3500基因测序仪操作流程

一、启动仪器

1．按下仪器的电源键，当仪器指示灯为绿色时表明仪器正常开启。

2．打开与仪器连接的计算机，点击Ctrl+Alt+Delete界面，点击Administrator，输入密码：Administrator。等待Daemon（隐藏图标），Server Monitor程序完全启动，Server Monitor图标上出现绿色对号时表示连接成功。

3．打开3500 Data Collection 软件，出现3500 Log In 登录界面，输入用户名和密码，本机用户名为：Administrator，密码为：Administrator1，点击“OK”，打开软件。检查所有耗材的剩余用量、仪器的信息、耗材的使用信息以及仪器维护提示灯信息。

4. 确认检测阴性、阳极缓冲液在刻度线以上，以及确认所有耗材已恢复至室温。

注：3500测序所用到的阳极缓冲液、阴极缓冲液在仪器上可存放一周，POP 胶在仪器上存放一周后需置于2-8℃保存，洗液为一次性消耗品，不可重复使用。

5. 将阴性缓冲液、阳极缓冲液、洗液等耗材安装至仪器上后，点击refresh，确认所有耗材均为有效状态。

二、仪器维护

1. 于软件主界面点击Dashbord，于菜单栏中选择Maintenance Wizards选项。

2. 将装有阳极缓冲液的耗材从仪器中取下，安装没有阳极缓冲液的容器，选择WASH pumper chamber and chanels选项，按照仪器指示，开始清洗管路并重新给毛细管灌胶直至完成全部操作。

3. 从Maintenance进入Spatial界面，按图示指示进行空间定位。结果应满足如

下要求：①峰高大致相同（大于6000）；②峰型尖锐，左右堆成；③橙色十字在峰顶端；④峰间距为13-16。当结果满足要求时，选择“Accept Results”，否则，选择“Reject Results”，重新进行空间定位。

4. 从Maintenance进入Spectral界面，按图示指示进行光谱校准。本仪器为8道毛细管，光谱校准品加样的位置为A1-H1，校准结果允许借用周边1道毛细管的结果；光谱校准通过显示绿色，借用信息为黄色箭头，失败为红色。校准成功选择“Accept”，否则，选择“Reject”，重新进行光谱校准。

三、检测运行

1. 测序PCR（以BigDye Terminator v3.1试剂盒为例），标准质粒和样品推荐测序反应体系及反应条件如下：

标准质粒测序反应体系：引物4 μL，Big dye 1 μL，BigDye Seq Buffer 3.5μL，超纯水10.5 μL，模板1 μL。

样品测序反应体系：引物（10 μM）0.5 μL，Big dye 1 μL，BigDye Seq Buffer 3.5μL，超纯水14 μL，模板1 μL。

测序反应条件为：96 ℃ 1 min →(96 ℃10 sec →50 ℃ 5 sec →60 ℃4 min)×25个循环→4 ℃保温

2. 测序产物纯化（以CENTRI-SEP spin-columns纯化柱为例介绍）

①于纯化柱中加入800 μL的无RNase超纯水，颠倒混匀，室温静置30 min。

②上下颠倒除尽气泡，去掉纯化柱底部的盖子，置于2 mL洗脱管中，在将纯化柱上部的盖子打开后，盖上盖子，压入空气，柱中的液体自动流入洗脱管中直至自行终止，最后洗脱管中的液体大约为200-250 μL，弃掉滤液。

③750×g离心2 min去除多余液体，离心完毕后洗脱管中约有300 μL液体。

④将纯化柱转移至1.5 mL的样品收集管中，从柱的斜面上缓缓加入20 μL的PCR测序产物。

⑤ 750×g离心2 min，取滤液备用，静止重复离心。

3. 测序产物加样

①于待检测孔中加入10 μL的Hi-Di甲酰胺后，再次加入10 μL纯化后测序产物，混匀，尽量避免气泡产生，不加样的空中加入10 μL的超纯水。

②于96孔板上安装胶垫，按照顺序组装到自动进样器上。

4. 数据收集软件运行

①点击Start pre-heat预热30 min，POP7和POP4的胶预热到60 ℃，POP6的胶预热到50 ℃，预热后检查detection cell的温度。

②通过Main workflow键进入Set up视窗，选择Define Plate Properties界面建立新的样品反应板，在Name栏输入样品板的名称，板子类型：96孔板，毛细管长度：50 cm，胶以及测序类型根据需要选定。

③输入样本名称，选择相应的Assays，File Name Conventions，Results Groups。

④切换到Load Plates for Run视图，从Recent Plates找到要电泳的反应板，点

击Link Plate（灰色表示反应板连接上，黑色则表示没有连接上），点击Start Run 进行电泳。

⑤切换到Monitor Run 视图，通过Assay，Sample，EPT界面查看样品的电泳

情况；通过Flags Found 界面借助软件可直接判断样品的结果是否满足质量要求，红色旗帜表示不满足质量要求，绿色旗帜表示满足质量要求。

⑥进入Review Results视窗，点击View Fragment/HID Results 查看样品的电泳

结果。如Offscale（峰过高，导致渗透峰产生），Board Peak（宽峰）等要素的图

标为绿色方块，Sizing Quality（内标的质量）为带对号的绿色方块，则表示满足质量要求；如Offscale，Board Peak 的图标为黄色三角形，Sizing Quality为带

