响应面法优化枯草芽孢杆菌产蛋白酶的发酵条件
响应面法优化枯草芽孢杆菌产蛋白酶的
发酵条件
张 智，朱宏亮，钮宏禹，罗欢华
（东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 １５００４０）
摘 要：在单因素试验的基础上，应用响应面分析法对影响枯草芽孢杆菌产蛋白酶的因素进行分析，得到了最佳发酵条件为温度４０℃、ｐＨ８．０４、接种量８．３％、发酵时间５６ｈ，此条件下的蛋白酶酶活为２４７．８ Ｕ／ｍｌ，比单因素试验的最高酶活２２８．３Ｕ／ｍｌ提高了８．５４％。关键词：枯草芽孢杆菌；蛋白酶；响应面
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｗｉｔｈ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ
Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ
ＺＨＡＮＧ Ｚｈｉ，ＺＨＵ Ｈｏｎｇ－ｌｉａｎｇ，ＮＩＵ Ｈｏｎｇ－ｙｕ，ＬＵＯ Ｈｕａｎ－ｈｕａ（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ， Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｒｂｉｎ １５００４０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ ：Ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔ， ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：４０ ℃， ｐＨ ８．０４ ａｎｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ａｍｏｕｎｔ ８．３％， Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｕｐ ｔｏ ２４７．８ Ｕ／ｍｌ ａｆｔｅｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ５６ ｈｏｕｒｓ． Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｈｉｇｈｅｒ ８．５４％ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｏｎｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔ， ｗｈｉｃｈ ｉｓｏｎｌｙ ２２８．３ Ｕ／ｍｌ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ；ｐｒｏｔｅａｓｅ；ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ
中图分类号：Ｑ８１５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００８）１２－０４００－０５
收稿日期：２００７－１０－１８
作者简介：张智（１９６４－）女，研究员，硕士，研究方向为食品发酵与食品微生物。Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｌｗｚ０７＠１６３．ｃｏｍ
枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）是一种安全的蛋白酶
生产菌［１］，它可产生大量的胞外蛋白酶，在工业生产中应用广泛。主要应用有以下五个方面：（１）在食品工业中应用：如奶酪生产、焙烤食品、大豆、玉米的深加工［２－３］
、水解产物的脱苦以及阿斯巴甜的合成等。（２）在制革行业中应用：如脱毛、脱皮等。（３）洗涤剂行业［４－５］，衣服的主要污染是汗液、血迹、食迹等。在汗液中除脂肪外，干物质的１／３是蛋白质。织物上的蛋白质，特别是陈化以后很难洗除，加入蛋白酶可大大的提高洗涤效果，延长织物的寿命，目前全世界洗涤剂用酶的消费量已达到１００００多吨。现已将蛋白酶加入牙膏、牙粉、漱口水中有助于去除牙垢。（４）医药行业，可作为消化、消炎、化痰止咳等药物以及治疗跌打伤、水肿血肿、消除坏死组织等。（５）除了应用于工业及医药行业外，还可以应用于基础研究中，蛋白酶的选择性肽键裂解可用于阐明结构功能关系、肽链合成以及蛋白质测序［６］等。现在蛋白酶的生产日趋火热。
响应面分析法［８］（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，ＲＳＭ）是一种优化工艺条件的有效方法，可用于确定各因素及其交互作用在工艺过程中对指标（响应值）的影响，精确地表述因素和响应值之间的关系，已被广泛地用于同时存在多因素影响的实验优化上。为了得到最佳产酶条件，本实验采用响应面分析法对影响菌种产酶的几个条件做了优化。１材料与方法１．１
菌种
枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）本实验室保存，是经过选育筛选出来的产蛋白酶性能稳定的菌株。１．２
培养基
斜面培养基：葡萄糖０．５％、酵母膏１％、蛋白胨０．５％、氯化钠０．２％、琼脂２％、自然ｐＨ值。
种子培养基：葡萄糖０．５％、酵母膏１％、蛋白胨０．５％、氯化钠０．２％、自然ｐＨ值。
摇瓶发酵培养基：玉米粉２％、酵母膏１％、氯化钠０．２％。
１．３试剂
Ｌ－Ｔｙｒｏｓｉｎｅ（酪氨酸） Ｓｉｇｍａ公司；干酪素 上海润捷化学试剂有限公司；去离子水；其他药品均为国产分析纯。
１．４仪器与设备
ＰＨＳ－２５型ｐＨ计 上海雷磁仪器厂；ｈｉｍａｃ ＣＲ２２Ｇ高速冷冻离心机 日本日立公司；７２２Ｓ型紫外可见分光光度计、旋转式恒温调速培养箱、超净工作台、水浴锅。１．５方法
１．５．１粗酶液制备
取活化好的斜面菌种（３４℃培养１８～２４ｈ），用接种环刮下菌种，将其转入到种子培养基，３４℃，１８０ｒ／ｍｉｎ摇床振荡２４ｈ，以５％的接种量转接于发酵培养基（５０ｍｌ发酵液／２５０ｍｌ三角瓶）中３７℃，１８０ｒ／ｍｉｎ摇床培养６５ｈ。将发酵液在４０００ｒ／ｍｉｎ的冷冻离心机中离心１０ｍｉｎ，得上清液即为粗酶液。
１．５．２蛋白酶活性测定
采用Ｆｏｌｉｎ－酚法［７］，１ｍｌ稀释一定倍数的粗酶液加２ｍｌ质量分数为０．５％的酪蛋白液，在ｐＨ值７．０，３７℃水浴１５ｍｉｎ，再用质量分数为１０％的三氯乙酸灭活；然后取１ｍｌ上述反应液的离心上清液，加１ｍｌ Ｆｏｌｉｎ－酚在５ｍｌ０．５５ｍｏｌ／Ｌ的Ｎａ２ＣＯ３的碱性条件下３７℃水浴１５ｍｉｎ，测６５０ｎｍ下的吸光度，以加灭活酶液的反应系统为空白。
在此反应条件下定义：每１ｍｉｎ生成１μｇ酪氨酸所需酶量定义为一个酶活（ＩＵ）。
１．５．３发酵条件筛选实验
１．５．３．１温度对发酵产酶活力的影响
考察不同温度对发酵产蛋白酶活力的单因素影响，设定３１、３４、３７、４０、４３、４６℃六个水平。选取ｐＨ７．５、接种量１０％、发酵４８ｈ，按照１．５．１的方法进行培养和制取粗酶液，以１．５．２的方法测定酶活，以蛋白酶活力高低作为评价指标，进行温度的四水平试验。１．５．３．２ｐＨ值对发酵产酶活力的影响
考察不同ｐＨ值对发酵产蛋白酶活力的单因素影响，设定ｐＨ６、６．５、７、７．５、８、８．５六个水平。选取温度４０℃、接种量１０％、发酵４８ｈ，测定方法同上。１．５．３．３接种量对发酵产酶活力的影响
考察不同接种量对发酵产蛋白酶活力的单因素影响，设定接种量２％、４％、６％、８％、１０％、１２％六个水平。选取温度４０℃、ｐＨ８、发酵４８ｈ，测定方法同上。
１．５．３．４发酵时间对发酵产酶活力的影响
考察不同发酵时间对发酵产蛋白酶活力的单因素影响，设定从２４ ｈ后每隔４ｈ测定一次酶活。１．５．３．５响应面试验设计
