生物化学BIOCHEMISTRY

生物化学BIOCHEMISTRY

绪论Prolegomena

What is BIOCHEMISTRY?

CHEMISTRY：the branch of science which deals with the identification of the substances of which matter is composed, the investigation of their properties and the ways in which they interact, combine, and change, and the use of these processes to form new substances

Biochemistry: the branch of science concerned with the chemical and physic-chemical processes which occur within living organisms

Including:

The chemistry of the components in living organisms (static biochemistry)

The principles for the chemical changes in living organisms (dynamic biochemistry)

The chemistry of metabolism and cell functions (functional biochemistry)

生物化学的主要分支：

按化学的研究范畴划分：生物无机化学（bioinorganic chemistry），生物有机化学（bioorganic chemistry），生物物理化学（biophysical chemistry）

按生物学的研究领域划分：动物生物化学（animal biochemistry），植物生物化学（plant biochemistry），微生物生物化学（microbe biochemistry）

按研究对象划分：蛋白质化学（protein chemistry），核酸化学（nucleate chemistry）

按与生产、生活关系划分：生理生化（physiological biochemistry），工业生化（industrial biochemistry），农业生化（agricultural biochemistry），医药生化（medicinal biochemistry）

生物化学的使命：揭示生命现象的本质，促进生命科学发展；改善人类健康水平和生活质量；促进物种的改良和优化；带动工、农业的发展和变革

分子生物学Molecular biology：

什么是分子生物学：在分子水平上研究生物大分子的结构与功能，从而阐明生命现象本质的科学

主要研究领域：蛋白质体系，蛋白质-核酸体系，蛋白质-脂质体系

分子生物学的三个支柱学科：生物化学，遗传学，微生物学

分子生物学的地位：由学科分支成长为主流前沿，殊途同归的集大成者，生物学科走向统一的前驱

古代生物化学（在化学中萌芽）：

19世纪以前：A.L. Lavoisier, “呼吸作用的本质和燃烧是一样的”；C.W. Scheele, 多种生化物质的分离；J.von.Liebig, 新陈代谢（stoff wechsel)；Hoppe Seyler, 1877年，提出“biochemie”近代生物化学（由静态走向动态）：

19世纪中叶——20世纪50年代，相关学科的蓬勃发展：1804，John Dalton 提出原子论；1859，Port Darwin 进化论；1865，Gregor Mendel 遗传定律；1869，D.L.Mendelyeev 元素周期律

生物化学的发展：

1848, Helmhoitz & Bernard，肝脏的生糖功能；1869，J.F. Michel 分离“核素”（核酸）；1897，Bucher ，酵母榨出液可使蔗糖发酵生成乙醇；1902，D.A. Leeven，从核酸中分离胞嘧啶；1904，Knoop ，脂肪酸的 -氧化；1907，E.H. Fischer ，蛋白质的降解与合成；1912，F.G. Hopkins，确立维生素概念，形成剑桥生物化学学派；1921，F.G.班廷和C.H.贝斯特，分离纯胰岛素；1926，J.B. Sumner 分离脲酶，并证明其是蛋白质；1929，Lohmann & Fiske ，ATP的能量功能；1931，Warburg 制得呼吸酶并研究其生物氧化作用；1937，Krebs，三羧

酸循环的假说；1950，L.C. Pauling，蛋白质构象（α-helix）；1953，Watson & Crick DNA的双螺旋模型

现代生物化学阶段（分子生物学时代）：

20世纪中叶——至今，技术的进步使生物学走向新的时代：1933，Ernst Ruska，电子显微镜，1935，G.C. 海韦希，同位素技术，1940?s，遗传学开始向分子水平迈进，1930?s~1940?s，计算机和自动控制技术的巨大进步

生物学各分支向分子水平进军并走向融合：

A. L. Hodgkin, 神经兴奋和传导的离子学说；1953，F. Sanger，胰岛素序列测定；1954，S. Benzer，噬菌体基因精细结构分析；1954，M. Calvin，光合作用的CO2固定，Calvin循环；1956，E.W. 萨瑟兰，cAMP，第二信使；1956，F.H.C. Crick，中心法则；1962，M. W. Nirenberg，遗传密码的发现；1965，邹承鲁、刑其毅等，人工合成牛胰岛素；1970，H.O. Smith，限制性内切酶；1970，梁栋材等，精度0.25nm的胰岛素结构（1974，达0.18nm）；1975，F. Sanger，建立DNA序列分析方法；1980，A. Keluger，DNA与组蛋白的结构

基因工程和基因技术的兴起：

P. Berg，DNA体外重组；1973，S.N. Cohen，外源基因在大肠杆菌的表达；1975，美国Asiomar 国际会议，制定第一个基因安全准则；1977，H.W. Boyer等，第一个基因工程产品——生长激素释放抑制激素（somatostatin）；1983，λ噬菌体DNA全序列；1985，Mulis，聚合酶链式反应技术（PCR)；1987，转基因植物：荧光素转入烟草；1990，Anderson & Cular 第一例基因治疗成功；1997，第一只成年动物体细胞克隆的绵羊——Dolly；2000，人类基因组计划（HGP）公布第一张草图

生物化学的一些基本问题

什么是生命：我们所处在的地球充满着无数的生物，从最简单的病毒、类病毒到菌藻树草，从鱼虫鸟兽到最复杂的人类，处处都可以发现它们的踪迹，觉察到生命的活动。地球上的生物形形色色，千姿百态。不同的生物，其形态、生理特征和对环境的适应能力各不相同，都经历着生长、发育、衰老、死亡的变化，都具有繁殖后代的能力。

生命的特征：新陈代谢、生长发育、繁衍后代、遗传变异、环境应激性、自主运动、进化演变；结构复杂性、组织性和有序性、物质能量交换、生长发育、遗传变异、环境应激性、进化演变

生命的定义：

“生命是蛋白体的存在方式，这个存在方式的基本因素在于和它周围的外部自然界的不断地新陈代谢，而且这种新陈代谢一停止，生命就随之停止，结果便是蛋白质的分解。”——恩格斯

“生命是开放的非平衡系统中发生的一系列过程”——鲍尔

“非平衡态是通过熵从生物体流向周围介质来维持的”（耗散结构）——薛定鄂

生命是高度有序的，开放的，具有耗散特征的，远离平衡态的动力学系统，其基本框架为：DNA-RNA-蛋白质不断更新的自组织属性具有多级超循环结构在生命系统混沌与吸引子作用下不断朝更高层次迈进

生命的化学基础：全世界250余万种生物，无论是形态结构还是生理过程都千姿百态，迥然不同，但他们却有着相似的化学基础。从分子到细胞（图）

生命的化学组成：水：65%-75% 蛋白质：10%-15% 脂质：3%-7% 糖类：2%-4% 核酸：3%-5%其他有机物：<1% 无机物：2%-3%

构成生命的化学元素：组成生命体的物质是极其复杂的。但在地球上存在的92种天然元素中，只有28种元素在生物体内被发现。

第一类元素：包括C、H、O和N四种元素，是组成生命体最基本的元素。这四种元素约占

了生物体总质量的99%以上。

第二类元素：包括S、P、Cl、Ca、K、Na和Mg。这类元素也是组成生命体的基本元素。第三类元素：包括Fe、Cu、Co、Mn和Zn。是生物体内存在的主要少量元素。

第四类元素：包括Al、As、Be、Br、Cr、F、I、Mo、Se、Si等。

重要的有机化学概念：

什么是有机物：有机物原义是“有生机的物质”，即来自于生命体的物质。“有机”、“无机”并无绝对界限。从目前来看，有机化学主要研究是以C、H元素共价结合体为骨架的“有机化合物”的结构、特性以及相互之间的转化和反应

