蛋白酶的发酵及酶活力测定实验报告
蛋白酶的发酵及酶活力测定实验报告
学院：生物科学与工程学院
专业：生物技术
班级： 1班
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学号：
摘要：蛋白酶是一类重要的工业用酶，广泛应用于食品、医药、洗涤剂、皮革、酿酒等行业。当前，食品工业用酶主要来自微生物，尤其是蛋白酶的应用最为广泛。作为一种生物催化剂,它具有催化反应速度快,无工业污染,催化反应条件适应性宽等的性质和优点。由于从植物和动物中生产蛋白酶具有的局限性,为了满足当今世界市场的需要,人们越来越多地把目光投到微生物蛋白酶上[2] 。微生物由于具有生长速度快、所需生长空间小、广泛的生化多样性及其遗传可操作性等特点,因而备受人们青睐。本文主要进行了菌种的生长曲线的绘制与菌种最佳发酵产酶时间等方面的研究。
关键字：蛋白酶生长曲线酶活力
第一章前言
1.1研究的目的与意义
蛋白酶是工业酶中用得最多的一种酶，是催化蛋白质肽键水解的一类酶,它作用于蛋白质,将其分解为蛋白胨、多肽及游离氨基酸[1] ，约占酶总量的 60%，其中碱性蛋白酶就占25%。有调查显示，酶制剂市场量最大的是洗涤剂用酶，第二位是淀粉加工用酶，以后依次为乳制品加工业、制酒工业、纺织工业和饮料加工业等用酶[2]。与动、植物来源的蛋白酶相比，利用微生物产的蛋白酶有易于培养、生长快、产量高、易于提取，适于大规模工业化生产，培养基的成本相对较低等优点，使微生物成为生产蛋白酶的重要来源和首选材料。
1.2 国内外研究概况
1.2.1 微生物蛋白酶的分类
由于从植物和动物中生产蛋白酶具有的局限性,为了满足当今世界市场的需要,人们越来越多地把目光投到微生物蛋白酶上[3]。当前工业用酶主要来源于微生物，微生物来源的蛋白酶按其作用的 pH 值的不同可分为三类，即碱性蛋白酶、中性蛋白酶及酸性蛋白酶，它们作用的最适 pH 值分别为碱性、中性及酸性。
1.2.2在食品工业中的应用
蛋白酶在食品工业上的应用主要是用在制干酪，蛋白质水解调味液，烤焙食品，肉类嫩化，功能性低聚肽和阿斯巴甜的合成等。食品加工使用的蛋白酶通常来自于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、米曲霉和黑曲霉等。
随着社会发展和生活水平不断提高，人们对肉类的需求量日益增长的同时，对肉的品质也提出了更高要求。微生物蛋白酶肉类嫩化剂是一种专门用于嫩化肉类的生物制剂，在适当温度下，可以断裂蛋白质中的某些肽键，提高肉的嫩度，使肉变得多汁、柔软、易于咀嚼，提高了肉的成品率、保质期和经济效益，因此十分经济且便于生产，并能取得显著效果。面包制作过程中，面粉中含有的不溶解性谷蛋白可以通过碱性蛋白酶限制性降解来修饰。用米曲霉蛋白酶和肽酶对面筋蛋白作有限的水解，可改善面团操作性能和机械性能，以适应不同制品的需要。酶处理后的面团其韧性和机械强度都有所增加。过量使用蛋白酶能减少面团的混合时间和增加面包产量。使用细菌蛋白酶可以增加面团的延展性[4]。
1.3本实验的研究内容
通过研究产蛋白酶菌来了解蛋白酶产生菌的生长情况，学会绘制其生长曲线，了解蛋白酶的性质及蛋白酶的测定原理，掌握蛋白酶的发酵及酶活力测定方法和掌握一定的知识与技能。
第二章材料与设备
2.1菌种
产蛋白酶芽孢杆菌
2.2培养基
2.2.1牛肉膏蛋白胨培养基
2.2.2酪素培养基
2.3主要试剂材料
福林试剂、0.4mol/L的碳酸钠溶液、0.4mol/L的三氯乙酸、0.5mol/LNaOH溶液、1mol/L 和0.1mol/L盐酸溶液、硼酸缓冲液(pH=10.5)、10g酪素溶液、100ug/mL L--酪氨酸标准溶液
2.4主要仪器设备
UV1000分光光度计、恒温水浴锅、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、移液枪、吸管、离心管、枪头、摇床、培养基
第三章分析测定方法
3.1福林-酚试剂法
福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。因此可利用此原理测定蛋白酶活力。通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度计在680nm波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。
3.2蛋白酶活力测定方法
按中华人民共和国专业标准 SB/T 10317-1999：蛋白酶活力测定法[5]测定。
3.2.1标准曲线的制作
管号
酪氨酸标
准溶液的
浓度ug/ml
取100ug/ml酪
氨酸标准溶液
的体积ml
取去离
子水的
体积ml
加0.4mol/L
的碳酸钠溶
液的体积ml
加福尔马
林的体积
ml
测定
OD680值
（A）
0 0 0.0 1.0 5.00 1.00 0
1 10 0.1 0.9 5.00 1.00 0.089
2 20 0.2 0.8 5.00 1.00 0.179
3 30 0.3 0.7 5.00 1.00 0.353
4 40 0.4 0.6 5.00 1.00 0.479
5 50 0.5 0.5 5.00 1.00 0.518
加完之后，置于40+0.2水浴中显色20min，取出，用分光度计于波长680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的对照管为空白，分别测定其吸光度值。以吸光度值A为纵坐标，酪氨酸的浓度C为横坐标，绘制标准曲线，计算出OD680=1时的浓度，即为吸光常数K值。
计算出OD680=1时的浓度，即为吸光常数K值，K=88.28。
3.2.2酶活力数值计算：
X= A×K×4/10×n
木瓜蛋白酶活力测定方法
木瓜蛋白酶活力测定方法 分别精密量取酪蛋白溶液5ml，置3支具塞试管中，置40℃水浴中保温10分钟，各精密加入供试品溶液2ml，摇匀，置40℃水浴中，开始记时，准确反应1小时，立即精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，置40℃水浴中放置30~40分钟，使沉淀的蛋白质完全凝固，滤过，滤液作为供试品溶液。精密量取酪蛋白溶液5ml置另一具试管，于40℃水浴中保温1小时，精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，精密加入供试品溶液2ml，置40℃水浴中放置30~40分钟，滤过，滤液作为空白溶液。照分光光度法（中国药典2000年版二部附录IV A），以0.1mol/L 盐酸溶液为空白，在275nm的波长处测定空白溶液、供试品溶液和对照品溶液的吸收度，按下式计算： 效价（单位/mg）=A/As＊Cs＊12/2＊稀释倍数/W 式中A为供试品溶液的吸收度减去空白溶液的吸收度： As为酪氨酸对照品溶液的吸收度： Cs为酪氨酸对照品溶液的浓度， ug/ml W为供试品重量，mg; 在上述条件下，释放1ug的酪氨酸的酶量为一个活力单位。 