X的红色方块，则表示不满足质量要求，可以通过Plot View和Sizing Table View 等界面分别查看样品的电泳图谱和内标的情况。

5. 测序结果分析

①点击sequence analysis V5.4软件，输入用户名DangDongCIQ，输入密码123456，打开软件。

②点击File，选择Add sample，选择所需分析测序文件。

③点击绿色三角形图标进行测序结果分析。测序峰图的荧光信号强度正常范围为1000-3000，且峰间距明显，测序结果质量分数较高，可视为本次测序基本成功。

6. 常见问题及解决措施

（1）信号值太高

①样品浓度过高，应稀释样本浓度，降低进样时间。

②反应体系中DNA加入过量。

（2）无信号值

①测序反应失败。

②毛细管堵塞，重新灌胶。

③毛细管阵列弯曲，应重新更换毛细管阵列。

④毛细管破裂或损坏

（3）低信号值

①甲酰胺降解，更换新的Hi-Di甲酰胺。

②样本量不足，增加DNA的量。

生产工艺流程图及说明

（1）电解本项目电解铝生产采用熔盐电解法：其主要生产设备为预焙阳极电解槽,项目设计采用大面六点进电SY350型预焙阳极电解槽。铝电解生产所需的主要原材料为氧化铝、氟化铝和冰晶石，原料按工艺配料比例加入350KA 预焙阳极电解槽中，通入强大的直流电，在945－955℃温度下，将一定量砂状氧化铝及吸附了电解烟气中氟化物的载氟氧化铝原料溶解于电解质中，通过炭素材料电极导入直流电，使熔融状态的电解质中呈离子状态的冰晶石和氧化铝在两极上发生电化学反应，氧化铝不断分解还原出金属铝——在阴极(电解槽的底部)析出液态的金属铝。电解槽中发生的电化学反应式如下： 2323497094032CO Al C O Al +?-+℃ ℃直流电在阴极(电解槽的底部)析出液态的金属铝定期用真空抬包抽出送往铸造车间经混合炉除渣后由铸造机浇铸成铝锭。电解过程中析出的O 2同阳极炭素发生反应生成以CO 2为主的阳极气体，这些阳极气体与氟化盐水解产生的含氟废气、粉尘等含氟烟气经电解槽顶部的密闭集气罩收集后送到以Al 2O 3为吸附剂的干法净化系统处理，净化后烟气排入大气。被消耗的阳极定期进行更换，并将残极运回生产厂家进行回收处置。吸附了含氟气体的截氟氧化铝返回电解槽进行电解。电解槽是在高温、强磁场条件下连续生产作业，项目设计采用大面六点进电SY350型预焙阳极电解槽，是目前我国较先进的生产设备。电解槽为6点下料，交叉工作，整个工艺过程均自动控制。电解槽阳极作业均由电解多功能机组完成。多功能机组的主要功能为更换阳极、吊运出铝抬包出铝、定期提升阳极母线、打壳加覆盖料等其它作业。（2）氧化铝及氟化盐贮运供料系统氧化铝及氟化盐贮运系统的主要任务是贮存由外购到厂的氧化铝和氟化盐，并按需要及时将其送到电解车间的电解槽上料箱内。

全基因组关联分析的原理和方法

全基因组关联分析(Genome-wide association study;GWAS)是应用基因组中数以百万计的单核苷酸多态性(single nucleotide ploymorphism ，SNP)为分子遗传标记，进行全基因组水平上的对照分析或相关性分析，通过比较发现影响复杂性状的基因变异的一种新策略。随着基因组学研究以及基因芯片技术的发展，人们已通过GWAS方法发现并鉴定了大量与复杂性状相关联的遗传变异。近年来，这种方法在农业动物重要经济性状主效基因的筛查和鉴定中得到了应用。全基因组关联方法首先在人类医学领域的研究中得到了极大的重视和应用，尤其是其在复杂疾病研究领域中的应用，使许多重要的复杂疾病的研究取得了突破性进展，因而，全基因组关联分析研究方法的设计原理得到重视。人类的疾病分为单基因疾病和复杂性疾病。单基因疾病是指由于单个基因的突变导致的疾病，通过家系连锁分析的定位克隆方法，人们已发现了囊性纤维化、亨廷顿病等大量单基因疾病的致病基因，这些单基因的突变改变了相应的编码蛋白氨基酸序列或者产量，从而产生了符合孟德尔遗传方式的疾病表型。复杂性疾病是指由于遗传和环境因素的共同作用引起的疾病。目前已经鉴定出的与人类复杂性疾病相关联的SNP位点有439 个。全基因组关联分析技术的重大革新及其应用，极大地推动了基因组医学的发展。(2005年, Science 杂志首次报道了年龄相关性视网膜黄斑变性GWAS结果,在医学界和遗传学界引起了极大的轰动, 此后一系列GWAS陆续展开。2006 年, 波士顿大学医学院联合哈佛大学等多个研究机构报道了基于佛明翰心脏研究样本关于肥胖的GWAS结果(Herbert 等. 2006);2007 年, Saxena 等多个研究组联合报道了与2 型糖尿病( T2D ) 关联的多个位点, Samani 等则发表了冠心病GWAS结果( Samani 等. 2007); 2008 年, Barrett 等通过GWAS发现了30 个与克罗恩病( Crohns ' disrease) 相关的易感位点; 2009 年, W e is s 等通过GWAS发现了与具有高度遗传性的神经发育疾病——自闭症关联的染色体区域。我国学者则通过对12 000 多名汉族系统性红斑狼疮患者以及健康对照者的GWAS发现了5 个红斑狼疮易感基因, 并确定了4 个新的易感位点( Han 等. 2009) 。截至2009 年10 月, 已经陆续报道了关于人类身高、体重、血压等主要性状, 以及视网膜黄斑、乳腺癌、前列腺癌、白血病、冠心病、肥胖症、糖尿病、精神分裂症、风湿性关节炎等几十种威胁人类健康的常见疾病的GWAS结果, 累计发表了近万篇论文, 确定了一系列疾病发病的致病基因、相关基因、易感区域和SNP变异。) 标记基因的选择： 1)Hap Map是展示人类常见遗传变异的一个图谱, 第1 阶段完成后提供了 4 个人类种族[ Yoruban ,Northern and Western European , and Asian ( Chinese and Japanese) ] 共269 个个体基因组, 超过100 万个SNP( 约1

