实验四乳鼠肺细胞原代培养

一、实验目的

1.了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。

2.学习细胞消化、细胞计数方法。

二、实验原理

原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断的地生长及繁殖。

三、实验用品

1.设备

培养箱、倒置显微镜、超净工作台、高压锅、恒温水浴箱、离心机等。

2.器材

眼科剪（尖头、弯头）、眼科镊（尖头、弯头）、培养皿、纱布块（或不锈钢网）、玻璃漏斗、量筒、移液管、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养皿等。

上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，15磅灭菌30min。此外，还需显微镜、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球等。

3.试剂

（1）D-Hanks平衡盐溶液：即无钙、镁离子的Hanks液。

（2）细胞消化液：％胰蛋白酶液（胰蛋白干粉，加D-Hanks平衡盐溶液100mL，溶解后过滤除菌，调pH值）

溶液。

（3）％NaHCO

（4）RPMI1640培养液。

以上溶液均经适当包装，除菌后备用。此外，还需胎牛血清和1000U/mL的青、链霉素液（双抗）。在RPMI1640培养液中加入10%胎牛血清，1%双抗，即成细胞培养液。

4.仪器药品

以3-5人为一个小组，每组需备：乳鼠一只；眼科剪、眼科镊各两把；90mm玻璃培养皿3个，用以清洗组织块；50mL离心管1个；5mL、10mL移液管各5支；35mm培养皿1个。

四、材料

出生后2-3天的乳鼠。

五、实验步骤

1.清洗与消毒

操作者首先进行手的清洗与消毒。

2.处死动物

新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2—3秒钟，置平皿中。

3.取肺

左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手以眼科直剪剪开皮肤，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，继而以另一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。用眼科聂取出肺，置于盛有Hanks液（含有200U/ml青链霉素）的玻璃平皿中，冲洗去血。

4.剪肺

用眼科剪将肺分成几个肺叶，用镊子去除周边的血凝块及纤维组织，用眼科剪剪去肺门处的支气管和血管，再用含有双抗的Hanks液冲洗1遍。用弯头眼科剪，将肾剪成1mm3大小的组织块，大小应尽量均匀一致，再用Hank液洗涤2-3次，直到液体澄清为止。

5.消化及分散组织块

将上步清洗过的Hank液吸掉，按组织块体积的5-6倍量加入消化液。转入50mL离心管，置于37℃水浴中进行消化。消化时间在20-40min左右。每隔10min摇动一次，以便组织块散开，以利继续消化，直到组织变成松散、粘稠状，并且颜色略变为白色为止。

从水浴中取出离心管，吸去胰蛋白酶液，加入少量培养液，用吸管反覆吹打组织块，直到大部分组织块均分散成混淆的细胞悬液为止。此时，可将分散的细胞悬液经过灭菌的纱布（或不诱钢网）进行过滤，以去除部分较大的组织碎片。

6.计数与稀释

从上步滤过的细胞悬液中吸取1mL细胞液，进行计数。将细胞液滴于血细胞计数板上，按白细胞计数法进行计数，计数后用培养液进行稀释，将细胞调整到5×105/ml左右

7.分装与培养

接种时，在25ml的培养瓶中先加入的培养液，在用移液管将接种1ml稀释好的细胞悬液，做好

培养箱进行培养

标志，注明细胞、日期等信息。然后将培养皿置于37℃，5%CO

8.观察

置于37℃培养的细胞，需逐日进行观察，主要观察：

（1）培养液若变为桔红色，一般显示细胞生长良好。

（2）细胞生长状况与培养液颜色的变化，如培养液变为紫红色，一般细胞生长不好。

（3）培养物是否被污染，如培养液变为黄色且混浊，表示该瓶被污染。

六、讨论

培养细胞的过程和结果。

七、思考题

如何提高原代细胞培养的效率。