C 原子是构成有机分子的重要元素，它能形成四个稳定共价键，是有机分子的骨架；H 原子做为最小的原子，具有形成稳定共价键以及离子键、氢键的能力；所有有机化合物均包含C、H元素构成的分子骨架

一般情况下，C原子的四跟共价键是对称的，形成四棱锥结构。对C-C单键连接的分子我们一般接受这一假设；C原子可绕单键自由旋转；C=C双键或三键具有刚性，因此C 原子与其他相连原子处于同一平面，不能旋转。

三种常用的有机分子结构：Fisher，Ball-and-stick，Space filling (图)

重要的有机官能团：所谓官能团，是指有机化合物中区别于共同碳骨架的结构部分。一般有机分子的化学性质主要取决于官能团。复杂的有机分子通常有多个官能团。

甲基，乙基，苯基，羟基，醛基，酮基，羧基，酯，醚，酐，乙酰磷酸，磷酸酐，氨基，酰氨基，胍基，咪唑基，巯基，二硫键，硫酯

有机分子的构型构象：

不对称碳原子：当一个C原子上连接的4个基团各不相同时，该C原子即不对称C原子，因不对称C原子上基团连接方式的不同，而产生有机分子的不同构型和手性现象。

构型：指有机分子内部基团的共价连接方式的差异。改变构型必须断裂共价键。

构象：由于各基团绕C原子旋转而产生的有机分子内各原子的空间排布的差异，不涉及共价键的断裂

R、S构型命名系统，D、L构型命名系统

生物化学反应的基本原则：

1，共价键是通过两个原子共用外层电子而形成的：原子有通过获得、失去或共享电子的方式，达到“满电子状态”的倾向；如果形成共价键的原子“电负性”相近，那么形成的共价键是非极性的，否则就是“极性的”；共价键的强弱，可用“键能”来衡量，所谓“键能”就是断裂该键所需的能量，或者该键形成时所释放的能量。

2，多数生化反应是通过“亲核基团”攻击“亲电基团”来实现的：“亲核基团”指那些含有多余电子，倾向于通过提供共享电子而形成共价键的官能团或原子，含O、N、S的基团是生化中常见的“亲核基团”；“亲电基团”指有空的电子轨道，倾向于通过捕获电子而形成共价键的官能团或原子，H+和金属阳离子是生化中常见的“亲电基团”；C原子可同时表现为C+、C-（取决于所连接的基团）。

重要的生物化学反应形式：氧化-还原（oxidation-reduction reaction）；取代反应（substitution reaction)；异构化反应（isomerization reaction）；缩合反应（condensation reaction）中的脱水反应（dehydration reaction）；裂解反应（lytic reaction）中的水解反应（hydrolytic reaction）。（图）电负性，键能，化学反应键的断裂有均裂和异裂，细胞内常见的亲核基团（含电负性较强的原子，具有孤对电子），SN1反应和SN2反应，异构化反应，氨基酸的脱水反应和二肽的水解反应。

生物分子间的其他非共价的相互作用力：

氢键：两个电负性原子（O，N）分享一个H原子和形成；离子键：不同电荷的基团之间的

相互吸引；疏水力：非极性基团相互聚集而排斥水分子或极性分子产生；范德华氏力：当两原子相互临近时产生。

蛋白质Proteins（I）——Amino Acids and Proteins

蛋白质概述The overview for proteins

protein, any of a class of nitrogenous organic compounds which have large molecules composed of one or more long chains of amino acids and are an essential part of all living organisms,especially as structural components of body tissues such as muscle, hair, collagen, etc., and as enzymes and antibodies ：Carbon 50％；Hydrogen 7％；Oxygen 23％；Nitrogen 16%；Sulphur0—3％；Other Trace（微量）

The content of Nitrogen in proteins is mostly 16%，Content of protein（g%）=the content of Nitrogen in the biological simples per gram ? 6.25

Proteins are macromolecules with huge Molecular Weight （6,000-1,000,000）

The Molecular Weight of a protein due to the amino acid constitute in it.

The quantity of amino-acids residue in a protein without prosthetic group could be reckoned by divided its molecular weight by 110.

The average molecular weight(MW) of amino-acids is 138，but most of amino-acids in proteins are small, they have an average MW at 128，then, take of the MW of water,18, when they dehydrated to form protein. So we got the MW of amino-acids residue in protein is 110

蛋白质的分类：

1，简单蛋白（Simple protein）:除氨基酸以外不含其他成分的蛋白质：

清蛋白（albumin）：溶于水、稀酸或稀碱；为饱和硫酸铵沉淀；e.g. 血清清蛋白、乳清清蛋白

球蛋白（globulin）为半饱和硫酸铵沉淀。（优球蛋白（euglobulin），不溶于水，溶于稀盐溶液；拟球蛋白（pseuglobulin），溶于水。）e.g.血清球蛋白、肌球蛋白、种子球蛋白

谷蛋白（glutelin）：不溶于水、醇、中性盐；易溶于稀酸或稀碱。e.g. 米谷蛋白、面谷蛋白醇溶谷蛋白（prolamine）不溶于水无水乙醇，溶于70-80%的乙醇，含脯氨酸和酰胺较多。e.g. 玉米醇溶蛋白、麦醇溶蛋白

组蛋白（histone）溶于水和稀酸，为氨水沉淀。分子含碱性氨基酸较多。 e.g. 小牛胸腺组蛋白

精蛋白（protamine）溶于水和稀酸，不溶于氨水。含碱性氨基酸特别多。 e.g. 鱼精蛋白、蛙精蛋白

硬蛋白（scleroprotein）不溶于水、盐、稀酸或稀碱。e.g. 角蛋白、胶原、弹性蛋白,

2，结合蛋白（conjugated protein）:除由氨基酸组成蛋白质部分外，还含有非蛋白成分，这些非蛋白成分，有时称辅基（prosthetic group）或配基（ligand）：

核蛋白（nucleprotein）辅基为核酸。e.g. 脱氧核糖核蛋白、核糖体

脂蛋白（lipoprotein）与脂质结合的蛋白，e.g. β1-脂蛋白，卵黄球蛋白

糖蛋白（glycoprotein）含单糖或多糖的蛋白质，e.g. 卵清蛋白、γ-球蛋白（抗体）、血型蛋白

磷蛋白（phosphoprotein）辅基为磷酸基的蛋白质。e.g. 酪蛋白，胃蛋白酶

卟啉蛋白（porphyrin protein）辅基含卟啉环的蛋白质，e.g. 血红蛋白、细胞色素C，叶绿蛋白，血蓝蛋白

黄素蛋白（flavoprotein）辅基为黄素腺嘌呤二核苷酸。 e.g. 琥珀酸脱氢酶、D-氨基酸氧化酶

金属蛋白（metalloprotein）与金属直接结合的蛋白质， e.g. 铁蛋白，乙醇脱氢酶，黄嘌呤氧化酶

3，根据蛋白质的分子外形分类：

球状蛋白质（globular proteins），纤维状蛋白质（fibrous proteins）

4，根据蛋白质功能分类：

结构蛋白质（structural proteins），酶蛋白（enzymes），运输蛋白质（transport proteins），运动蛋白质（kinesis proteins），贮藏蛋白质（storage proteins），防御蛋白质（defensive proteins）The brief review of Protein’s function：

Structural materials （结构物质）

Metabolic Catalysis （代谢作用催化）

Storages of Nutritions （营养贮藏）

Transport between organisms and its environment（运输）

Motility functions for organisms and cells（运动）

Metabolic regulation（调节）

Biological Defense: immune （免疫）

Signal transduction and response（转导应答膜）

Record, Transcription and express the genetic information, control the growth of organisms