根据单因素结果，利用响应面分析法（ＲＳＭ）对温度、ｐＨ值、接种量三个因素为自变量，每个因素取三水平，以－１、０、１编码，以蛋白酶活力（ＩＵ）为响应值，进行试验设计，所有实验重复３次，每次３个平行。如表１所示，采用ＭＩＮＩＴＡＢ１４软件进行数据处理。
图１ 温度对发酵产酶活力的影响曲线
Fig.1 Effects curve of temperature on activity of produced protease １２０
１００
８０
６０
４０
２０
０
３１３４３７４０４３４６
蛋
白
酶
活
力
（
Ｕ
／
ｍ
ｌ
）
发酵温度（℃）
２结果与分析
２．１温度对发酵产酶活力的影响
图１表明，温度从３１℃变化到４０℃，蛋白酶活力逐渐升高，增加趋势明显。随温度升至４０～４６℃，酶活逐渐下降，一方面由于酶的耐热性差，变性失活；另一方面是由于菌种在高温时大部分已死亡。综合考虑确定发酵温度为４０℃。
２．２ｐＨ值对发酵产酶活力的影响
表１ 因素水平编码表
Table 1 Coding table of factors and levers
因素
水平
－１０１Ａ 温度（℃）３７４０４３Ｂ ｐＨ７．５８８．５Ｃ 接种量（％）６８１０
图２ pH值对发酵产酶活力的影响曲线
Fig.2 Effects curve of pH value on activity of produced protease ２００
１５０
１００
５０
０
６６．５７７．５８８．５
蛋
白
酶
活
力
（
Ｕ
／
ｍ
ｌ
）
ｐＨ
图３ 接种量对发酵产酶活力的影响曲线
Fig.3 Effects curve of inoculation amount on activity of produced
protease
２５０２００１５０１００５００２
４
６
８
１０
１２
蛋白酶活力（Ｕ／ｍｌ）
接种量（％）
图２表明，ｐＨ值在６～７．５之间，酶活增长缓慢，在７．５～８之间酶活增长较明显，ｐＨ值再升高酶活逐渐下降，所以确定发酵ｐＨ值为８，说明该菌所产的酶偏碱性。２．３
接种量对发酵产酶活力的影响
图４ 发酵时间对发酵产酶活力的影响
Fig.4 Effects curve of fermentation time on activity of produced
protease
２５０２００１５０１００５００
２４２８３２３６４０４４４８５２５６６０６４６８７２
蛋白酶活力（Ｕ／ｍｌ）
发酵时间（ｈ）
从图４可以看出，发酵时间在２４～４８ｈ时酶活在逐渐增长，说明这时的菌体数在不断地积累；发酵时间在５２～６０ｈ时酶活增长趋于平缓，其５６ｈ为最高，这时菌体生长处于稳定期；发酵时间的再延长菌体生长进入衰亡期，酶活也开始下降，综合考虑确定发酵时间为５６ｈ。由于酶活在５６ｈ左右波动不大，所以不选此因素做响应面优化试验，以下实验的发酵时间都为５６ｈ。２．５
响应面优化分析
如表２所示，实验点共有２０个。可分为两类：一是１４个析因点；二是零点，为区域的中心点。零点实验重复６次，以估计误差。
利用ＭＩＮＩＴＡＢ１４ Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ程序对上面数据进行二
表２ 响应面试验设计及结果
Table 2 Design and results of response surface test
变异来源系数自由度ｔ值ｐ显著性模型－２１０８８９－８．９５０．０００＊ ＊Ａ５１９１６．４３０．０００＊ ＊Ｂ２６５４１４．７００．００１＊Ｃ６８．５１１．１００．２９８–Ａ
２
－６．８０１－７．１６０．０００＊ ＊Ｂ２－１７６１－５．１６０．０００＊ ＊Ｃ２－７．７２１－３．６１０．００５＊ＡＢ２．９７１０．８９０．３９５–ＡＣ０．１３８１０．１６０．８７２–ＢＣ
６．７７
１
１．３５
０．２０６
–
表３ 回归系数显著性分析
Table 3 Significance analysis of regression coefficients 注：＊．在ｐ＜０．０１水平显著；＊＊．在ｐ＜０．００１水平显著。
试验号ＡＢＣ酶活（Ｕ／ｍｌ）
１－１－１－１９８．７ ２１－１－１１０１．５ ３－１１－１９２．８ ４１１－１９７．４ ５－１－１１１１２．１ ６１－１１１０２．２ ７－１１１１１７．３ ８１１１１４１．２ ９－１００１７１．２ １０１００１６２．１ １１０－１０１８５．２ １２０１０１８２．３ １３００－１１９０．５ １４００１２０２． １５０００２４７．７ １６０００２４９．７ １７０００２３９．６ １８０００２５３．９ １９０００２４９．８ ２０
０
０
０
２５６．３
次多元回归拟合，获得酶活力的预测值对温度、ｐＨ值、接种量的二次多元回归方程：
Ｙ ＝ －２１０８８ ＋ ５１９Ａ ＋ ２６５４Ｂ ＋ ６８．５Ｃ －６．８０Ａ２－１７６Ｂ２ －７．７２Ｃ２ ＋ ２．９７ＡＢ ＋ ０．１３８ＡＣ ＋ ６．７７ＢＣ２．５．１
回归分析
由表３可知此模型是极其显著的，在回归方程的各项系数中ｂ１、ｂ１１、ｂ２２项回归系数差异极其显著，ｂ２、ｂ３３差异显著，其余项差异不显著。
由表４可知，模型回归的ｐ＝０．０００，失拟项的ｐ＝０．０１３，说明模型失拟不显著，回归显著，不需要引入更高次数的项，模型适当，校正复相关系数的平方Ｒ２＝９４．７％，说明二次回归方程的拟合程度较好，所以该模型可以用于枯草芽孢杆菌产蛋白酶发酵优化的理论预测。
从图３可以看出，接种量为８％时，其酶活最高。这说明接种量为２％～６％时由于菌体细胞量少，酶量也相应降低；接种量为１０％、１２％时，菌体细胞量太多，在菌体生长期已把营养物质消耗完，到产酶期营养物质浓度降低，不利于菌体产酶，所以蛋白酶产量下降。２．４
发酵时间对发酵产酶活力的影响
方差来源自由度平方和均方Ｆｐ＞Ｆ回归９７０３７４．４７８１９．４３８．９６
０．０００误差１０２００７．３２００．７失拟项５１８４０．４３６８．１１１．０３０．０１３
纯误差５１６６．９３３．４
所有项
１９
７２３８１．７
表４ 模型方差分析
Table 4 Analysis of variance of model
注：校正复相关系数的平方 Ｒ２ ＝９４．７％。
因素自由度平方和均方ＦｐＡ２５６３４４２８１７２２９．８６０．０００Ｂ２４９４００２４７００１８．２７０．０００Ｃ
２
４５０６９
２２５３５
１４．０３
０．０００
表５ 单因素方差分析结果
Table 5 Analysis of variance for single-factor test 图５ 蛋白酶活（Ｕ／ｍｌ）与温度、ｐＨ值的响应面图及其等高线Fig.5 Response surface plot and contour of protease activity (U/ml)
versus temperature and pH value
４２．６４２．０４１．４４０．８
４０．２３９．６３９．０３８．４３７．８３７．２
７．５０
７．７５
８．００８．２５
８．５０
１７５
Ａ． 温度（℃）
Ｂ． ｐＨ
２０５
２３５２２０
１７５１９０
Ｙ１３０１４５１６０１７５１９０２０５２２０２３５２５０
３结 论
通过响应面分析方法中的中心组合分析方法，对影
响菌种发酵产蛋白酶酶活的温度、ｐＨ值、接种量三个因素的交互作用进行研究。结果显示三因素对菌种发酵产蛋白酶酶活的影响作用是显著的，影响作用按主次顺序排列为温度＞ｐＨ值＞接种量，并利用统计学方法建立
２４０１７０
蛋白酶活（Ｕ／ｍｌ）
固定值：Ｃ．接种量（％） ＝８。
７．５
８．５
３７
４３
Ｂ．
ｐＨ
了提高菌种发酵产蛋白酶酶活的二次多项式模型，作为推测三因素以及三者的交互作用对菌种发酵产蛋白酶的适宜方法。确定最佳发酵条件为温度４０℃、ｐＨ８．０４、接种量８．３％、发酵时间５６ｈ，此条件下的蛋白酶酶活为２４７．８Ｕ／ｍｌ，比单因素试验的最高酶活２２８．３Ｕ／ｍｌ提高了８．５４％，基本达到了实验要求。
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微生物发酵工艺优化研究进展
