GST亲和层析介质使用说明书
GST亲和层析介质使用说明书
一、简介
GST亲和层析介质（GST Agarose）是专门设计用于纯化谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用蛋白的分离介质，一步分离就可得到高纯度的GST融合目标蛋白，纯化条件温和，可以保证蛋白的活性。
本产品是自主设计合成的GST琼脂糖凝胶，具有优良的物理和化学稳定性，使用寿命长，操作方便，批次重复性好，易于放大，是研发与生产的理想选择。
二、性能参数
三、适用范围
分离谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用的蛋白。
四、操作说明
1. 缓冲液配制
缓冲液A（平衡缓冲液）：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl，调节pH值至8.0。
缓冲液B（洗脱缓冲液）：10mM Glutathione（还原型），50mM Tris-HCl，调节pH值至8.0。因Glutathione易氧化，需现用现配。
（注：各种溶液配制完毕后，最好进行脱气处理，0.45 μm滤膜过滤备用)。
2. 样品预处理：
按每克湿重菌体/2~5ml平衡缓冲液的比例充分悬浮离心收集的菌体；600w功率，每循环超声3s，冷却3s，循环99×3次,破碎菌体；4℃、15000rpm离心15m，收集上清液，或用0.45μm滤膜过滤。
3. 装柱：
聚苯乙烯层析柱
1) 将层析柱固定在铁架台或层析架上，封闭层析柱下端出口，向柱内充入纯水，排开层析柱内空气，先将垫片完全浸没于水面下方，在保持水平的状态下，小心推向底部，避免垫片下方滞留气泡。
2) 打开层析柱下端出口，排出柱中纯水；在液面低至距垫片1~1.5cm高度时封闭下端出口，用移液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min，让介质自然沉降。
3) 从上端管口将另一垫片缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免垫片与介质接触面滞留气泡（如对实验结果要求不严，也可不放入上垫片，以提高流速）。
4) 在使用一段时间后，如果层析柱流速减慢，可先用小镊子沿边缘将垫片推翻，夹出垫片，倒出介质，清洗或更换新的垫片后，按2）、3）所述
玻璃层析柱
1) 将层析柱洗净后垂直固定到铁架台上；向柱中加入蒸馏水，排开柱子中的空气，在蒸馏水排尽以前，关闭柱子出口，在柱内保留5~8cm高度的蒸馏水。
2) 先将介质混匀，用移液枪按需要量吸取介质，或用玻璃棒紧靠柱子内壁引流，将介质加入到层析柱中；静置30min，让介质自然沉降。
3) 从上端管口将转换杆出液端缓慢推至介质沉降平面，使介质表面保持水平状态，注意避免转换杆与介质接触面间滞留气泡。
4) 在使用一段时间后，如果流速减慢，可先卸下上转换杆，将介质倒出，再取出下转换接头中滤网，清洗或更换后重新装柱。
4. 过柱：
1) 用10倍介质体积缓冲液A过柱，平衡介质；
2) 上样；
3) 用5~10倍介质体积缓冲液A过柱，洗去层析柱中剩余上样液并重新平衡介质；
4) 用5~10倍介质体积缓冲液B洗脱，收集洗脱液；
5) 用5~10倍介质体积缓冲液A重新平衡介质。
注：纯化过程流速不宜过快，对于1ml介质，流速保持在0.5ml/min为宜。
5. 介质清洗
如果在使用一段时间后，介质因表面沉积过多杂质导致蛋白结合能力下降，需对介质进行清洗。步骤如下：
1) 沉淀或变性物质的清洗：
用2倍介质体积6 M盐酸胍清洗，然后用5倍介质体积缓冲液A平衡介质。
2) 疏水缔合物质的清洗：
用3~4倍介质体积70%乙醇(或2倍介质体积去垢剂，如1% Triton? X-100) 清洗介质；然后用5倍介质体积缓冲液A平衡介质。
6. 介质再生
每次层析前，为达到最佳纯化效果，需对介质进行再生，步骤如下：
1) 2倍介质体积高pH缓冲液（0.1M Tris-HCl, 0.5M NaCl, pH8.5）和低pH缓冲液（0.1M sodium acetate, 0.5M NaCl, pH4.5）交替洗脱三次。
2) 10倍介质体积缓冲液A平衡介质。
7. SDS-PAGE检测：
1) 不同浓度SDS-PAGE分离胶分离范围
2) SDS-PAGE操作流程
A. 每个胶孔最适蛋白上样量为5~10μg。
B. 将含5~10μg蛋白的样品溶液与loading buffer混匀，90℃孵育5min，取出后5000rpm离心1 min。
C. 上样，15mA、30mA恒流或80V、120V恒压电泳。
8.介质保存