蛋白质的基本结构单位-氨基酸：

蛋白质的水解：

酸水解：常用6 mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸在105-110℃条件下进行水解，反应时间约20小时。优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是色氨酸被沸酸完全破坏；含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；天冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。

碱水解：一般用5 mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。部分的水解产物发生消旋化。该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏。

酶水解：目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（proteolytic enzyme）或称蛋白酶（proteinase）已有十多种。应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。最常见的蛋白水解酶有：胰蛋白酶（trypsin），胃蛋白酶（pepsin）、糜蛋白酶（chymotrypsin）、木瓜蛋白酶（papain）

氨基酸（amino acids, Aa）的结构通式：

生物体中发现的氨基酸达180余种，但组成蛋白质的基本氨基酸一共只有20种

?甘氨酸（glycine）氨基乙酸Gly G

?丙氨酸（alanine）α-氨基丙酸Ala A

?缬氨酸（valine）α-氨基异戊酸Val V

?亮氨酸（leucine）α-氨基异己酸Leu L

?异亮氨酸（isoleucine）α-氨基-β-甲基戊酸Ile I

?丝氨酸（serine）α-氨基-β-羟基丙酸Ser S

?苏氨酸（threonine）α-氨基-β-羟基丁酸Thr T

?半胱氨酸（cysteine）α-氨基-β-巯基丙酸Cys C

?甲硫氨酸（methionine）α-氨基-γ-巯基丁酸Met M

?天冬酰胺（asparagine）α-氨基丁二酸- β-酰胺Asn N

?谷氨酰胺（Glutamine）α-氨基戊二酸- γ-酰胺Gln Q

?天冬氨酸（aspartic acid）α-氨基丁二酸Asp D

?谷氨酸（glutamic acid ）α-氨基戊二酸Glu E

?赖氨酸（lysine）α,ε-二氨基己酸Lys K

?精氨酸（arginine）α-氨基-δ-胍基戊酸Arg R

?苯丙氨酸（phenylalanine）α-氨基-β-苯基丙酸Phe F

?酪氨酸（tyrosine）α-氨基-β-对羟苯基丙酸Tyr Y

?色氨酸（tryptophan）α-氨基-β-吲哚基丙酸Trp W

?组氨酸（histidine）α-氨基-β-咪唑基丙酸His H

?脯氨酸（proline）β-吡咯烷基-α-羧酸Pro P

除脯氨酸外，基本氨基酸的共同结构特点是：与羧基相邻的α-C原子上都有氨基，称α-氨基酸。除甘氨酸外，基本氨基酸的α-碳原子都是手性碳原子，因此都具有旋光性。构成蛋白质的基本氨基酸，α-碳原子都属L-构型。

氨基酸的分类：

1，根据侧链R基的化学结构可分为脂肪族、芳香族、杂环族和杂环亚族。

脂肪族氨基酸：一氨基一羧基中性Aa：Gly、Ala、Val、Leu、Ile，含羟基的Aa：Ser、Thr，含硫的Aa：Cys、Met，含酰胺基的Aa：Asn、Gln，一氨基二羧基的Aa：Asp、Glu，二氨基一羧基的Aa：Lys、Arg。

芳香族氨基酸：Phe、Tyr

杂环族氨基酸：Trp、His

杂环亚氨基酸：Pro

2，按侧链R基的极性性质分类：

非极性R基Aa：Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Met、Pro

不带电荷的极性R基Aa：Ser、Thr、Tyr、Asn、Gln、Cys、Gly

带正电荷的极性R基Aa：Lys、Arg、His

带负电荷的极性R基Aa：Glu、Asp

?必需氨基酸：Ile、Met、V al、Leu、Trp、Phe、Thr、Lys，（携一两本甲色书来）

其他不常见氨基酸：

蛋白质氨基酸：不常见Aa通常由常见Aa衍生：

4-羟脯氨酸：胶原；5-羟赖氨酸：胶原；6-N-甲基赖氨酸：肌球蛋白；γ-羧基谷氨酸：凝血酶原；锁链素：弹性蛋白；微生物和昆虫的蛋白质常含有D-氨基酸

非蛋白质氨基酸：β-丙氨酸（β-Ala）；γ-氨基丁酸；L-瓜氨酸（L-Cit）；L-鸟氨酸（L-Orn）怎样记忆氨基酸的分类：

记少不记多，记简不记繁，口诀：甘丙丝半苏缬蛋；亮和异亮中性完；酸性谷氨天门冬；精氨赖氨皆是碱；芳香族里酪苯丙；组氨色脯有杂环。

氨基酸的理化性质：

一般物理性质：无色晶体，熔点高（200?C），有味（不同），能溶于水，不溶于有机溶剂

旋光性：除甘氨酸外，都具有旋光性。

光吸收：可见光区域没有光吸收。远紫外（λ<200nm）都有光吸收。近紫外（220-300nm）只有Tyr、Phe、Trp有光吸收

两性性质与等电点：

氨基酸的两性电离：在水等极性介质中，Aa的偶极离子在水中：既起酸（质子供体）的作用。又起碱（质子受体）的作用。按Lowry的酸碱质子理论，酸是质子供体，碱是质子受体

等电点和等点状态：

Aa的带电状态与溶液的pH值有关，当Aa所带的正电荷和负电荷相等即净电荷为0的兼性

离子状态：称等电状态。使Aa处于等电状态的pH称为氨基酸的等电点

中性Aa的等电点：对于侧链基团不解离的氨基酸有：pI = (pK1+pK2)/2

酸性Aa的等电点：An acidic amino acid pI=(pK1+pKR)/2

碱性Aa的等电点：A basic amino acid pI=(pKR+pK2)/2

氨基酸的滴定：一般情况下氨基酸不能被滴定：等当点pH或过高（12-13），或过低（1-2），没有适当的指示剂可被选用。

氨基酸的甲醛滴定法：向AA溶液中加入过量的甲醛，用标准NaOH滴定时，由于甲醛与Aa中的-NH2作用形成-NH.CH2OH -N (CH2OH)2等羟甲基衍生物而降低了氨基的碱性，相对地增强了-NH3+的酸性解离，使Pk'2减少了2-3个pH单位，NaOH滴定的曲线A向pH 低的方向转移，滴定终点也移动pH9附近。

原因：甲醛与H2N-CH2-COO-结合,有效地减低了后者的浓度,所以对于加入任何量的碱, [H2N-CH2-COO- ]/ [+H3N-CH2-COO- ]的比值总要比不存在甲醛的情况下小得多。加入甲醛的甘氨酸溶液用标准盐酸滴定时，滴定曲线B并不发生改变。

氨基酸的常见化学反应：

1，α-氨基的反应：

（1）亚硝酸反应：范围：可用于Aa定量和蛋白质水解程度的测定（Van slyke法）。注意：生成的氮气只有一半来自于Aa，ε氨基酸也可反应，速度较慢．

（2）与酰化试剂的反应：Aa＋酰氯，酸酐－→Aa被酰基化。丹磺酰氯用于多肽链末端Ａa的标记和微量Ａa的定量测量．

（3）烃基化反应：Aa的氨基的一个氢原子可被烃基（包括环烃及其衍生物）取代．

与2，4－二硝基氟苯（DNFB，FDNB）反应，最早Sanger用来鉴定多肽或蛋白质的氨基末端的Aa

与苯异硫氰酸酯（PITC）的反应，Edman用于鉴定多肽或蛋白质的N末端Aa．在多肽和蛋白质的Aa顺序分析方面占有重要地位（Edman降解法）

（4）形成西佛碱反应：Aa的α-NH2能与醛类化合物反应生成弱碱，即西佛碱（schiff …s base）。前述甲醛滴定也属于西佛碱反应

（5）脱氨基反应：Aa在生物体内经Aa氧化酶催化即脱去α-NH2而转变成酮酸2，α-COOH参加的反应：

（1）成盐和成酯反应

Aa + 碱－→盐：Aa + NaOH －→氨基酸钠盐(重金属盐不溶于水)