试剂酪蛋白溶液：取酪蛋白1g，加0.05mol/L磷酸氢二钠溶液50ml,置沸水浴中煮30分钟，时时搅拌，冷至室温，加0.05mol/L枸椽酸溶液调节PH至6.0±0.1，并迅速搅拌，防止酪蛋白沉淀，用水稀释至100ml（临用新配）。酶稀释液：取无水磷酸氢二钠3.55g，加水400ml溶解，加乙二胺四醋酸二钠1.1g和盐酸半胱氨酸2.74g，振摇溶解，用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节PH6.5±0.1，用水稀释至500ml,混匀（临用新配）三氯醋酸溶液:取三氯醋酸17.99g，加醋酸钠29.94g和冰醋酸18.9ml，加适量水溶解后，加水使成1000ml，摇匀。 酶活力测定对照品溶液的制备:精密称取已105℃干燥至恒重的酪氨酸对照品适量，用0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml中约含40ug的溶液。供试品溶液的制备:取本品适量（约相当于木瓜酶活力120万单位），精密称定，加酶稀释液振摇，制成每1ml中含200~300单位的溶液，摇匀。 淀粉酶活力测定 实验技术 2008-05-27 18:01:29 阅读213 评论0字号：大中小 一、目的 淀粉是葡萄糖以α-1,4糖苷键及α-1，6 糖苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的重要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、 纺织工业的基本原料。 淀粉酶是加水分解淀粉的酶的总称，淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依 据，也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应。小麦成熟期如遇阴雨天气，有的品种会发生
年产1000吨酸性蛋白酶的生产工艺设计
1. 前言 酸性蛋白酶是一类最适pH值为2.5?5.0的天冬氨酸蛋白酶，相对分子质量为30000 ?40000。酸性蛋白酶主要来源于动物的脏器和微生物分泌物,包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。根据其产生菌的不同，微生物酸性蛋白酶可分为霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和担子菌酸性蛋白酶.根据作用方式可分为两类：一类是与胃蛋白酶相似，主要产酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一类是与凝乳酶相似，主要产酶微生物是毛霉和栗疫霉等。细菌未发现产酸性蛋白酶的菌株.由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。 国外关于酸性蛋白酶的生产研究从20世纪初就开始了。1908年，德国科学家从动物的胰脏中提取出胰蛋白酶，并将其用于皮革的鞣质。1911年美国科学家从木瓜中提取木瓜蛋白酶（在酸性，碱性和中性的条件下都能分解蛋白质的酶）并将木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白质浑浊物。自1954年吉田首次发现黑曲霉可产生酸性蛋白酶以来，国外对微生物发酵生产酸性蛋白酶进行了广泛的研究。1964年外国科学家首次发现大孢子黑曲霉突变体能产生两种不同的酸性蛋白酶，即酸性蛋白酶和酸性蛋白酶。1965年又从血红色陀螺孔菌，中分离出了一种酸性蛋白酶，并对该酶进行了纯化和结晶。1968年从微小毛霉中筛选出了一种酸性蛋白酶，并对其进行了纯化和酶学性质分析。1995年外国科学家对烟曲霉酸性蛋白酶的基因进行了克隆和测序。2001年又从假丝酵母中筛选出了一种酸性蛋白酶菌株，并对该酶进行了核苷酸序列分析和功能分析。国外学者对曲霉酸性蛋白酶的结构和功能等己经研究的较为透彻。 与国外相比，我国对酸性蛋白酶的研究相对较晚些。1970年上海工业微生
胰蛋白酶活性测定
实验一胰蛋白酶活性测定 实验目的：掌握测定胰蛋白酶浓度、活性、比活的原理与方法。 实验原理：胰蛋白酶相对分子量23.7 KD，主要水解肽链中碱性氨基酸与其它氨基酸相连接的肽键，此外还能水解碱性氨基酸形成的酯键，如把人工合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（N-benzuyl-L-argine ethyl ester, BAEE）水解为H-苯甲酰-L-精氨酸（BA）。 胰蛋白酶所催化的上述反应中，产物BA对253 nm 的光吸收远大于BAEE，因此可以在实验起始点把253 nm 的消光值调为零，然后记录反应体系对253 nm 的消光值的增量，并把这个增量作为测定胰蛋白酶的活性指标。 酶活单位定义：在底物BAEE浓度1m mol/L，光程1 cm，波长253nm，温度25 0C，测量体积3mL,.条件下吸光值每分钟递增0.001（A/min=0.001）为1个BAEE酶活单位。 胰蛋白酶制剂中蛋白质浓度含义： 胰蛋白酶含量一般E1%表达。这个值的含义是：浓度为1% 酶蛋白，在1cm光径下，对紫外280nm 的消光值。不同厂家、不同产品的E1%值有很大差别。E1% 值越高，表明酶制剂中酶蛋白含量越高。 由于酶制剂中蛋白质含量各不相同，所以用酶制剂配制E1%的蛋白质溶液时，按照厂家对产品的E1% 的测定值配制溶液。 在本实验中，胰蛋白酶酶蛋白样品采用SIGMA 公司生产的产品,生产公司对展品的描述是对280nm紫外吸收值15.3，配制胰蛋白酶标准溶液可根据厂家的这个说明。 器材以试剂：器材，电子天平，紫外分光光度计，微量加样器。试剂：标准胰蛋白酶，N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯，HCI, Tris。 1．胰蛋白酶活性测定： 1）配制E1%的胰蛋白酶溶液
酸性蛋白酶生产工艺
第六节酸性蛋白酶生产工艺 07040642 47 李继江 1 蛋白酶、蛋白类酶、酸性蛋白酶 1.1 蛋白酶的定义 蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，它可迅速水解蛋白质为胨、肽类，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。同时大多数微生物蛋白酶都是胞外酶。 1.2 微生物蛋白酶分类 微生物蛋白酶按其作用的最适pH可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶三类。 碱性蛋白酶为透明褐色液体，能与水混溶，最适温度50~60℃，最适pH8.5。 中性蛋白酶为金属酶，褐色颗粒或液体，易溶于水，最适温度45~55℃，最适pH5.5~7.5。 酸性蛋白酶为近乎白色至浅黄色无定型粉末或液体，易溶于水，最适温度45℃，最适pH2.5。 1.3 蛋白类酶 蛋白类酶主要是指由蛋白质组成的酶（P酶）；而主要由核糖核酸组成的酶称为核酸类酶（R酶）。 蛋白类酶分为氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶（或称连接酶）。 1.4 酶的生产方法 酶的生产方法主要有：提取分离法、生物合成法、化学合成法。 酶的微生物合成法主要有：液体深层发酵、固体培养发酵、固定化细胞培养、固定化原生质发酵。 酸性蛋白酶用微生物发酵法生产，采用液体深层发酵。 液体深层发酵是指液体培养基在发酵罐中灭菌冷却后，接入产酶细胞，一定条件下发酵，适用于微生物细胞、动植物细胞的培养。具有机械化程度高、技术管理严格、酶产率高、质量稳定，产品回收率高的特点，是目前酶发酵的主要方式。 1.5 酸性蛋白酶制剂的性能 1.5.1 酸性蛋白酶的作用机理 酶是一种蛋白质，它是活细胞产生的生物催化剂，生物体的新陈代谢活动都离不开酶的作用。酶的种类很多，酸性蛋白酶是水解酶类的一种，能够在微酸环境下（pH2．5～4．0）