龙源期刊网 https://www.360docs.net/doc/2513295910.html, 微生物发酵工艺优化研究进展 作者：张锐 来源：《海外文摘·学术》2017年第03期 摘要：近些年，在有关技术领域中微生物的发酵技术已得到了非常广泛的应用，特别在医药行业内应用此种技术十分普遍。微生物科技发展非常快，因此，人们也有不断深入的研究微生物的发酵工艺。为此，本文对影响微生物发酵的培养条件和培养基进行了分析，又对优化微生物发酵工艺的办法进行了讨论研究，为微生物工程的发展提供参考价值。 关键词：发酵工艺；微生物；培养条件；工艺优化；培养基 中图分类号：TQ920.6 文献标识码：A 文章编号：1003-2177（2017）03-0058-02 1 微生物发酵受培养基的影响 微生物在进行生长、代谢时，培养基能供给微生物发酵所需要的能量与营养物质，对合成发酵产物的效率和产品的质量保障来讲有着重要意义。在进行微生物发酵时，因其发酵条件与菌种的差异和不同的发酵阶段，需要培养基的成分也不同。一般情况下，微生物生长需要的营养要素有生长因子，碳源，无机盐和氮源四类。 1.1 选择氮源与碳源作发酵的培养基 氮源为微生物提供含氮的有机物与蛋白质，并且，还是合成含氮产物的参与者。氮源主要是有机氮源与无机氮源两种，如豆粉，氨盐，蛋白胨与硝酸盐等。碳源能够为微生物提供能量来源，形成产物和构建细胞。碳源的形式有油脂，多糖，单糖，天然复合物，双糖等，如豆油，葡萄糖，淀粉与蔗糖等。选择发酵的培养基中要有均衡的碳源与氮源比，确保其菌体能够正常生长，而且还有利于合成产物的速率。 1.2 无机盐对发酵培养基的影响 微生物的生长和生成的代谢产物都与无机盐有关重要关系。微生物在进行生长代谢时，构成的辅酶中有磷的参与，它是构成微生物生长，代谢的重要因素。有些菌种的发酵产物中包含磷酸根，因此在进行培养基发酵时，添加很多的磷酸盐，这利于产物快速合成。在微生物发酵中钙离子对细胞的生理状况起到了调节作用，例如，使细胞膜的通透性降低，维持细胞状态等。很多酶都用镁来作催化剂。微生物生长所需微量元素有很多，如，钴，铁，锌，锰等。经研究证明，枯草芽孢杆菌的生长中需要锰离子的参与，在发酵培养基中添加适量的氯化锰，可以提升枯草芽孢杆菌生成的发酵物中抑菌物质的活性。 2 微生物发酵受培养条件的影响
蛋白酶产生菌的筛选
蛋白酶产生菌的筛选 组别：第*组 班级：生工**班 组员：*** 指导老师：*** 一、实验目的 学习从自然界中分离蛋白酶产生菌
二、实验内容 蛋白酶产生菌的分离 三、实验原理 许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。 四、实验材料和用具 1.材料：土壤样品 2.试剂：牛肉膏蛋白胨培养及平板、奶粉培养基平板、45mL 无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、 3.仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、摇 床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液 管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂 瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。 五、操作步骤
（一）配制所需培养基 按照以下配方配制所需的培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g， 琼脂 1.5～2.0g，水 100ml，pH 7.2 配制200mL 奶粉培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g， 琼脂 2.0g，水 100ml，pH 7.0～7.2 脱脂奶粉 3g，配制200mL （二）分离 1.采集土壤样品，用无菌水植被1:10土壤悬液。 2.取1:10土壤悬液5 mL，注入已灭过菌的试管中，将此试 管放入75～80℃水浴中热处理10min以杀死非芽孢细菌。 3.取加热处理过的土壤悬液100～200μL，涂布接种到牛肉 膏蛋白胨培养平板，后将平板倒置，于30～32℃下培养24～48h. 4.对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明 的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。 （三）筛选 1、从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种奶粉斜面培养基，再转接奶粉培养基平板上，30～32℃下培养24～48h。
实验一腐乳产蛋白酶菌株的筛选1
实验一腐乳产蛋白酶菌株的分离 一、实验目的与要求 了解涂布分离和平板划线法从食物中分离食源性微生物的原理和方法，并熟练掌握该操作方法。 二、实验原理 微生物是蛋白酶的最佳来源，与动物和植物相比，微生物作为蛋白酶的来源具 有更多生理生化上的优越性。微生物来源的蛋白酶都是胞外酶，易于分离纯化，更 重要的是微生物易于培养和发酵，有广泛的生物化学多样性和遗传操作的感受性。 通过稀释涂布法或划线分离法在选择性平板上可以对产蛋白酶菌株进行分离。 稀释涂布平板法是一种将菌体按比例制备成若干个稀释度，再分别经涂棒涂布培养 而进行微生物分离纯化的方法；平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一 微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较 多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分 离微生物的“纯种”。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分 离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。 根据透明圈的大小来筛选目的菌株，透明圈越大的菌具有较强的产酶能力。对分离到的菌株进行纯化，得到高产蛋白酶菌株。 三、试验材料 1、材料与试剂 豆腐乳：市购豆腐乳 2、主要仪器与设备 无菌操作箱、恒温水浴锅、生化培养箱、高压灭菌锅、振荡培养箱 四、实验步骤与方法 1、培养基的制备 可溶性淀粉1%、酵母膏0.5%、酪蛋白1%、KH2PO40.1%、MgSO40.02%、琼脂2.0%，pH值为中性 配制方法：称取酪蛋白 1.0g，先用少量2%NaOH润湿，玻棒搅动，再加适量 的蒸馏水，在沸水浴中加热并搅拌，至完全溶解，补足水量至100mL，加入其他成分，调整pH，灭菌备用。 2、菌株纯化分离（涂布法和划线法每组选一种方法进行操作） （1）稀释法分离：采用无菌水，10倍梯度稀释豆腐乳的菌悬液到10-8，吸取
Design-Expert软件在响应面优化法中的应用详解