Aa-COOH + 醇－→酯：Aa+ EtOH －－－→氨基酸乙酯的盐酸盐（该反应以干燥的HCL 气体为催化剂，二氯亚砜做干燥剂）（Aa酯是制备Aa的酰氨or酰肼的中间物）

（2）当Aa的COOH变成甲酯，乙酯或钠盐后，COOH的化学反应性能被掩蔽或者说COOH 被保护，NH2的化学性能得到了加强或活化，易与酰基结合。

成酰氯反应：当氨基酸的氨基用适当的保护基保护以后，其羧基可与二氯亚砜作用生成酰氯。用于多肽人工合成中的羧基激活

叠氮反应：氨基酸的氨基通过酰化保护后，羧基经酯化转变为甲酯，然后与肼和亚硝酸变成叠氮化合物。用于多肽人工合成中的羧基激活

脱羧基反应：AA在脱羧酶的催化下生成一级胺和CO2。

3，α-氨基和α-羧基共同参与的反应

（1）与茚三酮反应：茚三酮在弱酸性溶液中与α-氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氨、脱羧反应，最后茚三酮与反应产物中的氨和还原茚三酮发生作用生成紫色物质。Pro与hyPro （羟脯氨酸）不释放氨，而直接生成黄色化合物。该反应用以定性，定量测定各种Aa，蛋白质，测定CO2 的量，从而可计算参加反应的Aa的量。

（2）成肽反应：一个Aa的NH2+另一个Aa的COOH可以缩合成肽，形成的键称肽键。4，侧链R基参加的反应

（1）R功能基：羟基，酚基，巯基（二硫键），吲哚基，咪唑基，胍基，甲硫基，非α-NH2,非α-COOH。

酪氨酸的酚基在3和5位上容易发生亲电取代反应：二碘酪氨酸或一硝基酪氨酸和二硝基酪氨酸。酪氨酸的酚基可以与重氮化合物（对氨基苯磺酸的重氮盐）生成桔黄色的化合物。——Pauly反应。组氨酸的咪唑基可以发生类似反应但产物颜色为棕红色。

精氨酸的侧链胍基在硼酸钠缓冲液（pH 8-9, 25-35?C）中，与1.2-环已二酮反应，生成缩合物。该缩合物在羟胺缓冲液中，重新生成Arg。

色氨酸的侧链吲哚基在温和条件下可被N－溴代琥珀酰亚胺（N-bromosuccinimide）氧化。此反应可用于分光光度法测定蛋白质中色氨酸的含量，并能在色氨酸和酪氨酸残基处选择性化学断裂肽键。

蛋氨酸侧链上的甲硫基是一个很强的亲核基团，与烃化试剂如甲基碘容易形成锍盐（sulfonium salt）

此反应可被硫基试剂逆转。在逆转反应中，原有的甲基和新加入的甲基除去的机会是相等的，因此当用14C标记的甲基碘处理时，获得的蛋氨酸将有50%是同位素标记的。

半胱氨酸侧链上的巯基（－SH）有很强的反应活性，可参与很多反应：

二硫键的形成和打开：2R-SH + 1/2 O2－→R-S-S-R + H2O ；Cu2+，Fe2+ ，Co2+和Mn2+存在下，巯基的空气氧化将显著提高。

胱氨酸中的二硫键在稳定蛋白质的构象上起很大的作用。氧化剂和还原剂都可打开二硫键。过甲酸可以定量地打开二硫键，生成磺基丙氨酸（cysteic acid）残基。还原剂如巯基化合物（R-SH）也能打开二硫键，生成半胱氨酸残基及相应的二硫化物

二硫苏糖醇（dithiothreitol，缩写为DTT），与胱氨酸中的二硫键反应形成一个含分子内二硫键的稳定六元环

巯基能和各种金属离子形成稳定程度不等的络合物 e.g. 对氯汞苯甲酸（p-chloromercuribenzoic acid）

由于许多蛋白质，如SH酶，其活性中心涉及-SH基，当遇到重金属离子而生成硫醇盐时，将导致酶的失活，因此制备这类蛋白质时应避免进入重金属离子。

半胱氨酸可与二硫硝基苯甲酸（dithionitrobenzoic acid，缩写为DTNB）或称Ellman氏试剂发生硫醇-二硫化物交换反应：

反应中1分子的半胱氨酸引起1分子的硝基苯甲酸的释放。它在pH8.0时，在412nm波长处有强烈的光吸收，因此可利用比色法定量测定-SH基。

蛋白质（II）——蛋白质的结构

蛋白质的共价结构:

蛋白质的一级结构（Primary structure）：蛋白质的共价结构，即蛋白质分子内部通过共价键连接而形成的结构形式，包含：①氨基酸在蛋白质内的排列顺序②二硫键的位置和连接顺序③侧链基团的修饰和连接情况（是否磷酸化，磷酸化位置；是否糖基化，糖基化位置，糖链组成；是否酯化，酯化位置，酯的组成）④是否有辅基或其他分子,连接方式。

肽键:

蛋白质是氨基酸通过脱水缩合形成肽键而形成的，实验证据：

（1）蛋白质分子中游离的α-氨基，α-羧基很少。若水解，游离α-氨基，α- 羧基以等mol 数增加→说明α氨基，α-羧基参与某种结合，水解时，这种结合断开。

（2）人工合成肽可以被蛋白酶水解

（3）包含O=C-N- H基团的化合物如双缩脲H2N-CO-NH-NH2能与硫酸铜--氢氧化钠溶液产生双缩脲颜色反应。天然蛋白质也存同样反应。

（4）人工合成的多聚AA的X射线衍射图案和红外吸收光谱与天然的纤维状蛋白质十分相似。

（5）我国在世界上首次人工合成蛋白质-结晶牛胰岛素的成功，完全证明了蛋白质的肽链结构学说的正确性。

肽键的特点：

酰胺键：由于酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基的共振作用，表现出高稳定性。C－N具40％双键性质。C＝O具40％单键性质。共振杂化体。C－N键长：0.184nm C＝N键长：0.127nm C N键长：0.132nm

亚氨基（－NH－）pH 0－14没有明显的解离和质子化倾向

肽键是一个平面，称肽平面。可以有反式顺式结构，但旋转能障较高，反式稳定（Pro例外）蛋白质中的每一个氨基酸单位称氨基酸残基（residue）

肽链结构的命名与书写：根据含Aa的数目命名：**肽。从NH2末端Aa残基开始，称为：某氨基酰某氨基酰某氨基酰…..氨基酸。书写时氨基端在左边，羧基端在右边；以氨基酸的三字缩写或单字缩写代表对应的氨基酸；用短横线代表氨基酸残基之间的肽键

肽的物理化学性质：

一般物理性质：短肽晶体、熔点很高（离子晶体、偶极离子）

肽的两性解离：决定于游离氨基末端、游离羧基末端以及侧链基团。肽链羧基的pK?比氨基酸的大一些，而氨基的pK?则要小一些

多肽等电点的计算：

中性肽的等电点：

酸性肽的等电点：

碱性肽的等电点：

常见化学反应：

①N端氨基酸残基与茚三酮、DNFB、PITC等反应

②C氨基酸残基成酯、成酰胺、成盐

③侧链氨基酸的反应：磷酸化：Tyr、Ser、Thr；酯化：Ser、Thr、Tyr；糖基化：Ser、Thr、Cys

④双缩脲反应（Biuret reaction）：多肽与CuSO4碱性溶液反应，生成紫红色或蓝紫色的复合物，540nm处有最大光吸收。

为肽和蛋白质特有（两个或两个以上肽键），氨基酸没有该反应。

天然活性多肽：定义：在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位，但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。

常见活性多肽：谷胱甘肽（GSH）；γ-Glu-Cys-Gly；巯基缓冲剂；脑啡肽（enkephalins）：神经系统中产生的一类短肽，具有多种特殊生物学功能；蕈毒素、蛇毒素：α－鹅膏蕈碱：能与真核生物的RNA聚合酶（RNA polymerase）Ⅱ和Ⅲ牢固结合而抑制酶的活性，因而使RNA的合成不能进行，但不影响原核生物的RNA合成；短肽类抗生素。

蛋白质一级结构测定：

氨基酸顺序测定的一般步骤：

要求：样品均一，纯度97%以上，已知分子量（误差小于10%）

一般步骤：①测定蛋白质分子中多肽链的数目——蛋白质末端残基（NH2末端、COOH末端）mol数；蛋白质的分子量。

②拆分蛋白质分子的多肽链。(几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).)

