发酵工程 举例说明如何通过代谢调控提高微生物产物产量

举例说明如何通过代谢调控提高微生物产物产量

2013.6.16 微生物有着一整套可塑性极强和极精确的代谢调节系统，以保证上千种酶能正确无误、有条不紊地进行极其复杂的新陈代谢反应。从细胞水平上来看，微生物的代谢调节能力要超过复杂的高等动植物。这是因为，微生物细胞的体积极小，而所处的环境条件却十分多变，每个细胞要在这样复杂的环境条件下求得生存和发展，就必须具备一整套发达的代谢调节系统。在长期进化过程中，微生物发展出一整套十分有效的代谢调节方式，巧妙地解决了这一矛盾。

通过代谢调节微生物可最经济地利用其营养物，合成出能满足自己生长、繁殖所需要的一切中间代谢物，并做到既不缺乏也不剩余任何代谢物的高效“经济核算”。

正常情况下，微生物代谢产物由于反馈抑制和反馈阻遏是不会大量积累的。但自然界里常发现一些微生物产生了过量的代谢产物，这主要是由于这些微生物代谢机制失调造成的，在工业发酵上，可运用遗传的和环境的控制和人为的代谢调节，使其产物大量积累。

如氨基酸发酵生产就是在代谢调节研究的基础上发展起来的。目前已经能够在转录和翻译上控制微生物的代谢，使微生物工业发酵进入了一个崭新阶段，即代谢控制发酵阶段。所谓的代谢控制发酵，就是人为地在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢活动，使目的产物大量生成、积累。

一般改变微生物代谢调节的方法有如下几种:

第一种是采用物理化学诱变，获得营养缺陷型

第二种方法是应用抗反馈调节突变法。

第三种就是控制发酵条件，改变细胞的渗透性。

一、应用营养缺陷型菌株以解除正常的反馈调节

这是氨基酸生产菌育种的最有效的办法。营养缺陷型是指某菌种失去合成某种物质的能力，即合成途径中某一步发生突变，使合成反应不能完成，最终产物不能积累到引起反馈调节的浓度，从而有利于中间产物的积累。例如，用高丝氨酸缺陷型生产菌进行赖氨酸发酵。一般在形成赖氨酸的过程中有3种产

物生成，只有赖氨酸和苏氨酸都达到一定浓度时，才能形成反馈抑制，从高丝氨酸切断这两个分支后，不能形成苏氨酸，也就不能形成反馈抑制。最后使赖氨酸的大量积累，这是打破代谢调节的第一种方法。

在直线式的合成途径中，营养缺陷型突变株只能累积中间代谢物而不能累积最终代谢物。

在分支代谢途径中，通过解除某种反馈调节，就可以使某一分支途径的末端产物得到累积。

黄色短杆菌的代谢过程

人工控制黄色短杆菌的代谢过程生产赖氨酸

二、应用抗反馈调节的突变株解除反馈调节

抗反馈调节突变菌株，指对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性的组成型菌株，或兼而有之的菌株。在这类菌株中，因其反馈抑制或阻遏已解除，或是反馈抑制和阻遏已同时解除，所以能分泌大量的末端代谢产物。

例如，当把Corynebacteriumcrenatum（钝齿棒杆菌）培养在含苏氨酸和异亮氨酸的结构类似物AHV（α-氨基-β-羟基戊酸）的培养基上时，由于AHV可干扰该菌的高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸脱氢酶以及二羧酸脱水酶，所以抑制了该菌的正常生长。如果采用诱变（如用亚硝基胍作为诱变剂）后所获得的抗AHV突变株进行发酵，就能分泌较多的苏氨酸和异亮氨酸。这是因为，该突变株的高丝氨酸脱氢酶或苏氨酸脱氢酶和二羧酸脱水酶的结构基因发生了突变，故不再受苏氨酸或异亮氨酸的反馈抑制，于是有大量的苏氨酸和异亮氨酸的累积。如进一步再选育出甲硫氨酸缺陷型菌株，则其苏氨酸产量还可进一步提高，原因是甲硫氨酸合成途径上的两个反馈阻遏也被解除了。

三、控制细胞膜的渗透性

微生物的细胞膜对于细胞内外物质的运输具有高度选择性。细胞内的代谢产物高浓度累积着，并自然地通过反馈阻遏限制了它们的进一步合成。采取生理

学或遗传学方法，改变细胞膜的透性，使细胞内的代谢产物迅速渗漏到细胞外。这种解除末端产物反馈抑制作用的菌株，可以提高发酵产物的产量。

1．通过生理学手段控制细胞膜的渗透性在谷氨酸发酵生产中，生物素的浓度对谷氨酸的累积有着明显的影响，只有把生物素的浓度控制在亚适量情况下，才能分泌出大量的谷氨酸。

生物素影响细胞膜渗透性的原因，是由于它是脂肪酸生物合成中乙酰CoA 羧化酶的辅基，此酶可催化乙酰CoA的羧化并生成丙二酸单酰辅酶A，进而合成细胞膜磷脂的主要成分——脂肪酸。因此，控制生物素的含量就可以改变细胞膜的成分，进而改变膜的透性和影响谷氨酸的分泌。

当培养液内生物素含量很高时，只要添加适量的青霉素也有提高谷氨酸产量的效果。其原因是青霉素可抑制细菌细胞壁肽聚糖合成中转肽酶的活性，结果引起其结构中肽桥间无法进行交联，造成细胞壁的缺损。这种细胞的细胞膜在细胞膨压的作用下，有利于代谢产物的外渗，并因此降低了谷氨酸的反馈抑制和提高了产量。

2．通过细胞膜缺损突变而控制其渗透性应用谷氨酸产生菌的油酸缺陷型菌株，在限量添加油酸的培养基中，也能因细胞膜发生渗漏而提高谷氨酸的产量。这是因为油酸是一种含有一个双键的不饱和脂肪酸（十八碳烯酸），它是细菌细胞膜磷脂中的重要脂肪酸。油酸缺陷型突变株因其不能合成油酸而使细胞膜缺损。另一种可以利用石油发酵产生谷氨酸的Corynebacteriumhydrocarbolastus（解烃棒杆菌）的甘油缺陷型突变株，由于缺乏a-磷酸甘油脱氢酶，故无法合成甘油和磷脂。其细胞内的磷脂含量不到亲株含量的一半，但当供应适量甘油（200μg/ml）时，菌体即能合成大量谷氨酸（72g/L），且不受高浓度生物素或油酸的干扰。