生物传感器及其在农药残留中的应用

专业文献综述

题目: 生物传感器及其在农药残留中的应用姓名: 李枞

学院: 植物保护

专业: 农药学

班级: 5

学号: 2011102159

指导教师: 杨红职称: 教授

2012 年05月01日

生物传感器及其在农药残留中的应用

摘要：生物传感器是一种新型的分析工具，在农药残留的检测中具有极其重要的应用价值。本文介绍了生物传感器的定义、原理、分类和特点，并对生物传感器分析农药残留物的应用、研究进展和发展趋势进行了探讨。

关键词：生物传感器；农药残留物；应用；研究进展

The Application of Biosensor in the Determination of Pesticide Residues Abstract：Biosensor is a new analysis tool.It has very important applied value in the pesticide residues analyse.This article describes the definition,theory,classification and characteristics of biological sensors in detail,and discussed the applications,research development and development trends of biosensor analysis of pesticide residues.

Key word：biosensor；pesticide residues；application；research development

前言

自上世纪80年代以来，国际上农药残留分析新技术的研究非常活跃，不断有新方法、新技术涌现，以满足现场快速检测样品量的迅速增加，对分析的灵敏度、特异性和快捷性提出了更苛刻的要求。生物传感器法就是其中日渐成熟的一种。生物传感器具有体积小、成本低、灵敏度高、选择性及抗干扰能力强、响应快等优点。近年来，随生物技术的日臻完善、微电子学技术的迅速发展以及实际应用领域的迫切要求，作为一种多学科交叉的高技术、作为一种强有力的分析工具，它已成功地应用于医学、国防、环境、食品工业及农业等领域。该文主要对生物传感器在农药残留分析中的应用进行了概述。

1生物传感器

生物传感器实际上是一种特殊的化学传感器，是用生物活性物质( 如酶、抗体、抗原、细胞等) 作识别元件，配以适当的物理或化学信号转换器所构成的分析工具。

1. 1 生物传感器的工作原理

生物传感器以生物化学和传感技术为基础，其工作原理可用图1表示：待测物质经扩散作用进入分子识别元件，经分子识别，与分子识别元件特异性结合，发生生物化学反应，产生的生物学信息通过信号转换器转化为可以定量处理的光信号或电信号，再经仪表的放大和输出，即可达到分析检测的目的。

图1

1.2生物传感器的分类

生物传感器主要有下面三种分类命名方式：

根据生物传感器中分子识别元件即敏感元件可分为五类：酶传感器（enzymesensor），微生物传感器（microbialsensor），细胞传感器（organallsensor），组织传感器（tissuesensor）和免疫传感器（immunolsensor）显而易见，所应用的敏感材料依次为酶微生物个体、细胞器、动植物组织、抗原和抗体。

根据生物传感器的换能器即信号转换器分类有：生物电极传感器（bioelectrode），半导体生物传感器（semiconductbiosensor），光生物传感器（opticalbiosensor）、热生物传感器（calorimetricbiosensor）、压电晶体生物传感器（piezoelectricbiosensor）等，换能器依次为电化学电极、半导体、光电转换器、热敏电阻、压电晶体等。

以被测目标与分子识别元件的相互作用方式进行分类有生物亲合型生物传感器（affinitybiosensor）。

三种分类方法之间实际互相交叉使用。

1.3生物传感器的特点

与其他分析方法相比，生物传感器的特点如下：

①待测的样品不用经过预先处理，除缓冲液外无需其它试剂，可以同时对样品进行分离和检测。

②所用催化剂为固定化生物活性物质，可以重复多次使用，克服了过去酶法分析试剂费用高和化学分析繁琐复杂的缺点。

③专一性强，只对特定的底物起反应，而且不受颜色、浊度的影响，可以检测较混浊的样品，而不影响测定结果，不像pH试纸检测法等方法。

④分析速度快，准确度高，样品用量微。

⑤操作系统比较简单，可以实现连续监测，容易实现自动化测量。

⑥传感器连同测定仪的成本远低于大型分析仪器，便于推广普及。

⑦有的生物传感器能够可靠地指示微生物培养系统内的供氧状况和副产物的产生。在生产控制中能得到许多复杂的物理化学传感器综合作用才能获得的信息。同时它们还指明了增加产物得率的方向。