③测定多肽链的Aa组成。（水解蛋白质获得Aa混合液、色谱分析氨基酸组成和含量、分析水解液氨含量，推导酰胺氨基酸的含量。）

④分析多肽链的N末端和C末端残基。

⑤断裂多肽链内的二硫键（过甲酸氧化，巯基化合物还原）。（可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。）

⑥多肽链断裂成肽段（酶解法，化学法）。（溴化氰水解法，能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键）。

⑦测定各个肽段的Aa顺序（Edman降解法）。（Edman （苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。）

⑧确定肽段在多肽链中的次序。

⑨确定原多肽链中二硫键的位置。

多肽N末端分析方法：

（1）二硝基氟苯（DNFB or FDNB法），Sange试剂（图）

（2）丹磺酰氯（DNS）法：原理：与DNFB相同。优点：DNS具强烈的荧光，检测灵敏度可以达到1?10-9mol比DNFB法高100倍（图）

（3）苯异硫氰酸酯（PITC）法（图）

（4）氨肽酶法：氨肽酶：可以从多肽链的N端逐个降解氨基酸的肽链外切酶。亮氨酸氨肽酶（LAP）：水解以Leu为N末端的肽键速度为最大

多肽C末端分析方法：

（1）肼解法：蛋白质or 多肽＋无水肼, C末端Aa以游离形式存在，其他Aa转变为相应的Aa酰肼化物加入苯甲醛可以使Aa酰肼化物转变成二苯基衍生物沉淀，C末端Aa则在溶液中。缺点：Gln、Asp、Cys破坏不易测出，Arg →Orn。（图）

（2）还原法：肽链C末端Aa + 硼氢化锂→α－氨基醇

（3）羧肽酶法：最有效，最常用的测C端殘基方法。羧肽酶：专一地从肽链的C端逐个降解，释放出游离Aa肽链外切酶

多肽链的部分断裂和肽段的拼接：

常用蛋白酶（内切酶）：①胰蛋白酶（Trypsin ）：专一性强、只断裂Lys、Arg的羧基参与形成的肽键；可以通过修饰增加或减少酶切位点。

②糜蛋白酶（Chymotrypsin ）：专一性﹤胰蛋白酶，断裂Phe, Trp, Tyr等疏水芳香Aa的羧基所形成的肽键；断裂键邻近的基团若为碱性：裂解能力↑，酸性：裂解能力↓

③嗜热菌蛋白酶（thermolysin ）：含Zn. Ca，Zn是活力必需的，Ca与热稳定有关；专一性差，断裂较短的多肽链or大肽段最适PH8－9。

④胃蛋白酶（Pepsin）：专一性＝糜蛋白酶，要求被断裂键两侧的殘基都是疏水性Aa；最适PH2，可用来确定二硫键的位置。

⑤金黄色葡萄球菌蛋白酶（Glu蛋白酶）：磷酸缓冲液PH7.8，能在Glu殘基和Asp殘基的羧基侧断裂肽键；NH4HCO3缓冲液PH7.8，或醋酸铵缓冲液PH4.0中，只能断裂Glu殘基的羧基侧肽键。

⑥梭状芽孢杆菌蛋白酶（Arg蛋白酶）：专门裂解Arg殘基的COOH所形成的肽键，对不溶

性蛋白质的长时间裂解很有效。

肽段的拼接次序确定：

（1）利用不同的方法获得多种肽段组合：断裂点位置差异越大越好，断裂点不宜过多或少。确定肽段在多肽链中的次序：利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。

（2）确定N、C末端的Aa残基。

（3）确定各个肽段的Aa顺序。

（4）根据不同的肽段组合内Aa顺序的部分重叠，确定肽段的拼接次序。

所得资料

氨基末端残基H

羧基末端残基S

第一套肽段第二套肽段

OUS SEO

PS WTOU

EOVE VERL

RLA APS

HOWT HO

二硫键的位置确定：胃蛋白酶水解；过甲酸打开二硫键；双向电泳法分析。

①一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，

②利用电泳技术分离开各个肽段，用过甲酸处理后，在垂直方向上再次电泳。由于二硫键断裂后，肽段的大小、电荷性质会发生变化，因此，会出现偏离对角线的现象

③利用已知的肽段组成和排序，可以推知二硫键位置

蛋白质的一级结构和生物功能的关系：

同源蛋白质的种属差异与生物进化：

同源蛋白质：在不同的有机体中实现同一功能的蛋白质

顺序同源：同源蛋白质的Aa顺序的相似性。

不变残基：同源蛋白质Aa顺序中对所有的种属来说都相同的Aa残基

可变残基：不同种属有相当大的变化的Aa残基

生物学意义：生物进化的标记，e.g. 细胞色素C；遗传变异的分子基础，e.g. 镰刀型贫血病。一级结构的改变与蛋白质的活性变化：

局部断裂与蛋白质的激活：

胰岛素原的激活：前胰岛素原(N末端多一段肽链,信号肽引导新生的多肽链进入内质网) →胰岛素原(信号肽被切) (Golgi体) →胰岛素(肽酶催化胰岛素的二个特定肽键断裂)。

胰岛素原包括A、B链和C链，C链即连接肽，在储存颗粒（storage granule）中，可以为

特殊的肽酶切去，而转变成活性的胰岛素。

血液凝固的机制：13种凝血因子构成凝血系统；血浆纤维蛋白原在凝血酶的激活作用下转变为不溶性纤维蛋白；激活作用是通过凝血酶切去纤维蛋白原N末端富含酸性氨基酸的A、B肽，然后在XIIIa（纤维蛋白稳定因子）作用下，发生交联而实现凝血。

其他一级结构变化与功能：①磷酸化：许多生物酶可以通过磷酸化/去磷酸化实现活性的改变。②连接糖链：活性、抗原性、寿命。③连接脂质：活性、溶解性

蛋白质的二级结构：

蛋白质的二级结构(Secondary structure)是指肽链的主链在空间的排列,或规则的几何走向、旋转及折叠。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。

