合酶时，要注意用活力高、质量好的酶。同时在提取PCR模板时，应特别注意防止污染抑制酶活性物质（如酚、氯仿）的存在。尽管Taq DNA
聚合酶对模板纯度要求不高，但也不允许有破坏性有机试剂的污染。保证引物的3’端与靶基因的互补。PCR反应的各温度点的设置要合理。
（2）假阳性：PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生，所以污染是PCR假阳性的主要根源。污染的原因可能有：
①样品间交叉污染。样品污染主要有收集样品的容器被污染，或样品放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样品而造成相互间交叉污染；样品核酸模板在提取过程中，由于移液器污染导致样品间污染；有些微生物样品尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。
②PCR试剂的污染。主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于移液器、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
③PCR扩增产物污染。这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，因为PCR产物拷贝量大，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳性。还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染移液器的反复吸样都可形成气溶胶而污染。
④实验室中克隆质粒的污染。在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见，因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。
为了避免因污染而造成的假阳性，PCR操作时采取如下措施：
①合理分隔实验室。将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开，最好能划分①标本处理区；②PCR反应液制备区；③PCR循环扩增区；④PCR产物鉴定区。
②移液器：移液器污染是一个值得注意的问题，由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入移液器内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。
③预混和分装PCR试剂：所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存，以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR 试剂与反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。
④防止操作人员污染，手套、吸头、小离心管应一次性使用。
⑤设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。
⑥减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止。
⑦选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部，开管动作要轻，以防管内液体溅出。
2.注意个人防护和环境保护，电泳中用到的EB（Times New Roman体）可诱发基因突变，试验中被EB污染的物品要有专用收集处，并通过焚烧作无害化处理。
3.实验用品应专用，实验前应将实验室用紫外线照射以破坏残留的DNA或RNA。
总而言之，PCR的条件是随系统而异的，并无统一的最佳条件，先选用通用的条件扩增，然后可以通过稍稍改变各参数，使反应条件得到优化，以取得优良的特异性和产率。【实验报告】
1.实验结果
（1）你所做的PCR实验阳性对照是否出现相应扩增带? 如果有扩增带，请对你的试验结果进行描述。如果失败，请分析其原因。
2.思考题
（1）PCR技术的基本原理？
（2）影响PCR实验成功的因素有哪些？
（3）PCR检测中出现假阳性，可能导致的因素有哪些？
（4）根据实验过程中的体会，总结如何做好PCR实验？关键因素有哪些？
实验2 RT-PCR检测猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸
【目的要求】
通过本实验使学生初步了解和熟悉病毒核酸（RNA）的分离与RT-PCR技术的基本原理、操作方法、影响因素和应用。
【基本原理】
猪繁殖与呼吸综合征( Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒( Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV)引起的一种传染病,其临诊特征为各种年龄的猪均可感染,病猪厌食、嗜睡、体温升高,妊娠母猪发生早产、流产、死胎、弱胎和木乃伊胎,种公猪性功能下降,仔猪和育肥猪呼吸障碍。1987年该病首次报道于美国,随后迅速蔓延北美、欧洲及亚洲各国,目前已成为一种地方性流行病。1996年初,我国也报道了本病的发生。由于PRRS与其它引起猪繁殖障碍的疾病存在着非常类似的临诊症状,根据现场诊断很难做出准确鉴别。实验室诊断方面,如病毒的分离与鉴定,抗原及抗体的检测等方法或特异性、敏感性差,或操作技术复杂、费时费力等缺点,不能满足临床需要。PRRSV属动脉炎病毒科成员，有囊膜，基因组为单股正链RNA，大小约15kb。反转录-聚合酶链式反应（Reverse Transcript- Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）方法具有特异、敏感、快速诊断等优点，因此PRRSV适用RT-PCR方法进行检测。
RT-PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，它是以RNA为模板，根据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA。这一过程与一般遗传信息流转录的方向相反，故称为反转录，催化此过程的DNA聚合酶叫做反转录酶(reverse transcriptase)。基本过程是以dNTP为底物，以RNA为模板，按5’→3’方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA(complementary DNA, cDNA)，它与RNA模板形成RNA-DNA 杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA 链。至此，完成由RNA指导的DNA合成(图23-2)，然后将DNA进行PCR扩增。PCR扩增的基本原理见实验1部分。