2生物传感器在农药残留检测中的应用

目前生物传感器在农药残留检测中应用非常广泛，不同种类的生物传感器特点不同，用途也有明显差异。根据生物敏感部件的不同，下面主要介绍酶传感器、微生物传感器、免疫传感器及压电传感器等。

2.1酶生物传感器

酶生物传感器是指酶与特定的固相载体特异性的结合形成酶复合物，将其装在一个小柱子中制成一个固定化反应柱，或将酶固定在电极上以电化学的方式将酶促反应的产物信息传导出去。酶生物传感器的基本原理是用电极、热敏电阻等来检测酶促反应中所参与的物质以及伴随反应的光热等，将之转变成电信号输出。

不同的农药残留物与酶作用的方式不同：有些残留物经过酶的催化转变成其他物质；有些残留物可特异性的抑制酶的活性；有些残留物可作为调节因子或辅助因子对酶起到修饰作用。

最早的生物传感器是以酶作为电极，葡萄糖作为底物被检测到的。1967年Updike和Hicks[1]用葡萄糖氧化酶作为电极制成传感器来检测样品中葡萄糖含量。自此，越来越多的学者对酶生物传感器产生兴趣，并极大的推动了它的发展。

在诸多酶生物传感器中，乙酰胆碱酯酶类生物传感器是研究最多的[2]。它是根据农药对靶标酶即乙酰胆碱酯酶（AChE）有抑制作用的原理研制的。乙酰胆碱是高等动物中神经信号的传递中介，乙酰胆碱的除去依赖于胆碱酯酶(AChE)，在胆碱酯酶的催化下，乙酰胆碱水解为乙酸和胆碱，反应式如下:

这些反应生成产物必须迅速去除，否则连续的刺激会造成机体兴奋，最后导致传递阻断而引起机体死亡。有机磷和氨基甲酸酯类农药与乙酰胆碱类似，能与酶酯基的活性部位发生不可逆的键合从而抑制酶活性，酶反应产生的pH值变化可由电位型生物传感器测出。自1951年Giang与Hall发现有机磷农药在体外也能抑制AChE后，许多研究报告都是基于这一原理。这类传感器的基本类型是与pH电极相连，通过检测有无抑制剂情况下pH的变化值测得农药的浓度。依据信号转换器的类型，酶传感器大致可分为酶电极（主要包括离子选择电极、气敏电极、氧化还原电极等电化学电极）、酶场效应晶体管传感器（FET—酶）和酶热敏电阻传感器等。

由于单酶传感器只能测定数目有限的环境污染物，所以可以在一个生物传感器上偶联几种酶促反应来增加可测分析物的数目。BernabeilM用AChE和胆碱氧化酶（ChOD）双酶系统，制备了测对氧磷和涕灭威的电流型H2O2传感器，其检测范围为10~ 100ppb。Mary T. L. 等也根据AChE和胆碱氧化酶的联合固定及顺序反应原理制成了生物传感器，Ache的抑制作用通过H2O2传感器测得H2O2形成的降低而获得,该传感器可检测10nmol对氧磷, 并可稳定2个月, 在4℃磷酸盐缓冲液中可贮存一年。还有将ChOD和BChE共同固定在膜上对马拉硫磷、对硫磷进行监测, 检测限分别可达到2ppb、6ppb，这种方法已成功地用于地表水和土壤样品中几种农药的检测研究。但高含量的重金属离子、无机阴离子及一些有机物对传感器的响应有负干扰。