二级结构的研究方法：X-衍射；圆二色性；核磁共振；荧光偏振。

肽平面二面角与蛋白质二级结构：

（1）Cα-N1，Cα-C2单键，可自由旋转：

Φ角--绕Cα-N1键旋转的角度

Ψ角--绕Cα-C2键旋转的角度

Φ、Ψ原则上可以在-180--+180 之间任意取值

多肽链的所有可能构象都能用Φ、Ψ这两个构象角描述，每一对Φ、Ψ称肽平面的二面角。

（2）Ramachandran构象图：

可能构象分析：由于分子间的相互作用力，并非所有构象都可以成

Ramachandran构象图的预测作用

几种常见的二级结构：

1，α-螺旋（α-helix)，结构要点：

肽链内每个残基Cα的成对二面角φ和ψ各自取同一数值：φ＝－57°ψ＝－48°。右手、左手螺旋，均由L-型Aa残基构成，右手α-螺旋和左手α-螺旋不是对映体，蛋白质中α-螺旋几乎均为右手的，右手的比左手的稳定。每圈螺旋占3.6个AA残基，沿螺旋轴方向上升0.54nm。肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的酰胺基团的-C=O基与第四个氨基酸残基酰胺基团的-NH基形成氢键。α-螺旋是不对称的分子结构，具有旋光能力，天然α-helix的不对称因素引起右旋。

α-螺旋结构的结构通式与命名：

α-螺旋结构中重复性结构：

命名：第一个数字表示每圈螺旋包含的残基数，下标数字表示氢键封闭的环所包含的主链原子数，同时也可标出氢键封闭的环内的重复单位数

常见的螺旋形式：（1）3.613螺旋(n=3)：非整数螺旋，蛋白质中α-螺旋结构的主要类型。（2）310螺旋（n=2）：一般只出现在β-转角内。（3）4.416螺旋（n=4）: 紧缩螺旋，某些核酸结合蛋白。

不同氨基酸对α-螺旋结构形成的影响：

（1）利用多聚氨基酸分析（见下页图）

（2）R基小，不带电荷的Aa，易于形成α-螺旋结构：Ala、Val、Glu、His等

（3）当一圈螺旋形成以后，再加入残基形成螺旋就变得容易了

（4）带相同电荷的Aa，相互临近的区域，不容易形成α-螺旋结构

（5）Cα附近支链长的氨基酸，对α-螺旋的形成是不利的，尤其Ile将破坏α-螺旋的稳定（6）Pro的Cα-N1，Cα-C2单键不能旋转，不具有亚氨基，不能形成链内氢键，所以α-螺旋在Pro处中断，形成结节（kink）。

（7）Gly由于空间位阻小，构象柔性大，常形成β-转角。

2，β-折叠(β-pleated sheet)，结构要点：

（1）两条或多条几乎完全伸展的多肽链侧向聚集在一起，相邻肽链上的－NH和C＝O之间形成有规则的氢键，这样的多肽构象就是β－折叠。平行式：各肽链的排列极性（N→C）是同一方向的，Φ＝－119°ψ＝+113°，重复周期0.65nm，常见于球状蛋白；反平行式：相邻肽链的极性相反，Φ＝－139°ψ＝+135°重复周期0.70nm，常见于纤维状蛋白

（2）所有的肽键都参与链间氢键的交联，氢键与肽链的长轴接近垂直。

（3）多肽主链为据齿状折叠构象，侧链的Cα－Cβ键几乎垂直于折叠片平面，侧链R基交替地分布在片层平面的两侧

（4）纤维状蛋白的β-折叠主要在不同肽链间形成，而球状蛋白则可以在肽链的不同片段间形成

常出现在β-折叠的Aa：Ile、Leu、Tyr、Val、Phe、Lys

3，β-转角（β-trun），结构要点：

（1）三种类型：每种类型都有4个Aa残基。类型I、类型II，均为伸展弯折（无螺旋），差别在于中心肽单位相互之间有180?的旋转关系。类型III在第一和第三个氨基酸残基之间形成一小段310螺旋

（2）弯曲处的第一个残基的C=O和第四个残基的NH之间形成一个4→1氢键。产生一种不很稳定的环形结构

（3）β-转角多数都处在球状蛋白质分子表面

常出现在β-转角的Aa：类型II的C3常为Gly。还有Asn、Asp、Pro、Cys、Ser、Thr

蛋白质的三级结构：

定义：蛋白质的三级结构(Tertiary Structure)是指在二级结构基础上，肽链的不同区段的侧链基团相互作用在空间进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构。

三级结构是单条肽链构成的蛋白质所具有的最高级构象，是蛋白质表现完整生物活性的最低构象要求，即只有具有了完整的三级结构，才能表现出蛋白质的生物活性。

超二级结构（super-secondary structure）：

定义：在蛋白质中，特别是球状蛋白质中，若干相邻的二级结构单元组合在一起。彼此相互作用，形成有规则，在空间上能辨认的二级结构组合体充当三级结构的构体，称为超二级结构。（在结构的组织层次上高于二级结构，但没有构成完整的结构域）

常见的超二级结构：

（1）αα型：由两股或三股右手α－helix彼此缠绕而成的左手超螺旋，重复距离约为14nm。是α－角蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白、纤维蛋白质中的一种超二级结构。

在αα型中，α－helix的结构作出相应调整：每圈螺旋为3. 5个残基，重复单位0. 51nm ；单个的α－helix每隔7个残基重复一次。稳定因素是非极性侧链间的范德华力

（2）βαβ型：由二段平行式的β－链和一段连接链组成，此超二级结构称β×β－单位。在βαβ型中，连接链α－helix或无规则卷曲大体上反平行于β－链；最常见的β×β组合是由三段平行式的β－链和二段α－helix链构成，此超二级结构称Rossmann-折叠；几乎所有的实例（只有两个例外）中连接都是以右手交叉连接方式处于β－折叠的一侧。

（3）βββ型：β－曲折和回形拓扑结构（βββ）组合的二种超二级结构。

β－曲折：由在一级结构上连续，在β－折叠中相邻的三条反平行式，β－链通过紧凑的β－转角连接而成，β－曲折含有与α－helix相近数目的氢键。回形拓扑结构（βββ）：反平行式β－折叠片中常出现的一种超二级结构。

三级结构的主要维系因素：氢键、疏水键、离子键和范德华力等。疏水键，在蛋白质三级结构中起着重要作用。

蛋白结构的实例：

球状蛋白：

纤维状蛋白：角蛋白（Keratin）（包括α-角蛋白、β -角蛋白）、胶原蛋白。

α-角蛋白：毛发的结构：一根毛发周围是一层鳞状细胞(scaIe cell)，中间为皮层细胞(cortical celI)。皮层细胞横截面直径约为20μm。在这些细胞中，大纤维沿轴向排列。所以一根毛发具有高度有序的结构。毛发性能就决定于α—螺旋结构以及这样的组织方式。

卷发(烫发)的生物化学基础：永久性卷发(烫发)是一项生物化学工程(biochemical engineering),α—角蛋白在湿热条件下可以伸展转变为β—构象，但在冷却干燥时又可自发地恢复原状。这是因为α—角蛋白的侧链R基一般都比较大，不适于处在β—构象状态，此外α—角蛋白中的螺旋多肽链间有着很多的二硫键交联，这些交联键也是当外力解除后使肽链恢复原状(α—螺旋构象)的重要力量。这就是卷发行业的生化基础。

β -角蛋白：丝心蛋白(fibroin)这是蚕丝和蜘蛛丝的一种蛋白质。丝心蛋白具有抗张强度高，质地柔软的特性，但不能拉伸。它具有0.7nm周期，这与α—角蛋白在湿热中伸展后形成的β—角蛋白很相似(0.65nm周期)。丝心蛋白是典型的反平行式折叠片，多肽链取锯齿状折叠构象，酰胺基的取向使相邻的Cα为侧链腾出空间，从而避免了任何空间位阻。在这种结构中，侧链交替地分布在折叠片的两侧。

丝蛋白的结构：丝蛋白是由伸展的肽链沿纤维轴平行排列成反向β-折叠结构。分子中不含α-螺旋。丝蛋白的肽链通常是由多个六肽单元重复而成。这六肽的氨基酸顺序为：-（Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala）n-

