花生蛋白的提取工艺
碱性蛋白酶提取花生水解蛋白
摘要：
利用碱性蛋白酶从冷榨花生饼中提取花生水解蛋白。研究了温度、pH 值、加酶量、液固比、水解时间对蛋白质提取率的影响,确定最佳工艺参数为温度55 ℃、pH9.0、加酶量是0.8%、水解时间3 h、液固比7∶1, 在此条件下蛋白质提取率为81.32%。
1、材料与方法
（1）实验材料
冷榨花生饼(蛋白质48.09%, 脂肪8.74%, 粗纤维 4.71%); 碱性蛋白酶(2.4 AU/g)；
主要仪器设备：
SC- A型精密恒温水槽, 868 型酸度计, 78- 1 型磁力搅拌器, UV- 2100 紫外可见光分光光度计, 酶反应器。
（2）实验方法
花生水解蛋白的提取：一定质量花生饼(粉碎过80 目筛)与蒸馏水按一定比例加入酶反应器中, 恒温搅拌一定时间, 调节pH 值至适宜, 加入一定量酶进行水解, 并维持反应液pH恒定(变化范围±0.01)。反应结束后, 沸水浴中灭酶5 min, 3000 r/min 离心20min, 收集上清液, 残渣用2 倍体积水洗涤, 合并两次离心所得上清液, 计量体积, Folin- 酚法，测定其中蛋白含量。
蛋白质提取率的计算：
花生蛋白提取率(%)=(提取的上清液蛋白质质量/原料中蛋白质质量)×100%
2、结果与分析
（1）温度对蛋白质提取率的影响在加酶量0.4%,pH8.0, 液固比7∶1, 水解时间 3 h 时, 考察了温度对蛋白提取率的影响, 结果如图 1 所示。
由图1 可知, 随着温度升高, 蛋白质提取率逐渐提高, 当温度达到55 ℃, 蛋白质提取率最高。当温度>55 ℃时, 随温度升高蛋白质提取率反而降低, 其原因可能是超过酶最适温度, 酶分子空间结构发生改变, 导致酶活性减弱或丧失。（2）pH 值对蛋白质提取率的影响在温度55 ℃,加酶量0.4%, 液固比7∶1, 时间3 h 时, 考察了pH值对蛋白提
取率的影响, 结果如图 2 所示。
从图2 可看出, pH 值对蛋白质提取率影响比较大, 这是因为不同pH 值会分别影响底物和酶的构象, 从而影响酶与
底物结合和催化。pH 值较低时蛋白质提取率随着pH 值增加而迅速增加, 当pH 值为8.0 时, 蛋白质提取率达73.5%。随着pH 值进一步增加, 蛋白质提取率增加趋势平缓。（3）加酶量对蛋白提取率的影响在温度55 ℃,pH8.0, 液固比7∶1, 时间3 h 时, 考察了加酶量对蛋白提取率的影响, 结果如图3 所示。
由图3 可看出, 蛋白质提取率随着加酶量增加而增加, 酶用量增加可大大增加酶与底物结合几率,从而提高蛋白质提取率。当加酶量>0.6%时, 蛋白质提取率提高趋于缓慢。另外加酶量太大会干扰酶解物组成, 且大大增加成本, 综合考虑确定加酶量为0.6%。
（4）液固比对蛋白质提取率的影响在温度55 ℃,加酶量0.4%, pH8.0, 时间3 h 时, 考察了液固比对蛋白提取率的影响, 结果如图4 所示。
液固比小有利于蛋白质和酶相互接触, 但液固比小, 溶液黏度大且蛋白质不能充分浸润, 影响酶对蛋白的作用, 液固比大可降低体系黏度, 加快传质过程。由图 4 可知, 随着液固比的增大, 蛋白提取率逐渐增加, 当液固比达到7∶1 后, 蛋白提取率增加平缓。从水解物后期干燥处理考虑, 其液固比越小越有利于干燥, 基于此选取液固比为7∶1。
（5）水解时间对蛋白质提取率的影响在温度55℃, 加酶量0.4%, pH8.0, 液固比7∶1 时, 考察了水解时间对蛋白提取率的影响, 结果如图 5 所示。
由图5 可看出, 随水解时间的延长蛋白质提取率也随之增加, 水解时间在 3 h 之后, 蛋白提取率增加趋势渐缓。这表明随着水解时间的进一步延长,蛋白酶活力相对下降, 同时有较大机会作用于已溶出的蛋白质。延长水解时间将增加生产成本, 降低经济效益, 因此确定水解时间为 3 h。
3、结论
花生饼粕中含约50%蛋白质, 是一种很好的植物蛋白资源。采用酶法提取花生水解蛋白, 作用条件温和, 蛋白质多肽链可水解为短肽链, 提高蛋白质消化率, 其有效应用是目前植物蛋白工业发展方向。笔者对碱性蛋白酶提取花生水解蛋白的工艺条件进行了优化, 蛋白质提取率可达81.32%。
花生蛋白的提取工艺
碱性蛋白酶提取花生水解蛋白 摘要： 利用碱性蛋白酶从冷榨花生饼中提取花生水解蛋白。研究了温度、pH 值、加酶量、液固比、水解时间对蛋白质提取率的影响,确定最佳工艺参数为温度55 ℃、pH9.0、加酶量是0.8%、水解时间3 h、液固比7∶1, 在此条件下蛋白质提取率为81.32%。 1、材料与方法 （1）实验材料 冷榨花生饼(蛋白质48.09%, 脂肪8.74%, 粗纤维 4.71%); 碱性蛋白酶(2.4 AU/g)； 主要仪器设备： SC- A型精密恒温水槽, 868 型酸度计, 78- 1 型磁力搅拌器, UV- 2100 紫外可见光分光光度计, 酶反应器。 （2）实验方法 花生水解蛋白的提取：一定质量花生饼(粉碎过80 目筛)与蒸馏水按一定比例加入酶反应器中, 恒温搅拌一定时间, 调节pH 值至适宜, 加入一定量酶进行水解, 并维持反应液pH恒定(变化范围±0.01)。反应结束后, 沸水浴中灭酶5 min, 3000 r/min 离心20min, 收集上清液, 残渣用2 倍体积水洗涤, 合并两次离心所得上清液, 计量体积, Folin- 酚法，测定其中蛋白含量。
蛋白质提取率的计算： 花生蛋白提取率(%)=(提取的上清液蛋白质质量/原料中蛋白质质量)×100% 2、结果与分析 （1）温度对蛋白质提取率的影响在加酶量0.4%,pH8.0, 液固比7∶1, 水解时间 3 h 时, 考察了温度对蛋白提取率的影响, 结果如图 1 所示。 由图1 可知, 随着温度升高, 蛋白质提取率逐渐提高, 当温度达到55 ℃, 蛋白质提取率最高。当温度>55 ℃时, 随温度升高蛋白质提取率反而降低, 其原因可能是超过酶最适温度, 酶分子空间结构发生改变, 导致酶活性减弱或丧失。（2）pH 值对蛋白质提取率的影响在温度55 ℃,加酶量0.4%, 液固比7∶1, 时间3 h 时, 考察了pH值对蛋白提
花生蛋白粉
Q/HLJS 辽宁虹螺健康食品企业有限公司企业标准 Q/HLJS 0001S—2010 代替Q/HLJS001-2007 花生蛋白粉 2010-03-01发布2010-05-20实施辽宁虹螺健康食品企业有限公司发布