Starodub[3]等分别用乙酰胆碱酯酶(AChE)和丁酰胆碱酯酶(BchE)为敏感材料，制作了离子敏场效应晶体管型传感器，两种生物传感器均可用于蔬菜等样品中有机磷农药毒死稗、DDVP和伏杀磷的测定，检测限为10-5~ 10-7mol/L。LeaPogacnik[4]等用其作为敏感材料，做成了光热生物传感器，对蔬菜中的有机磷和氨基甲酸酯类农药进行测定，其结果与GC-MS 检测结果一致。李元光[5]用乙酰胆碱酯酶电极和单片机结合研制的掌上型有机磷农药现场检测仪可测定0.5~43.1μg/ml的敌敌畏和0.1~ 15μg/ml的对硫磷，且仪器的响应时间短，仅需3min。

传统检测有机磷农药的酶传感器，几乎都是建立在胆碱酯酶的基础上，由于检测步骤多，测量时间相对长，抑制物多，且抑制过程多为不可逆抑制，造成再生困难等，难于满足现场快速检测的要求。有机磷水解酶(OPH) 是一类水解有机磷化合物的酶，其优点是将

有机磷农药作为酶的底物,而不是抑制剂，能专一性地切断它的磷氰、磷硫、磷氟和磷氧键，产生两分子质子、一分子乙醇及其它产物，这些产物在许多情况下带有发色基团或具有电活性，向周围装置提供了一系列可测信号，后续的信号转换器将这些信号转换成光或电信号，从而可以进行有机磷农药的定量分析[6]。利用此原理开发新形式的传感器，如双重的安培-电位型传感器，双酶(AChE和OPH)传感器等用于检测多组分农药样品，再加上基因工程的进步,使得OPH传感器有着更为广阔的发展空间。

AshokMulchandani[7]等采用有机磷水解酶结合电化学、光学转换器检测有机磷农药,可达到快速、简单、灵敏、高效。Nogue用一种固化了醛脱氢酶的酶传感器检测有机磷和氨基

甲酸酯农药，其最小检出量为9ng/kg，而传统方法的最小检出量为400ng/kg[8]。Turdean开发出一种以固化酶抑制为基础的生物电极电流计, 可选择性的检测低浓度的有机磷农药[9]。

2.2微生物传感器

微生物传感器是利用细菌、放线菌和真菌等微生物活细胞制成的传感器。常见的微生物传感器种类很多，它们之间的差异主要是信号转化器类型的不同。微生物传感器的测定原理有两类：一类是利用微生物在消化底物时需要氧的参与，即呼吸作用；另一类是利用微生物所含酶种类的不同。

酶可与底物进行特异性的结合，但是用于农药残留检测不仅成本高，而且稳定性差。微生物生长快、繁殖旺，它可源源不断地吸收外界营养物质通过自身代谢一部分转变成自身结构物质；另一部分转变成代谢产物和废物迅速排出体外，因此为生物被认为是天然的复合酶系统。将微生物固定在特定的膜上制成的生物传感器稳定性强、适用范围广、寿命长成本低。例如，Pandard等[10]将小球藻固定在聚乙烯包被的碳电极表面与三氧化铝之间，借助二极管照明可以在短时间内测出除草剂中的多种成分的含量。

微生物传感器的研究近几年来发展很快，Koblizek等从嗜热蓝细菌中获得PSⅡ颗粒，将其作为传感器因子，研制出一种微生物传感器，用作多种农药残留的检测。这种感受器不仅稳定性好而且灵敏度高[11]。Larsen[12]利用一种小型微生物Pseudmonas sp固定化后可以将三氧化氮转化成一氧化二氮的原理，将该菌固定到校毛细血管中，置于一氧化二氮小电化学感受器的前端，研制成微生物传感器。它可将产生的一氧化二氮在其他电负性的银表面还原。这种传感器灵敏度高、抗逆性强。

Mulchandani等[13]将含有OPH基因片段的质粒通过转化导入到一种摩拉氏菌（Moraxella sp）的菌体内，然后筛选出可表达OPH的工程菌。将适量的菌体与3:1的石墨粉和矿物油混在一起制成传感器，这种传感器灵敏度高、反应时间长、因此发展潜力很大。