图23-2 RT-PCR基本原理示意图
【器材准备】
1.TRIzol LS Reagent RNA提取试剂。
2.氯仿、异丙醇、70%乙醇。
3.DEPC处理水：按1∶1000的比例将DEPC加入三蒸水，室温放置12h以上。
4.5×反转录反应缓冲液。
5.SuperScript TMⅡ反转录酶（200U/μL）。
6.RNA酶抑制剂(40U/μL)。
7.2.5 mM dNTPs：含dA TP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5 mM。
8.10×PCR Buffe r、Taq DNA聚合酶。
9.DNA分子量标准。
10.上样缓冲液：2.5g/L溴酚蓝、400g/L蔗糖水溶液。10mg/ml溴乙锭(EB)(具致癌性，操作时应戴手套)，琼脂糖。
11.50×TAE：242g Tris，57.1mL 冰乙酸，100mL 0.5mol/L EDTA（pH8.0）加三蒸水定容到1000mL。使用液为1×。
12. PRRSV标准毒株、PRRSV-RNA可疑组织样品、PRRSV-RNA阴性组织样品等。
13.引物：
（1）反转录引物：可用随机引物（Random Primers）（市售）、Oligo（dT）12-18（市售）或Random Primers与Oligo（dT）按3：1混合而成的引物Oligo（dT）/Random primer，或用相对PRRSV RNA来说的PCR下游单侧特异性引物。
（2）PCR引物序列：以高度保守的ORF7作为扩增靶区设计并合成一对引物，序列如下：引物F：5-ATGCCAAATAACAACGGCAAG C；引物R：5-TTAATTTGCACCCTGACTG-3。
14.仪器：台式高速离心机、PCR扩增仪、电泳仪、水平式电泳槽、紫外透射反射分析
仪、微量加样器、Eppendorf管、吸头与水浴箱等。
【实验步骤】
1.病毒核酸（RNA）的分离：病毒核酸（RNA）分离方法很多，实际应用时可灵活考虑。本实验选择市售商品化TRIzol LS Reagent RNA提取试剂完成猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRSV)基因组RNA的分离。操作按TRIzol LS Reagent RNA提取试剂使用说明书进行，步骤如下：
（1）在1.5mL离心管中加入250μL的PRRSV细胞培养物和750μL TRIzol LS，盖上管盖，倒置混匀，室温放置10min。
（2）加入200μL氯仿，将匀浆剧烈振荡15sec，室温静置5min使核蛋白质复合体彻底裂解。
（3）4℃12 000 rpm离心15min，将上层含RNA的水相移入一新管中。为了降低被处于水相和有机相分界处的DNA污染的可能性，不要吸取水相的最下层。
（4）加入等体积的异丙醇，充分混匀液体，室温放置10min。
（5）4℃12 000 rpm离心15min，弃上清，再用70%的乙醇洗涤沉淀，然后离心，再用吸头彻底吸弃上清，在自然条件下干燥沉淀，溶于适量DEPC处理的水中。直接用于RT-PCR 或-80℃贮存，备用。
（6）另外，也可选择异硫氰酸胍法完成PRRSV RNA的提取。
2.病毒cDNA第一链的合成（反转录，RT）
病毒cDNA第一链的合成参照Invitrogen公司的SuperScript TMⅡ反转录酶使用说明进行，步骤如下：
（1）于微量离心管中加入6μL RNA、2μL反转录引物：Oligo（dT）/Random primer混合物，混匀，65℃5min。
（2）冰浴2min，离心。
（3）继续加入以下组分：
5×反转录反应缓冲液4μL
0.1 m M DTT 2μL
2.5mmol dNTPs 2μL
SuperScript TMⅡ反转录酶1μL（200U/μL）
RNA酶抑制剂0.5μL（40U/μL）
DEPC水 2.5μL
（4）混匀，42℃水浴50min，最后70℃水浴15min，完成cDNA链合成。
取出后可以直接进行PCR，或者放于-20℃保存备用。试验中同时设立阳性和阴性对照。
3.PCR扩增
根据扩增目的选择引物F与引物R，按TaKaRa公司Ex-Taq DNA 聚合酶使用说明进行，步骤如下：
按以下次序将各成分加入0.5ml 灭菌Eppendoff管中。
双蒸灭菌水37.5μL
反转录产物4μL
引物F（25pmol/μL）0.5μL
引物R（25pmol/μL）0.5μL
10×PCR Buffer 5μL
2.5mmol dNTPs 2μL
Taq酶0.5μL（5U/μL）
注意首先加入双蒸灭菌水，然后再按照顺序逐一加入上述成分，每一次要加入到液面
下。
（4）全部加完后，混悬，瞬时离心，使液体都沉降到Eppendorf管底。
（5）在PCR扩增仪上执行如下反应程序：94℃3min；94℃30 sec，50℃45 sec，72℃1min，30个循环；最后72℃延伸10min结束。可根据扩增目的基因的不同，选择不同的循环参数。
4.电泳检测
（1）将倒胶槽两端用透明胶带封闭并放置在水平的台面上，放好梳板，使梳板齿下沿距倒胶槽板1mm。
（2）配制合适浓度的琼脂糖凝胶，如配制1.2％的凝胶，则称取琼脂糖1.2g于三角瓶中，加入100ml 1×TAE电泳缓冲液，置微波炉中加热煮沸后以蒸馏水补足体积至100ml，迅速混匀，待冷至60℃左右时，加入100μL 0.5mg/ml的EB液，充分混匀。倒胶至倒胶槽内，使厚度为3～5mm，排除气泡后待胶完全凝固，撕去两端胶带。
（3）将倒胶槽置电泳槽中，加入1×TAE电泳缓冲液使没过胶面2～3mm，轻轻拔出梳板。
（4）加样：取2μL上样缓冲液于Parafilm膜上，加入PCR产物5μL，混匀后，加入点样孔中，不要溢出孔外。同时设DNA分子量标准。
（5）电泳：样品在负极端，接通电源，5V/cm恒压电泳30～60min即可。
（6）检测：电泳结束，关闭电泳仪电源，取出倒胶槽，将电泳完毕的琼脂糖凝胶放在紫外灯300nm下观察，可见桔红色明亮带，根据电泳条带的位置判断结果。
5.结果判定
在阳性对照孔出现相应扩增带、阴性对照孔无此扩增带时判定结果。
若样品扩增带与阳性对照扩增带处于同一位置，则判定为PRRSV-RNA阳性，否则判定为阴性。
【注意事项】
1.分离高质量的病毒RNA是RT-PCR成败的关键。由于RNA酶无处不在，且可耐受多种处理（例如煮沸）而不失活，因此RNA在分离过程中极易受其污染而降解。为了获取完整的RNA，应创造一个无RNA酶的环境。整个操作过程应戴一次性手套并勤换。所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温（240℃）烘烤以达到消除RNA酶的目的。注意采用灭菌的一次性塑料制品，且不得重复使用；非一次性的玻璃和塑料用品须在使用前应用0.05%焦碳酸二乙酯（DEPC）室温处理过夜，然后高压灭菌去除DEPC，以确保无RNA 酶；所有溶液（Tris除外）均须加入0.05% DEPC浸泡过夜后高压灭菌。