Q/HLJS 0001S—2010 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则修订。 本标准代替Q/HLJS001-2007《花生蛋白粉》。 本标准与Q/HLJS001-2007《花生蛋白粉》的主要差异：—— —— —— 本标准由辽宁虹螺健康食品企业有限公司提出并起草。 本标准主要起草人：孙建华、祁玉全、周宏志。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： ——Q/HLJS001-2007。
Q/HLJS 0001S—2010 花生蛋白粉 1 范围 本标准规定了花生蛋白粉的术语和定义、要求、试验方法、检验规则、标志、标签、包装、运输和贮存。 本标准适用于以花生为主要原料经加工制成的花生蛋白粉。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 1533-86 花生仁 GB/T 4789.2-94 食品卫生微生物学检验菌落总数测定 GB/T 4789.3-94 食品卫生微生物学检验大肠菌群测定 GB/T 5009.3-2003 食品水分的测定 GB/T 5009.4-2003 食品灰分的测定 GB/T 5009.5-2003 食品蛋白质的测定 GB/T 5009.6-2003 食品脂肪的测定 GB 7101-2003 固体饮料卫生标准 GB 7718 预包装食品标签通则 GB/T 12096-89 淀粉细度测定方法 GB 19300-2003 炒货食品卫生标准 JJF 1070 定量包装商品净含量计量检验规则 国家质量监督检验检疫总局令（2005）第75号《定量包装商品计量监督管理办法》 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准： 花生蛋白粉：脱脂花生仁经一定生产工艺过程所得的粉状产品。 4 要求 4.1 原料要求 4.1.1 花生仁：应符合GB/T 1533-86的规定。 4.2 感官要求 感官要求应符合表1的规定。
蛋白提取步骤
提蛋白及WB的步骤 整个过程细胞或蛋白都必须放冰上 准备工作：前一天准备：借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂是否充足、 当天准备：洗玻璃板、开紫外，冰块、碎冰、标记离心管及离心管、细胞刮板、 开低温高速离心机 细胞裂解液配制： 1ml cell lysis 10ul NP-40（离心机后） 25ul 焦磷酸钠 40ul NaF 1ul β-甘油磷酸 2 ul Na3VO4 1ul 蛋白酶抑制剂（用完即放回冰箱） 10ul PMSF（最后加，随加随用，有毒） 细胞裂解和收集 1.观察细胞状态，并准备提蛋白：吸走培养基、用PBS洗细胞两次（倾斜贴壁加PBS，左 右轻轻摇），倾斜贴壁吸走PBS。 2.将细胞盘拿到外间冰上，加裂解液（体积网上推荐：一般106加），冰上静置1-2min。 3.刮细胞：细胞刮板每次用之前拿水涮一涮，甩干，然后从中间到外面打圈刮，再从下往 上，从上往下全面刮，（刮的时候要迅速），最后用枪吸取裂解液至离心管。 细胞破碎 4.超声波破碎细胞：准备三个小烧杯，加满冰块，三个小夹子。（超声波破碎仪的铁棒不 要碰到离心管的壁和底部） 超声波设置： 工作功率5% 工作时间3min 开机时间15s，关机时间30s 温度0度， 报警温度1度 5.4℃、13000r/min，离心15min。（离心机用后一直保持打开的状态，） 蛋白保存 6.蛋白保存及分装：吸上清液至离心管，涡旋、吸一半至另一个管中，涡旋。-80℃保存。注意事项：PMSF一定要现用现加，PMSF在水溶液中不稳定，30min内就会降解一半。样品处理超过1h，补加一次。
BCA测定蛋白浓度 1、测空白板，选差异较小的孔。 BCA测定法波长570，Bracford：595 2、标准蛋白的稀释（5mg/ul）：分装1ml PBS来使用，稀释标准蛋白至ul。 取5ul标准蛋白+45ul PBS 3、加样： 浓度0 BSA（ul）0481216 PBS（ul）20161284 4、样品蛋白稀释20倍：2ul蛋白+18ul PBS 5、配BCA：每个孔200ul，一个样品2个重复，A:B=50:1,根据样品数来计算BCA的用量， 一般防止损耗，多算一个样。 6、加BCA：悬空加、37℃孵育30 min。（手不能碰板的底部，影响测定结果） 7、计时30min 8、配分离胶，灌胶，加水封。 9、计时20min。 10、测蛋白：先振板、再设置参数。 11、计算上样体积: 12、配浓缩胶，灌胶，加梳子，等1-2min，出现缩胶的地方补上。 13、打开干式加热器 10、蛋白质上样：根据计算结果乘以稀释倍数，算出蛋白浓度，以体积最大的为准，其他用 水补足。(最大上样量为20ul，除去buffer的体积，蛋白质最大上样体积为16ul) 标记离心管 加样顺序：水、buffer(1/4)、蛋白、离心-涡旋-离心。100℃变性10min（迅速，确保变性程度一致） 11、计时10min ，变性10min。 12、安装电泳槽: 电泳液（1X）：配制：90ml（10X）+810ml水（只能用一次） 液面刚覆盖胶，不能有气泡。 13、上样：maker 上样量为3ul。依次上样（吸样品时最好一次吸完）枪头不能撬板，笔直打进去 14、电泳 分离胶100V，20min左右、条带都跑开即可。 浓缩胶145V 1h 有等紫色部分跑到底结束。 转膜 准备工作：转移缓冲液(只能用2次)、三层滤纸、海绵、PVDF膜 PVDF膜用之前用甲醇浸泡数秒。 用海绵和滤纸之前先浸湿。 转膜：负极（黑板）海绵-三层滤纸-胶-PVDF膜-三层滤纸-海绵-正极（白板）。 三层滤纸和膜都需要赶气泡。
蛋白质提取与制备的原理和方法
蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。 蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用 稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。 蛋白质类别和溶解性质 白蛋白和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。真球蛋白 : 一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。拟球蛋白: 溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出 醇溶蛋白: 溶于70～80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇 壳蛋白: 在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液 精蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 组蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱 缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等) : 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如脂肪部分露于外，则脂溶性占优势，如脂肪部分被包围于分子之中，则水溶性占优势。 蛋白质的制备是一项十分细致的工作。涉及物理学、化学和生物学的知识很广。近年来虽然有了不改进，但其主要原理仍不外乎两个方面： 一是利用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等； 二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离的目的，如电泳、超离心、超滤等。由于蛋白质不能溶化，也不能蒸发，所能分配的物相只限于固相和液相，并在这两相间互相交替进行分离纯化。 制备方法可按照分子大小、形状、带电性质及溶解度等主要因素进行分类。按分子大小和形态
花生蛋白质在食品中的应用
花生蛋白质在食品中的应用 继大豆蛋白被人们充分认识和深度利用后，花生蛋白也开始引起人们的重视。花生蛋白质是一种完全蛋白质，含有人体必需的八种氨基酸。花生蛋白质可消化率高，极易被人体吸收利用，其消化系数可达90％以上。花生蛋白质具有诱人食欲的香味，简单地烘焙和磨碎成粉就可以用于多种食品加工，既可作为食品的主要成分，又可作为食品添加剂，还可兼用。这种特殊的优点，标志着花生蛋白在食品中占有十分重要的地位。花生蛋白质中10％为水溶性蛋白，其余90％为碱溶性蛋白，由花生球蛋白和伴花生球蛋白两部分组成，花生蛋白的等电点在pH4．5左右。花生球蛋白的分子量约为30000，等电点为pH5～5．2；伴花生球蛋白的分子量由2×104～2×106的6～7个单体组成，等电点为pH3．9 ～4。花生蛋白产品多种多样，其中以粉状花生蛋白为主要产品，如花生粉、浓缩蛋白、分离蛋白等。花生粉又包括全脂、半脱脂和脱脂花生粉。花生蛋白质溶解性PDI值为54％～90％，持水能力2．1～4．8 克水／克蛋白，吸油能力0．98～1．3克油／克蛋白，起泡度130％～ 160％。花生蛋白的制取一般有两条途径：第一，以花生仁作原料，采用水溶法同时分离出油脂和蛋白质；第二，利用低温浸出或压榨取油后的饼粕作原料制取花生粉，或进一步做浓缩蛋白和分离蛋白。由于采用工艺和操作条件不同，可生产出几种不同的花生蛋白产品。全脂花生粉是由花生仁作原料直接加工而成的一种粉状产品，蛋白质含量30 ％；脱脂花生粉是由直接浸出或预榨浸出粕生产的，蛋白质含量65％。浓缩蛋白是花生脱脂后，只除去少量水溶性糖分、灰分和其他微量成分，而淀粉和纤维素随凝聚的蛋白质集中为一体，蛋白质含量为70％。分离蛋白是利用碱溶酸沉原理，不仅除去低分子水溶性糖分，还除去纤维素、淀粉等成分而制得的，其纯度高，蛋白质含量达90％以上。在加工过程中，大部分磷脂也集中在花生蛋白粉中，这不仅提高了营养价值，而且对其溶解性也有利。花生蛋白目前在食品工业及人们的日常膳食中得到初步应用。为最佳地发挥花生蛋白的功能特性，科学地选择应用领域和配方，以下简要介绍花生蛋白产品的应用方法。作添加剂。利用花生蛋白的香味和溶解特性，即溶解度大，水溶程度高，可生产代乳品、饮料等强化食品，或单独冲调，或与奶粉等混合冲调饮用，可形成稳定的胶体溶液，产生令人易于接受的愉快风味。在此类制品中用量浓缩蛋白为10％～15％，分离此类制品中用量浓缩蛋白为10％～50％，分离蛋白为5％～30％。冰淇淋、焙烤食品、儿童食品等不需要很高溶解性的食品，其添加量浓缩蛋白为4％～10 ％，分离蛋白为2％～7％。脱脂花生粉适用于饼干、面包、蛋糕之类食品，其添加量饼干为10％～15％，面包为4％～8％，蛋糕为15％～ 25％。同时应适当增加疏松剂量，可提高膨松性和柔软性，延缓老化期。将浓缩蛋白1％～2％，分离蛋白0．5％～1．5％，或脱脂花生粉 1．5％～3．5％，掺入面粉中制作馒头、面条，耐高温，滑爽有咬劲。作吸油保水剂。利用花生蛋白的吸水性、保水性、吸油性、乳化性等特性，将花生蛋白添加到火腿、香肠、午餐肉等畜禽肉制品中，可保持肉汁，促进脂肪吸收，使油水界面张力降低，乳化的油滴被制品表面的蛋白质所稳定，形成保护层，可防止乳化状态被破坏。从而使制品能够实现组织细腻、口感良好、风味诱人、富有弹性。作发泡稳定剂。花生蛋白粉经酶法或碱法处理后，是很好的发泡剂，可广泛应用于糖果、中西糕点、冰淇淋等食品中。例如在充气糖果生产中，加入1％～2％的花生蛋白粉，控制温度在35℃左右，浓度 25％左右，同样可以起到蛋白干和明胶的作用。还可作为汽水的发泡稳定剂，用于汽
细胞总蛋白提取方法
细胞总蛋白提取方法 一、溶液配制 1.100mM NaF (NaF MW=41.99) 10ml 称取NaF 41.99mg，超纯水8ml溶解后定容至10ml。 2.100 mM PMSF 3.RIPA溶液100ml 成分分子量终浓度 Tris 121.14 0.6 g 5.0 mM (pH 7.4) NaCl 58.44 0.87 g 150 mM EDTA 372.24 37.22 mg 1 mM NP-40 1 ml 1% SDS 0.1 g 0.1% 脱氧胆酸钠0.5 g 0.5% 溶解于80 ml超纯水中，待溶解后加入HCl调pH值至7.4，定容至100 ml。 ※使用前加入 成分储存浓度加入量终浓度 PMSF 100 mM 10μl/1ml 1 mM NaF 100 mM 10μl/1ml 1 mM Aprotinin 10μg/μl0.2μl/1ml 2μg/μl Leupetin 10μg/μl0.2μl/1ml 2μg/μl 二、方法 1.细胞收取 1)细胞传代至60mm培养皿中，待细胞融合约100%，收集细胞 2)弃培养基，加入PBS 2ml清洗培养皿一次，弃PBS。 3)加入0.05%胰酶2ml，37℃温育1min。 4)待细胞变形后，将细胞吹下转移至一个1.5ml ependorf 管中，10,000rpm×3min，4℃ 5)弃上清，1ml预冷的PBS清洗沉淀，10,000rpm×