2.3免疫传感器

利用农药与特异性抗体结合反应特性研制免疫传感器，可用于对相应农药残留进行快速定量定性检测。免疫传感器利用的是抗体和抗原之间的免疫化学反应。抗体是上百个氨基酸分子高度有序排列而成的高分子，当免疫系统细胞暴露在抗原物质或分子（如有机污物）上时，抗体中有对抗原结构进行特殊识别、结合的部位，根据“匙-锁”模型，抗体可与其独特的抗原高度专一地可逆结合，其间有静电力、氢键、疏水作用和范德华力，将抗体固定在固相载体上，可从复杂的基质中富集抗原污染物，达到测定污染物浓度的目的。酶、微生物传感器在测定污染物时有催化过程，可直接通过放大、转换系统产生相应

的信号；而免疫传感器中的抗体与污染物作用时没有催化过程，需要有其它体系帮助才能

完成物理信号的转换和放大[14]。免疫传感器分为竞争法和夹心法两类。根据使用的信号转

换器，有电化学免疫传感器、光学免疫传感器、压电免疫传感器及表面等离子体共振（SPR ）型传感器。

Wan-Li Xing [15]等人研制了便携式的光纤免疫传感器检测甲基对硫磷，其最小检测限为0.1ng/mL 。Antje J 等人用安培免疫移行传感器检测水样中的trazine 杀虫剂, 检测限达1μg/L, 时间仅1~ 3min 。对另一种类似杀虫剂阿特拉津，则有压电晶体免疫传感器、流注(FIA) 分析免疫传感器、安培免疫电极测定。光纤免疫传感器可用于对硫磷的测定，且灵敏度高，可达1nmol/L 。还有人用波导干涉仪(Waveguide Mach-Zchnder Interferometer)免疫传感器检测杀虫剂。多氯联苯也是一种杀虫剂，在水、食物、牛奶中可检测到它们的存在，过量会引起脑瘤。Zhao 等人用多克隆抗体PCB 抗体(Abs) 制作敏感膜光纤免疫传感器对其测定，下限为10mg/L ，时间仅几十秒到几分钟[16]。

李建平等[17]利用除草剂对植物类囊体束缚酶分解过氧化氢的拮抗作用,研制了一种快速检测痕量除草剂的电化学生物传感器。将植物类囊体用聚乙烯醇，苯乙烯吡啶( PVA-SbQ) 光敏聚合剂在紫外光诱导下产生大分子网状结构进行包埋，制成生物敏感膜，并固定在铂电极表面。根据加入除草剂时类囊体膜束缚酶分解过氧化氢活性的变化，可以对百草枯、敌草龙、扑草净、阿特拉津、莠灭净等除草剂进行检测。

2.4压电生物传感器

压电生物传感器是一种高灵敏度的压电质量传感与特定的生物反应结合在一起的生

物分析方法。该传感器工作原理是[18]：表面吸附会降低压电晶体的振荡频率，将对污染物

中的目标物质有效的敏感材料涂在石英晶体表面，当石英晶体与配基接触时就会发生吸附，从而完成对污染物的测定。频率的变化于物质质量相关，符合Sauerbey 方程A m f f /103.226??=?-(Δf 为涂着晶基频变化值，f 为晶体共振频率，A 为晶体面积，Δm 为涂层质量）。压电生物传感器的原理是：石英晶体以一个基础频率震荡，当污染物中的抗原或抗体与包被在晶体表面的抗体或抗原进行特异性结合时，负载的增加引起晶片震荡频率相应下降，下降值与吸附物质量有相关性。