03 实验三 碱性蛋白酶活力测定
实验三. 碱性蛋白酶活力测定 【实验目的】 1. 掌握测定碱性蛋白酶活力的原理和酶活力的计算方法。 2. 学习测定酶促反应速度的方法和基本操作。 【实验原理】 酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。 酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。 碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。 【实验材料】 1.实验器材 电热恒温水浴槽；分析天平；容量瓶；移液管；721分光光度计 2.实验试剂 (1)福林试剂：在1L容积的磨口回流瓶中加入50g钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、125g钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、350ml蒸馏水、25ml 85％磷酸及50ml浓盐酸，充分混匀后回流10h。回流完毕，再加25g硫酸锂、25ml蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴，冷却后定容到500ml。过滤，置于棕色瓶中暗处保存。使用前加4倍蒸馏水稀释。 (2)1%酪蛋白溶液：称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后，慢慢加入0.2mol/L NaOH 4ml，充分研磨，用蒸馏水洗入100ml容量瓶中，放入水浴中煮沸15分钟，溶解后冷却，定容至100ml，保存于冰箱内。 (3)pH10缓冲溶液： 甲液（0.05mol/L硼砂溶液）：取硼砂(Na2B4O7·10H2O) 19克，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。 乙液：0.2mol/L氢氧化钠溶液 配制pH10硼砂氢氧化钠溶液：吸取甲液50ml，再加入乙液21ml，用蒸馏水定容至200ml。 (4)标准酪氨酸溶液：精确称取酪氨酸50mg，加入1ml 1mol/L盐酸溶解后用蒸馏水定容至50ml，即得1mg/ml酪氨酸标准溶液。 (5)0.4mol/L碳酸钠溶液,0.4mol/L三氯醋酸溶液。 【实验操作】 1.制备酪氨酸标准曲线 (1) 取7支试管，编号，按下表配制不同含量的酪氨酸溶液。（见下页） (2) 在上述7支试管中，分别加入1%酪蛋白溶液1ml，于40℃水浴中保温15分钟，取出后，加入0.4mol/L三氯醋酸3ml，充分摇匀，各管分别用滤纸过滤。 (3)分别吸取滤液1ml放入另7支试管中，加入0.4mol/L碳酸钠溶液5ml，福林试剂1ml，充分摇匀，于40℃水浴中保温15分钟，然后于每管中各加入3ml蒸馏水，充分摇匀。 (4) 用721型分光光度计，以0号管作对照，在680nm处测定光密度。
3吨碱性蛋白酶课程设计--年产3吨碱性蛋白酶发酵工艺设计
年产3吨碱性蛋白酶发酵工艺设计 摘要 在现代食品工业中, 酶的应用几乎涉及到食品加工的各个领域。随着酶制剂日益广泛的应用,经济效益显著。蛋白酶是水解蛋白质肽链的一类酶的总称, 而碱性蛋白酶则适宜在碱性条件( pH9——11) 下水解动植物蛋白质, 广泛存在于动植物及微生物中。设计中首先根据参考资料选定了碱性蛋白酶发酵生产的具体工艺流程，通过物料衡算确定需要立方米发酵罐台和立方米种子罐台，在此基础上得出发酵工段所需要的各种原料量，通过能量衡算确定水、无菌空气和蒸汽等的消耗量。然后对主要设备进行计算和选型，得出发酵罐、种子罐及通用设备、非标准设备等的结构尺寸、冷却装置、传动装置，根据工艺要求确定罐的附属设备和辅助设备以及发酵过程中的优化控制。 根据计算结果，设计了两张图纸，分别为发酵罐装配图、工艺流程图。 关键词：碱性蛋白酶发酵罐种子罐物料衡算
1绪论-------------------------------------------------------------- 1 1.1碱性蛋白酶概述---------------------------------------------- 1 1.2碱性蛋白酶的性质-------------------------------------------- 1 1.3碱性蛋白酶的使用条件---------------------------------------- 1 1.4碱性蛋白酶的保存-------------------------------------------- 1 1.5注意事项---------------------------------------------------- 1 1.6碱性蛋白酶的主要应用---------------------------------------- 2 1.6.1在洗涤剂中的应用-------------------------------------- 2 1.6.2在皮革中的应用---------------------------------------- 2 1.6.3在饲料添加剂中的应用---------------------------------- 3 1.6.4在纺织行业的应用-------------------------------------- 3 1.6.7在玉米深加工中的应用---------------------------------- 3 1.7碱性蛋白酶的发展前景---------------------------------------- 4 2设计任务---------------------------------------------------------- 4 2.1设计内容---------------------------------------------------- 4 2.2设计要求---------------------------------------------------- 4 