组织病理学技术

组织病理学技术

一．实验综述

组织病理学切片技术是融解剖学、组织胚胎学及技术、病理学及技术和临床于一体的综合性课程。是一门新兴的学科。在当今不断发展、变革的社会中，在学科相互融合，知识相互渗透，技术不断发展、概念不断更新的时代，在时代要求综合素质人才辈出的今天，组织病理学切片技术的兴起尤为必要和重要。主要任务是：使学生获得和掌握学会观察人体重要器官的解剖学特征、组织学结构、病理学变化并联系相关功能，从而在形态上观察、机能上分析、综合上判断和科学上研究疾病。同时联系病变器官的代谢和机能的改变，探讨疾病的病因、发病机制以及病理变化与临床表现的内在联系和相互的关系。为由基础走向临床打下坚实的基础。

二．实验目的

1.掌握病理组织切片的基本制作过程步骤

2.掌握病变器官的代谢和机能的改变

3.明白病理组织切片制作过程中的注意事项

4.了解病理切片的制作程序及仪器的操作和注意事项

二．实验材料

1.实验材料：手术盘、镊子、手术刀、石蜡、小鼠病理组织、纱布、烧杯、脱水机、塑料包埋盒、水浴锅、切片机、染色机、载玻片、盖玻片、铅笔、标签

2.实验试剂：福尔马林、酒精（50%、55%、70%、75%、80%、85%、95%、无水浓度）、二甲苯、苏木素、盐酸酒精、伊红染液、树胶

四．实验步骤

（一）取材

从尸体解剖材料或临床手术切除的待检材料上选取供作切片标本的病理组织切块，称为取材。

1.取材要全面具有代表性，能显示病变的发展过程。为此要选取病变显著的区

域和可疑灶，在统一组织块中最好包括病灶及其周围的健康组织，并应包含该器官的主要结构部分。较大而重要的病变可从病灶中心到外周的不同部位取材，以反映病变各阶段的形态学变化。

2.取材时要尽量保持组织的自然状态与完整性，避免认为变化。为此，切取组

织块的剪刀要锋利，切取时勿使组织受挤压、拉扯胡揉搓。

3.组织块的大小要适当，通常其长、宽、厚以1.5×1×0.4cm为宜，必要时可

增大到2×1.5×0.5cm，以便于固定液迅速浸透。尸体剖检时采取病理组织块可切得稍大些，待固定几小时后在家以修整，切到适当的大小。

4.对于特殊病灶要做适当标记。

5.注意避免类似的组织块混淆。

6.制片的组织块，越新鲜越好。

7.接受送检标本时，须依据送检单详细检查送检物。

（二）固定和固定液

将组织浸在固定液内，使细胞组织内的物质成为不溶性，让固有形态和结构得以保存叫作固定。固定是为了保持组织、细胞与生活时的形态相似。

1. 本次试验的固定液为：10%福尔马林液（实验室常用固定液）

福尔马林 100ml

自来水 900ml

2.固定时的注意事项

（1）.固定组织时固定液用量要充分，液量勿少于组织块总体积的4倍。（2）.勿使组织块之间粘连。

（3）.将被检病例的畜别、编号、剖检号等信息写于标签上贴好。

（4）.组织固定要尽可能恰当地掌握时间。时间过短过长都不好，根据组织大小而定，一般数小时到数天。

（三）冲洗

组织固定后，通常用流水冲洗12~24小时，以洗净固定液，停止固定作用，避免组织固定，而影响制片效果，是时组织经过冲洗也可改变硬度。

（四）脱水

将组织内的水分彻底去除，称为脱水。常用脱水剂为酒精。

70%酒精 2小时

85%酒精 1.5~2小时

95%酒精(1) 1.5~2小时

95%酒精(2) 1.5~2小时

无水酒精(1) 1.5~2小时

无水酒精(2) 1.5~2小时

（五）透明

透明是指组织脱水后，通过透明剂的作用而脱去酒精使组织透明，并使石蜡抑郁渗入组织的过程。二甲苯能溶于酒精，又可溶解石蜡，是最常用的透明剂。但不宜时间过长，会使组织收缩、硬化变脆。

1:1酒精二甲苯此液为过渡液，时间要求不严格

二甲苯(1) 0.25-0.5小时

二甲苯(2) 0.25-0.5小时

（六）浸蜡

组织经过透明作用后移入熔化的石蜡中浸渍，使石蜡充分渗透到组织内，起填充作用，称为浸蜡。浸蜡后的组织硬度均匀适中，可是切片完整。

浸蜡过程与时间：

1:1二甲苯石蜡 1小时

1:2二甲苯石蜡 1小时

石蜡(1) 1.5小时

石蜡(2) 1.5小时

（七）包埋

石蜡包埋，是将饱浸石蜡的组织块的过程。

方法：将包埋用蜡倾注于包埋容器内，用镊子夹取浸透石蜡的组织块，将其平整切面向下平置于包埋容器底部，并用镊子轻轻压平，待石蜡凝固后检查蜡块内是否有气泡，如有气泡需重新包埋。