全基因组重测序数据分析

全基因组重测序数据分析 1. 简介(Introduction) 通过高通量测序识别发现de novo的somatic和germ line 突变，结构变异-SNV，包括重排突变（deletioin, duplication 以及copy number variation）以及SNP的座位；针对重排突变和SNP的功能性进行综合分析；我们将分析基因功能（包括miRNA），重组率（Recombination）情况，杂合性缺失（LOH）以及进化选择与mutation之间的关系；以及这些关系将怎样使得在disease（cancer）genome中的mutation产生对应的易感机制和功能。我们将在基因组学以及比较基因组学，群体遗传学综合层面上深入探索疾病基因组和癌症基因组。实验设计与样本（1）Case-Control 对照组设计；（2）家庭成员组设计：父母-子女组（4人、3人组或多人）；初级数据分析 1．数据量产出：总碱基数量、Total Mapping Reads、Uniquely Mapping Reads统计，测序深度分析。 2．一致性序列组装：与参考基因组序列（Reference genome sequence）的比对分析，利用贝叶斯统计模型检测出每个碱基位点的最大可能性基因型，并组装出该个体基因组的一致序列。3．SNP检测及在基因组中的分布：提取全基因组中所有多态性位点，结合质量值、测序深度、重复性等因素作进一步的过滤筛选，最终得到可信度高的SNP数据集。并根据参考基因组信息对检测到的变异进行注释。 4．InDel检测及在基因组的分布: 在进行mapping的过程中，进行容gap的比对并检测可信的short InDel。在检测过程中，gap的长度为1~5个碱基。对于每个InDel的检测，至少需要3个Paired-End序列的支持。 5．Structure Variation检测及在基因组中的分布: 能够检测到的结构变异类型主要有：插入、缺失、复制、倒位、易位等。根据测序个体序列与参考基因组序列比对分析结果，检测全基因组水平的结构变异并对检测到的变异进行注释。

全基因组从头测序(de novo测序)

全基因组从头测序(de novo测序) https://www.360docs.net/doc/2119078301.html,/view/351686f19e3143323968936a.html 从头测序即de novo 测序，不需要任何参考序列资料即可对某个物种进行测序，用生物信息学分析方法进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。利用全基因组从头测序技术，可以获得动物、植物、细菌、真菌的全基因组序列，从而推进该物种的研究。一个物种基因组序列图谱的完成，意味着这个物种学科和产业的新开端！这也将带动这个物种下游一系列研究的开展。全基因组序列图谱完成后，可以构建该物种的基因组数据库，为该物种的后基因组学研究搭建一个高效的平台；为后续的基因挖掘、功能验证提供DNA序列信息。华大科技利用新一代高通量测序技术，可以高效、低成本地完成所有物种的基因组序列图谱。包括研究内容、案例、技术流程、技术参数等，摘自深圳华大科技网站 https://www.360docs.net/doc/2119078301.html,/service-solutions/ngs/genomics/de-novo-sequencing/ 技术优势: 高通量测序：效率高，成本低；高深度测序：准确率高；全球领先的基因组组装软件：采用华大基因研究院自主研发的SOAPdenovo软件；经验丰富：华大科技已经成功完成上百个物种的全基因组从头测序。研究内容: 基因组组装■K-mer分析以及基因组大小估计；■基因组杂合模拟（出现杂合时使用）； ■初步组装；■GC-Depth分布分析；■测序深度分析。基因组注释■Repeat注释； ■基因预测；■基因功能注释；■ ncRNA 注释。动植物进化分析■基因家族鉴定（动物TreeFam；植物OrthoMCL）；■物种系统发育树构建； ■物种分歧时间估算（需要标定时间信息）；■基因组共线性分析； ■全基因组复制分析（动物WGAC；植物WGD）。微生物高级分析 ■基因组圈图；■共线性分析；■基因家族分析； ■CRISPR预测；■基因岛预测（毒力岛）； ■前噬菌体预测；■分泌蛋白预测。熊猫基因组图谱Nature. 2010.463:311-317. 案例描述大熊猫有21对染色体，基因组大小2.4 Gb，重复序列含量36%，基因2万多个。熊猫基因组图谱是世界上第一个完全采用新一代测序技术完成的基因组图谱，样品取自北京奥运会吉祥物大熊猫“晶晶”。部分研究成果测序分析结果表明，大熊猫不喜欢吃肉主要是因为T1R1基因失活，无法感觉到肉的鲜味。大熊猫基因组仍然具备很高的杂合率，从而推断具有较高的遗传多态性，不会濒于灭绝。研究人员全面掌握了大熊猫的基因资源，对其在分子水平上的保护具有重要意义。黄瓜基因组图谱黄三文, 李瑞强, 王俊等. Nature Genetics. 2009. 案例描述国际黄瓜基因组计划是由中国农业科学院蔬菜花卉研究所于2007年初发起并组织，并由深圳华大基因研究院承担基因组测序和组装等技术工作。部分研究成果黄瓜基因组是世界上第一个蔬菜作物的基因组图谱。该项目首次将传

工艺流程及优势介绍

云南意构建筑装饰工程有限公司企业简介 2012年12月

第一部分、企业简介云南意构建筑装饰工程有限公司成立于2005年7月，注册资金1000万元整，持有铝合金门窗施工壹级、装饰装修施工壹级、幕墙施工贰级、钢结构施工贰级资质。公司拥有两条意大利进口飞幕设备、两条国产金皇宇设备，年产铝合金门窗40万平米，为承接各类大型工程奠定了坚实的基础。随着产业的发展，公司积极学习国内优秀同行业的工艺流程，通过几年的学习积累，我们已熟练掌握了优质门窗的加工工艺。近年来已承接了南亚风情第壹城、星耀水乡、中航云玺大宅、汇都中心二期、长丰星云园等大型铝合金门窗工程，并在施工过程中及售后维修过程中得到了业主方一致好评。