2.病毒cDNA第一链的合成（反转录）步骤（1）、（2）中，将RNA溶液置65℃中温育，然后冷却再加样目的是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构，使Poly(A+)尾充分暴露，从而提高Poly(A+)RNA的回收率，此步骤不能省略。
3.RT-PCR过程中的PCR步骤中最常见的问题参见实验1注意事项内容。
【实验报告】
1.实验结果
（1）你所做的RT-PCR实验阳性对照是否出现相应扩增带? 如果有扩增带，请对你的试验结果进行描述。如果失败，请分析其原因。
2.思考题
（1）RT-PCR技术的基本原理？
（2）影响RT-PCR实验成功的因素有哪些？
（3）RT-PCR检测中出现假阳性，可能导致的因素有哪些？
（4）根据实验过程的体会，总结如何做好RT-PCR实验？关键因素有哪些？
实验3 核酸杂交技术检测病毒核酸
【目的要求】
通过本实验使学生初步了解和熟悉病毒核酸杂交技术的基本原理、操作方法、影响因素和应用。
【基本原理】
鸡马立克氏病(Marek’s Disease ，MD) 是由马立克氏病病毒(Marek’s Disease Virus，MDV)引起的鸡的一种传染性肿瘤病,它同时还能引起感染鸡的免疫抑制,从而导致对多种
疫苗免疫效应降低。应用特异、敏感的方法对该病作出早期诊断是控制其流行的一项重要措施。实验室诊断MD的方法很多,到目前为止有琼脂扩散试验、免疫荧光抗体试验、酶联免疫吸附试验等,但这些方法存在敏感性低及易出现非特异性反应等缺点。近年来业已建立的一些分子生物学方法,如核酸探针技术，以其特异、快速、敏感，适合检测和早期诊断等特点,已在MDV检测及MD的诊断上得到应用。
核酸杂交技术是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的方法。其原理主要是利用四种脱氧核苷酸中碱基配对原则(G=C、A=T)，核酸变性和复性理论（图23-3）。
图23-3核酸分子杂交原理示意图
病毒核酸杂交基本原理是将和已知病毒核酸特定区域碱基互补的DNA或RNA克隆片段，用非放射性物质(如生物素、地高辛) 或放射性物质(如32P)标记，制备成核酸分子探针。在适当条件下，核酸探针与临床样品中的病毒核酸形成双链结构而被保留，然后通过放射自显影或免疫技术检测标记的核酸片段。若被检样品与探针形成杂交双链，则显示阳性结果。如样品中无与探针互补的序列，则不发生分子杂交，结果为阴性。常用的杂交方法有DNA 斑点杂交、原位杂交、Southern杂交和Northern杂交。
下面以地高辛(Dig)标记的单链DNA探针试剂盒检测MDV核酸为例，对常用的DNA 斑点杂交法进行介绍。将MDV-DNA样品滴于硝酸纤维素膜上，MDV-DNA经处理变性，双螺旋DNA变为单链DNA吸附在固相滤膜上，再加分子质量较小的地高辛标记的单链DNA（即核酸探针），在一定条件下按互补碱基顺序配对的特点进行结合，形成DNA—DNA
的双链杂交分子。然后用偶联有酶的抗地高辛抗体结合物作为酶标记，再分别用显色底物使杂交部位显色以达到检测目的，其反应过程见图23-4。
图23-4 地高辛标记的探针检测酶联免疫反应
【器材准备】
1.Dig-MDV-DNA探针：参照Dig-DNA探针标记试剂盒说明进行制备。
2.预杂交液（pH7.0-8.6）：Ficoll 0.8ml，2.0g/L BSA 0.8ml，20g/L PVP 0.8ml，20×SSC 2ml，1 mg/m1小牛胸腺DNA 0.4ml,双蒸水2.8ml,0.5mol/L HCl 0.4ml。
3.漂洗液
（1）20×SSC：NaCl 175.32g，枸橼酸钠(2H2O)88.2g，加双蒸水至1000ml。
（2）4×SSC-1.0g/L SDS：20×SSC 100ml，100.0g/L SDS 5ml，双蒸水395ml。
（3）参照（2）法配制4×SSC-5.0g/L SDS、0.1×SSC-1.0g/L SDS。
（4）3mol/L NaCl-0.5mol/L Tris：NaCl 175.32g，Tris 60.5g，双蒸水395ml。
4.MDV 中国疫苗株814 株或中国标准株Jing-1 株、MDV-DNA可疑组织样品与MDV-DNA阴性组织样品等。
5.器材：负压抽滤点样器、硝酸纤维素膜、塑料袋、烤箱、水浴箱、冰箱、塑料封接机。【实验步骤】
1.病毒DNA分离：MDV核酸分离方法参照实验1 PCR 检测传染性喉气管炎病毒核酸部分（1.病毒核酸的分离）进行。
2.探针标记：MDV pp38基因片段DNA 特异寡核苷酸探针标记，参照Dig-DNA探针试剂盒说明书进行。
3.点样：将上述适度稀释的病毒核酸（DNA）80μl、阳性对照80μl、阴性对照80μl点样于硝酸纤维素膜(NC膜)或尼龙膜上，负压抽滤。
4.变性：用0.5 mol/L NaOH变性点样膜10min，再抽干水分按下述顺序洗膜。
（1）0.5 mol/L HCl漂洗1次，每次10min。
（2）3 mol/L NaCl-0.5 mol/L Tris(pH7.5)漂洗1次，每次15min。
（3）1 mol/L Tris-0.5 mol/L NaCl(pH7.5)漂洗1次，每次20min。
（4）0.5 mol/L Tris-0.5 mol/L NaCl(pH7.5)漂洗1次，每次20min。
（5）0.2mol/L Tris-EDTA(0.002mol/L)(pH7.5)漂洗1次，每次5min。
（6）2×SSC漂洗1次，每次5min。
（7）80℃ 5min，氯仿浸泡5min，再80℃烘干2h。
5.预杂交：将滤膜和预杂交液—起放塑料袋内密封65℃水浴5h。
6.杂交：
（1）将地高辛标记的MDV pp38基因探针放沸水中煮沸10 min ,再置冰中速冷变性。（2）在塑料袋内留有适量预杂交液，加入变性的Dig-ILTV DNA，除去气泡，充分混匀，
密封，68℃摇动，杂交过夜或6 h 以上。
7.洗膜：按下列顺序充分洗去未杂交的标记物。
（1）4×SSC 1.0g/L SDS漂洗1次，每次10～30min。
（2）4×SSC 5.0g/L SDS 65℃漂洗1次，每次4h。
（3）0.1×SSC 1.0g/L SDS 45℃漂洗1次，每次2h。
8.显色：将杂交膜置80℃烘干30min，再装入塑料袋内，加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，室温显色3～4h；双蒸水洗涤，终止反应，以BCIP和NBT为底物进行显色。
9.结果判定
在阴阳对照正常的情况下，阳性标本硝酸纤维素膜点样处呈紫色。可与同时杂交的已知的MDV DNA样品显色强度相比较，进行样品中MDV DNA的定量检测。阳性与阴性结果如图23-5。
图23-5 DNA斑点杂交检测结果
【注意事项】
1.实验要设立各种对照（阳性对照、阴性对照与空白对照）。
2.非特异显色的排除。非特异显色是固相膜杂交方法常遇到的问题，指标记DNA非特异结合到空白膜上而显色，即本底。这个问题的克服一是使用高纯度的核酸制品和充分严格的杂交条件，二是选择合格的杂交反应液充分封闭膜上的非特异结合位点和对膜进行处理。