注意事项：

1.包埋时注意组织块切面，必须将平整切面向下平置于包埋容器底部

2.包埋用蜡的熔点须与浸蜡时石蜡(2)的熔点一致

3.包埋盒大小须与组织块大小适宜

4.包埋完毕，及时写清标本编号

（八）切片及附贴

1.切片

制作石蜡切片多用轮转式切片机。蜡块、切片刀准备好后，即可开始切片。

(1).将蜡块放于持物台上，调节切片机，式切片刀接近蜡块。

(2).炫动调节器，使厚度为10-20微米。

(3)启动切片机并观察蜡块被切削情况，至组织全面完整切平后，再将调节器调至所需厚度指标。一般石蜡切片的厚度为5-7微米为宜。转动切片机时用力要均匀，使切片完整、厚薄均匀，能连续成带。

(4)切片切出后，随即用洁净毛笔轻轻挑起，使之牵引成带，放入水浴锅内展片。

2.贴片

贴片是指将菲薄的切片贴敷于载玻片的过程。用洁净的载玻片将漂浮于水浴锅表面的切片轻轻挑起，使切片附于载玻片上。

（九）染色

染色是用一种以上的染料浸染组织切片，使组织细胞中的不同物质，因着色性能不同而染成不同色彩，从而便于在显微镜下观察。

染色的步骤：

1.脱蜡：将干燥的切片一次通过下列溶液。

(1).二甲苯(1) 5-20min

(2).二甲苯(2) 5-20min，进行彻底脱蜡

(3).1:1二甲苯酒精 1-2min，为国度溶液

(4).无水酒精 2min

(5).95%酒精 2min

(6).85%酒精 2min

(7).75%酒精 2min

(8).55%酒精 2min

2.染色：将经过脱蜡的切片，移入染色液中进行染色。

(1).苏木素液 5min

(2).蒸馏水洗片刻

(3).盐酸酒精分化 1-5S（切片进入些液作2-3次提取即可）

(4).自来水洗 10-20min，此时切片逐渐呈现鲜蓝色，这一步起反蓝作用，使细胞核更清晰。

(5).50%酒精 2min

(6).70%酒精 2min

(7).85%酒精 2min

(8).95%酒精 2min

(9).0.5%伊红酒精浸液 1-2min

3.脱水、透明：伊红染色之后，切片一次通过下列溶液，洗去伊红浮色，并进行脱水透明。

(1).95%酒精(1) 洗去多余伊红染液

(2).95%酒精(2) 脱去伊红浮色，切片进行此液后反复提取，直到无浮色脱下为止

(3).无水酒精(1) 4-5min

(4).无水酒精(2) 4-5min,彻底脱水

(5).二甲苯(1) 10-20min

(6).二甲苯(2) 10-20min充分透明

（十）封固

封固是指切片上滴加封固和盖玻片，以利于观察和保存。

将完全透明的切片从二甲苯液中取出，擦去切片以外载玻片上的二甲苯，用粗细适度的玻璃棒滴加树胶一滴于切片一端，随即将盖玻片一端与树胶接触稍稍前推，并与载玻片成30度角，徐徐下落，将切片封盖，盖玻片加盖之前，需在酒精灯火焰上稍加烘烤，以去潮气，然后将烘烤面向上加盖。操作要迅速准确，勿使切片在空气中暴露太久，以防二甲苯挥发切片干燥。

（十一）镜检

先用低倍镜（x10）观察，找到合适的病变观察部位;再用高倍镜(x40)观察,观察具体的病变特征和病理变化。

五.实验结果

经过显微镜的观察得到小鼠肝组织病变与肾组织病变图如下：

1.肝组织病变图

2.肾组织病变图

六．实验讨论及分析

通过实习不仅加深对理论知识的理解和认证，而且掌握基本病理过程的形态表现及主要疾病时的形态改变；在正确理解和掌握病理学基本理论的基础上学习病理学的观察方法，理论联系实际，使病理与临床有机结合，形态和功能密切联系，提高分析问题和解决问题的能力，并培养学生的创新能力和实践能力，为其以后的临床学习打下坚实的基础。

下面是切片时碰到的问题的原因及可能处理的方法：(1)组织发脆：一般是脱水、透明、浸蜡时间过长、温度过高，并与组织本身质地也有关，在切片时，边切边用嘴向蜡片吹气，可能会好些。(2)切片卷起，可能是刀不锋利，或刀锋在另一面，或刀角度过大，切片太厚等等。(3)蜡片弯曲：可能是刀锋不均，切片刀未磨直，切片刀与蜡块不平行。(4) 透明、浸蜡时间过长、温度过高，并与组织本身质地也有关(5)厚薄不均：可能是刀、刀座及蜡块未夹紧，组织太硬，或切片机主轴太向前，或切片机已磨损。(6)切片出现裂痕：可能是刀有缺口，石蜡内有杂质，组织内有钙化、骨片或有线结, 也可能会有棉纸纤维等。