4℃~8℃条件下，介质可长期保存于20%乙醇中。
五、GST Agarose分离GST融合蛋白实例
层析介质：GST 1ml；对照GST介质（国际领先品牌）1ml
样品：表达可溶性GST-tag融合thioredoxin的大肠杆菌BL21裂解液
结合缓冲液：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl，pH 8.0
洗脱缓冲液：10 mM Glutathione（还原型）, 50 mM Tris-HCl, pH8.0
流速：GST 1ml，0.5ml/min；对照GST介质1ml，0.5ml/min
实验结果：
色谱分析结果见图1，色谱各组分的SDS-PAGE结果见图2。
图1 GST Agarose分离GST融合蛋白色谱图
1.低分子量Marker；
2.上样液；
3.GST-流穿液；
4.GST-洗脱液；
5.对照-流穿液；
6.对照-洗脱液
1 2 3 4 5 6
图2 纯化后SDS-PAGE图
六、GST亲和层析介质使用注意事项
1. GST融合蛋白与还原型谷胱甘肽的结合比较缓慢，为获得最大结合量，需要保证足够的作用时间，因而在上样时要维持较低流速。在样品中加入5~10mM DTT可以增加介质对目标蛋白的吸附。对于按常规步骤操作吸附效果不好的样品，可以先把介质和样品混合，轻轻振摇2~4h，再装柱，用平衡缓冲液进行重新平衡、洗脱等操作。
2. 不同的GST融合蛋白取得最佳纯化效果所需还原型谷胱甘肽浓度、洗脱体积和洗脱时间可能有所不同。必要时需对流穿液、洗脱液进行SDS-PAGE以及Western杂交分析，以确定最佳纯化条件。
3.GST融合蛋白以包涵体形式存在时不能与介质结合，必须先进行变性、复性、透析处理后才能用介质进行纯化。纯化效果取决于复性效率。
4.纯化后出现杂带的常见原因
1) 目标蛋白断裂或酶解
解决方案：向缓冲液A和缓冲液B中加入1mM PMSF抑制蛋白酶活性，或0.1％TritonX-100或0.1％Tween-20等稳定剂。
2) GST融合蛋白不完全表达
GST融合蛋白有时候只表达到GST部分就终止，GST标签蛋白连同完全表达的融合蛋白均能与介质结合并被洗脱下来，因而洗脱液中出现26KD左右的杂带。
解决方案：尝试用不同浓度的还原型谷胱甘肽洗脱；优化表达条件，降低GST融合蛋白不完全表达量；改变外源基因在载体中插入的酶切位点，重新构建表达载体；在不改变外源基因两端酶切位点的情况下，更换通用载体。
5.如后续实验需要除去洗脱液中还原型谷胱甘肽，可采用超滤或透析的方法。
七、GST标签切除
GST标签可用位点专一的蛋白酶如凝血酶或Xa因子从融合蛋白中切除。蛋白酶解后，再用GST亲和层析方法去除GST 标签，目标蛋白存在于流出液中。一般情况下，与切除GST标签后得到的外源蛋白相比，凝血酶用量极小，如果后续实验要求不严格，不需进一步除去与外源蛋白共存与洗脱液中的凝血酶。如需除去凝血酶，则可将样品用pH7~8的缓冲液溶解，然后直接过1ml的苯甲脒琼脂糖凝胶或者肝素琼脂糖凝胶吸附凝血酶。
质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告及思考题
1．实验目的： （1）通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒； （2）通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术； 2．实验材料及用品 （1）实验仪器（apparatus）： 恒温培养箱（Constant temperature incubator）、恒温摇床（Constant temperature shaking table）、高速离心机（High speed centrifuge）、漩涡振荡器（V ortex mixer）、超净工作台（Bechtop）、高压灭菌锅（Autoclave）、微量加样器（Pipettes）、烧杯（beaker）、量筒（graduated cylinder）、玻璃棒（stir bar）、微波炉（microwave）、天平（Pan balance）、电泳梳子（comb）、电泳槽（electrophoresis tank）、电泳器（Electro-phoresis System）、紫外灯（Ultraviolet transilluminator ） 3）、材料与试剂（Reagents）： ①溶液I（Solution Ⅰ）： 50mmol/L 葡萄糖；25mmol/L 三羟基甲基氨基甲烷（Tris）Tris-HCl（pH8.0）；10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）pH8.0 溶液I可成批配制，每瓶约100ml，10磅高压蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。 ②溶液Ⅱ（Solution Ⅱ）：新鲜配制，等体积混合 0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）；1% SDS （可用10％贮存液稀释配制）注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。 ③溶液III （Solution Ⅲ，100mL)：加上后混匀会形成絮状沉淀 60mL 5mol/L KAc， 11.5mL 冰醋酸， 28.5mL H2O （该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L） ④TE液缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）；1 mmol/L EDTA（pH8.0） ⑤70% 乙醇； ⑥平衡酚：氯仿1：1： 将量取25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入24 ml 氯仿和 1 ml 异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。 ⑦LB培养基： 胰化蛋白胨10g 酵母提取物5g NaCl 15g pH 7.0 ⑧琼脂糖（Agarose）； ⑨1 liter（升）5×TBE备用溶液（stock solution）： 54g tris base，27.5g 硼酸（boric acid），20ml 0.5 mol/L EDTA , pH 8.0； ⑩6×凝胶加样缓冲液：
反演实验三
《地球物理反演概论》上机实验报告实验三：迭代法求解地震层析成像问题 姓名： 学号： 专业：地球物理学 指导教师：邵广周 完成时间：2017.12.21
一、实验内容 利用ART 及SIRT 迭代算法实现下图所示的地震层析成像问题。 ???? ??????????????????????= ????????????? ? ??????????????????????????????????????? ?020******* 0000 000200020002100100100010010010001001001111000000000111000000000111987 6543 21m m m m m m m m m 二、实验要求 编制相应的程序，在计算机上实现ART 及SIRT 迭代算法。将ART 及SIRT 算法的反演结果与实验二的结果进行对比分析，比较各反演方法的优缺点。 三、算法原理 对于线性反问题Gm=d ，系统的每一行对应着一个n 维超平面，共m 个超平面。Kaczmarz 算法的基本原理是：从事先给定的初始模型(0)m 开始，通过将初始模型投影到由G 的第一行定义的超平面上得到(1)m ，然后再将(1)m 投影到由G 的第二行定义的超平面上得到(2)m ，以此类推直到将所有m 个超平面投影完毕。重复上述迭代过程，直到解成功收敛。 Kaczmarz 算法流程： 1、令(0)0m = 2、for i=0，1，…，m ，()(1) () 11111 i i i T i i i T i i G m d m m G G G ++++++-=- 3、判断解是否收敛，如不收敛，返回步骤 如果Gm=d 有唯一解，Kaczmarz 算法将收敛于该解。如果系统有多个解，算法将收敛于与初始模型(0)m 最接近的那个解。特别地，如果(0)0m = ，我们将会
迈克尔逊干涉实验报告
φ M 1 d L 2d S 1’ S 2’ G S M 1’ M 2 迈克尔逊干涉实验 39042122 吴淼 摘要：迈克尔逊干涉仪是一个经典迈克尔逊和莫雷设计制造出来的精密光学仪器，在近代物理和近代计量技术中都有着重要的应用。通过迈克尔逊干涉的实验，我们可以熟悉迈克尔逊干涉仪的结构并掌握其调整方法，认识电光源非定域干涉条纹的形成与特点，部分从并利用干涉条纹的变化测定光源的波长。 实验原理： (1)迈克尔逊干涉仪的光路 迈克尔逊干涉仪的光路图如图（一）所示。从光源S 发出的一束光 摄在分束板G1上，将光束分为两部分：一部分从G1半反射膜处反射，射向平面镜M2；另一部分从G1透射，射向平面镜M1。因G1和全反射平面镜M1、M2均成45°角，所以两束光均垂直射到M1、M2上。从M2反射回来的光，透过半反射膜；从M2反射回来的光，为半反射膜反射。二者汇集成一束光，在E 处即可观察到干涉条纹。光路中另一平行平板G2与G1平行，其材料厚度与G1完全相同，以补偿两束光的光程差，称为补偿板。在光路中，M1’是M1被G1半反射膜反射所形成的虚像，两束相干光相当于从M1’和M2反射而来，迈克尔逊干涉仪产生的干涉条纹如同M2和M1’之间的空气膜所产生的干涉条纹一样。 （2）单色电光源的非定域干涉条纹 M2平行M1’且相距为d ， S 发出的光对M2来说，如S’发出的光，而对于E 处的观察者来说，S’如位于S2’一样。又由于半反 射膜G 的作用，M1如同处于S1’的位 图（一） 迈克尔孙干涉仪光路