自1972年Shons 首次将抗原包被在石英晶体表面检测牛血清蛋白抗体以来，压电免疫传感器在很多领域广泛应用起来。

3在农药残留分析中的前景展望

尽管生物传感器在一定的实验室条件下使用状态良好，但并没有在工业中得以广泛应用，其最大问题仍然是稳定性、精确度和可信度。生物传感器的研制过程有诸多难点，其一是如何高效地筛分出高活性的酶和选择合适的固定化方法。为了使传感器具有令人满意的灵敏度，关键是保证有足够量高活性酶尽可能牢固地固定在半导体片上。为了缩短传感器的响应时间及延长寿命，在工艺上，将基膜做得尽可能的薄则成为另一个难点。生物传

感器研制的第三个难点是如何改进传感器对应用条件的适应性与稳定性[19]。依托现代生物

技术如生物酶抑制技术、ELISA 、PCR 、芯片技术等，便携、灵敏、快速、稳定的生物传感

器是将来的发展趋势[20]。

①适当的生物化合物、酶、受体、DNA 和新种微生物的有效性:生物传感器的发展要求生物化合物具有一定的有效性。溶胶凝胶材料作为酶固定化载体开辟了生物传感器新的研究领域。由于涉及检测特异性,所以必须使用合适的化合物, 并加以正确设计，试验不同

的方法,以回收昂贵的辅因子。

②免疫试剂和分子印痕高聚物的有效性：免疫化学法用于农残分析的主要问题是其特异性太高或太低，所以要将传感器成功地应用于农残分析就取决于新设计的免疫化学物的商业可行性，而且确定免疫试剂的有效性十分必要。

③应用基因工程技术，可创造出检测能力更强的生物元件：如在检测有机磷时，不同来源的酶敏感性相差很大，采用定点突变可使酶敏感性大幅度提高。

④与其它仪器集成：HPLC或CE与高选择性和灵敏度的生物传感器检测系统的联合已经被几个研究机构开发出来。

⑤向便携式、小型化、低成本、高灵敏度和高选择性的生物传感器发展：为了对食品中的痕量的残留农药或生物毒素进行精确分析，必须提高生物传感器的灵敏度和稳定性、改善生物材料结构及性能，尤其是研制生物敏感材料，将是生物传感器发展的方向之一。小型仪器可减少样品体积、试剂消耗和生产费用。此外，可能会开发出多分析物生物传感器，从而将多种生物成分固定在一个微片上，用同一传感片检测几种农药残留物及其代谢产物。当然，还有一些问题如样品介质的系统封闭、极低体积（μL级别）样品的转移等急需解决，这无疑将有助于降低分析费用。

4结束语

与国外相比，国内在农药残留快速检测方面较为落后,主要采用酶抑制技术，如酶液比色法、pH测定法和纸片速测法等。目前大多数是以简单的生化技术形成的酶片、检测箱、速测卡、速测仪等, 存在对农药检测的种类有限，不能给出定性和定量结果，且灵敏度较低等缺点。20世纪90年代国内开始有几家单位开展农药免疫分析的研究，且主要集中于ELA，其中大都以ELISA为主，但其只适合分析一种或一类农药，且试剂价格昂贵。与上述方法相比，生物传感器法可大大提高检测灵敏度，缩短检测时间，以更低廉的费用分析更多的样品,减少有机溶剂的使用，对相应的农药残留进行更快速精确的定性定量检测。它在测定方法多样化、提高测量灵敏度、缩短响应时间、提高仪器自动化程度和适应现场检测能力等方面已取得了长足进步。它甚至可以插入生物组织或细胞内实现超微量快速跟踪分析。

生物传感器法在日本、美国等国家发展较快，在我国还主要停留在研究开发阶段[21]。但随着新技术、新材料的不断涌现,生物传感器在实验室研究的良好基础上，再解决其稳定性、精确度、货架寿命等问题后，必将更加小型化、实用化、商品化，投入市场使用也指日可待，使我国农药残留快速检测技术的应用出现多元化的局面。可以预见，随着性能的日趋成熟和品种的不断增加,生物传感器在农药残留分析中具有广阔的应用前景。

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