第二部分、施工工艺我公司常年从事铝合金门窗工程施工，对铝合金门窗严格执行以下施工工艺流程，一、加工工艺流程基体表面清理→放样→开料→下料→钻铣→组件拼装→成品检验→包装→出厂二、安装工艺流程放线→铝合金外框安装→框底填充发泡剂→固定玻璃安装→窗扇的定位及安装→五金件安装→拆除保护膜→框与墙体的防水处理→调试→清洁卫生→交验三、铝合金门窗制作的关键工艺部分 1、下料：我公司拥有目前行业内最先进的意大利飞幕下料设备，保证了铝合金型材下料尺寸的精度。 2、组角：我公司在组角工艺上采用平整钢片，这样做的好处能让45度对角处理的平整。组角前打胶防渗漏，三元乙丙胶条采用四角无缝烫接。 3、打胶：我公司有固定的人员负责打胶，长时间从事单一工作，确保了打胶的品质。 4、密封处理：因铝合金门窗是由杆件组装而成，有接缝就存在渗漏隐患，我公司专人负责质量，严格把关杜绝了隐患发生。确保工程质量。在胶条的街头处我公司采取烫接，确保了铝合金门窗的密封。 5、现场安装的横平竖直：公司培养了大批专业从事铝合金门窗安装

DNA测序标准实验流程(V1.3版)

DNA测序标准实验流程（V1.2版）1．对DNA的要求纯度：OD 260 / OD 280 = 1.6 ~ 2.0， PCR产物用量：每反应15 -20ng（片段大于3KB可加两倍DNA）。质粒DNA用量：每反应20 -25ng（插入片段大于3KB质粒要加两倍DNA）。 1300载体本身序列就比较长，我们建议每反应加50-80ng。每个小组一次配100份BD MIX(BD 0.4ul,5*buffer 1.8ul,water 2.8ul)长期保存，每个反应体系加5ul 2．P CR产物的测序PCR反应（测序PCR反应中只要加一个引物就可以，需要加热盖）标准反应体系： 10ul体系试剂用量纯化的P CR产物(15-20 ng / μL) 1 μL （片段大于3KB可加两倍DNA）引物(2 pmol / μL) 1 μL BigDye (2.5 x) 0.4 μL BigDye Seq Buffer (5 x) 1.8μL 灭菌去离子水 5.8μL 96 °C 1 min → (96 °C 10 sec → 50 °C 5 sec → 60 °C 2 min) x 25个循环→ 4 °C保温质粒DNA的测序PCR反应标准反应体系： 10ul体系试剂用量质粒DNA (20-25 ng / μL) 1 μL （插入片段大于3KB质粒要加两倍DNA）引物(2 pmol / μL) 1 μL BigDye (2.5 x) 0.4 μL BigDye Seq Buffer (5 x) 1.8 μL 灭菌去离子水 5.8 μL 96 °C 1 min → (96 °C 10 sec → 50 °C 5 sec → 60 °C 2 min) x 25个循环→ 4 °C保温注意：BigDye (2.5 x)是一种含有DNA聚合酶和荧光物质的混合物，非常昂贵，平时都放在-20度保存。加之前拿出来放在冰上融化，用完马上放回-20冰箱。BigDye (2.5 x)和BigDye Seq Buffer (5 x)可以混合后一起加到反应体系，有多的话可以放在-20冰箱，下次还能使用。 BIGDYE尽量避光，一般用铝珀纸遮盖。P CR样品处理过程中如在室温放置和酒精挥发阶段都尽量用铝珀纸遮盖或者放入抽屉，有利于样品的稳定性。 3．测序产物纯化单个0.2 mL离心管离心方法： 1. 每孔加入1μL 7.5M NH3Ac，26μL 100%酒精，盖好，震荡4次。（酒精和NH3Ac先混合好，而且要比样品数多预算几个） 2. 台式离心机12000 x g 4°C离心20 min，马上用枪吸尽上清液。(DNA很微量，基本看不到，所以枪头不要碰到DNA沉积处) 3. 每孔加入100μL 75% 酒精，12000 x g 4°C离心10 min，马上用枪吸尽上清液。（如果不是马上操作，DNA沉淀很可能浮起，被吸走，所以如果没有及时吸去上清的话，要重新离心5MINS。） 4. 让酒精在室温避光（抽屉）挥发干净(至少20mins)，加入10 μL Hi-Di Formamide溶解DNA。 5. 在PCR仪上变性：95 °C 4 min，4 °C 4 min。上机测序。 96孔板整板离心方法： 1. 每孔加入1μL 7.5M NH3Ac，26μL 100%酒精，盖好，震荡4次。（酒精和NH3Ac先混合好，而且要比样品数多预算几个） 2. 板式离心机4000 x rpm 4°C离心30min；马上倒置96孔板，弃上清，倒置在洗水纸上，离心500rpm，1mins。 3. 加100μL 75% 酒精，4000 rpm 4°C离心20 min；马上倒置96孔板，弃上清，离心500rpm,1mins。 4.让酒精在室温避光（抽屉）挥发干净（至少15mins），加入10 μL Hi-Di For mamide溶解DNA。 5. 在PCR仪上变性：95 °C 4 min，4 °C 4 min。上机测序。 4. 部分相关试剂酒精：100%酒精使用国产分析纯；75%酒精用去离子水配制。 BigDye (2.5 x) -20度保存 BigDye Seq Buffer (5 x) 4度保存 7.5M NH3Ac 4度保存 Hi-Di For mamide -20度保存黄方亮 2009.10.27日整理