Design-Expert 软件在响应面优化法中的应用 （王世磊郑州大学450001） 摘要：本文简要介绍了响应面优化法，以及数据处理软件Design-ExpertDesign-Expert的相关知识，最后结合实例，介绍该软件在响应面优化法上的应用实例。 关键词：数据处理，响应面优化法，Design-Expert软件 1.响应面优化法简介 响应面优化法,即响应曲面法( Response Surface Methodology ，RSM)，这是一种实验条件寻优的方法，适宜于解决非线性数据处理的相关问题。它囊括了试验设计、建模、检验模型的合适性、寻求最佳组合条件等众多试验和统计技术；通过对过程的回归拟合和响应曲面、等高线的绘制、可方便地求出相应于各因素水平的响应值[1]。在各因素水平的响应值的基础上，可以找出预测的响应最优值以及相应的实验条件。 响应面优化法，考虑了试验随机误差；同时，响应面法将复杂的未知的函数关系在小区域内用简单的一次或二次多项式模型来拟合，计算比较简便，是降低开发成本、优化加工条件、提高产品质量、解决生产过程中的实际问题的一种有效方法[2]。 响应面优化法，将实验得出的数据结果，进行响应面分析，得到的预测模型，一般是个曲面，即所获得的预测模型是连续的。与正交实验相比，其优势是：在实验条件寻优过程中，可以连续的对实验的各个水平进行分析，而正交实验只能对一个个孤立的实验点进行分析。 当然，响应面优化法自然有其局限性。响应面优化的前提是：设计的实验点应包括最佳的实验条件，如果实验点的选取不当，使用响应面优化法师不能得到很好的优化结果的。因而，在使用响应面优化法之前，应当确立合理的实验的各因素与水平。 结合文献报道，一般实验因素与水平的选取，可以采用多种实验设计的方法，常采用的是下面几个： 1.使用已有文献报道的结果，确定响应面优化法实验的各因素与水平。 2.使用单因素实验[3]，确定合理的响应面优化法实验的各因素与水平。 3.使用爬坡实验[4]，确定合理的响应面优化法实验的各因素与水平。 4.使用两水平因子设计实验[5]，确定合理的响应面优化法实验的各因素与水平。 在确立了实验的因素与水平之后，下一步即是实验设计。可以进行响应面分析的实验设计有多种，但最常用的是下面两种：Central Composite Design-响应面优化分析、Box-Behnken Design-响应面优化分析。 Central Composite Design，简称CCD，即中心组合设计，有时也成为星点设计。其设计表是在两水平析因设计的基础上加上极值点和中心点构成的，通常实验表是以代码的形式编排的,实验时再转化为实际操作值（,一般水平取值为0,±1,±α,其中0为中值,α为极值, α=F*（1/ 4）； F 为析因设计部分实验次数, F = 2k或F = 2 k×（1/ 2 ），其中 k为因素数，F = 2 k×（1/ 2 一般 5 因素以上采用，设计表有下面三个部分组成[6]：(1) 2k或 2 k×（1/ 2 ）析因设计。(2)极值点。由于两水平析因设计只能用作线性考察,需再加上第二部分极值点,才适合于非线性拟合。如果以坐标表示,极值点在相应坐标轴上的位置称为轴点(axial point) 或星点( star point) ,表示为(±α,0,…, 0) , (0,±α,…, 0) ,…, (0, 0,…,±α)星点的组数与因素数相同。(3)一定数量的中心点重复试验。中心点的个数与CCD设计的特殊性质如正交
响应面法优化枯草芽孢杆菌产蛋白酶的发酵条件
响应面法优化枯草芽孢杆菌产蛋白酶的 发酵条件 张 智，朱宏亮，钮宏禹，罗欢华 （东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 １５００４０） 摘 要：在单因素试验的基础上，应用响应面分析法对影响枯草芽孢杆菌产蛋白酶的因素进行分析，得到了最佳发酵条件为温度４０℃、ｐＨ８．０４、接种量８．３％、发酵时间５６ｈ，此条件下的蛋白酶酶活为２４７．８ Ｕ／ｍｌ，比单因素试验的最高酶活２２８．３Ｕ／ｍｌ提高了８．５４％。关键词：枯草芽孢杆菌；蛋白酶；响应面 Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｗｉｔｈ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ＺＨＡＮＧ Ｚｈｉ，ＺＨＵ Ｈｏｎｇ－ｌｉａｎｇ，ＮＩＵ Ｈｏｎｇ－ｙｕ，ＬＵＯ Ｈｕａｎ－ｈｕａ（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ， Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｒｂｉｎ １５００４０，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ ：Ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔ， ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｂｙ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：４０ ℃， ｐＨ ８．０４ ａｎｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ａｍｏｕｎｔ ８．３％， Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｕｐ ｔｏ ２４７．８ Ｕ／ｍｌ ａｆｔｅｒｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ ５６ ｈｏｕｒｓ． Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｈｉｇｈｅｒ ８．５４％ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｏｎｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔ， ｗｈｉｃｈ ｉｓｏｎｌｙ ２２８．３ Ｕ／ｍｌ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ；ｐｒｏｔｅａｓｅ；ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ 中图分类号：Ｑ８１５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００８）１２－０４００－０５ 收稿日期：２００７－１０－１８ 作者简介：张智（１９６４－）女，研究员，硕士，研究方向为食品发酵与食品微生物。Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｌｗｚ０７＠１６３．ｃｏｍ 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）是一种安全的蛋白酶 生产菌［１］，它可产生大量的胞外蛋白酶，在工业生产中应用广泛。主要应用有以下五个方面：（１）在食品工业中应用：如奶酪生产、焙烤食品、大豆、玉米的深加工［２－３］ 、水解产物的脱苦以及阿斯巴甜的合成等。（２）在制革行业中应用：如脱毛、脱皮等。（３）洗涤剂行业［４－５］，衣服的主要污染是汗液、血迹、食迹等。在汗液中除脂肪外，干物质的１／３是蛋白质。织物上的蛋白质，特别是陈化以后很难洗除，加入蛋白酶可大大的提高洗涤效果，延长织物的寿命，目前全世界洗涤剂用酶的消费量已达到１００００多吨。现已将蛋白酶加入牙膏、牙粉、漱口水中有助于去除牙垢。（４）医药行业，可作为消化、消炎、化痰止咳等药物以及治疗跌打伤、水肿血肿、消除坏死组织等。（５）除了应用于工业及医药行业外，还可以应用于基础研究中，蛋白酶的选择性肽键裂解可用于阐明结构功能关系、肽链合成以及蛋白质测序［６］等。现在蛋白酶的生产日趋火热。 响应面分析法［８］（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，ＲＳＭ）是一种优化工艺条件的有效方法，可用于确定各因素及其交互作用在工艺过程中对指标（响应值）的影响，精确地表述因素和响应值之间的关系，已被广泛地用于同时存在多因素影响的实验优化上。为了得到最佳产酶条件，本实验采用响应面分析法对影响菌种产酶的几个条件做了优化。１材料与方法１．１ 菌种 枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）本实验室保存，是经过选育筛选出来的产蛋白酶性能稳定的菌株。１．２ 培养基 斜面培养基：葡萄糖０．５％、酵母膏１％、蛋白胨０．５％、氯化钠０．２％、琼脂２％、自然ｐＨ值。
芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶
枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶的研究 XXX （XXX农业与生物技术学院，XX XX，XXX） 摘要：通过单因子实验对枯草芽孢杆菌发酵产碱性蛋白酶的培养基条件进行优化，采用此优化培养基对发酵菌株进行单因素试验，结果表明在其他条件均不变 且以牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、（NH 4） 2 SO 4 、KNO 3 作为枯草芽孢杆菌发酵产碱 性蛋白酶培养基的唯一氮源时，最佳的氮源为蛋白胨，在此条件下碱性蛋白酶活力可达209.7U/ml。 关键字:枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶发酵 引言：碱性蛋白酶是指pH值为碱性的条件下水解蛋白质肽键的酶类,其最适pH值一般为9-11，属于肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类，除可催化蛋白质水解为氨基酸外，在有机溶剂中还可催化多肽的合成，是一类非常重要的工业用酶, 其产量约占整个世界酶制剂产量的30 %, 广泛存在于动、植物及微生物体中,在食品、医药、化工等工业有着广泛用途[1]。由于微生物碱性蛋白酶与来自动、植物的相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量较高、选育简单快速, 易于实现工业化生产等特点, 因此, 微生物碱性蛋白酶已成为研究的热点[2]。碱性蛋白酶等工业化酶制剂主要是通过复杂而成本较高的微生物培养基制备的, 其培养基成本约占工业化成本的30 %-40 %；另外, 碱性蛋白酶具有潜在的工业化应用前景, 因此经价格低廉的培养基选育较高产量的菌株以降低产酶成本显得尤为重要[3]。目前,国产碱性蛋白酶主要在酶活、成本和酶学性质等方面还不能满足工业发展要求, 大规模工业用碱性蛋白酶主要依赖进口[4]，本实验主要通过单因子试验优化枯草芽孢杆菌发酵培养基，以进一步提高枯草芽孢杆菌所产碱性蛋白酶粗酶的活力。 1材料和方法 1.1 试剂与器材 碱性蛋白酶菌种；Na 2CO 3 (0.4mol/L)；干酪素（10g/L）；三氯乙酸(0.4mol/L)； 福林试剂；100ul/ml酪氨酸标准液；胰蛋白胨；酵母浸粉；葡萄糖；糊精；CaCl 2 ； K 2HPO 4 ；牛肉膏；柠檬酸钠；（NH 4 ） 2 SO 4 ；KNO 3 恒温水浴锅，分光光度计；试管若干；移液管；吸耳球；洗瓶；漏斗；离心 机；高压灭菌锅；5L发酵罐体系；pH计；恒温摇床。 1.2 操作方法 1.2.1 福林法制作标准曲线 取11支试管，按表1所示标号加入试剂（除0号做空白对照，其余每只重复一次计算时取平均值），混匀，再加入1ml福林试剂摇匀，水浴20min，以不含酪氨酸的0号管作为空白，于分光光度计下测A680的值。以A680的值为横坐标，酪氨酸浓度为纵坐标作图如图1。
DesignExpert响应面分析实验设计案例分析和CCD设计详细教程
食品科学研究中实验设计的案例分析 —响应面法优化超声波辅助酶法制备燕麦ACE抑制肽的工艺研究 摘要：选择对ACE 抑制率有显著影响的四个因素：超声波处理时间(X1)、超声波功率(X2)、超声波水浴温度(X3)和酶解时间(X4)，进行四因素三水平的响应面分析试验，经过Design-Expert优化得到最优条件为超声波处理时间28.42min、超声波功率190.04W、超声波水浴温度55.05℃、酶解时间2.24h，在此条件下燕麦ACE 抑制肽的抑制率87.36%。与参考文献SAS软件处理的结果中比较差异很小。 关键字：Design-Expert 响应面分析 1.比较分析 表一响应面试验设计 因素 水平 -1 0 1 超声波处理时间X1(min) 20 30 40 超声波功率X2(W) 132 176 220 超声波水浴温度X3(℃) 50 55 60 酶解时间X4(h) 2.Design-Expert响应面分析 分析试验设计包括：方差分析、拟合二次回归方程、残差图等数据点分布图、二次项的等高线和响应面图。优化四个因素（超声波处理时间、超声波功率、超声波水浴温度、酶解时间）使响应值最大，最终得到最大响应值和相应四个因素的值。 利用Design-Expert软件可以与文献SAS软件比较，结果可以得到最优，通过上述步骤分析可以判断分析结果的可靠性。 2.1 数据的输入
2.2 Box-Behnken响应面试验设计与结果 2.3 选择模型
2.4 方差分析 在本例中，模型显著性检验p<0.05，表明该模型具有统计学意义。由图4知其自变量一次项A，
B，D，二次项AC,A2,B2,C2,D2显著(p<0.05)。失拟项用来表示所用模型与实验拟合的程度，即二者差异的程度。本例P值为0.0861>0.05，对模型是有利的，无失拟因素存在，因此可用该回归方程代替试验真实点对实验结果进行分析。 图 5 由图5可知：校正决定系数R2(adj)(0.9788>0.80)和变异系数（CV）为0.51%，说明该模型只有2.12%的变异，能由该模型解释。进一步说明模型拟合优度较好,可用来对超声波辅助酶法制备燕麦ACE抑制肽的工艺研究进行初步分析和预测。
实验十一 产蛋白酶菌株的筛选-2013
实验十一产蛋白酶菌株的筛选-2013 实验十一产蛋白酶菌株的筛选 碱性蛋白酶是一类最适宜作用pH为碱性的蛋白酶，在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高，适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业性酶类。 从自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物学的一项重要工作，也是学习微生物学的学生应该掌握的基本技能。 一、基本原理 , 自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。 , 水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。 , 碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。 , 原理:Folin试剂与酚类化合物(Tyr,Trp,Phe)在碱性条件下发生反应形成蓝色化合物，用蛋 白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，通过分光光度计测定可知酶 活大小。 二、实验目的 , 学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法 , 学习并掌握细菌菌株的摇瓶液体发酵技术
, 掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法 三、实验器材 1(菌株 从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株 2(溶液和试剂 蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，NaCO，Folin 试剂，硼砂，23 酪氨酸，水等 3(仪器和用品 三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计，培养摇床，高压灭菌锅，尺，玻璃小漏斗和滤纸 四、操作步骤 1. 培养基和试剂的配制 (1)牛奶平板:在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶 (2)发酵培养基:玉米粉4%，黄豆饼粉3%，NaHPO 0.4%，KHPO 0.03%，3 mol/l NaOH 调节2424 pH到9.0，0.1MPa 灭菌20min，250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。 (3)pH11硼砂- NaOH缓冲液:硼砂19.08克溶于1000ml水中;NaOH 4g，溶于1000 ml水中，二液等量混合。 (4)2%酪蛋白:称取2g干酪素，用少量0.5mol/l NaOH润湿后适量加入pH11的硼砂- NaOH缓冲液，加热溶解，定容至100ml，4?冰箱中保存，使用期不超过一周。 2. 酶活标准曲线的制作