3.使用的抗体进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。抗体的有效期和保存条件要经常检查，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。底物显色液最好新鲜配制，如有沉渣应进行过滤后再用。
4.显色过程最好实时监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。
5.结果判定时，应与阳性、阴性对照进行比较，克服肉眼观察所造成的误差。
6.在实验过程中应严格注意控制污染，所用器皿需高温消毒，实验者需戴手套。另外，在处理点样硝酸纤维素膜(NC膜)或尼龙膜时，自始至终应保持湿润，勿令其干燥。
【实验报告】
1.实验结果
DNA斑点杂交实验设立的各种对照显色是否正常? 并对你的试验结果进行描述。如果失败，请分析其原因。
2.思考题
（1）核酸杂交技术的基本原理？请阐述斑点杂交法主要步骤。
（2）在斑点杂交实验中引起非特异性染色的主要因素有哪些？应如何排除？
(陈金顶)
参考文献
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9.曹澍泽等主编. 兽医微生物学及免疫学技术.北京：北京农业出版社，2003
微生物常规鉴定技术
微生物常规鉴定技术 一、形态结构和培养特性观察 １、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。 ２、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同一种的细菌在一定条件下，培养特征却有一定稳定性。，以此可以对不同微生物加以区别鉴定。因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。 １）细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。 ２）霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。
革兰氏染色: 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。 该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色步骤： （1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。 （2）晾干：与简单染色法相同。 （3）固定，与简单染色法相同 （4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟。 （5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。 （6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。 （7）水洗：用水洗去碘液。 （8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色，立即水洗。 （9）复染：滴加蕃红复染5min。 （10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。 （11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。 （12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。 （13）实验完毕后的处理： ①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦 去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次。c.再用干净的擦镜纸将 镜头擦2—3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。 ②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干
病毒分子生物学鉴定常用技术
实验二十三病毒核酸检测常用技术 （Techniques of Detecting Nucleic Acid of Viruses in Common Use ） 近年来随着分子生物学的发展，基因检测技术在微生物学实验室诊断中也取得了长足的进展。由于部分病原微生物的基因组已成功地被克隆并进行了核苷酸序列测定，因此根据病原微生物的基因特点，应用分子生物学技术检测样品中有无相应病原微生物的核酸，从而可以特异、灵敏地判定标本中是否含有相应的病原微生物。在微生物学的研究及感染性疾病的诊断中，最常使用的微生物核酸检测技术有PCR、RT-PCR、核酸杂交等技术，现对病毒核酸（DNA、RNA）的分离、PCR、RT-PCR、核酸杂交等技术的基本原理、操作方法、应用及影响因素等进行概述。 实验 1 PCR 检测传染性喉气管炎病毒核酸 【目的要求】 通过本实验使学生初步了解和熟悉病毒核酸（DNA）的分离与PCR技术的基本原理、操作方法、影响因素和应用。 【基本原理】 鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis, ILT)是由疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科的喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis Virus, ILTV)引起的一种急性上呼吸道传染病, 常表现呼吸困难、产蛋鸡产蛋下降和死亡, 是危害养鸡业发展的重要疫病之一。但在临诊上极易与其它一些呼吸道疾病相混淆, 如禽流感、新城疫、传染性支气管炎、支原体感染等。常规检测IL TV 的方法有病原分离鉴定和血清学试验, 这些方法虽经典，但费时且敏感性差, 不能检测亚临床感染, 而传染性喉气管炎潜伏感染是疾病的一种重要表现形式。聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是目前比较快速、敏感、特异的检测手段，已被广泛应用在病毒核酸检测方面。本实验以PCR方法检测鸡传染性喉气管炎病毒核酸为例，对PCR方法进行介绍。 PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93～94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA 均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍（图23-1）。
微生物检验常规鉴定技术
第一章微生物检验常规鉴定技术 课堂教学计划（1学时） 第一章微生物检验基本知识 包括显微镜、染色技术、培养基制备技术、接种、分离纯化和培养技术等。 接种、分离纯化和培养技术