胶原蛋白：胶原蛋白或称胶原(collagen)是很多脊椎动物和无脊椎动物体内含量最丰富的蛋白质，它也属于结构蛋白质，使骨、腱、软骨和皮肤具有机械强度。胶原蛋白至少包括四种类型，称胶原蛋白I、II、III和IV

（1）腱的胶原纤维具有很高的抗张强度(tensile strength)，约为20-30kg／mm2,相当于12号

冷拉钢丝的拉力。

（2）胶原蛋白在体内以胶原纤维的形式存在。其基本组成单位是原胶原蛋白分子

（3）一级结构分析表明，胶原蛋白α肽链的96%都是按三联体的重复顺序：(g1y—x—y)n 排列而成。Gly数目占残基总数的三分之一，x常为Pro，y常为OH-pro(羟脯氨酸)和OH-lys （羟赖氨酸）。

（4）胶原蛋白的二级结构是由三条肽链组成的三股螺旋，这是一种右手超螺旋结构。螺距为8.6nm，每圈每股包含30个残基。其中每一股螺旋又是一种特殊的左手螺旋，螺距为0.95nm，每一螺圈含3.3个残基,每一残基沿轴向的距离为0.29nm

（5）原胶原蛋白分子在胶原纤维中都是有规则地按四分之一错位，首尾相接，并行排列组成纤维束。

（6）原胶原蛋白分子经多级聚合形成胶原纤维。在电子显微镜下，胶原纤维呈现特有的横纹区带，区带间距为60-70 nm，其大小取决于胶原的类型和生物来源。

蛋白质的四级结构：

定义：蛋白质的四级结构(Quaternary Structure)是指由多条各自具有一、二、三级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构形式；各个亚基在这些蛋白质中的空间排列方式及亚基之间的相互作用关系。

这种蛋白质分子中，最小的单位通常称为亚基或亚单位(Subunit)，它一般由一条肽链构成，无生理活性或不具有完整生理活性。由多个亚基聚集而成的蛋白质常常称为寡聚蛋白。

四级结构的类型：

（1）同聚体：由相同的亚基通过非共价键聚集而成的寡聚蛋白

（2）异聚体：由不同的亚基通过非共价键聚集而成的寡聚蛋白

（3）根据亚基的数目可以称：同**聚体，异**聚体

四级结构的维系：疏水力是维系四级结构的主要方式；亚基之间的契合关系。

寡聚蛋白质与别构效应：

别构效应（allosteric effect）：指蛋白质与配基结合改变蛋白质的构象，进而改变蛋白质的生物活性的现象

别构蛋白质（allosteric protein）：具有别构效应的蛋白质，多为寡聚蛋白，包括活性部位和调节部位

同位效应：指别构蛋白质与一种配基的结合对于该蛋白和同种配基的结合能力的影响

正协同效应：第一个配基的结合引起第二个，第三个…配基更容易结合。这种同位效应称正协同效应

负协同效应：第一个配基的结合导致第二个，第三个… 配基更难结合，这种同位效应称负协同效应

异位效应：如果蛋白质分子中，相互之间发生作用的部位是不同的，也即活性部位上所发生的反应将受到调节部位与效应物结合的影响，称异位效应

血红蛋白的结构与功能：

组成：4个亚基组成，成年人红细胞由α、β两种亚基各两条构成。每条肽链都卷曲成球状，都有一个空隙容纳一个血红素，它们都能与氧气结合。以α2β2四聚体形式存在一分子Hb能与4分子氧气结合。分析Hb与氧气结合，发现Hb的4个亚基和4个氧气结合时平衡常数（Keq）并不相同。而是有4个不同的平衡常数，Hb与最后一个氧气结合时其结合力最大。Hb与氧气结合将影响其四级结构，即亚基与亚基之间的相对位置发生变动，这种变化增强了Hb和O2的亲和力

蛋白质各级结构之间的相互关系：

各级结构之间的递进：

一级结构对高级结构的指导作用：一级结构是高级结构的基础；高级结构由一级结构和其他构象指导因素共同决定；（最低势能原则：分子的稳定构象往往是该分子内结构势能最低的状态）微环境和折叠辅助因子的影响。

高级结构对低级结构的影响。

蛋白质（III）——蛋白质的主要研究技术

蛋白质的性质：

（一）胶体性质：蛋白质分子直径在1~100nm范围内

透析：根据蛋白质分子大于一般小分子物质的特点，可以利用半透膜把蛋白质与小分子分开。丁达尔现象。水化现象。吸附现象。

（二）酸碱性质：

等电点与电场迁移：蛋白质在等电点附近溶解性最小，电场中不迁移

一般情况下，大分子蛋白质的等电点是不能直接利用氨基酸侧链基团推算。

（三）蛋白质的颜色反应：

①双缩脲反应：与CuSO4碱性溶液反应，生成紫红色或蓝紫色的复合物，540nm处有最大光吸收。

②米伦反应：蛋白质与硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸、亚硝酸的混合液反应生成白色沉淀，加热后变为红色，这是酚类化合物的反应（Tyr）

③乙醛酸反应：蛋白质溶液加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，两液层之间会出现紫色环，这是含吲哚基化合物的反应（Trp），明胶一般无此反应

④坂口反应：蛋白质加入次氯酸、 -萘酚、氢氧化钠可以生成红色化合物，胍基反应（Arg）

⑤酚试剂：福林（Folin）试剂，酚基（Tyr）可以把磷钼酸、磷钨酸还原成蓝色化合物，Lowry 法。

（四）光吸收性质：蛋白质在280nm处有强烈的光吸收，Phe、Tyr、Trp，其Trp贡献最大。蛋白质的沉淀与变性：

沉淀作用：蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件将影响蛋白质的溶解性质，在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。（1）可逆沉淀：在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。

可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，根据蛋白质的不同溶解和沉淀性质将目标蛋白质和其他物质分开：

①等电点沉淀法：调整pH至对应蛋白质等电点，使其沉淀分离；适用于区分等电点差异大的亲水蛋白

②盐析与盐溶法：中性盐影响蛋白质溶解性的双向作用；常用盐析剂：MgCl2、（NH4）2SO4、K2SO4

③有机溶剂沉淀法：改变介质常数，破坏蛋白质胶体的水化作用；常用丙酮、乙醇，结合低温和等电点共同沉淀蛋白质

（2）不可逆沉淀：在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。

变性沉淀因素：高温，强酸碱，重金属盐，有机试剂：溶剂、脲、胍、生物碱，去垢剂：SDS（十二烷基磺酸钠）。

变性后蛋白质化学性质的改变：生物活性丧失，侧链基团暴露（颜色反应增强）。物理化学

性质改变：溶解性↓、粘度↑、扩散系数↓。生物化学性质改变：易于酶解。

蛋白质的分离纯化一般流程：

（1）前处理：分离组织、破碎细胞、去其他组分（注意问题：保持蛋白质的完整和活性） 常用方法：超声粉碎，微研磨，酶消化，超速离心

（2）粗分级

常用方法：盐析法、等电沉淀、有机溶剂

要求：简便、处理量大、既能除去大量杂质，又能收缩蛋白质溶液

（3） 细分级：进一步提纯

常用方法：层析、电泳（规模小，分辨率高）

（4）结 晶：只有纯度达到一定的程度，才能实现结晶。（结晶不一定意味着蛋白质已提纯） 本身有一定提纯作用。

蛋白质的纯度鉴定：

①活性鉴定：酶、激素等可以用对应的生物活性检测来确定纯度

②抗原抗体效价法

③电泳、层析、超离心等方法

④恒溶法：在严格控制的条件下，以加入的固体蛋白的量对溶解蛋白的量作图，可以确定是否提纯。

⑥根据纯化和鉴定的方式的不同，常把蛋白质的纯度定义为：电泳纯、结晶纯、色谱纯等等 蛋白质分离纯化常用技术：

（一）沉降分离（Sedimentation ）：蛋白质分子量、形状的不同会产生密度和沉降速度的差异。

（1）差速离心：利用蛋白质分子在离心力场的作用下沉降速度的差异分离不同蛋白质。单位离心力场下，物质的沉降速度与分子量和分子形状有关。在生物化学中常用沉降系数（S ）表征分子量：