3碱性蛋白酶生产工艺选择-------------------------------------------- 5 3.1生产工艺的选择---------------------------------------------- 5 3.2工艺流程图-------------------------------------------------- 5 3.3工艺流程图说明---------------------------------------------- 6 3.3.1菌种的制备-------------------------------------------- 6 3.3.2孢子的制备-------------------------------------------- 6 3.3.3种子的制备-------------------------------------------- 6 3.4菌种的改良-------------------------------------------------- 6 3.5培养基的制备------------------------------------------------ 8 3.6灭菌的方法-------------------------------------------------- 8 3.6.1湿热灭菌---------------------------------------------- 8 3.6.2培养基的连续灭菌-------------------------------------- 9 3.6.3空气除菌---------------------------------------------- 9
测定蛋白酶活力实验
测定蛋白酶活力实验 一、实验目的 1.加深了解酶活力的概念。 2.学习掌握测定蛋白酶活力的方法。 二、实验原理 酶活力指酶催化某一特定反应的能力。其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。 酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μg 酪氨酸所需的酶量。 实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。产物酪氨酸在碱性条件下与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，该蓝色化合物在680nm 处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比。 因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋白酶的活力。 三、仪器和试剂 仪器: 恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。原料 枯草杆菌蛋白酶：称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉，用少量L，磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，震荡15分钟，使充分溶解，干纱布过滤，取滤液冰箱备用。使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释。
试剂 1. Folin-酚试剂： 在2L 磨口回流瓶中加入钨酸钠(Na2WoO4. 2H2O)100g，钼酸钠(Na2WoO4. 2H2O)25g，蒸馏水700mL，85%磷酸50mL 以及浓盐酸100mL，充分混匀后，微火回流加热10小时。再加入硫酸锂150g，蒸馏水50mL 和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸15min，以驱赶过剩的溴。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤，溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。使用前用标准NaOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度(约为2mol/L)，然后加水稀释至1mol/L，即可使用。 2. 0.2mol/L 盐酸溶液 3. L 氢氧化钠溶液 4. L 碳酸钠溶液 5. 10%三氯乙酸溶液 6. 磷酸缓冲液： 称取磷酸氢二钠(Na2HPO4 . 12H2O)7.16g，用水定容至100mL(A 液)；称取磷酸二氢钠(Na2HPO4.12H2O)3.12g，用水定容至100mL(B 液)。取A 液84mL，B 液16mL 混合后，得到磷酸缓冲液，可长期存放。临用时稀释10倍即可。 7. 标准酪氨酸溶液(50μg/mL)：称取以烘干至恒重的酪氨酸，用L 盐酸约30mL 溶解后，蒸馏水定容至250mL。 8. 酪蛋白溶液%)：称取1.25g 酪蛋白，用L 氢氧化钠溶液(20mL)溶解，再用磷酸缓冲液定容到250mL。
蛋白酶活力的测定
实验三蛋白酶活力的测定 一、目的 掌握用分光光度计法测定蛋白酶活力的原理与操作技术。 二、原理 蛋白酶水解酪蛋白，其产物酪氨酸能在碱性条件下使福林——酚试剂还原，生成鉬蓝与钨蓝，以比色法测定。 三、试剂及仪器 1．福林—酚试剂 称取50g钨酸钠(Na2WO4?2H2O)，12.5g钼酸钠(Na2MoO4?2H2O)，置入1000mL原底烧瓶中，加350mL水，25mL85%磷酸，50mL浓盐酸，文火微沸回流10h，取下回流冷凝器，加50g硫酸锂(Li2SO4)和25mL水，混匀后，加溴水脱色，直至溶液呈金黄色，再微沸15min，驱除残余的溴，冷却，用4号耐酸玻璃过滤器抽滤，滤液用水稀释至500mL。 使用时用2倍体积的水稀释。 2．0.4mol/L碳酸钠溶液：称取42.4g碳酸钠，用水溶解并定容至1000mL。 3．0.4mol/L三氯乙酸溶液：称取65.5g三氯乙酸，用水溶解并定容至1000mL。 4．2%酪蛋白溶液 称取2.00g酪蛋白(又名干酪素)，加约40mL水和2~3滴浓氨水，于沸水浴中加热溶解，冷却后，用pH7.2磷酸缓冲溶液稀释定容至100mL，贮存于冰箱中。 5．pH7.2磷酸缓冲液 0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：称取31.2g磷酸二氢钠(NaH2PO4?2H2O)，用水溶解稀释至1000mL； 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液：称取71.6g磷酸氢二钠(Na2HPO4?12H2O)，用水溶解稀释至1000mL； pH7.2磷酸缓冲溶液：取28mL 0.2mol/L磷酸二氢钠溶液和72mL 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，用水稀释至1000mL。 6．标准酪氨酸溶液： 准确称取0.1g DL-酪氨酸，加少量0.2mol/L盐酸溶液(取1.7mL浓盐酸，用水稀释至100mL)，加热溶解，用水定容至1000mL，每毫升含DL-酪氨酸100微克。 7．仪器：分光光度计、试管 四、操作步骤 1．标准曲线绘制 在上述各管中各取1mL，分别加入5mL 0.4mol/L碳酸钠溶液，1mL福林—酚试剂，于400C水浴显色20min，在680nm波长下测吸光度，绘制标准曲线，在标准曲线上求得吸光度