一、接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。 １、接种工具和方法 接种和分离工具 1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 常用的接种方法有以下几种： １）划线接种这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。 ２）三点接种在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。 ３）穿刺接种在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。 ４）浇混接种该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C 左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。 ５）涂布接种与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。 ６）液体接种从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中，或从液体培养物中将菌液移至
2020年(生物科技行业)微生物常规鉴定技术
（生物科技行业）微生物常 规鉴定技术
微生物常规鉴定技术 壹、形态结构和培养特性观察 １、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。 ２、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同壹种的细菌在壹定条件下，培养特征却有壹定稳定性。，以此能够对不同微生物加以区别鉴定。因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的壹项重要内容。 １）细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性仍是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。 ２）霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如
青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。 革兰氏染色: 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）俩大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。 该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这俩类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色步骤： （1）涂片：涂片方法和简单染色涂片相同。 （2）晾干：和简单染色法相同。 （3）固定，和简单染色法相同 （4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟。 （5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。 （6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。 （7）水洗：用水洗去碘液。
微生物分类鉴定
第三节微生物的分类鉴定方法 一、微生物鉴定的依据 获得纯化的微生物分离菌株后，首先判定是原核微生物还是真核微生物，这实际上在分离过程中所使用的方法和选择性培养基已经决定了分离菌株的大类的归属，从平板菌落的特征和液体培养的性状都可加以判定。然后，如是原核微生物，便可根据表14-3 所示的经典分类鉴定指标进行鉴定，如条件允许，可做碳源利用的BIOLOG-GN 分析和16S rDNA 序列分析。多项结果结合起来确定分离菌株的属和种。 表14-3 微生物经典分类鉴定方法的指标依据 二、微生物鉴定的技术与方法 根据目前微生物分类学中使用的技术和方法，可把它们分成四个不同的水平：①细胞形态和行为水平，②细胞组分水平，③蛋白质水平，④基因组水平； 在微生物分类学发展的早期，主要的分类鉴定指标是以在细胞形态和习性为主，可称为经典的分类鉴定法。其他三种实验技术主要是60 年代以后采用的，称为化学分类和遗传学分类法，这些方法再加上数值分类鉴定法，可称为现代的分类鉴定方法。 （一）、经典分类鉴定法 经典分类法是一百多年来进行微生物分类的传统方法。其特点是人为地选择几种形态生理生化特征进行分类，并在分类中将表型特征分为主、次。一般在科以上分类单位以形态特征、科以下分类单位以形态结合生理生化特征加以区分。最后，采用双歧法整理实验结果，排列一个个的分类单元，形成双歧检索表（图14-4 ）。 A. 能在60 o C 以上生长 B. 细胞大，宽度1.3~1.8mm ……………………………………… 1. 热微菌属 ( Thermomicrobium )
BB. 细胞小，宽度0.4~0.8mm C. 能以葡萄糖为碳源生长 D. 能在pH4.5 生长…………………………………………… 2. 热酸菌属 ( Acidothermus ) DD. 不能在pH4.5 生长………………………………………………… 3. 栖热菌属 ( Thermus ) CC. 不能以葡萄糖为唯一碳源……………………… 4. 栖热嗜油菌属( 栖热嗜狮菌属Thermoleophilum ) AA. 不能在60 o C 以上生长 图14-4 双歧法检索表例样 应用BIOLOG-GN 仪检测分离菌株对众多碳源的利用情况判断分离菌株的分类地位，近年来也时有应用。在BIOLOG-GN 仪上有96 个小孔，其中95 孔内分装有95 种不同碳源的缓冲液，1 孔为无碳源的缓冲液对照，各孔接入适宜菌浓度和液量的分离菌株培养物，定温培养，每日定时读取BIOLOG-GN 仪计算机上各碳源利用情况，一般为时1 周，BIOLOG-GN 仪可显示出该鉴定菌株的最可能归属。 （二）、数值分类法 又称阿德逊氏分类法() 。它的特点是根据较多的特征进行分类，一般为50 ～60 个，多者可达100 个以上，在分类上，每一个特性的地位都是均等重要。通常是以形态、生理生化特征，对环境的反应和忍受性以及生态特性为依据。最后，将所测菌株两两进行比较，并借用电子计算机计算出菌株间的总相似值，列出相似值矩阵( 图14-5) 。为便于观察，应将矩阵重新安排，使相似度高的菌株列在一起，然后将矩阵图转换成树状谱(dendrogram)( 图14-6) ，再结合主观上的判断( 如划分类似程度大于85 ％者为同种，大于65 ％者为同属等) ，排列出—个个分类群。 图14-5 显示6 个细菌菌株的遗传相似矩阵图
第十五章 病毒病的分子生物学诊断