工艺流程及其描述

xx 有限公司沙棘籽油软胶囊生产工艺流程图及其说明生产工艺流程图注：※号为CCP 点表示洁净区表示普通工序表示洁净加工工序

生产工艺流程描述 2.1原料的采购采购计划初步拟定：由销售部根据市场需要和产品库存制定生产计划，并确认原辅料库存，若原辅料库存数量不能满足生产需要时，应及时通知采购人员进行采购。 2.2原料验收：库管员及时通知质量部取样，质量部依据《原辅料检验标准》进行检测，库管员凭质量部出具的检验报告单，办理入库手续，不合格则通知采购员作退货处理。 2.3组织生产： 2.3.1由销售部向质量部下达《生产、包装指令》，质量部根据产品工艺配方向生产部下达《生产指令》，由生产工艺员再次确认工艺配方，然后向生产各工序下达分解指令。 2.3.2混料：工序接到生产指令后，根据指令领取物料，在进入洁净区前进行脱包灭菌（用紫外灯或臭氧发生器进行灭菌），称量放入乳化罐混匀，乳化好后用200目的筛网过滤，将其中可能存在的杂质过滤清除，混好料液贮存于料液罐中置于药液区存放待生产。 2.3.3溶胶：溶胶工序操作人员接到指令领取明胶、甘油等，首先在进入洁净区前进行脱包灭菌，灭菌后按工艺要求将明胶、甘油、纯化水按比例称量入罐溶胶，溶好的胶液抽真空后对其黏度检测（2-4OE）放胶。放胶时要用120目的筛网过滤将其中可能存在的杂质滤除，在溶胶过程中因溶胶温度在76℃-80℃，此温度足可以杀死原料中可能存在的细菌。将溶好的胶液放置在胶罐中保温静置待用。 2.3.4压丸：压丸工序根据指令选择模具，安装调试后，把混好的料液和备好的胶液进行上机操作，上机时要注意胶皮的厚度、内容物的装量等，同时要随时监视胶丸的丸形、装量，防止胶丸漏夜。 2.3.5 定型干燥：胶囊压丸后进入转笼内经过一定时间风吹干燥，失去部分水分，使胶丸定形，定形时间：≥3小时，转笼转速：40-50r/min。 2.3.6排盘干燥：将在干燥笼中初步干燥后的软胶囊，放在一定尺寸的干燥盘上使其分布均匀，再在风室中通过一定的温度、湿度，进行干燥，使软胶囊的水分达到要求（胶皮水分≤14%）。风室温度：20-27℃、相对湿度：≤50% 2.3.7选丸：干燥后的软胶囊对其外观进行挑选，将有缺陷的胶囊剔除，同时将其表面可能存在的杂质去除。 2.3.8抛光：擦去胶丸表面的油脂，使胶丸表面光滑有光泽。 2.3.9上工序处理好的软胶囊质量部对其进行取样检测，若合格交下工序包装；不合格交上工序处理。（微生物不合格由上工序用酒精清洗，清洗后由质量部重

人类全基因组测序

1 技术优势全基因组测序（Whole Genome Sequencing，WGS）是利用高通量测序平台对人类不同个体或群体进行全基因组测序，并在个体或群体水平上进行生物信息分析。可全面挖掘DNA 水平的遗传变异，为筛选疾病的致病及易感基因，研究发病及遗传机制提供重要信息。全基因组测序平台优势 HiSeq X 测序平台读长：PE150 通量：1.8T/run 测序周期：3 天专为人全基因组测序准备、测序周期短、通量高

生物信息分析技术路线技术参数样品要求样本类型：DNA 样品样本总量：≥1.0 μg DNA (提取自新鲜及冻存样本) ≥1.5 μg DNA (提取自FFPE 样本)样品浓度：≥ 20 ng/μl 测序平台及策略HiSeq X PE150 测序深度肿瘤：癌组织(50X),癌旁组织/血液样本(30X)遗传病：30~50 X 项目周期37天

3 案例解析该研究选取3个家系中6个患者和1个正常个体，首先使用基因芯片寻找纯合突变位点，然后对其中无亲缘关系的2例患者采用全基因组测序研究，在2例患者非编码区域均发现相同的变异，10号染色体PTF1A 末端发生一个点突变（chr10：23508437 A>G），且变异在患病人群和细胞试验中均得到了验证。研究解释了生长发育启动子隐性变异是罕见孟德尔遗传病的常见致病原因，同时说明许多疾病的致病突变也可能位于非编码区。图1 检出的变异信息智力障碍是影响新生儿心智发育的一类疾病。这项研究选取50个经过基因芯片和全外显子测序未确诊致病因子的trio 家系，全基因组测序检出84个de novo SNVs 和8个de novo CNVs，及一些结构变异（如VPS13B、STAG1、IQSEC2-TENM3），检出率为42%。揭示编码区的de novo SNVs 和de novo CNVs 是导致智力障碍的主要因素，全基因组测序可以作为可靠的遗传性检测应用工具。案例一单基因病研究——全基因组测序鉴定PTF1A末端增强子常染色体隐性突变导致胰腺发育不全[1] 案例二复杂疾病研究——全基因组测序解析智力障碍的主要致病因素[2] 图2 PTF1A 的家系图谱

基因组重测序分析流程-代码文件

差异位点分析流程步骤分解数据准备： mkdir 1.QC cd 1.QC ln -s /root/mdna-data/reseq/1.QC/*.fastq . Ls cd .. mkdir 2.mapping cd 2.mapping ln -s /root/mdna-data/reseq/2.mapping/ref.fasta . 步骤1：参考基因建索引 cd 2.mapping ##bwa建索引： bwa index ref.fasta Expected Result：得到一系列BWA 进行alignment 需要的文件。 ##samtools建索引： samtools faidx ref.fasta Expected Result：生成refgene.fasta.fai。每行都是fasta 文件中每条contig 的record，每条record 由contig name, size, location, basesPerLine 和bytesPerLine 组成。 ##生成字典： java -jar /root/mdna_software/picard-tools-1.102/CreateSequenceDictionary.jar R=ref.fasta O=ref.dict Expected Result：生成refgene.dict。描述fasta 文件内容，类似SAM header 格式。步骤2：bwa比对 ##用bwa作比对： nohup bwa aln -e 3 -i 10 -t 1 -R 100 -q 20 ref.fasta ../1.QC/test_trim1.fastq -f 1.sai & nohup bwa aln -e 3 -i 10 -t 1 -R 100 -q 20 ref.fasta ../1.QC/test_trim2.fastq -f 2.sai & nohup bwa aln -e 3 -i 10 -t 1 -R 100 -q 20 ref.fasta ../1.QC/test_trim_unpaired.fastq -f s.sai & jobs