分光光度法测定蛋白酶酶活
分光光度法测定蛋白酶酶活 1适用范围 本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的测定。 2测定原理 蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素（酪蛋白）底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生产钼蓝和钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品的酶活力。 酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。 3仪器和设备 3.1分析天平：精度为0.0001g。 3.2紫外分光光度计。 3.3恒温水浴锅：精度±0.2℃。 3.4PH计：精度为0.01PH单位。 4试剂和溶液 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。 4.1福林（Folin）试剂 市售分析纯福林试剂。 4.2福林使用溶液 一份福林试剂与两份水混合，摇匀。 4.3碳酸钠溶液（42.4g/L） 称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000ml。 4.4三氯乙酸c（CCl3COOH）=0.4mol/L 称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。 4.5氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L 称取氢氧化钠片剂20.0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至1000ml，摇匀。 4.6盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L
1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。 0.1 mol/L HCL：取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。 4.7缓冲溶液 4.7.1磷酸缓冲液（pH＝7.5，适用于中性蛋白酶） 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4?12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4?12H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。 4.7.2乳酸缓冲液（pH＝3.0，适用于酸性蛋白酶） 甲液：称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液：称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液：取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。4.810g/L酪素溶液 称取酪素（固定厂家生产，不同厂家产品对实验结果有影响）1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量的缓冲溶液（测中性蛋白酶加磷酸缓冲液，测酸性蛋白酶加乳酸缓冲液）约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的ｐH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。 4.9L－酪氨酸标准溶液（100μg/mL） 称取预先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用1mol/L盐酸60 mL 溶解后再用蒸馏水定容至100 mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。 吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L－酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。 5分析步骤 5.1标准曲线的绘制 5.1.1L—酪氨酸标准溶液：按表1配置。L—酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。 表1
年产1000吨酸性蛋白酶的生产工艺设计
1. 前言 酸性蛋白酶是一类最适pH值为的天冬氨酸蛋白酶，相对分子质量为30000 40000。酸性蛋白酶主要来源于动物的脏器和微生物分泌物,包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。根据其产生菌的不同，微生物酸性蛋白酶可分为霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和担子菌酸性蛋白酶.根据作用方式可分为两类：一类是与胃蛋白酶相似，主要产酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一类是与凝乳酶相似，主要产酶微生物是毛霉和栗疫霉等。细菌中尚未发现产酸性蛋白酶的菌株.由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。 国外关于酸性蛋白酶的生产研究从20世纪初就开始了。1908年，德国科学家从动物的胰脏中提取出胰蛋白酶，并将其用于皮革的鞣质。1911年美国科学家从木瓜中提取木瓜蛋白酶（在酸性，碱性和中性的条件下都能分解蛋白质的酶）并将木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白质浑浊物。自1954年吉田首次发现黑曲霉可产生酸性蛋白酶以来，国内外对微生物发酵生产酸性蛋白酶进行了广泛的研究。1964年外国科学家首次发现大孢子黑曲霉突变体能产生两种不同的酸性蛋白酶，即酸性蛋白酶和酸性蛋白酶。1965年又从血红色陀螺孔菌，中分离出了一种酸性蛋白酶，并对该酶进行了纯化和结晶。1968年从微小毛霉中筛选出了一种酸性蛋白酶，并对其进行了纯化和酶学性质分析。1995年外国科学家对烟曲霉酸性蛋白酶的基因进行了克隆和测序。2001年又从假丝酵母中筛选出了一种酸性蛋白酶菌株，并对该酶进行了核苷酸序列分析和功能分析。国外学者对曲霉酸性蛋白酶的结构和功能等己经研究的较为透彻。 与国外相比，我国对酸性蛋白酶的研究相对较晚些。1970年上海工业微生物研究所首先从黑曲霉中筛选出一株产酸性蛋白酶菌株，并和上海酒精厂协作进行中试生产，填补了我国酸性蛋白酶制剂的空白.近年来国内在酸性蛋白酶上的研究大都致力于选育产酶活力高、抗逆性好的菌种，并获得了一些很有应用前途的产酶菌株。目前用于酸性蛋白酶生产的高产菌株主要有黑曲霉、宇佐美曲霉和青霉及它们的突变株。李永泉等，对宇佐美曲霉所产的酸性蛋白酶进行了发酵过程动力学研究.戚淑威等对青霉产酸性蛋白酶的适宜条件和酶学性质进行了分析。谢必峰等，采用硫酸铵盐析法和离子交换层析法分离纯化了黑曲霉产酸性蛋