置，所以E 处观察到的干涉条纹，犹如S1’、S2’发出的球面波，它们在空间处处相干，把观察屏放在E 空间不同位置，都可以看到干涉花纹，因此 这一干涉为非定域干涉。 如果把观察屏放在垂直于S1’、S2’的位置上，则可以看到一组同心圆，而圆心就是S1’,、S2’的连线与屏的交点E 。设E 处 （ES2’=L ）的观察屏上，离中心E 点远处某一点P ，EP 的距离为R ，则两束光的光程差为 2222)2(R L R d L L +-++=? L>>d 时，展开上式并略去d 2/L 2，则有 ?cos 2/222d R L Ld L =+=? 式中φ是圆形干涉条纹的倾角。所以亮纹条件为 2dcos φ=k λ (k=0,1,2,…) ① 由此式可知，当k 、φ一定时，如果d 逐渐减小，则cos φ将增大，即φ角逐渐减小。也就是说，同一k 级条纹，当d 减小时，该圆环半径减小，看到的现象是干涉圆环内缩；如果d 逐渐增大，同理看到的现象是干涉条纹外扩。对于中央条纹，若内缩或外扩N 次，则光程差变化为2Δd=Nλ.式中，Δd 为d 的变化量，所以有 λ=2Δd/N ② 通过此式则能有变化的条纹数目求出光源的波长。 实验仪器： 迈克尔逊干涉仪、氦氖激光器、小孔、扩束镜、毛玻璃。
亲和层析技术在生物科学中的应用及发展
亲和层析技术在生物科学中的应用及发展 摘要：近几十年来，亲和层析技术发展十分迅速，广泛应用于生物分子(如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素受体、糖蛋白、核酸及多糖类等)及组织(如细胞、细胞器、病毒等)的分离和纯化，是蛋白质组学研究中重要的技术之一。介绍了亲和层析的基本类型及配体合成的研究进展，概述了亲和层析技术在蛋白质组学以及在其他方面的应用和发展动态。 关键词：亲和层析；基本原理；类型；应用 亲和层析(amnitychromaloSraphy)是利用偶 联亲和配体的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目 标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层析法， 近几十年来，亲和层析技术发展十分迅速，并在生 物技术产品、生物分子及组织的分离和纯化领域 取得令人瞩目的成就。现已广泛用于分离纯化蛋 白质、肽、酶及其底物和抑制剂、抗体及抗原、核酸 及其特异性作用物、激素及受体、细胞及细胞表面 物等等”。基于此，本文针对亲和层析的基本类 型，配体的选择和亲和层析在生物学特别是蛋白 质组学中的应用等方面作一介绍。 1 亲和层析的类型 亲和层析柱中被固定的配体是决定亲和层析 成功的关键因素。根据配体与生物大分子之间相 互作用体系不同，可以把亲和层析分为以下4种 类型。 1．1 生物亲和层析(BAFC) 生物亲和层析是利用自然界中存在的生物特 异性相互作用物质对的亲和层析。通常具有高的 选择性。典型的物质对有酶-底物、酶-抑制剂、 激素—受体等。 1．2 免疫亲和层析(1AFC) 利用抗原抗体中的一方为配体，亲和吸附另 一方的分离系统，称免疫亲和层析，免疫亲和层 析应用相当广泛，许多典型的亲和层析纯化蛋白 质的过程已经使用了单克隆抗体作为亲和配体， 目前，利用抗体－抗原模式，有可能得到每一种目
生物医学传感器与检测技术教学
《生物医学传感器与检测技术实验》教案大纲 张日欣李元斌 一、课程名称：生物医学传感器与检测技术实验 Experiments in Biomedical Sensor & Detecting Techniques 二、课程编码：0702831 三、学时与学分：24/1.5 四、先修课程：数字电子技术，模拟电子技术，项目生理学，电子测试与实验，生物医学测量与仪器实验。 五、课程教案目标 1．本课程是生物医学项目专业的一门专业课，它应用电子技术，传感器测量技术和计算机技术，解决生物医学领域中的信号提取，检测和处理以及生物医学仪器的设计等问题； 2．使学生了解典型医学仪器的原理、特点和性能指标，学习正确使用传感器，设计检测电路，掌握基本测量技术； 3．