三代基因组测序技术原理(简介)

三代基因组测序技术原理简介【写在前面的话】：首先，这一篇博文中的内容并非原创，而是对多篇文献中内容的直接摘录，有些图片和资料还来自身边的同事（在此深表谢意！），再夹杂自己的零星想法，写在这里分享与大家，同时也是为了方便自己日后若有需要能够方便获得，文章比较长。摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。图1：测序技术的发展历程生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。第一代测序技术第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。这个网址为sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。

基因组DNA测序文库构建

基因组DNA测序文库构建 1.对收到的DNA样品进行检测，取2-3ul样品，用1%的琼脂糖胶检测，对于纯度不够（含 RNA或蛋白）的DNA样品需要柱纯化后重新检测。对于细菌基因组需要扩增16S全长序列，进行验证。对于噬菌体或者质粒样品，若用16S全长引物扩增，无目的条带则无细菌基因组污染，若出现目的条带则存在污染，需要去除后建库。 2.用Qubit检测DNA样品浓度。 3.吸取部分DNA样品，用TE或Elution Buffer稀释，终浓度在10ng/ul-30ng/ul之间，体积为130ul。用Covaris破碎，破碎时请根据需要片段大小，按标准操作流程操作。 4.样品足够多的情况下，可以取适量破碎后的产物进行PAGE胶或者琼脂糖胶检测。 5.对破碎后的产物进行柱式法（5倍体积的B3+100-200ul异丙醇）浓缩回收，加入50-100ul TE或Elution Buffer洗脱。回收产物用Qubit测值。 6.修平和磷酸化 100ul体系

DNA 1ug 5 X T4 polymerase buffer 20ul BSA (5mg/ml) 2ul ATP (100mm) 1ul dNTP（10mm）10ul T4 DNA Polymerase (5U/ul) 1ul Klenow（10U/ul）1ul T4 PNK (10U/ ul) 1.5ul 22°C反应20min，柱式法纯化,50-100ul TE洗脱。纯化后Qubit测值。 7.加‘A’ 100ul体系 DNA 0.5-2.5ug 10 X klenow buffer 10ul dATP(10mm) 1-3ul Klenow(exon-)（5U/ul）1-3ul 37°反应20min，柱式法纯化，50-100ul TE洗脱。纯化后Qubit测值。 8.连接头 200ul体系 10 X T4 DNA ligase buffer 20ul PEG4000 30ul ATP(100mm) 2ul DNA X 接头 Y T4 DNA ligase 1.5-2ul 加水至 200ul DNA与接头的摩尔比约在1:3至1:10之间。 9.连接产物用柱式法纯化后，跑琼脂糖胶切割目的区域回收。 10.PCR扩增 10 X TagE buffer 5ul Mg2+ 4ul dNTP(10mm) 1ul lib-PCR-F 0.5ul

项目介绍及工艺流程

项目介绍及生产工艺流程 1电站简介本电站规划总量50MWp，一次建成，共设置50个光伏发电单元，每个光伏发电单元产生直流电源通过一组逆变器（2台）及一台箱式变压器逆变升压至一回35kV集电线路，50个光伏发电单元通过5回35kV集电线路汇集到1回35kV母线上，经主变压器（1台）升压至110kV，再以一回110kV线路并网。（1）项目名称：中电投沧州渤海新区50兆瓦光伏电站项目。（2）项目性质：该工程属光伏发电新建项目。（3）建设规模：光伏发电，装机容量50MWp。 2生产工艺系统 2.1光伏发电工艺简介太阳能通过光伏组件转化为直流电能，再通过并网型逆变器将直流电能转化为与电网同频率、同相位的正弦波交流电，经箱式变压器升压至35kV后经集电线路汇入变电站35kV母线，再经主变升压至110kV后,由1回110kV线路T接至徐郭Ⅲ线（徐庄站-郭庄站）。光伏发电工艺流程示意图如下：

2.2光伏发电单元光伏发电单元包括太阳能电池组件至箱式变压器之间的所有电气设备，其中主要由太阳能电池组件、直流汇流箱、（直、交流）电缆、逆变器、升压变压器及相应的配电监控单元等组成。每1MW为一个光伏发电单元，每个光伏发电单元由4280块245W多晶硅组件构成，容量1048.6kWp，整个光伏电站有50个上述单元组成。 2.2.1光伏组件该工程选用多晶硅太阳能电池组件。技术参数见下表所示。表2-1 光伏组件技术性能一览表

2.2.2光伏阵列的设置本工程光伏阵列采用固定式安装方式，基础采用 250mmx250mm预制钢筋混凝土方桩，固定式支架朝正南方向放置，光伏组件的倾角为33°。（1）光伏电池组件阵列间距本工程每个光伏阵列由40块组件构成，每个阵列长20180mm，宽2684mm。阵列东西向间距为220mm，每2个阵列间设置820mm 宽通道，阵列南北向间距5.2m。一个完整的光伏发电单元由107个上述阵列组成。（2）太阳能光伏电池组件串、并联每个光伏发电单元由214串组串（每20块组件组成1个光伏组串组成），容量为1048.6kWp；每个光伏发电单元配备14个汇流箱