蛋白酶活力测定方法
酸性蛋白酶产品概述: 蛋白质由氨基酸组成，是自然界中发现的最复杂的有机化合物之一。由盐酸和蛋白酶分解成易被高等动物的肠道和微生物有机体的细胞膜吸收的氨基酸。包括人类在内的每种动物，必须要有足够的蛋白质来维持自身生长，来生成每个细胞所必需的氨基酸，一些特种蛋白质还是某些特殊细胞、腺体分泌物、酶和激素的功能性组成元素。蛋白酶是指一些有催化功能的酶，能够水解（断裂）蛋白质，因此也被称为蛋白水解酶。蛋白水解酶在许多的生理和病理过程中发挥着重要作用，在食品和乳品加工业也有着广泛应用。工作机理 蛋白水解酶制剂本产品能在酸性条件下水解蛋白质食品中的缩氨酸键，释放氨基酸或者多肽。在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒、黄油和酱油生产中，添加酸性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进，从而加速发酵并提高产量。本产品是一种酸性蛋白酶制剂，在酸性条件下具有较高活性，由酸性蛋白酶高产菌株——曲霉菌深层发酵而成。它广泛应用于饲料、纺织、废水处理和果汁提纯方面。 酸性蛋白酶（Acid protease ）是指蛋白酶具有较低的最适pH，而不是指酸性基团存在于酶的活性部位，酸性蛋白酶的最适PH从2左右（胃蛋白酶）到4左右。从酶的活力-PH曲线分析，在酶的活性部位中含有一个或更多的羟基。这一类蛋白酶中研究最彻底的是胃蛋白酶。（酸性蛋白酶537容易失活）
简介：酸性蛋白酶是由隆科特黑曲霉优良菌种经发酵精制提炼而成，它能在低PH条件下，有效水解蛋白质，广泛应用于酒精、白酒、啤酒、酿造、食品加工、饲料添加、皮革加工等行业。 1、产品规格：，规格有5万u/g～10万u/g 液体型为黑褐色液体，规格有50000u/ml～10000u/ml. 2、酶活力定义：一个酶活力单位是1g酶粉或1ml酶液在40℃，PH3.0条件下，1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位（u/g或u/ml） 特性1、温度范围为：最适温度范围为40℃-50℃2、PH为：最适PH范围为2.5～3.5 使用方法 1、白酒工业： 本品用以淀粉为原料的生产酒精及白酒行业，提高出酒率0.25%个酒分，提高发酵速度。 2、食品工业： 食品上用以淀粉改良，提高食品风味、改良品质，因能提高氨基酸含量 3、啤酒生产： 能有效阻断双乙酰生成，缩短啤酒成熟期。 4 饲料添加剂：提高饲料利用率。 5、毛皮软化： 提高上色率，手感丰满，增加毛皮光泽。
胰蛋白酶活性检测试剂盒说明书 紫外分光光度法
胰蛋白酶活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 货号：BC2310 规格：50T/48S 产品内容： 提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂×1支，4℃避光保存。临用前加1mL蒸馏水充分溶解。 试剂二：液体50mL×1瓶，4℃保存。 产品说明： 胰蛋白酶选择性水解变性蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，是一种重要的消化酶。此外，胰蛋白酶还广泛应用于脓胸、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等的辅助治疗。 胰蛋白酶催化水解BAEE的酯键，生成BA，BA在253nm处有吸收峰，通过测定253nm吸光度增加速率，即可计算出胰蛋白酶的活性。 自备仪器和用品： 紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 称取约0.1g样品，加入1mL提取液进行冰浴匀浆，10000rpm4℃离心10min，取上清液，即粗酶液，置冰上待测。或者直接称取1mg酶粉，加1mL提取液，充分混匀后置冰上待测（为保证实验的准确性建议梯度稀释）。 二、测定： 1.分光光度计预热30min以上，调节波长到253nm，蒸馏水调零。 第1页共2页
2.工作液的配制：将试剂一与试剂二按2:97配置工作液，按需配制，并置于37℃水浴预热30min以上。 3.空白管：取1mL石英比色皿，加入990μL工作液，再加入10μL蒸馏水，混匀，迅速于253nm测定0s 和60s的吸光度，分别记为A1、A2，△A空白=A2-A1。 4.测定管：取1mL石英比色皿，加入990μL工作液，再加入10μL粗酶液，混匀，迅速于253nm测定0s 和60s的吸光度，分别记为A3、A4，△A测定=A4-A3。 三、胰蛋白酶活性计算： 1.按蛋白浓度计算： 活性单位（U）定义：在1mL体系下，37℃每毫克蛋白质每分钟催化253nm处吸光值增加0.001为一个单位。胰蛋白酶（U/mg prot）=(△A测定-△A空白)÷0.001÷（Cpr×V1）÷T =100000×(△A测定-△A空白)÷Cpr 2.按样本鲜重计算： 活性单位（U）定义：在1mL体系下，37℃每克组织每分钟催化253nm处吸光值增加0.001为一个单位。 胰蛋白酶（U/g鲜重）=(△A测定-△A空白)÷0.001÷（W×V1÷V2）÷T =100000×(△A测定-△A空白)÷W Cpr：粗酶液蛋白质浓度（需要另外测定），mg/mL；W：样本鲜重，g； V1：加入反应体系中粗酶液体积，10μL=0.01mL；V2：粗酶液总体积，1mL； T：反应时间，1min。 注意事项： 实验前用1～2个样做预实验，保证吸光值变化在0.01～0.15之间。 第2页共2页
实验二、细菌蛋白酶的发酵制备