产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离
实验一产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离 一、教学目标及基本要求 1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术 2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法 3. 学习和掌握枯草芽孢杆菌的分离技术 4. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法 二、实验原理 枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。 1. 枯草芽孢杆菌的芽孢耐热的特点。 由于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。 2. 枯草芽孢杆菌的产酶特征。 利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。 3. 枯草芽胞杆菌的形态特征 枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。 4. 枯草芽胞杆菌的生理生化特性 枯草芽孢杆菌能够液化明胶，冻化牛乳，还原硝酸盐，不产生吲哚，H2S，V-P反应阳性，水解淀粉。葡萄糖发酵产酸不产气，需氧，适温25～31℃生长。 三、实验材料 1. 样品：从地表下10~15cm的土壤或者枯枝烂叶、腐烂稻草中用无菌小铲、纸袋取土样， 并记录取样的地理位置、pH、植被情况等。（学生自取） 2. 培养基 ①肉汤培养基（附录Ⅱ-1.1）：100 mL/组，其中20 mL液体培养基/250 mL△中（内装玻璃
发酵工艺优化
发酵工艺优化 从摇瓶试验到中试发酵罐试验的不同之处 1、消毒方式不同，摇瓶是外流蒸汽静态加热（大部分是这样的），发酵罐是直接蒸汽动态加热，部分的是直接和蒸汽混合，会因此影响发酵培养基的质量，体积，PH，透光率等指标。扩大时摇考虑 2、接种方式不同，摇瓶是吸管加入，发酵罐是火焰直接接种（当然有其他的接种方式），要考虑接种时的菌株损失和菌种的适应性等。 3、空气的通气方式不同，摇瓶是表面直接接触。发酵罐是和空气混合接触，考虑二氧化碳的浓度和氧气的融解情况。 4、蒸发量不同，摇瓶的蒸发量不好控制，湿度控制好的话，蒸发量会少。发酵罐蒸发量大，但是可以通过补料解决的。 5、搅拌方式不同，摇瓶是摇转方式进行混合搅拌，对菌株的剪切力较小。发酵罐是直接机械搅拌，注意剪切力的影响和无菌的影响。 6、PH的控制，摇瓶一般通过碳酸钙和间断补料控制PH，发酵可以直接流加控制PH，比较方便。 7、温度控制，摇瓶是空气直接接触或者传热控制温度，但是发酵罐是蛇罐或者夹套水降温控制，注意降温和加热的影响。 8、注意染菌的控制方法不一样，发酵罐根据染菌的周期和染菌的类型等可以采取一些必要的措施减少损失。 9、发酵罐可以取样或者仪表时时检测，但是摇瓶因为量小不能方便的进行控制和检测。 10、原材料不一样，发酵所用原材料比较廉价而且粗旷，工艺控制和摇瓶区别很大等等 发酵工艺中补料的作用 补料分批培养(fed—batch culture简称FBC)是指在分批培养过程中、间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法、与传统的分批集中补料培养相比、它有以下优点： (1)可以避免在分批发酵中因—次投料过多造成发酵液环境突变，造成菌丝大量生长等问题，改善发酵液流变等性质，使得发酵过程泡沫得以控制，节省消泡剂，并提高了装罐系数。 (2)可以控制细胞质量，以提高芽抱的比例，并使pH得以稳定。 (3)可以解除底物抑制，产物反馈抑制和分解阻遏。 (4)可以使“放料和补料”方法得以实施。该方法在发酵后期、产生了一定数量代谢产物后，在发酵液体积测量监控下，放出一部分发酵液，同时连续补充——部分新鲜营养液，实现连续带放、既有利于提高产物产量．又可降低成本，使得发酵指数得以大幅度提高。 (5)利用FBC技术、可以使菌种保持最大的生产力状态．随着传感技术以及对发酵过程动力学理沦深入研究、用模拟复杂的数学模型使在线方式实最优控制成为可能。 连续补料控制目前采用有反馈控制和无反馈控制两种方式。有反馈控制：选择与过程直接关系的可检测参数作为控制指标，例如可以测量、控制发酵液PH、采用定量控制葡萄糖流加。稳定PH在次级代谢最旺盛水平。而无反馈控制FBC是指无固定的反馈参数，以经验和数学模型相结合的办法来操作最优化控制、从而使抗生素发酵产量得以大幅度提高。例如发酵过程中前体的补加。由此可见，要实现对发酵过程的有效控制，就先要解决补科的连续控制问题。 目前国外发酵生产过程连续补料采用：流量计(电磁流量计、液体质量流量计)、小型电动、气动隔膜调节阀和控制器来实现连续补料控制。菜发酵工厂在中试试验中还成功地运用了电子称加三阀控制的自动补科系统 至于装液量的问题，应该从以下几个方面考虑： 1、保持在你所需要的转速培养情况下（尤其是在后期，菌丝很多时，转速很高时），不能让发酵液把你的塞子湿掉，容易造成染菌。 2、装液量的体积在消毒过程中，不能因为沸腾把塞子湿掉，或者跑出三角瓶，装液量太多会出现这样的情况。很容易染菌。 3、根据你的菌种的情况和发酵液的粘度，需要的混匀程度等等方面也要考虑。 4、建议你做一个梯度试验（40－50－60－70－80等）就可以找到你所需要的装液量。 关于剩余空气的排除在灭菌完毕后（100度左右），立刻用盖子或者其他的用品把你的培养摇瓶盖好，有时候这么点空气根本对兼性厌氧发酵没有什么影响，如果你的菌种要求很严的话，最好用干冰加入已经灭菌的空摇瓶后，立刻用其他的样品培养基分装即可。当然也可以用氮气。最好是二氧化碳。 你可以再查查看是否有其他的方法，我说的也不完全。！！
分离产蛋白酶的芽孢杆菌菌株的分离方案
分离产蛋白酶的芽孢杆菌菌株的分离方案 一．取样环境及原因 选择一块污染较少且植被丰富，腐殖质较厚的地块，取表层一下5—10cm处的土样，这样可以保证土壤中有多种类和多数量的高活性的微生物，并且可以避免污染物对菌种的影响。 二．筛选流程 1)将采集的土壤样品用无菌水制备1:10的土壤悬液。 2)取1:10土壤悬液5mL，注入已灭菌的试管中，将试管放入75—80℃水浴中 热处理10min，以杀死非芽孢细菌及其他微生物。 3)取热处理过的悬液100—200μL，涂布接种到牛肉膏白胨培养基平板，将平板倒置， 于30—32℃培养24—48小时。 4)对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片， 做芽孢染色，选出芽孢杆菌菌落。 5)从芽孢杆菌菌落处分别挑取少许菌苔，接种到含酪蛋白的斜面培养基上，再点接于含酪 蛋白的平板，30—32℃培养24—48h，测定平板上菌落苔直径和水解圈的直径。 6)筛选出水解圈于菌落直径比值大的菌落进行发酵培养，取发酵液进行酶活力测定。再取 发酵液酶活力大的菌落进行接种培养。 三．筛选模型的选择及原因 芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌，并且广泛存在于土壤中，且其性质稳定，可较容易与其它细菌分离，繁殖速度快，体积较大，在培养时可抑制有害菌生长。而且对人体无害，可代谢生产多种酶和有机酸。 四．如何检验筛选所得的菌株是所需的目的菌种 芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，可用革兰氏染色法初步判定，且其在酪蛋白平板上会产生水解圈，并且其菌种有体积较大，表面干燥、粗糙、不透明等特征，较易和其它菌种分辨。还可以利用显微镜观察比较其形态特征来判定是否为芽孢杆菌。