第十五章病毒病的分子生物学诊断 第一节概述 由于分子生物学技术的飞速发展，病毒病的实验室诊断技术已从常规的病毒分离鉴定以及抗原和抗体的免疫学检测，进入到可对病毒基因序列和结构直接进行测定的分子生物学水平，包括对病毒核酸（DNA或RNA）和蛋白质分子的特异序列或结构。常用于病毒核酸序列和基因结构测定的分子生物学技术包括基因组电泳分析、DNA酶切图谱分析、寡核苷酸指纹图、核酸杂交、聚合酶链式反应（PCR）等，其中核酸杂交和PCR技术又以其特异、快速、敏感、适于早期和大量样品的检测等优点，成为当今病毒病诊断最具应用价值的方法。DNA杂交的敏感度已经提高到0.05 pg /μl水平，只要有1000个DNA拷贝就可被检测出来；PCR可以检测出一个拷贝的DNA分子。 分子生物学诊断的特异性取决于核酸序列的特异性。获取病毒特异DNA片段的基础是进行病毒基因的克隆，即首先建立易于获得足够量病毒DNA的病毒基因无性繁殖系。病毒基因克隆以后，就可以比较容易地用酶促法或化学法来测定其核苷酸序列，再将获得的序列输入计算机，与基因序列库中的已知序列进行比较分析，就能准确地定位病毒特异的基因序列。到目前为止，越来越多的病毒基因被克隆和测序，几乎涉及所有动物病毒科的成员，一些重要病毒的全基因序列已被测定，这无疑促进了病毒病分子生物学技术的发展。 第二节病毒基因的克隆与鉴定 一、概述 病毒基因的克隆是在原核细胞中进行的，可以采用细菌质粒、粘性质粒或λ噬菌体作为载体，但最常用细菌质粒载体，在大肠杆菌中进行。 1．克隆用质粒的结构特征：必须具备3个主要结构特征。①具有负责其在宿主细胞中自主复制的复制起始区（Ori）；②具有克隆后便于筛选的标记基因（如对各种抗生素的抗性基因等）；③含有外源基因的克隆位点。常用的质粒有pUC18/ pUC19和pBR322等。pUC18/ pUC19为高拷贝质粒（700~800个/细胞），含有多克隆位点，以满足多种内切酶切割的DNA片段的克隆；pBR322为中拷贝质粒（50~80个/细胞）。 2．病毒基因克隆的目的：①病毒基因片段的大量制备；②序列分析；③基因表达与调控研究；④构建病毒载体；⑤制备核酸探针等。 3．病毒基因克隆方法：由于病毒基因组DNA和RNA以及单链和双链之别，可采用不同的基因克隆方法。DNA病毒基因可在限制性内切酶切割后直接进行克隆；RNA病毒
常用的分子生物学基本技术
常用的分子生物学基本技术 核酸分子杂交技术 由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。 固相杂交 固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。 斑步杂交（dot hybridization） 是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。 印迹杂交（blotting hybridization） Southern印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段，将凝胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显色，检测特定大小分子的含量。可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析（RELP）等。 Northern印迹杂交:由Southerm印杂交法演变而来，其被测样品是RNA。经甲醛或聚乙二醛变性及电泳分离后，转移到固相支持物上，进行杂交反应，以鉴定基中特定mRNA分子的量与大小。该法是研究基因表达常用的方法，可推臬出癌基因的表达程度。 差异杂交（differential hybridization） 是将基因组文库的重组噬菌体DNA转移至硝酸纤维素膜上，用两种混合的不同cDNA探针（如：转移性和非转移性癌组织的mRNA逆转录后的cDNA）分别与滤膜上的DNA杂交，分析两张滤膜上对应位置杂交信息以分离差异表达的基因。适用于基因组不太复杂的真核生物（如酵母）表达基因的比较，假阳性率较低。但对基因组非常复杂的盐酸核生物（如人），则因工作量太大，表达的序列所占百分比较低（仅5％左右），价值不大。
分子生物学常用实验技术
分子生物学常用实验技术 第一章质粒DNA的分离、纯化和鉴定 第二章 DNA酶切及凝胶电泳 第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 第四章 RNA的提取和cDNA合成 第五章重组质粒的连接、转化及筛选 第六章基因组DNA的提取 第七章 RFLP和RAPD技术 第八章聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆 第九章分子杂交技术 第十章测序技术 第一章质粒DNA的分离、纯化和鉴定 第一节概述 把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术,送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。细菌质粒是重组DNA技术中常用的载体。 质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活,而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。 质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有1个或几个质粒分子,如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在20个以上,如Col E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时,细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制,紧密型质粒复制停止,而松驰型质粒继续复制,质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个,此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。 利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在,当两种质粒同时导入同一细胞时,它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争,在一些细胞中,一种质粒占优势,而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后,占少数的质粒将会丢失,因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。 质粒通常含有编码某些酶的基因,其表型包括对抗生素的抗性,产生某些抗生素,降解复杂有机物,产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。 质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列,并去掉了大部分非必需序列,使分子量尽可能减少,以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列,这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检