二代测序流程

Illumina测序的化学原理目前我们接触到的很多生物信息学的技术，都是基于NGS技术的，比如RNA-Seq，ChIP-Seq，FAIRE-Seq，ChIA-PET，Hi-C等等。所谓的NGS就是Next Generation Sequencing，翻译为“下一代测序技术”，或者是“第二代测序技术”。之所以这么叫，是因为相比较于第一代测序技术其测序通量有了很大的提升一些常用的基本概念介绍： flowcell：是指Illumina测序时，测序反应发生的位置，1个flowcell含有8条lane lane：每一个flowcell上都有8条泳道，用于测序反应，可以添加试剂，洗脱等等tail：每一次测序荧光扫描的最小单位 reads：指测序的结果，1条序列一般称为1条reads bp：base pair 碱基对，用于衡量序列长度双端测序：是指一条序列可能比较长，如500bp，我们可以两端各测150bp junction：在进行双端测序时，中间会留有200bp测不到的东西，我们称其为junction adapter：就是在测序时需要的一段特定的序列，有类似于引物的功能 primer：PCR中的引物测序反应基本流程介绍： 1、建库 A、将基因组DNA用超声波打断（由于Illumina测序策略本身的问题，导致其测序长度不可能太长，目前最好的X Ten测序仪也就只能双端各测150bp，所以不可能直接拿整个基因组去测序，因此在测序的时候就需要先将其打断成一定长度的片段，这个根据需要使用不同的策略，一般测人的基因组，我们是先将其打断成300-500bp长度的片段，这个是根据跑胶控制的） B、打断以后会出现末端不平整的情况，用酶补平，所以现在的序列是平末端 C、完成补平以后，在3'端使用酶加上一个特异的碱基A D、加上A之后就可以利用互补配对的原则，添加adapter，这个adpater可以分成两个部分，一部分是测序的时候需要使用的引物序列，另一部分是建库扩增时候需要用到的引物序列 E、进行PCR扩增，使得DNA样品浓度能够满足上机要求建库示意图如下：

一代测序规范操作规范

P C R产物测序实验操作流程一、实验试剂和耗材准备（一）实验试剂（二）、实验耗材

二、实验仪器三、实验操作具体步骤（一）核酸的提取按照DNA或RNA提取试剂盒操作（具体操作步骤参考试剂盒操作说明书），如是RNA需进一步反转录为cDNA。-20℃保存备用。（二）测序PCR模板的制备（1）、预先制备适量冰（2）、在冰上融化模板DNA、引物以及Extender PCR-to-Gel Master Mix （3）、按照以下反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上（4）将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序 95℃5min→

（95℃ 30sec，67℃ 30sec -0.5 ℃/循环，72℃ 1min）x14循环→ （95℃ 30sec，57℃ 30sec，72℃ 1min）x 30循环→ 72℃ 7min→4℃ Forever （5）琼脂糖凝胶电泳检测:量取适量1×TBE缓冲液并称取一定量琼脂粉溶于其中制成1%-2%的琼脂糖凝胶，在微波炉上加热溶化，待温度降至60℃-70℃左右加入荧光染料，温度降至40℃-50℃左右将琼脂粉溶液倒入插有梳子的凝胶槽中冷却，待凝胶完全凝固备用。将凝胶置于水平电泳槽中，取少量PCR产物上样电泳，将电泳好的样品置于凝胶成像系统中进行检测和分析。（6）将检测合格的PCR产物用酶解法进行纯化。根据核酸外切酶I (Exo I)，碱性磷酸酶(AIP)的作用浓度，加入到PCR反应产物中，37℃消化15min，85℃使酶失活15min。纯化体系如下：（三）、纯化后的PCR产物的测序反应 1、纯化后的PCR产物按照1:3~1:6稀释（若琼脂糖凝胶电泳条带非常亮，可以适当增大稀释倍数） 2、测序反应用引物稀释到1μM （1）PCR产物测序反应体系（10μl）： PCR产物测序体系中PCR产物的加入量如下表： DNA纯度：OD260/OD280=1.6~1.8；DNA含量（ng/μl）=OD260×50

机械加工工艺流程描述

机械加工工艺流程详解 1.机械加工工艺流程机械加工工艺规程是规定零件机械加工工艺过程和操作方法等的工艺文件之一，它是在具体的生产条件下，把较为合理的工艺过程和操作方法，按照规定的形式书写成工艺文件，经审批后用来指导生产。机械加工工艺规程一般包括以下内容：工件加工的工艺路线、各工序的具体内容及所用的设备和工艺装备、工件的检验项目及检验方法、切削用量、时间定额等。 1.1 机械加工艺规程的作用 (1)是指导生产的重要技术文件工艺规程是依据工艺学原理和工艺试验，经过生产验证而确定的，是科学技术和生产经验的结晶。所以，它是获得合格产品的技术保证，是指导企业生产活动的重要文件。正因为这样，在生产中必须遵守工艺规程，否则常常会引起产品质量的严重下降，生产率显著降低，甚至造成废品。但是，工艺规程也不是固定不变的，工艺人员应总结工人的革新创造，可以根据生产实际情况，及时地汲取国内外的先进工艺技术，对现行

工艺不断地进行改进和完善，但必须要有严格的审批手续。 (2)是生产组织和生产准备工作的依据生产计划的制订，产品投产前原材料和毛坯的供应、工艺装备的设计、制造与采购、机床负荷的调整、作业计划的编排、劳动力的组织、工时定额的制订以及成本的核算等，都是以工艺规程作为基本依据的。 (3)是新建和扩建工厂（车间）的技术依据在新建和扩建工厂（车间）时，生产所需要的机床和其它设备的种类、数量和规格，车间的面积、机床的布置、生产工人的工种、技术等级及数量、辅助部门的安排等都是以工艺规程为基础，根据生产类型来确定。除此以外，先进的工艺规程也起着推广和交流先进经验的作用，典型工艺规程可指导同类产品的生产。 1.2 机械加工工艺规程制订的原则工艺规程制订的原则是优质、高产和低成本，即在保证产品质量的前提下，争取最好的经济效益。在具体制定时，还应注意下列问题： 1)技术上的先进性在制订工艺规程时，要了解国内外本行业工艺技术的发展，通过必要的工艺