6)重复PBS清洗一次 7)弃上清，-80℃冻存待裂解 2.蛋白提取 1)向细胞沉淀中加入200μl RIPA缓冲液(含1mM PMS 1mM NaF、2μg/ml Aprotinin、2μg/ml Leupetin) 后冰上放置40mins 2)10,000rpm×15min，4℃ 将上清转移至一个新的ependorf 管中（约250μl）
蛋白质提取方法
蛋白质提取方法-------列举10种方法 一、植物组织蛋白质提取方法（summer） 1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4 小时）。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清夜，样品制备完成。 蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl（PH8）45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！ 二、植物组织蛋白质提取方法(summer) 三氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1 小时），然后真空干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30 分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm 以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。 药品： 提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮 裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！ 三、组织：肠黏膜（newinbio） 目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达 应用TRIPURE 提取蛋白质步骤： 含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量）倒转混匀，置室温10min 离心：12000 g，10min，4度，弃上清，加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE 用量）振荡，置室温20min 离心：7500g，5 min，4 度，弃上清 重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2 次 沉淀中加入100％乙醇2ml 充分振荡混匀，置室温20 min 离心：7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀，1％SDS溶解沉淀 离心：10000g，10min，4度 取上清-20 度保存（或可直接用于WESTERN BLOT） 存在的问题：加入1％SDS 后沉淀不溶解，还是很大的一块，4 度离心后又多了白色沉定，SDS 结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。 解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分钟，
牛血清白蛋白的分离提纯工艺
课程设计说明书 课程名称：生物分离工程 设计题目：牛血清白蛋白的分离提纯工艺 院系：环境与化学工程学院 学生姓名：孙盼盼 学号：41004020111 专业班级：10级生物工程01班 指导教师：王晓军 2013年6月20日
目录 1.设计任务书 (1) 2.设计背景 (1) 2.1 牛血清白蛋白分离提纯的简介 (1) 2.2 牛血清白蛋白分离提纯的意义 (1) 3.设计原理 (2) 4.设计工艺流程及设计方案说明 (2) 4.1对原材料的粗分级分离 (3) 4.2对粗分离成分进行细分级分离 (3) 4.3 蛋白的结晶与重结晶 (3) 4.4 对分离出的蛋白质进行纯度鉴定 (3) 4.5 牛血清白蛋白质分离提纯的整个工艺流程 (3) 5.操作过程 (4) 5.1蛋白质分离的准备阶段 (4) 5.2细分级分离设备的设计 (4) 5.3蛋白质的纯度鉴定 (8) 6.参考文献 (8) 7.课程设计心得 (9)
1.设计任务书 现有一混合物料液中含有酪蛋白（分子量：57000Da，pI 4.5）、β-乳球蛋白（分子量：35000Da，pI 5.1）、α-乳白蛋白（分子量：14000Da，pI 4.2）和牛血清白蛋白（分子量：66200Da，pI 4.7），设计一个分离纯化工艺纯化其中的牛血清白蛋白。 2.设计背景 2.1 牛血清白蛋白分离提纯的简介 蛋白质是（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%~20%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。 蛋白质具有很多生物化学共性，运用相关性质进行蛋白质的分离制备多种不同的单一蛋白质，更好的为人们所有。蛋白质的分离提纯技术已经很成熟，相关的工艺流程包含各种不同的分离提纯设备，这些设备运用蛋白质的不同原理对其进行分离纯化，单一蛋白质的分离提纯在现实生活中具有重要意义！ 2.2 牛血清白蛋白分离提纯的意义 牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫
提取蛋白的常规方法
