2011—2013年辽阳市流感病毒实验室检测结果分析

发表时间：2014-04-09T14:43:02.983Z 来源：《中外健康文摘》2013年第39期供稿作者：刘婧媛

[导读] 2011-2013年两年间辽阳市均有流感病毒流行,通过实验室检测得知两年的流行病毒毒株型别不同,证实了流感病毒抗原性变异的特性。

刘婧媛 (辽阳市疾病预防控制中心质量管理科辽宁辽阳 111000）

【摘要】流行性感冒病毒是引起急性呼吸道感染的重要病原，传播迅速,常会引起暴发，甚至造成世界大流行。上世纪流感病毒就引起四次世界大流行，造成相当严重的损失[1]。目的为了探究流感病毒流行和变异规律，了解其根据流感病毒核蛋白（NP），M1蛋白抗原性和基因特性的不同分为甲（A）乙（B）丙（C）三型[2],病毒具有抗原性变异的特性,提供控制流行的科学依据,对 2011—2013年度辽阳市流行性感冒的病原学监测结果进行分析。方法采集流感样病例的咽拭子标本,采用real time-PCR进行核酸检测，分别用人红细胞、狗肾细胞(MDCK)进行病毒分离,采用血凝抑制方法(HAI)进行流感病毒型别鉴定。结果 2011年4月~2012年3月共检测辽阳市流感哨点医院咽拭子标本388份,核酸检测PCR阳性13例，分离到流感病毒10株,阳性分离率为2.58%,经分型鉴定A型H3N2亚型2株(20%),B型Victoria5株(50%),B型Yamagata3株(30%),A型H1N1亚型、新H1N1未检出；2012年4月~2013年3月共检测辽阳市流感哨点医院咽拭子标本593份,核酸检测PCR 阳性40例，分离到流感病毒30株,阳性分离率为5.06%,经分型鉴定A型H1N1亚型2株(6.67%)，A型H3N2亚型,15株(50%),新H1N112株(40%)，B型Yamagata,1株(3.33%)，B型Victoria未检出。结论:2011~2012年度流感流行季节中辽阳市有流感流行,流行的优势毒株为B型,同时有A型H3N2亚型毒株的存在；2012~2013年度流感流行季节中辽阳市有流感流行,流行的优势毒株为A型H3N2亚型和新H1N1,同时有A型H1N1亚型、B型Yamagata毒株的存在。

【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2013）39-0179-02

1.材料和方法

1.1标本

2011年4月1日-2012年3月31日采集的辽阳市中心医院咽拭标本388份；2012年4月1日-2013年3月31日采集的辽阳市中心医院咽拭标本593份。

1.2流感病毒核酸 real time-PCR

1.2.1采用Quant One step RT-PCR kit RNA 提取试剂盒提取流感病毒样本核酸。

1.2.2QIAGEN real time (荧光定量PCR法)检测试剂盒扩增病毒核酸，反应体系见表1

组分体积（μl）

2×QuantiText Probe RT-PCR Master Mix12.5×

上游引物（40μM）0.5×

下游引物（40μM）0.5×

Probe （10μM）0.5×

QuantiText RT Mix0.25×

Rneasy Free Water UP to 25

病毒核酸RNA 5.0×

1.2.3将上述加好的反应体系的反应管放于PCR仪进行反应，反应程序如下：见表2

步骤反应温度(℃)时间(min)是否采集荧光循环数

逆转录酶605否1

5030否1

预扩增9515否1

950.25否45

扩增及荧光收集550.5否45

720.5是45

725否1

1.2.4结果判定及标准

对照：阴性对照无CT值或CT值为零，阳性对照CT值＜30。

样品：CT值≤35报告为阳性。

样品：37≤CT值≤40为灰区，需重新采样检测。

样品：无CT值或CT值为零报告为阴性。

1.3流感病毒分离

上述PCR结果为阳性的样本接种培养好的MDCK细胞生长液，观察细胞病变情况。

1.3.1将已长成单成的MDCK细胞生长液，用DPBS液洗两遍。

1.3.2每瓶接种标本0.5ml，每个标本接种1瓶，轻摇，使标本完全覆盖细胞，置35℃吸附2小时。

1.3.3倒掉感染液，用DPBS液洗两遍，每瓶加入含2μg/ml胰酶的病毒维持液10ml，35℃培养。

1.3.4次日起每天观察有无细胞病变（CPE）并记录，如病变明显细胞脱落可收获并做血凝，如未有病变，继续观察7日收获做血凝。

1.4血凝实验