响应面优化实验方案设计
食品科学研究中实验设计的案例分析 ——响应面法优化超声辅助提取车前草中的熊果酸 班级：学号：姓名： 摘要：本文简要介绍了响应面曲线优化法的基本原理和使用步骤，并通过软件Design-Expert 软件演示原文中响应面曲线优化法的操作步骤。验证原文《响应面法优化超声辅助提取车前草中的熊果酸》各个数据的处理过程，通过数据对比，检验原文数据处理的正确与否。 关键词：响应面优化法数据处理 Design-Expert 车前草 前言： 响应曲面设计方法(Response SufaceMethodology，RSM)是利用合理的试验设计方法并通过实验得到一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法（又称回归设计）。 响应面曲线法的使用条件有：①确信或怀疑因素对指标存在非线性影响；②因素个数2-7个，一般不超过4个；③所有因素均为计量值数据；试验区域已接近最优区域； ④基于2水平的全因子正交试验。 进行响应面分析的步骤为：①确定因素及水平，注意水平数为2，因素数一般不超过4个，因素均为计量值数据；②创建“中心复合”或“Box-Behnken”设计；③确定试验运行顺序(Display Design)；④进行试验并收集数据；⑤分析试验数据；⑥优化因素的设置水平。 响应面优化法的优点：①考虑了试验随机误差②响应面法将复杂的未知的函数关系在小区域内用简单的一次或二次多项式模型来拟合，计算比较简便，是降低开发成本、优化加工条件、提高产品质量，解决生产过程中的实际问题的一种有效方法③与正交试验相比，其优势是在试验条件寻优过程中，可以连续的对试验的各个水平进行分析，而正交试验只能对一个个孤立的试验点进行分析。 响应面优化法的局限性: 在使用响应面优化法之前，应当确立合理的实验的各因素和水平。因为响应面优化法的前提是设计的试验点应包括最佳的实验条件，如果试验点的选取不当，实验响应面优化法就不能得到很好的优化结果。 原文《响应面法优化超声辅助提取车前草中的熊果酸》采用经典的三因素三水平Box-Behnken 试验设计，以熊果酸的提取率为响应值，通过回归分析各工艺参数与响应值之间的关系，并由此预测最佳的工艺条件。本文利用软件验证原文中的数据处理过程，以检验原文数据是否处理正确。 1 确定实验因素 原文利用超声波辅助提取车前草中的熊果酸，而影响熊果酸提取率的因素有很多，如超声波的功率、提取时间、溶剂温度、溶剂种类、液固比等。原文参考文献《柿叶中总三萜的提取以及熊果酸分离, 纯化研究》中提取熊果酸的方法提取熊果酸，即将干燥的车前草粉碎后过筛，取20～40 目的车前粉，用石油醚在 55℃脱脂 3 次，干燥备用。精密称取一定量的车前粉，加入一定量的乙醇，称量，在一定的超声波功率下提取一定时间后，擦干外壁，再称量，用乙醇补充缺失的质量，离心。用注射器抽取一定量上清液，过μm 滤膜，进行检测。每个实验进行 3 次平行实验。取其平均值。结果以提取率(E)的来表示。
枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌产酶研究分析
个人收集整理仅供参考学习 枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌产酶分析 一、概述 1. 枯草芽孢杆菌 枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属地一种.单个细胞0.7～0.8 ×2～3微米，着色均匀. 无荚膜，周生鞭毛，能运动.革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9 ×1.0～1.5 微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大.菌落表面粗糙不透明， 污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭.需氧菌.可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚.b5E2RGbCAP 有地菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶地重要生产菌；有地菌株具有强烈降解核苷酸地酶系，故常作选育核苷生产菌地亲株或制取5'-核苷酸酶地菌种.在遗传学研究中应用广泛，对此菌地嘌呤核苷酸地合成途径与其调节机制研究较清楚.广泛分布在土壤及腐败地有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名.p1EanqFDPw
2.地衣芽孢杆菌 地衣芽孢杆菌，种属芽孢杆菌科细菌为革兰氏阳性杆菌；细胞大小：0．8μm×（1．5～3．5）μm；细胞形态及特点：细胞形态和排列呈杆状、单生.细胞内无聚-β-羟基丁酸盐（PHB ）颗粒，产生近中生地椭圆状芽孢，孢囊稍膨大. 在肉汁培养基上地菌落为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，24h 后菌落直径为3mm.本菌有动力.可调整菌群失调达到治疗目地，可促使机体产生抗菌活性物质、杀灭致病菌.能产生抗活性物质，并具有独特地生物夺氧作用机制，能抑制致病菌地生长繁 殖.DXDiTa9E3d 二、产酶地种类 1.枯草芽孢杆菌代谢产酶种类枯草芽孢杆菌产生多种酶和其他代谢产物，主要由以下几个方面：枯草芽孢杆菌菌体在生长过程中产生地枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质对致病菌或内源性感染地条件致病菌有明显地抑制作用；RTCrpUDGiT 枯草芽孢杆菌能迅速消耗消化道内环境中地游离氧，形成肠道低氧环境，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道PH 值，间接抑制其它致病菌地生长；5PCzVD7HxA 枯草芽孢杆菌能刺激动物免疫器官地生长发育，激活淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力； jLBHrnAILg 枯草芽孢杆菌菌体能自身合成消化性酶类，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪
发酵工艺优化
发酵工艺优化---现代发酵工业调控策略 发布日期：2010-04-10 来源：[标签:来源] 作者：[标签:作者] 浏览次数：716 发酵是细胞大规模培养技术中最早被人们认识和利用的。发酵技术在医药、轻工、食品、农业、环保等领域的广泛应用，使这一技术在国民经济发展中发挥着越来越重要的作用。为了提高发酵生产水平，人们首先考虑的是菌种的选育或基因工程的构建。而实际上，发酵工艺的优化，包括生物反应器中的工程问题，也同样非常重要。发酵环境条件的优化发酵环境条件的优化是发酵过程中最基本的要求，也是最重要、最难掌握的技术指标。温度、pH值、溶氧、搅拌转速、氨离子、金属离子、营养物浓度等的优化控制，依据不同的发酵而有所不同。同时，微生物在 发酵是细胞大规模培养技术中最早被人们认识和利用的。发酵技术在医药、轻工、食品、农业、环保等领域的广泛应用，使这一技术在国民经济发展中发挥着越来越重要的作用。为了提高发酵生产水平，人们首先考虑的是菌种的选育或基因工程的构建。而实际上，发酵工艺的优化，包括生物反应器中的工程问题，也同样非常重要。发酵环境条件的优化发酵环境条件的优化是发酵过程中最基本的要求，也是最重要、最难掌握的技术指标。温度、pH 值、溶氧、搅拌转速、氨离子、金属离子、营养物浓度等的优化控制，依据不同的发酵而有所不同。同时，微生物在生长的不同阶段、生产目的代谢产物的不同时期，对环境条件可能会有不同的要求。因此，应该在生物反应器内，使温度、pH值、溶氧、搅拌转速等不断变换，始终为其提供最佳的环境条件，以提高目的产物的得率。在发酵放大实验中，一般都很注重寻找最佳的培养基配方和最佳的温度、pH值、溶氧等参数，但往往忽视了细胞代谢流的变化。例如：在溶解氧浓度的测量与控制时，关心的是最佳氧浓度或其临界值，而不注意细胞代谢时的摄氧率；用氨水调节pH值时，关心的是最佳pH值，却不注意添加氨水时的动态变化及其与其他发酵过程的参数的关系，而这些变化对细胞的生长代谢却非常重要。基于此，华东理工大学的张嗣良提出了“以细胞代谢流分析与控制为核心的发酵工程学”的观点。他认为，必须高度重视细胞代谢流分布变化的有关现象，研究细胞代谢物质流与生物