1、原料的选择 早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经 常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料， - 105 - 蛋白质提取与制备Protein Extraction and Preparation 因而对提取要求更复杂一些。 原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成 本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量 来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属 的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查 制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解 蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属 必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但 使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对 动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。 2、前处理 a、细胞的破碎 材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷 冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先 将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难 易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即 可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。 ⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达 10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两 个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间
花生低温预榨_浸出_低温脱溶制油同时制备脱脂花生蛋白粉工艺研究
收稿日期:2008-07-10 基金项目:湖北省重大科技专项(ZDN 0005) 作者简介:刘大川(1943),男,教授,主要从事油脂及植物蛋白方面的研究工作(E -m a il)dcli u @whpu .edu .cn 。 油脂加工 花生低温预榨、浸出、低温脱溶制油同时 制备脱脂花生蛋白粉工艺研究 刘大川1 ,孙 伟2 ,俞伯群2 ,刘瑞利2 ,方雪华3 ,张安清 4 (1 武汉工业学院,武汉430023;2 宜城市天鑫油脂有限公司,湖北宜城441400;3 鄂州市华天设备工程有限公司, 湖北鄂州436000;4 安陆市天星粮油机械设备有限公司,湖北安陆432600) 摘要:将清理分级后的花生仁低温烘干,脱红衣后于65 以下直接进入低温螺旋榨油机进行预榨,低温花生油经沉淀、精滤即达到压榨一级花生油标准。低温预榨饼经适度破碎并调节水分后进入浸出器,用6# 溶剂萃取油脂,湿粕进入热气式搅拌型低温脱溶装置,在小于80 的温度下低温脱溶,然后进行超微粉碎得到脱脂花生蛋白粉,其蛋白质含量(N 6.25,干基)为60 7%,氮溶解指数(NS I)为68 5%。 关键词:花生仁;脱红衣;低温预榨;浸出;低温脱溶;脱脂花生蛋白粉 中图分类号:TS224 文献标志码:A 文章编号:1003-7969(2008)12-0013-03 Si m ultaneous preparation of peanut oil and defatted protein po wder by lo w -te mperature prepressi ng ,extracti on and lo w -te m perature desol ventizi ng L I U D achuan 1,S UN W ei 2,YU Boqun 2,L I U Ru ili 2 , F AN G Xuehua 3,Z HANG A nqi ng 4 (1 W uhan Po lytechn ic Un i v ersity ,W uhan 430023,Ch i n a ;2 Y icheng T ianx in O ilCo .,Ltd ., H ubeiY i c heng 441400,Ch i n a ;3 E zhou H uatian Equ i p m ent Eng ineeri n g Co .,Ltd ., H ubei Ezhou 436000,China ;4 Anlu T ianx i n g O ilM ach i n ery Co .,L td .,H ubeiAn l u 432600,Ch i n a)Abst ract :The cleaned ,graded peanut ker nelw as dried i n lo w -te m perature ,and then w as decorticated .The decorticated peanut ker nelw as d irectl y prepressed in the l o w -te m perature scre w press i n less than 65 ,the prepressed o ilw as precipitated and filtered to achieve 1st grade pressed peanut o i.l The lo w -te mperature prepressed cake w as cracked and adj u sted appropriate ly itsw ater conten,t t h en ex tracted w ith 6# so lven.t The w etm