常用的分子生物学基本技术
常用的分子生物学基本技术?核酸分子杂交技术 ?由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性,它已成为分子生物学中最常用的基本技术,被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（ｐrｏbe),待测核酸序列可以是克隆的基因征段,也可以是未克隆化的基因组DＮA和细胞总RNＡ。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的,能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或ＲNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。? 固相杂交 ?固相杂交（soｌｉd－phase ｈｙbｒｉdizatｉon)是将变性的DNＡ固定于固体基质(硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上,再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。? 斑步杂交(dot hyｂrｉｄizａtｉoｎ）??是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或ＲNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单,事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品,可在同一张膜上同时进行多个样品的检测;根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量,而且特异性较差，有一定比例的假阳性。 印迹杂交(blｏttｉng hybridizatioｎ） ?Southｅrn印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的ＤNA片段，将凝胶上的DＮA变性并在原位将单链ＤNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上,经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显色,检测特定大小分子的含量。可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析(ＲELP)等。 ?Ｎortｈeｒn印迹杂交:由Southeｒm印杂交法演变而来，其被测样品是RNA。经甲醛或聚乙二醛变性及电泳分离后,转移到固相支持物上，进行杂交反应,以鉴定基中特定mRＮＡ分子的量与大小。该法是研究基因表达常用的方法,可推臬出癌基因的表达程度。? 差异杂交(differential hybridｉzatｉon) ?是将基因组文库的重组噬菌体DNA转移至硝酸纤维素膜上,用两种混合的不同ｃDNA探针(如:转移性和非转移性癌组织的mRNＡ逆转录后的ｃDNA)分别与滤膜上的DNA杂交，分析两张滤膜上对应位置杂交信息以分离差异表达的基因。适用于基因组不太复杂的真核生物（如酵母）表达基因的比较，假阳性率较低。但对基因组非常复杂的盐酸核生物(如人),则因工作量太大,表达的序列所占百分比较低（仅5％左右),价值不大。 ?cDＮA微点隈杂交（cDＮＡmiｃroａｒray hybriｄizａtion）? 是指将cDNA克隆或cDNA的ＰCR产物以高度的列阵形式排布并结合于固相支持物上(如:尼龙膜或活化的载玻片)以微点阵,然后用混合的不同DNＡ探针与微点阵上的DNA进行杂交。再利用荧光、化学发光、共聚焦显微镜等技术扫描微点阵上的杂交信息。它比差异杂交技术的效率高、速度快、成本低，适用于大规模的分析。已成商品问世。其缺点是无法克服保守的同源序列及重序对杂交信息的干扰。??寡核苷酸微点隈杂交(oligonucleotｉｄｅmicｒoarraｙhybridizatiｏn)? 是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸,使它共价结合于支持物表面，与平均长度为20-50nt的混合RNA或cDNA探针进行杂交，以提高杂交的特异性和灵敏度。应用共聚焦显微镜可检测跨越三个数量级的杂交信息。适用于低丰度mRNA的检测,以区分基因家族不同成员的差异表达特征，或鉴定同一转录在不同组织和细胞中的选择性剪接。但有工作量较大、
分子生物学常用技术习题
第五章常用分子生物学技术的原理及其应用习题（引自网络精品课程） 一、选择题 （一）A型题 1 ．分子杂交实验不能用于 A ．单链 DNA 与 RNA 分子之间的杂交 B ．双链 DNA 与 RNA 分子之间的杂交 C ．单链 RNA 分子之间的杂交 D ．单链 DNA 分子之间的杂交 E ．抗原与抗体分子之间的杂交 2 ．关于探针叙述错误的是 A ．带有特殊标记 B ．具有特定序列 C ．必须是双链的核酸片段 D ．可以是基因组 DNA 片段 E ．可以是抗体 3 ．下列哪种物质不能用作探针 A ． DNA 片段 B ． cDNA C ．蛋白质 D ．氨基酸 E ． RNA 片段 4 ．印迹技术可以分为 A ． DNA 印迹 B ． RNA 印迹 C ．蛋白质印迹 D ．斑点印迹 E ．以上都对 5 ． PCR 实验延伸温度一般是 A ．90 ℃ B ．72 ℃ C ．80 ℃ D ．95 ℃ E ．60 ℃ 6 ． Western blot 中的探针是 A ． RNA B ．单链 DNA C ． cDNA D ．抗体 E ．双链 DNA 7 ． Northern blotting 与 Southern blotting 不同的是 A ．基本原理不同 B ．无需进行限制性内切酶消化 C ．探针必须是 RNA D ．探针必须是 DNA E ．靠毛细作用进行转移 8 ．可以不经电泳分离而直接点样在 NC 膜上进行杂交分析的是 A ．斑点印迹 B ．原位杂交 C ． RNA 印迹 D ． DNA 芯片技术 E ． DNA 印迹 9 ．下列哪种物质在 PCR 反应中不能作为模板 A ． RNA B ．单链 DNA C ． cDNA D ．蛋白质 E ．双链 DNA 10 ． RT-PCR 中不涉及的是 A ．探针 B ． cDNA C ．逆转录酶 D ． RNA E ． dNTP 11 ．关于 PCR 的基本成分叙述错误的是 A ．特异性引物 B ．耐热性 DNA 聚合酶 C ． dNTP D ．含有 Zn 2+ 的缓冲液 E ．模板 12 ． DNA 链末端合成终止法不需要 A ． ddNTP B ． dNTP C ．引物标记 D ． DNA 聚合酶 E ．模板 13 ． cDNA 文库构建不需要 A ．提取 mRNA B ．限制性内切酶裂解 mRNA C ．逆转录合成 cDNA D ．将 cDNA 克隆入质粒或噬菌体 E ．重组载体转化宿主细胞 14 ．标签蛋白沉淀是 A ．研究蛋白质相互作用的技术 B ．基于亲和色谱原理 C ．常用标签是 GST D ．也可以是 6 组氨酸标签 E ．以上都对 15 ．研究蛋白质与 DNA 在染色质环境下相互作用的技术是 A ．标签蛋白沉淀 B ．酵母双杂交 C ．凝胶迁移变动实验 D ．染色质免疫沉淀法 E ．噬菌体显示筛选系统 16 ．动物整体克隆技术又称为