微生物基因组denovo测序分析流程

#流程大放送#微生物基因组Denovo测序分析知因无限一介绍微生物基因组De novo测序分析也叫微生物基因组从头测序分析，指不依赖于任何参考序列信息就可对某个微生物进行分析的测序分析技术，用生物信息学的方法进行序列拼接获得该物种的基因组序列图谱，然后进行注释等后续一系列的分析。微生物Denovo基因组测序及分析技术可以应用于医药卫生等领域。二技术应用领域 1、基因组图谱的系统性构建例子：过去几个月，肠病毒D68令数百名美国儿童患病。华盛顿大学的研究人员测序和分析了肠病毒D68（EV-D68）的基因组，这一成果将发表在新一期的Emerging Infectious Diseases杂志上。（Genome Sequence of Enterovirus D68 from St. Louis, Missouri, USA）肠病毒D68（EV-D68）能在儿童中引起严重的呼吸道疾病。其基因组序列可以“帮助人们开发更好的诊断测试，”共同作者Gregory Storch说。“有助于解释病毒感染为什么会造成严重的疾病，以及EV-D68为什么比过去传播得更广。”（来自于生物通的报道） 2、微生物致病性和耐药性位点检测及相关基因功能研究例子：根据分泌蛋白、毒力因子、致病岛、必需基因等结果去探讨所测物种致病性和耐药性。 3、微生物的比较基因组分析，确定各个近缘微生物中的系统发育关系二基本分析流程图

三可能的结果展示图示例图1 微生物基因组的功能注释

示例图2 微生物基因组的系统进化关系注：以上图片和文字来自参考文献21。六参考文献 [1] Hong-Bin Shen, and Kuo-Chen Chou, "Virus-mPLoc: a fusion classifier for viral protein subcellular location prediction by incorporating multiple sites", Journal of Biomolecular Structure & Dynamics, 2010, 28: 175-86. [2]Hong-Bin Shen and Kuo-Chen Chou, "Virus-PLoc: A fusion classifier for predicting the subcellular localization of viral proteins within host and virus-infected cells.", Biopolymers. 2007, 85, 233-240. [3] Ren Zhang and Yan Lin, (2009) DEG 5.0, a database of essential genes in both prokaryotes and eukaryotes. Nucleic Acids Research 37, D455-D458. [4] The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats. BMC Bioinformatics. 2007 May 23;8(1):172. [5] The Pfam protein families database: M. Punta, P.C. Coggill, R.Y. Eberhardt, J. Mistry, J. Tate, C. Boursnell, N. Pang, K. Forslund, G. Ceric, J. Clements, A. Heger, L. Holm, E.L.L. Sonnhammer, S.R. Eddy, A. Bateman, R. D. Finn Nucleic Acids Research (2014) Database Issue 42:D222-D230. [6] Clustal W and Clustal X version 2.0.(2007 Nov 01) Bioinformatics (Oxford, England) 23 (21) :2947-8.PMID: 17846036. [7] Felsenstein, J. 2004. PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3.6. Distributed by the author. Department of Genome Sciences, University of Washington, Seattle. [8] Li et al (2010). De novo assembly of human genomes with massively parallel short read

Sanger测序流程

Sanger测序一、原理 Sanger法测序是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G 结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA 碱基序列。 ABI 3730XL测序仪是高质量的长片段读取和序列分析的测序平台，应用灵活而广泛，可同时分析96个样品。该仪器采用4色荧光同时检测，可不间断24小时运行，自动灌胶，上样，电泳分离，检测及数据分析。二、技术路线三、操作流程 1、DNA的提取一般采用试剂盒提取（参考试剂盒提供的protocol）。 2、PCR扩增与电泳 ①配置PCR体系（25ul体系） DNA浓度大于30ng/ul（DNA浓度需要测定）: 试剂名称用量 H2O15.2μl 10*PCR buffer 2.5μl 2.5Mm dNTPs3μl primer（前后引物各1ul）2μl LA Taq酶0.3μl DNA模板2μl 注意: 对于CEBPA和NOTCH1此类GC含量高的将10*PCR buffer 2.5ul换为2*GC buffer 12.5ul, H2O 为5.2ul。

每次96孔板加样后都必须贴封口膜，离心混匀（2000g 1min）, 防止挂壁。EP管与96孔板等都为商品型一次性产品, 注意标记板号, 样本号和引物号。 ②设置PCR反应程序一般程序：96℃预变性2min, 96℃30s, 57℃30s, 72℃2min, 35cycles; 72℃延伸5min; 4℃/15℃∞。CEBPA和NOTCH1程序：96℃预变性5min, 95℃40s, 64℃/66℃40s, 72℃1min, 35cycles; 72℃延伸5min; 4℃/15℃∞。 ③琼脂糖凝胶电泳配置1.5%（60ml 0.9g, 大胶板150ml 2.25g）的琼脂糖凝胶, 再分别取2ul loading buffer与4ul DNA 扩增产物混合后进行电泳, 160V 35min。 3、PCR产物纯化 ①配制消化液 TaKaRa Alkaline Phosphatase 虾碱酶0.5μl TaKaRa Exonuclease I 外切酶0.5μl 配置消化液, 分别取虾碱酶与外切酶1:1混合。PCR产物离心后，每个孔中加入1μl以上消化液到PCR反应液中。 ②纯化反应：上PCR仪进行程序反应。程序为SAP: 37℃60min, 80℃15min, 4℃/15℃∞。 4、测序反应 ①SEQ MIX配置试剂：ABI PRISM? BigDye? Termina tor v3.1 cycle Sequencing Kit 根据PCR反应的数量按照下表配制MIX：试剂名称用量 BigDye 0.4μl Sequencing Buffer 0.8μl H2O 1.8μl Primer（3.2pmol/μl）（引物可单加）1μl 模板（即3-②中的产物）1ul 按照测序反应表在96孔板中加入3μl以上MIX，1μl对应引物，1μl对应PCR产物（注意封膜后要求压膜）,离心。（测序反应只有一个引物，为避免加样过程中的液体消耗，体系需要超量配置）。 ②SEQ程序: 96℃预变性2min, 96℃10s, 55℃5s, 60℃90s, 25cycles; 4℃/15℃∞。 5、纯化此步骤是将测序反应体系中除目标单链核酸片段之外的杂质尽可能去除, 以减少ABI 3730毛细管电泳时杂质对峰图质量的影响。 ①试剂准备：