ealw as conveyed i n to the lo w -te m pera t u re desolventizer to deso lven tize in less than 80 ,and then super-m icro-cr ushed to ach i e ve defatted peanut protei n po wder .The prote i n conten t o f the productw as 60 7%(N 6.25,dry),and t h e nitrogen dissolved index (NSI)w as 68 5%.K ey w ords :peanu t ker ne;l de-red-cover ;l o w -te m perature prepressi n g ;ex tracti o n;lo w -te m perature deso lventizi n g ;defatted peanut pr o te i n po w der 花生是我国最主要的油料资源之一,据资料显示,2004~2006年度我国花生产量分别为1434.2、1434.2、1466.6万,t 超过印度,居世界第一位 [1-3] 。 花生属豆科一年生草本作物。花生仁中一般含油脂46%~52%,油脂中不饱和脂肪酸含量达80%以上,其中油酸含量为39.2%~65.7%,亚油酸含量为16.8%~38.2%,是一种营养价值较好的食用油。花生中含蛋白质25%~30%,花生蛋白含有8种人体必需氨基酸,除蛋氨酸较低外,其他氨基酸含量均达到联合国粮农组织(FAO )规定的标准, 花生中所含胰蛋白酶抑制剂等抗营养因子比大豆低 13 2008年第33卷第12期 中 国 油 脂 C H I NA O I LS AN D FATS
蛋白质提取与制备的原理和方法
蛋白质提取与制备的原理和方法 蛋白质提取与制备蛋白质种类很多，性质上的差异很大，既或是同类蛋白质，因选用材料不同，使用方法差别也很大，且又处于不同的体系中，因此不可能有一个固定的程序适用各类蛋白质的分离。但多数分离工作中的关键部分基本手段还是共同的，大部分蛋白质均可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中，少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂中。因此可采用不同溶剂提取、分离及纯化蛋白质和酶。 蛋白质与酶在不同溶剂中溶解度的差异，主要取决于蛋白分子中非极性疏水基团与极性亲水基团的比例，其次取决于这些基团的排列和偶极矩。故分子结构性质是不同蛋白质溶解差异的内因。温度、pH、离子强度等是影响蛋白质溶解度的外界条件。提取蛋白质时常根据这些内外因素综合加以利用。将细胞内蛋白质提取出来。并与其它不需要的物质分开。但动物材料中的蛋白质有些可溶性的形式存在于体液（如血浆、消化硫等）中，可以不必经过提取直接进行分离。蛋白质中的角蛋白、胶原及丝蛋白等不溶性蛋白质，只需要适当的溶剂洗去可溶性的伴随物，如脂类、糖类以及其他可溶性蛋白质，最后剩下的就是不溶性蛋白质。这些蛋白质经细胞破碎后，用水、稀盐酸及缓冲液等适当溶剂，将蛋白质溶解出来，再用离心法除去不溶物，即得粗提取液。水适用于白蛋白类蛋白质的抽提。如果抽提物的pH用适当缓冲液控制时，共稳定性及溶解度均能增加。如球蛋白 类能溶于稀盐溶液中，脂蛋白可用 稀的去垢剂溶液如十二烷基硫酸钠、洋地黄皂苷（Digitonin）溶液或有机溶剂来抽提。其它不溶于水的蛋白质通常用稀碱溶液抽提。 蛋白质类别和溶解性质 白蛋白和球蛋白: 溶于水及稀盐、稀酸、稀碱溶液，可被50%饱和度硫酸铵析出。 真球蛋白: 一般在等电点时不溶于水，但加入少量的盐、酸、碱则可溶解。 拟球蛋白: 溶于水，可为50%饱和度硫酸铵析出 醇溶蛋白: 溶于70～80%乙醇中，不溶于水及无水乙醇 壳蛋白: 在等电点不溶于水，也不溶于稀盐酸，易溶于稀酸、稀碱溶液 精蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 组蛋白: 溶于水和稀酸，易在稀氨水中沉淀 硬蛋白质: 不溶于水、盐、稀酸及稀碱 缀合蛋白(包括磷蛋白、粘蛋白、糖蛋白、核蛋白、脂蛋白、血红蛋白、金属蛋白、黄素蛋白和氮苯蛋白等) : 此类蛋白质溶解性质随蛋白质与非蛋白质结合部分的不同而异，除脂蛋白外，一般可溶于稀酸、稀碱及盐溶液中，脂蛋白如
花生蛋白粉生产工艺
加工技术 花生蛋白粉生产工艺 贝惠玲 （广东省食品工业研究所） 【摘要】介绍了以花生蛋白为主要原料，生产花生蛋白粉的制作工艺。 【关键词】花生；蛋白粉；制作工艺 中图分类号：TS278文献标识码：A 文章编号：1009-1807（2001）08-0046-02 花生是我国主要的油料作物之一，其总产量世界排名第二，约占世界花生总产量的15%。花生的综合利用及加工对促进我国农业生产有极其重要的作用；花生蛋白正成为我国重要的植物蛋白资源。 1原材料与制作工艺 1.1材料与主要设备 原辅材料有花生仁、脱脂奶粉及白糖等。 设备有选仁机、花生脱皮机、热烫机、研磨机、均质机、冷热缸、离心分离机、喷雾干燥塔及包装机等。 1.2工艺流程 花生仁→选仁→浸泡→脱红衣→热烫→研磨→精磨→定容→离心分离→含粗纤维的蛋白液→加配料→高压 ↑ →毛油精炼→成品油白糖、奶粉 均质→喷雾干燥→冷却→包装→成品 1.3制作工艺 ①原料选择。选择无霉烂的花生仁。 ②浸泡。于常温水中浸泡0.5h，利于脱红衣。 ③脱红衣。用花生仁专用脱皮机脱去红衣，去皮率可达98%以上。 ④热烫。在96℃热水中热烫5min，其作用是钝化脂肪氧化酶并使花生仁吸水，以利于研磨。 ⑤研磨。先用碟式研磨机进行粗磨，再用胶体磨进行精磨，此时物料细度≤10μm。 ⑥离心分离。用碟片式分离机将花生中的油脂分离出30%，毛油精制为成品油，其余蛋白液生产蛋白粉。分离机转速为5000r/min，比重环90mm。 ⑦杀菌。在85℃条件下保持10min。 ⑧三道均质。三道均质是指将3台均质机串连起来使用，每台使用压力为40～50MPa。含有粗纤维的蛋白液经三道均质后，物料细度可达2μm以下。 ⑨喷雾干燥。采用喷雾干燥塔干燥，进风温度为170～180℃，排风温度为75～80℃，塔身温度为80℃。 ⑩冷却、包装。经喷雾干燥后的花生蛋白粉在包装间内冷却至室温，过筛后包装。 ○1毛油经过乳化处理后，再经碟片式分离机分离为成品油。 2产品配方及质量标准 2.1产品配方 花生仁250k g、白砂糖130k g和脱脂奶粉10k g，加水量至1000k g。 2.2感官指标 色泽：花生蛋白粉呈乳白色。 气味：具有花生应有的香味，无异味。 2.3微生物指标 细菌总数（个/g）：≤10000 大肠菌群（个/100g）：≤90 致病菌不得检出 2.4理化指标 水分（%）：≤3 蔗糖（%）：≤40 砷（以As计）（m g/k g）：≤0.5 铅（以Pb计）（m g/k g）：≤1.0 3结果与讨论 3.1花生的灭酶问题 钝化脂肪氧化酶是花生蛋白生产中的关键工艺措施。经多次试验，选择了96℃热烫5min的钝化工艺，既不会使花生蛋白过度变性（整粒的花生不容易变性），又能钝化酶的活性。经本工艺处理的花生蛋白粉，其过氧化值为油脂的0.03%，低于国际上0.15%的标准，其结果见图1。 3.2花生中粗纤维的利用 生产植物蛋白饮料，通常需要将原料加水研磨，抽提后去除渣滓（粗纤维），其抽提液再经浓缩干燥而成花生蛋白粉。本工艺则是将粗纤维全部利用，即用3台高压均质机在40～50MPa的压力下将粗纤维多次剪切， 4"2""#年第$期《粮油加工与食品机械》
蛋白提取方法
?1 材料与方法 1、1 材料 1、1、１组织与细胞得来源: ?１。1、2 仪器设备?机械组织匀浆器?低温高速离心机(＞40,０0０g) 超速离心机?超生细胞破碎仪 超纯水装置 ??1、1。3 试剂 三氯醋酸(TCＡ) 丙酮 二硫苏糖醇(DＴT) ?尿素?CＨAＰS?PMSF?EDTA ?乙醇?磷酸 考马斯亮蓝Ｒ3５0 ?抑肽素Ａ?亮肽素 试剂纯度均应就是分析纯或以上。? 1。１、４溶液配制?(1) PBS: ?NａCl８g,KCl 0、2 g,Na２HPＯ4 1。44 g,ＫH2PO4,溶于800 ml水中,用HCl调pＨ至7.4,用纯水定容至1 L; ?(2)ＥDTA 储存液: 18.61g Na2EDTA?2Ｈ２O,溶于70 ml纯水中,用10 mol/L NaOH调节ｐH值至8.0(约需2 g ＮａＯH颗粒),定容为100 ml、可高压灭菌后分装备用;?(３) 亮肽素储存液(50 μg/ｍl,100×) １0mｇ/ml溶于水,-75℃保存;使用时配成50 μg/ｍl储液,-２0℃保存; (4) 抑肽素储存液(7０μg／ml,10０×) 1 mg／ｍl溶于甲醇,—75℃保存;使用时配成７0 μg/ml储液,-2０℃保存; (5) PＭＳＦ储存液(１０ｍM,100×): １７.4mｇPMＳF,溶于１ml异丙醇中,—２0℃保存。?ＤTT储存液(1 M): ?０。31ｇDTT溶于2 ｍlＨ2O中,-20℃保存(DTT或含有DTT得溶液不能进行高压处理,可过滤除菌)。?(7) 裂解液: Lysis bufｆｅr Ａ (９M ｕｒeａ,４%ｗ/v ＣＨAＰS, 1％w／v DTT, ０.5％CA and a cｏｃktaiｌof ｐｒoteａｓｅinhibitｏrs)??Lysｉs buffer B (7 M urｅa, 2M ｔhiｏuｒea,4% w/v ＣHＡＰS, 1％w／v DTT,０、５% CA ａnｄａcocktaiｌoｆｐroteａse inhｉbitors) ?Lysｉｓbｕｆｆer C 40 ｍＭTrｉs－base (ｐH 9。5)iｎｕltrapｕｒe H2O Ｌyｓis buffer D (8 Ｍurｅa, 4％CHＡＰS, 4０mM Tris(ｂasｅ), 40 ml) ?Lyｓｉs buffer E ?(５M urea, 2 M tｈioｕreａ, 2％SB3-10, 2％CHAPS,１% w/v DTT, 0、５% CＡandａcocktａｉl ｏｆproteaｓe inhibitors) 100μL SDＳsaｍple solｕｔion (1% w/v SDＳ, 0、3７５M Ｔｒiｓ－HCl, pH8。8, 50 mM DTＴ,２5％v／ｖgly ?LysiｓbｕfｆeｒＦ? ｃeroｌ) ●CA、蛋白酶抑制剂混合物与DＴT在临用前加入。?蛋白酶抑制剂混合物［3]?成分终浓度?蛋白酶抑制剂混合物 PMSF 35 μg/ml oｒ 1 mM EDTA 0、３mg/ml (1 ｍM) 抑肽素 0。7 μg/ｍl?亮肽素 0、5μg／ｍl? 1.2 方法?1。1.1组织蛋白提取方法 １、２.1。1三氯醋酸/丙酮沉淀法[1］?(1)冰上取材,称湿重,置液氮中冻存或直接进行下一步; (2)在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织; ?(３)将粉末悬浮于含DTT(0。2％w／v)得10％三氯醋酸(w/v)得丙酮溶液中; (4)蛋白–２0℃沉淀过夜; ?(5)35０00×g(6℃)离心30min; ?将沉淀重悬于含０.2％DTT得预冷丙酮中; ?(7)-2０℃放置1h; 350０0×g(6℃)离心30min; (9)在通风橱中让丙酮充分挥发,得到干燥得沉淀; 15℃,40000×ｇ,离心1hr; (10)在裂解液中重新溶解沉淀(5０－10０ｍg组织需要1ml裂解液); ?( ) 11 (12)用Ｂraｄｆoｒd法[2］测定上清得蛋白浓度,分装后置–75℃保存。?1、2、1。2超速离心法?(1)取材; ?(2)用研钵在液氮冷冻条件下将样品
蛋白质的提取方法
沉淀法分级蛋白质： 水溶性蛋白质分子表面带有亲水性基团，因此很容易进行水合作用，顺利进入水溶液中。如果溶液的pH偏离等电点，则所有分子会带相同电荷，这进一步增进了它们的分散能力。因此，凡是能破坏蛋白质分子水合作用或者减弱分子间同性相斥作用的因素，都可能降低蛋白质在水中的溶解度，使其沉淀。常用的方法有盐析法和有机溶剂法。 （一）盐析法向蛋白质水溶液中加入中性盐，可以产生两种影响：一是盐离子与蛋白质分子中的极性和离子基团作用，降低蛋白质分子的活度系数，使其溶解度增加。在盐浓度较低时以这种情形为主，蛋白质表现为易于溶解，称为盐溶现象；二是盐离子也与水这种偶极分子作用，使水分子的活度降低，导致蛋白质水合程度的降低，使蛋白质溶解度减少。在盐浓度较高时这种情形起决定性作用，蛋白质便会沉淀，称为盐析现象。采用加入中性盐的方法使各种蛋白质依次分别沉淀的方法称为盐析法。 