定量PCR的实验步骤。

定量PCR的实验步骤

一、标准曲线的标准DNA样品准备

1.将目的片段进行克隆，对克隆得到的阳性菌落进行质粒DNA的提取和纯化（试剂盒），纯化后的质粒DNA纯度用DO260/DO280的比值来鉴定，纯的DNA比值应该在1.8-1.9之间，如果比值大于1.9的时候表示有RNA污染，小于1.6的时候表示有蛋白质的污染（DO260的1OD值相当于50ng/ul的双链DNA 或33ng/ul的单链DNA或40ng/ul的RNA）；

2.采用紫外分光光度法（DO260 nm）测定质粒DNA的吸光度DO260值为A，（B=1DO260=50 ng/ul），由于载体质粒序列和插入的目标片段的序列都是已知的，这样通过核苷酸的相对分子量和标准品序列信息估算出单个质粒DNA （阳性质粒）的分子量C (ng/mol)，进而计算标准品的拷贝数D(copy/uL)：

拷贝数D=A×B

C

×6.02×1023(copy/ul)

3.将2步骤中计算出来的已知拷贝数的质粒DNA以10倍为梯度进行稀释，稀释7个系列（各个梯度的浓度一般为101～107），作为标准曲线的DNA模板；

二、未知样品的定量标定

模板质粒DNA每个梯度设置3个平行样。未知样品设置2个平行样，同时设置一个没有质粒DNA的阴性对照。（定量实验，误差是不可避免的，设立平行样，对数据进行统计处理，可以将误差降低到最小，以满足小样本统计的要求；确保数据的有效性，排除假阳性的干扰，必须设置阴性对照，阳性对照有标准样品就做，没有标准样品就可以省略不做）；

2.按照下面的程序进行荧光定量PCR反应：

95℃ 3 min

95℃10 s

58℃20 s 40个循环

72℃20 s

95℃30 s

58℃10 s 溶解曲线，并且在72℃和58℃时候读盘。

95℃

3.程序完成后进行溶解曲线分析，确定反应过程的特异性；同时用琼脂糖凝胶电泳对定量PCR的产物进行检验；

4.根据求得的未知样品中目的基因的拷贝数E( copy/ul)以及根据相关文献记载的单个细胞中含有的目标基因的拷贝数F（copy/cell，在相关的文献中能够找到假定的每个细胞中含有的目的基因的拷贝数），进而计算出单位样品中所含有的细胞当量数CEN：

CEN=E

F

(cell/ul)

这样既对目标基因进行了定量也对细胞数进行了定量（用细胞当量数表示）荧光定量PCR为什么使用外标定量，而不是内标定量？

A、内标对实时荧光定量PCR的影响

若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。

B、荧光定量PCR无需内标定量

实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：

（1）Ct值的高度重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。

（2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。

美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，

得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方法。