响应面法实验
试验设计与优化方法，都未能给出直观的图形，因而也不能凭直觉观察其最优化点，虽然能找出最优值，但难以直观地判别优化区域．为此响应面分析法（也称响应曲面法）应运而生．响应面分析也是一种最优化方法，它是将体系的响应（如萃取化学中的萃取率）作为一个或多个因素（如萃取剂浓度、酸度等）的函数，运用图形技术将这种函数关系显示出来，以供我们凭借直觉的观察来选择试验设计中的最优化条件． 显然，要构造这样的响应面并进行分析以确定最优条件或寻找最优区域，首先必须通过大量的量测试验数据建立一个合适的数学模型（建模），然后再用此数学模型作图． 建模最常用和最有效的方法之一就是多元线性回归方法．对于非线性体系可作适当处理化为线性形式．设有m个因素影响指标取值，通过次量测试验，得到n组试验数据．假设指标与因素之间的关系可用线性模型表示，则有应用均匀设计一节中的方法将上式写成矩阵式或简记为式中表示第次试验中第个因素的水平值；为建立模型时待估计的第个参数；为第次试验的量测响应（指标）值；为第次量测时的误差．应用最小二乘法即可求出模型参数矩阵B如下将B阵代入原假设的回归方程，就可得到响应关于各因素水平的数学模型，进而可以图形方式绘出响应与因素的关系图． 模型中如果只有一个因素（或自变量），响应（曲）面是二维空间中的一条曲线；当有二个因素时，响应面是三维空间中的曲面．下面简要讨论二因素响应面分析的大致过程． 在化学量测实践中，一般不考虑三因素及三因素以上间的交互作用，有理由设二因素响应（曲）面的数学模型为二次多项式模型，可表示如下：通过n次量测试验（试验次数应大于参数个数，一般认为至少应是它的3倍），以最小二乘法估计模型各参数，从而建立模型；求出模型后，以两因素水平为X坐标和y坐标，以相应的由上式计算的响应为Z坐标作出三维空间的曲面（这就是2因素响应曲面）．应当指出，上述求出的模型只是最小二乘解，不一定与实际体系相符，也即，计算值与试验值之间的差异不一定符合要求．因此，求出系数的最小二乘估计后，应进行检验．一个简单实用的方法就是以响应的计算值与试验值之间的相关系数是否接近于1或观察其相关图是否所有的点都基本接近直线进行判别．如果以表示响应试验值，为计算值，则两者的相关系数R定义为其中对于二因素以上的试验，要在三维以上的抽象空间才能表示，一般先进行主成分分析进行降维后，再在三维或二维空间中加以描述．等等………… 2注意事项 对于构造高阶响应面，主要有以下两个问题： 1，抽样数量将显著增加，此外，普通的实验设计也将更糟。 2，高阶响应面容易产生振动。 响应面法(response surface methodology，记为RSM)最早是由数学家Box和Wilson于1951年提出来的。就是通过一系列确定性的“试验”拟合一个响应面来模拟真实极限状态曲面。其基本思想是假设一个包括一些未知参量的极限状态函数与基本变量之间的解析表达式代替实际的不能明确表达的结构极限状态函数。响应面方法是一项统计学的综合试验技术，用于处理几个变量对一个体系或结构的作用问题，也就是体系或结构的输入(变量值)与输出(响应)的转换关系问题。现用两个变量来说明:结构响应Z与变量x1,x2具有未知的、不能明确表达的函数关系Z=g(x1,x2)。要得到“真实”的函数通常需要大量的模拟，而响应面法则是用有限的试验来回归拟合一个关系Z= g’(x1,x2)，并以此来代替真实曲面Z=g(x1,x2)，将功能函数表示成基本随机变量的显示函数，应用于可靠度分析中。响应面方法实际上源于一种试验设计方法，试验设计方法是用来研究设计参数对模型设计状况影响的一种取样策略，决定了构造近似模型所需样本点的个数和这些点的空间分布情况。目前广泛应用于计算机仿真试验设计的主要方法是拉丁超立方体抽样和均匀设计，这两种试验设计能应用于多种多样的模型，且对模型的变化具有稳健性。 3响应面分析
发酵工艺优化
发酵工艺优化 发酵工艺优化 从摇瓶试验到中试发酵罐试验的不同之处 1、消毒方式不同，摇瓶是外流蒸汽静态加热（大部分是这样的），发酵罐是直接蒸汽动态加热，部分的是直接和蒸汽混合，会因此影响发酵培养基的质量，体积，PH，透光率等指标。扩大时摇考虑 2、接种方式不同，摇瓶是吸管加入，发酵罐是火焰直接接种（当然有其他的接种方式），要考虑接种时的菌株损失和菌种的适应性等。 3、空气的通气方式不同，摇瓶是表面直接接触。发酵罐是和空气混合接触，考虑二氧化碳的浓度和氧气的融解情况。 4、蒸发量不同，摇瓶的蒸发量不好控制，湿度控制好的话，蒸发量会少。发酵罐蒸发量大，但是可以通过补料解决的。 5、搅拌方式不同，摇瓶是摇转方式进行混合搅拌，对菌株的剪切力较小。发酵罐是直接机械搅拌，注意剪切力的影响和无菌的影响。 6、PH的控制，摇瓶一般通过碳酸钙和间断补料控制PH，发酵可以直接流加控制PH，比较方便。 7、温度控制，摇瓶是空气直接接触或者传热控制温度，但是发酵罐是蛇罐或者夹套水降温控制，注意降温和加热的影响。 8、注意染菌的控制方法不一样，发酵罐根据染菌的周期和染菌的类型等可以采取一些必要的措施减少损失。 9、发酵罐可以取样或者仪表时时检测，但是摇瓶因为量小不能方便的进行控制和检测。 10、原材料不一样，发酵所用原材料比较廉价而且粗旷，工艺控制和摇瓶区别很大等等 发酵工艺中补料的作用 补料分批培养(fed—batch culture简称FBC)是指在分批培养过程中、间歇或连续地补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法、与传统的分批集中补料培养相比、它有以下优点： (1)可以避免在分批发酵中因—次投料过多造成发酵液环境突变，造成菌丝大量生长等问题，改善发酵液流变等性质，使得发酵过程泡沫得以控制，节省消泡剂，并提高了装罐系数。 (2)可以控制细胞质量，以提高芽抱的比例，并使pH得以稳定。 (3)可以解除底物抑制，产物反馈抑制和分解阻遏。 (4)可以使“放料和补料”方法得以实施。该方法在发酵后期、产生了一定数量代谢产物后，在发酵液体积测量监控下，放出一部分发酵液，同时连续补充——部分新鲜营养液，实现连续带放、既有利于提高产物产量．又可降低成本，使得发酵指数得以大幅度提高。 (5)利用FBC技术、可以使菌种保持最大的生产力状态．随着传感技术以及对发酵过程动力学理沦深入研究、用模拟复杂的数学模型使在线方式实最优控制成为可能。 连续补料控制目前采用有反馈控制和无反馈控制两种方式。有反馈控制：选择与过程直接关系的可检测参数作为控制指标，例如可以测量、控制发酵液PH、采用定量控制葡萄糖流加。稳定PH在次级代谢最旺盛水平。而无反馈控制FBC是指无固定的反馈参数，以经验和数学模型相结合的办法来操作最优化控制、从而使抗生素发酵产量得以大幅度提高。例如发酵过程中前体的补加。由此可见，要实现对发酵过程的有效控制，就先要解决补科的连续控制问题。 目前国外发酵生产过程连续补料采用：流量计(电磁流量计、液体质量流量计)、小型电动、气动隔膜调节阀和控制器来实现连续补料控制。菜发酵工厂在中试试验中还成功地运用了电子称加三阀控制的自动补科系统