各种离子盐析能力的强弱可用Hofmeister序列表示： PO4>SO4>C2O4>(CHOHCOO)2>AC>Cl>NO3, K>Rb>Na>Cs>Li>NH4 实际工作中，常用的盐析剂是硫酸铵，因为它盐析能力强，在水中溶解度大，价格便宜，浓度高时也不会引起蛋白质生物活性的丧失。硫酸铵浓溶液的pH约为5.5，配置硫酸铵饱和溶液时，可在水中加过饱和量的硫酸铵，加温至50℃，至大部分盐溶解，室温放置过夜后，再用NaOH或硫酸调所需pH。 （二）有机溶剂沉淀法在等电点附近，蛋白质分子主要以偶极离子形式存在。这时如果添加有机溶剂，由于有机溶剂有较低的介电常数，会使溶液介电常数减小，根据库伦定律，这样会增强偶极离子之间的静电引力，从而使分子聚集沉淀。另一方面，有机溶剂本身的水合作用会破坏蛋白质表面的水合层，也促使蛋白分子脱水沉淀。选用有机溶剂的原则是：1.必须能与水完全混溶；2.不与蛋白质发生反应；3.要有较好的沉淀效应；4.溶剂蒸汽无毒，且不易燃。丙酮和乙醇是使用最为广泛的两种有机溶剂。在低介电常数环境中，蛋白质分子基团间的作用力会受到影响，超过限度时会使蛋白质变性。因此，有机溶剂沉淀法一般都要在低温下进行。蛋白质分子本身是多价离子，对溶液介电常数有相当贡献。当蛋白浓度太低时，如添加有机溶剂过度会产生变性现象，若这时加入介电常数大的物质（如甘氨酸），可避免蛋白变性。蛋白浓度高时，介电常数也相应提高，可以减少蛋白变性。 （三）有机聚合物沉淀法除了盐和有机溶剂能使蛋白质沉淀外，水溶性中性高聚物也能沉淀蛋白质。分子量高于4000的PEG可以非常有效地沉淀蛋白质。最常用的使分子量6000和20000的PEG。PEG可以看作是聚合的有机溶剂，其作用原理可能与有机溶剂类似。聚丙烯酸可以沉淀带正电蛋白质。聚丙烯酸分子上有相当多的羧基，碱性蛋白质含较多的碱性基团，羧基和碱性基团形成盐键，则把聚丙烯酸和碱性蛋白结成成很大颗粒沉淀下来。沉淀时碱性蛋白与溶液分开，加入钙离子后，聚丙烯酸成钙盐，蛋白质则游离出来。
蛋白提取方法
1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 组织和细胞的来源： 1.1.2 仪器设备 机械组织匀浆器 低温高速离心机(>40,000 g) 超速离心机 超生细胞破碎仪 超纯水装置 1.1.3 试剂 三氯醋酸(TCA) 丙酮 二硫苏糖醇(DTT) 尿素 CHAPS PMSF EDTA 乙醇 磷酸 考马斯亮蓝R350 抑肽素A 亮肽素 试剂纯度均应是分析纯或以上。 1.1.4 溶液配制 (1) PBS： NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4 1.44 g, KH2PO4，溶于800 ml水中，用HCl调pH至7.4，用纯水定容至1 L； (2) EDTA 储存液： 18.61 g Na2EDTA?2H2O，溶于70 ml纯水中，用10 mol/L NaOH调节pH值至8.0 (约需2 g NaOH颗粒)，定容为100 ml。可高压灭菌后分装备用； (3) 亮肽素储存液(50 μg/ml，100×) 10 mg/ml溶于水，-75℃保存；使用时配成50 μg/ml储液，-20℃保存； (4) 抑肽素储存液(70 μg/ml，100×) 1 mg/ml溶于甲醇，-75℃保存；使用时配成70 μg/ml储液，-20℃保存； (5) PMSF储存液(10 mM, 100×): 17.4 mg PMSF，溶于1ml异丙醇中，-20℃保存。 DTT 储存液(1 M): 0.31 g DTT溶于2 ml H2O中，-20℃保存(DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理，可过滤除菌)。 (7) 裂解液:
Lysis buffer A (9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors) Lysis buffer B (7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors) Lysis buffer C 40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2O Lysis buffer D (8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml) Lysis buffer E (5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors) Lysis buffer F 100 μL SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT, 25% v/v glycerol) ●CA、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。 蛋白酶抑制剂混合物[3] 成分终浓度 蛋白酶抑制剂混合物 PMSF 35 μg/ml or 1 mM EDTA 0.3 mg/ml (1 mM) 抑肽素 0.7 μg/ml 亮肽素 0.5 μg/ml 1.2 方法 1.1.1组织蛋白提取方法 1.2.1.1三氯醋酸/丙酮沉淀法[1] (1)冰上取材，称湿重，置液氮中冻存或直接进行下一步； (2)在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织； (3)将粉末悬浮于含DTT(0.2%w/v)的10%三氯醋酸（w/v）的丙酮溶液中； (4)蛋白–20℃沉淀过夜； (5)35000×g(6℃)离心30min； 将沉淀重悬于含0.2%DTT的预冷丙酮中； (7)-20℃放置1h； 35000×g(6℃)离心30min； (9)在通风橱中让丙酮充分挥发，得到干燥的沉淀； (10)在裂解液中重新溶解沉淀（50-100mg组织需要1ml裂解液）； (11)15℃,40000×g，离心1hr； (12)用Bradford法[2]测定上清的蛋白浓度，分装后置–75℃保存。 1.2.1.2超速离心法 (1)取材； (2)用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每1g样品加入0.5ml裂解液，使用组织匀浆器匀浆30s；