分子生物学实验常规技术操作
分子生物学实验常规技术操作 目录 1. 质粒提取 1.1 小提质粒 1.2 小量快提质粒鉴定： 1.3 大提质粒： 2. 酶切 2.1 制备型酶切 2.2 小量酶切鉴定 2.3 DNA片段5'突出端的补平 3. 琼脂糖凝胶电泳 4. 回收 4.1 从低熔点琼脂糖凝胶中回收DNA片段 4.2 小量胶回收DNA片段试剂盒操作（见操作手册） 4.3 无水乙醇沉淀回收 5. 连接 5.1 一般连接 5.2 平端动态连接 6. 转化 6.1 质粒快速转化 6.2 连接物转化 7. 制普通固体培养板 8. 涂板 9. 挑菌 10. 血清中病毒核酸的提取(蛋白酶K法) 哺乳动物细胞单克隆株分离 常用溶液、培养基配制
1. 质粒提取： 1.1 小提质粒： 本实验室在常规条件下采用碱裂解法小量提取质粒 (1)从平板上挑取单菌落或摇甘油菌(5～50uL)，接种于3mL LB液体培养基中（加有相 应的抗生素），37℃振荡培养至OD2.0以上，但也无需过浓。 *通常DH5а菌株摇12～14hr;JM101 7～8hr;ER2566 10～12hr * (2)取1.5mL菌液于1.5mLEppendorf管（可取未灭菌的新管）中，12000rpm离心15～30sec， 弃上清。通常可取1.5mL菌液再离心一次，弃去上清后在纸上扣干。 *不要忘记将用完的试管及管盖放入指定处以备回收处理 * (3)加入150uL溶液I，振荡使菌体沉淀充分 ．．悬浮。 *务必悬浮完全 * (4)加入150uL溶液II，立即轻轻翻转几下，使菌体裂解。 *可观察到原浑浊的菌悬液变清变粘 * (5)加入180uL溶液Ⅲ，立即上下颠倒充分混匀7～10次，不宜太剧烈。 *可观察到白色团片状沉淀出现。* (6)置冰浴10分钟，也可置于-20℃中5min。 (7)12000rpm离心8～10分钟。 (8)在离心过程中可取未灭菌的新1.5mLEppendorf管，加入等体积(350～400uL即可)酚- 氯仿-异戊醇（25:24:1）备用；取灭菌过的新1.5mLEppendorf管，加入2倍体积(780uL 即可)的无水乙醇置于-20℃备用。 *加酚-氯仿-异戊醇时要小心，应吸位于下层的酚相，而不要带入上层 的Tris-cl保护液 * (9)离心完将上清迅速倒入已加好的酚-氯仿-异戊醇中, 充分混匀。 *小心不要将白色沉淀物倒入酚-氯仿-异戊醇中 * (10)12000rpm离心4～5分钟。 (11)吸水相，加入已加好的无水乙醇中,颠倒混匀几次。 *小心不要吸入酚相，没把握时宁愿放弃一些水相 * (12)-20℃放置5～15分钟。 (13)12000rpm离心10分钟。 (14)迅速弃上清，沉淀用适量70%乙醇洗一次，于纸上扣干。 *小心不要将沉淀洗掉 * (15)置于恒温器上干燥(55℃)至无色透明或无乙醇气味，一般大约5～10min。 (16)加入30～40uL 1×TE缓冲液溶解沉淀，-20℃储存备用。 *做完实验请及时收拾实验台* 1.2 小量快提质粒鉴定：（目前较少采用） (1)取培养的菌液1mL，12000rpm 离心30s，收集菌体，在纸上扣干残留培养液。 (2)用50uL 无菌水充分悬浮菌体。
微生物常规鉴定的技术
微生物常规鉴定的技术 一、形态结构和培养特性观察 1、微生物的形态结构观察主要是通过染色,在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构(包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等)及染色特性进行观察,直观地了解细菌在形态结构上特性,根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。 2、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落(colony)。不同微生物在某种培养基中生长繁殖,所形成的菌落特征有很大差异,而同一种的细菌在一定条件下,培养特征却有一定稳定性。,以此可以对不同微生物加以区别鉴定。因此,微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。 1)细菌的培养特征包括以下内容:在固体培养基上,观察菌落大小、形态、颜色(色素是水溶性还是脂溶性)、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况(菌膜、环)混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况 2)霉菌酵母菌的培养特征:大多数酵母菌没有丝状体,在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似,只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似,有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体,菌丝粗长,在条件适宜的培养基里,菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色,因而菌落边缘和中心,正面和背面颜色常常不同,如青霉菌:孢子青绿色,气生菌丝无色,基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛状菌落。 二、生理生化试验 微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物,生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。 微生物检验中常用的生化反应有: 1、糖酵解试验 不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异,或能利用或不能利用,能利用者,或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。 试验方法:以无菌操作,用接种针或环移取纯培养物少许,接种于发酵液体培养基管,若为半固体培养基,则用接种针作穿刺接种。接种后,置