实验二、细菌蛋白酶的发酵制备 一、实验目的原理 了解气升式发酵罐的结构及特点，学会使用该类型的发酵罐培养微生物。本实验在5L 发酵罐中进行细菌培养。通过测定菌体浓度了解细菌的生长规律，通过测定蛋白酶活力了解产物生成，分析菌体生长与产物生成的关系。同时检测发酵过程中的溶氧、pH等。 二、材料与方法 1.实验用培养基 LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物 5g/L，氯化钠10g/L，卡那霉素5mg/L，pH7.4。 0.5mg/mL抗生素溶液：称取 0.05g 卡那霉素溶于 100ml 无菌水。小管分装后置-20℃冻存备用。 斜面培养基：配方同 LB 液体培养，调pH至7.4后添加琼脂15g/L。 三、实验过程 1.种子制备 250mL锥形瓶装培养基50mL，接种斜面菌种一环，于旋转摇床37℃培养12h 转速150-200转/分。 2.发酵前准 1).清洗。发酵罐培养前后进行清洗（空气分布器、管内壁、顶板放零件的小间隙），外壁、底板、顶板擦干净。 2).连接。进行发酵之前要对发酵系统（蒸汽发生器管路、空气压缩系统、冷却系统、发酵流加系统及在线控制系统）进行调试。主要工作是检查通气与通水管道的连接正确与否、管道是否破损、空压机能否正常工作、在线控制系统能否正常工作。发酵罐中配置用于供给冷却水、循环水及排水的管子。空压机空气供给的配管。连接发酵罐、PH 控制器、DO 控制器等电源。注意不漏电和接错线。 3).试剂。配置培养基、酸碱平衡液、消泡剂等。 3.电极标定 3.1 pH 电极标定 pH 电极零点和斜率要在进行灭菌以前进行，电极在使用前先用蒸馏水清洗并检查电极信号有无故障，然后再进行标定。一般而言如果发酵液偏酸性我们用6.86 和4.00 的缓冲液，如果偏碱性则配制6.86 和9.18 的缓冲液。 点击控制器屏幕画面下方的“标定”，弹出标定菜单，选择相应罐（F1-F4）下的“pH 电极”，弹出相应的pH 电极标定界面。先进行零点标定，以酸性为例，将pH 电极联好电极线用蒸馏水洗净后插入pH6.86 的标准液中，点击“零点值”，输入6.86，然后点击“开始”，待采样值完全稳定后点击“结束”。然后用蒸馏水清洗电极探测头后插入pH4.01 的标准液中，同样方法输入斜率值 4.01 来标定斜率。 接下来将PH 电极插在发酵罐上与培养基一起进行灭菌，并用纱布和牛皮纸将电极的金属头包住，以免接触到水。实消后，冷却下来，连上电极线，接到灌上，这时PH 电极将信号传给控制系统并显示发酵罐内发酵液的PH 值。在发酵控制台上设定需要控制的PH，控制系统会通过流加酸碱控制PH。也可不控制PH，通过电极对发酵过程的PH 变化进行检测。
蛋白酶提取、活力测定实验总结
发酵实验总结 生物技术1002 1610100311 刘小波 摘要： 1、实验目的：通过本次实验，学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法，学习并掌握细菌菌株的药瓶液体发酵技术，了解碱性蛋白酶活力测定的原理，掌握碱性蛋白酶活力测定的方法。 2、实验方法：从玉米黄顶菊混种土壤中筛选蛋白酶，之后经液体发酵扩大培养，挑选出活力较强的菌落，通过碱性蛋白酶活力测定的方法测出蛋白酶活力的大小。 3、实验结果： 实验原理： 1、能够产生胞外蛋白酶的菌株在平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的筛选依据。 2、蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可以利用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，先对分子质量较小的仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。在280nm 波长下测定溶液吸光度的增加，就可以计算酶的活力。 实验材料： 玉米黄顶菊混种土样、酪蛋白、牛肉膏、磷酸氢二钠、氯化钠、琼脂、蒸馏水、0.02mol/l磷酸盐缓冲液（ph7.5）、1%酪蛋白溶液、5%三氯醋酸（TCA）溶液、烧杯、试管、容量瓶、量筒、玻璃棒、移液枪、电子秤、高温高压灭菌锅、恒温培养箱、离心机、水浴锅、紫外线分光光度计等。实验方法： 蛋白酶的筛选： 1、准确称取玉米黄顶菊混种土样10g，放入装有90mL无菌水的250mL三角瓶中，用手震荡20min，使微生物细胞分散，静置20～30s，即成10－1稀释液；再用1mL无菌吸管，吸取10－1稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10－2稀释液；再换一支无菌吸管，吸取10－2稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，也吹吸3次，成10－3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10－4、10－5、10－6、10－7、10－8一系列稀释菌液。 2、配酪素培养基（加琼脂），高压灭菌，倒平板，编号1、2、3。另外配不加琼脂的液体培养基，
分光光度法测定蛋白酶酶活知识讲解
分光光度法测定蛋白 酶酶活
分光光度法测定蛋白酶酶活 1适用范围 本方法适用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的测定。 2测定原理 蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素（酪蛋白）底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生产钼蓝和钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液吸光度。酶活力与吸光度成正比，由此可以计算产品的酶活力。 酶活单位的定义：每1mL粗酶液，在一定温度和pH值条件下，10min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个酶活力单位，以（u/mL）表示。 3仪器和设备 3.1分析天平：精度为0.0001g。 3.2紫外分光光度计。 3.3恒温水浴锅：精度±0.2℃。 3.4PH计：精度为0.01PH单位。 4试剂和溶液 除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂和蒸馏水。 4.1福林（Folin）试剂 市售分析纯福林试剂。 4.2福林使用溶液 一份福林试剂与两份水混合，摇匀。 4.3碳酸钠溶液（42.4g/L） 称取无水碳酸钠（Na 2CO 3 ）42.4g，用水溶解并定容至1000ml。 4.4三氯乙酸c（CCl 3 COOH）=0.4mol/L 称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。 4.5氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L 称取氢氧化钠片剂20.0g，加水900ml并搅拌溶解，待溶液到室温后加水定容至1000ml，摇匀。