)f

m x dt dx S p ρυω-=≡12

定义：单位离心力场下的沉降速度

mp ，分子颗粒质量

（1-ρν）为浮力因子

f ：摩擦系数

Svedberg 单位：10-13秒，S

（2）密度梯度离心：利用物质在密度与其相同的溶液中不会沉降的特点区分不同密度的物质。常用蔗糖，CSCl 等构建。

（二）层析、色谱（Chromatography ）：

（1）分配层析：

一般原理：利用待分离物质在流动相和固定相中分配系数的不同，使物质间出现移动速度的差异，从而区分不同的物质。

常用方式：分配柱层析，滤纸层析，薄层层析，离子交换层析，气相色谱

高效液相色谱（HPLC）：利用非常细的颗粒固相支持剂，提高分配表面积；溶剂系统采用高压，提高系统速度。

（2）离子交换层析：

原理：利用不同离子在不同的pH下与固定相结合强度的差异，使待分离的物质在特定条件下与固定相中的同型离子发生交换，而与固定相结合，从而区分不同物质。

可分为：阳离子交换柱：强酸型、弱酸型；阴离子交换柱：强碱型、弱碱型

常用介质：聚苯乙烯-苯二乙烯树脂，离子交换纤维素，离子交换葡聚糖

洗脱方式：分段洗脱，梯度洗脱。

（3）分子排阻层析（molecular-exclusion Chromatography）

原理：利用具有不同孔径的多孔网状结构的凝胶珠作为分离介质，小分子由于扩散作用进入凝胶颗粒内部而被滞留；大分子被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。又称凝胶过滤、分子筛。

一般步骤：①柱平衡，②蛋白质混合物上柱，③洗脱液洗脱蛋白，④收集记录。

可以用于分析分子量：分子量与洗脱体积相关；排阻极限：表示分级范围的上限，不能扩散进入凝胶珠微孔的最小分子的分子量。

（4）亲和层析（Affinity chromatography）：

原理：利用待分离蛋白质与固定相中相应配体的特异性结合，将目标蛋白质与其他物质分开一般步骤：①制备交联有配体的层析柱；②蛋白质上样，平衡；③杂质洗脱；④可溶性配体洗脱目标蛋白质

（三）电泳（elecctrophoresis）：在外电场的作用下，带电颗粒，例如不处于等电状态的蛋白质分子，将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称电泳

电泳的基本原理：相同分子，有相同的电泳迁移率：

带电颗粒在电场中的泳动速度主要决定于它所带的净电荷量以及颗粒的大小和形状。颗粒在电场中发生泳动时，将受到两种方向相反的力的作用

?F(电场力)=qE(=qU/s)

?f(摩擦力)=fv

?q＝颗粒所带的电量

E＝电场强度或电势梯度＝U/s

U＝两电极间的电势差(以伏特表示)

S= 两电板之间距离(以厘米表示)

f＝摩擦系数(与颗粒的形状，大小和介质的粘度有关)

v＝颗粒泳动速度(以厘米／秒表示)

?当颗粒以恒速移动时，qE=fv ，即：v/E=q/f ，在一定的介质中对其一种蛋

白质来说q/f是一个定值，因而v/E也是定值，它被称为迁移率或泳动度：

u=v/E

常见电泳形式：

（1）界面移动电泳：在U型管中使蛋白质溶液与缓冲液形成清晰液面，利用电泳过程中液面的移动来记录电泳结果。血浆电泳、毛细管电泳都属于这一类

（2）区带电泳：在固定的支持物上进行电泳，各组分因迁移率不同，形成不同区带，可以区分不同蛋白质。滤纸电泳、薄膜电泳、涂层电泳、微介质电泳、凝胶电泳（3）SDS-盘式凝胶电泳：

1.用聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，可以将凝胶分别作成浓缩胶和分离胶两部分.

2.浓缩胶一般孔径较大，pH6.8，分离胶一般孔径较小，pH8.8

3.样本加入SDS（十二烷基磺酸钠）、巯基乙醇、尿素处理，使蛋白质分子带上均匀的负

电荷，分子形状变为一致的杆状分子，消除电荷差异和分子形态差异的影响。

4.具有：样品的浓缩效应，凝胶对分子的筛选效应。

5.可以用于测定蛋白质分子量，以标准分子量的蛋白质做对照，迁移率与分子量的对数成反比。

6.蛋白质可用考马斯亮蓝或者苯胺黑染色，也可将其转移到醋酸酯膜上，用相应的抗体鉴定，称west blotting

7.样本与凝胶之间没有共价的结合，可以将电泳后的样本回收，复性后，将保持其功能。（4）等电聚焦电泳：利用蛋白质在等电点的pH时不会发生电场迁移的原理，缓冲液或固定介质中构建pH梯度，蛋白质“聚焦”在等于其等电点的pH点处，形成一个很窄的区带，从而区分不同的蛋白质。区分精度可以到0.02pH。

酶（I）——酶通论与酶促动力学

高效的生物催化剂——酶：

酶是生物催化剂，具有催化剂的普遍性质：提高反应速度，不改变平衡点；降低反应的活化能；自身在反应完成前后不发生改变

不同于非酶催化剂的方面：

（1）催化效率高，可以提高反应速度108~1020，比非酶催化剂催化效率高出107~1013倍（2）具有高度的专一性，一种酶只作用于特定的一类甚至是一种物质，该物质称酶的底物（Substrate）

（3）酶容易失活，比一般催化剂要求的条件严格

（4）酶的催化能力受到严格的调节控制，如抑制剂、共价修饰、反馈调节、酶原激活、激素调剂等

（5）化学本质不同，酶是高分子物质，常带有辅酶、辅基

（6）酶促反应常表现出底物饱和性

酶的生物学意义:

（1）生命现象是由酶催化的多步反应的整合：营养素分子的分解；化学能的贮存和转换；从小分子前体合成生物大分子。

（2）酶是生物过程所必需的：在生理条件下无催化剂许多反应进行的太慢，不能适应生命的要求；由于细胞内环境的特殊，没有酶作为催化剂时许多生化反应不能进行

（2）酶的研究是理解生命过程的必由之路：遗传现象的基础，帮助我们理解生物个体差异的由来，遗传缺陷引起代谢紊乱的机制；生理病理过程的发生机理，疾病的发生与治疗；应用于生物乃至于非生物产业。

酶的化学组成：

（1）大多数是蛋白质(除小分子的有催化能力的RNA—核酶)

（2）一些酶的活性除肽链外不需要在酶的活性中心存在其他化学基团，称单纯酶

（3）另一些需要附加的非肽链成分的辅助因子(结合酶)：如果辅助因子与酶疏松地结合，这种辅助因子称为辅酶；如果辅助因子与酶紧密地结合，这种辅助因子称为辅基。（4）许多酶可以结合调节因子或共价修饰：这些因子并非酶催化所必须，但可以调节酶活性；包括激素、第二信使、钙调蛋白等；共价修饰包括：磷酸化、糖基化等。

（5）许多酶可以由多个亚基构成：可以同聚蛋白，也可以是异聚蛋白；可以分为催化亚基和调节亚基。

酶活性的测定：

（1）酶活力与酶反应速度：

酶活力：指酶催化化学反应的能力，可以通过酶所催化的化学反应的速度来衡量。酶促反应