4.6盐酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L 1 mol/L HCL:取90mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。 0.1 mol/L HCL：取9mL浓盐酸溶解于蒸馏水中，定容至1000mL。 4.7缓冲溶液 4.7.1磷酸缓冲液（pH＝7.5，适用于中性蛋白酶） 称取磷酸氢二钠（Na2HPO4?12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4?12H2O） 0.5g，加水溶解并定容至1000mL。 4.7.2乳酸缓冲液（pH＝3.0，适用于酸性蛋白酶） 甲液：称取乳酸（80％～90％）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液：称取乳酸钠（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL。 使用溶液：取甲液8 mL，加乙液1 mL，混匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。 4.810g/L酪素溶液 称取酪素（固定厂家生产，不同厂家产品对实验结果有影响）1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量的缓冲溶液（测中性蛋白酶加磷酸缓冲液，测酸性蛋白酶加乳酸缓冲液）约80 mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直到完全溶解，冷却后，转入100 mL容量瓶中，用适宜的ｐH缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。 4.9L－酪氨酸标准溶液（100μg/mL） 称取预先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000g，精确至0.0002g，用 1mol/L盐酸60 mL溶解后再用蒸馏水定容至100 mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。 吸取1mg/ mL酪氨酸标准溶液10.00 mL，用0.1mol/L盐酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L－酪氨酸标准溶液。此溶液在冰箱内贮存或立即使用。 5分析步骤 5.1标准曲线的绘制 5.1.1L—酪氨酸标准溶液：按表1配置。L—酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测 定。
蛋白酶的工厂设计
年产1500m3蛋白酶的工厂设计 摘要 蛋白酶是催化肽键水解的一类酶，它可迅速水解蛋白质为胨、肽类，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。同时大多数微生物蛋白酶都是胞外酶。微生物蛋白酶按其作用的最适pH可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶三类。酸性蛋白酶是一种羧基蛋白酶，它的分子质量为30-40kD，等电点（pH3.0-5.0） 酸性蛋白酶现已广泛应用于食品、饲料、酿造、毛皮与皮革、医药、胶原纤维等各个行业之中。本设计采用豆饼粉、玉米粉、淀粉为主要的培养基原料，并选用黑曲霉（Aspergillus niger ）3.350菌种发酵。其中豆饼粉3.75%，玉米粉0.625%，鱼粉0.625%，氯化铵1%，氯化钙0.5%，磷酸氢二钠0.2%。 本设计利用通风搅拌式发酵罐进行发酵，同时利用离子交换树脂对母液进行提取，提高了酸性蛋白酶的生产效率，减少了生产成本。设计还包括发酵罐，全厂平面图，车间平面布置图，工艺流程图。 关键词：酸性蛋白酶发酵工厂设计
The Process Design of the Protease used for Section with the Capacity of 1500m3 Annually Abstract protease is a kind of Peptone and peptide. It has been discover across in animal giblets ,the stem of plant,fruit , microbial and so on.Most of the Microbial protease are ectoenzyme .According to its best Optimum pH function ,Microbial protease Can be divided into Acid protease ,Neutral protease and alkaline protease .Acid protease is a kind of Carboxyl protease , Its molecular weight is 30-40 kd, lower isoelectric point (pH3.0-5.0) Acid protease in food, medicine, textile, leather, feed, cosmetics, washing industries have applications, natural health, avirulent and harmless, quite safe. So in this paper the basic content of more acid protease, production process and application development were introduced. This design USES the bean cake powder, corn flour, starch as the main medium of raw materials, and selects the Aspergillus Niger, Aspergillus Niger) 3.350 bacterial fermentation. With bean cake powder 3.75%, corn flour 3.75%, 0.625% fish meal, 1% ammonium chloride, calcium chloride 0.5%, disodium hydrogen phosphate 0.2%. This design using the ventilation agitator in fermentor, using ion exchange resin in mother liquid was extracted at the same time, improve the efficiency of the acid protease production, reduce the production cost. The design also includes Fermentor, The factory plan, Shop floor plan, Flow Chart. Key Words: Acid protease ; fermentation; plant-design;