为医学仪器设计奠定基础。 六、适用学科专业 生物医学项目 七、基本教案内容与学时安排 ●热敏器件及温度传感器特性实验<4学时） ●压力传感器性能实验<4学时） ●气敏传感器特性实验<4学时） ●光电式脉搏探测器<4学时） ● ECG前置放大器<4学时） ●陷波器仿真、制作与调试<4学时） ●安全隔离设计与调试<4学时） ● ECG放大器的整体调试<4学时） ● 12导联心电工作站的原理及使用<4学时） 八、教材及参考书： 教材：生物医学电子技术与信号处理实验指导书,张日欣、李元斌、邹昂等自编教材，武汉：华中科技大学教材科，2004年9月 参考文献： 1．生物医学检测技术讲义，杨玉星自编教材，1998年 2．生物医学电子学，蔡建新，张唯真，北京大学出版社，1997年 3．传感器原理与应用，黄贤钨，电子科技大学出版社，1999年 4．生物医学测量，陈延航，人民卫生出版社，1986年 5．医学物理，刘普和，人民卫生出版社，1986年 6．医学仪器-应用与设计，约翰G.韦伯斯特，新时代出版社，1985年 7．Protel 98 for windows 电路设计应用指南，程凡等，人民邮电出版社，1999年 九、考核方式 实验报告+实践表现 《生物医学测量与仪器实验》教案大纲
亲和层析基本知识亲和层析法是利用生物大分子与某些对应的专一
一、亲和层析基本知识 亲和层析法是利用生物大分子与某些对应的专 一分子特异识别和可逆结合的特性而建立起来的一 种生物大分子纯化方法，也叫做生物亲和或生物特 异性亲和色谱。这种特异可逆结合的物质很多，如 抗原与抗体、底物与酶、激素与受体等，他们间的 这种特异亲和能力又叫亲和力。 亲和色谱中，一对互相识别的分子互称对方为 配体，如激素可认为是受体的配体，受体也可以认 为是激素的配体。 其他组分不产生这种专一性的结合，而直接流出色谱柱。然后，便可以利用洗脱剂将吸附在柱中的生物大分子洗脱下来。 亲和色谱法具有高度的专一性，而且色谱过程简单、快速，是一种理想的有效分离纯化生物大分子的手段。 二、固相载体的选择 对于一个成功的亲和色谱分离来说，一个重要的因素就是选择合适的固体载体。一个理想的载体，首先它必须尽可能少地同被分离的物质进行相互作用，以避免非特异的吸附作用。因此，优先选用的是中性聚合物，例如，琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶。其次，载体必须具有良好的通透性，即使在亲和剂键合在它的表面之后也必须保持这种特性。连接亲和剂的先决条件是有足够量的某些化学基团存在，这些基团在不影响载体的结构，也不影响被连接的亲和剂的条件下被活化或衍生。载体在结合亲和剂后，必须在机械性能和化学性质上具有稳定性，而且在改变pH、离子强度、温度以及变性剂的条件下也应该稳定。载体必须有大的孔网结构，允许大分子物质自由出入。再者，载体的组成大小也应均匀。高孔度对于大分子物质的分离是个重要的条件，它的主要作用是提供欲分离的物质与配体间的接触机会。配体大多结合在载体的孔内部，孔太小，生物大分子进不去，即使配体偶联率很高，结合生物大分子的量也不会太大。这不是我们所希望的。一般常用的载体有纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和多孔玻璃等。 三、配体的选择 亲和层析的固体基质具有一个与之共价相连的特殊结合分子（如配位体），连接后的配体对互补分子的亲和力不会改变。配体是发生亲和反应的功能部位，也是载体和被亲和分子
溶菌酶实验 实验报告 第七组
溶菌酶的提取和系列性质测定实验报告 学院：生物科学与工程学院 班级： 姓名： 学号： 组别：第七组 组员：
一、实验内容： 溶菌酶的提取和系列性质测定 在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶的提纯工作往往要求多种方法交替应用，才能得到较为满意的效果。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离提纯效果。 溶菌酶又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶、球蛋白G，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。溶菌酶相对分子质量约为1.44×104，是一种强碱性蛋白质，等电点在10.0以上，并对温度和酸不敏感。在自然界中，普遍存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿液、淋巴液等细胞中，植物卷心菜、萝卜、木瓜等，以蛋清含量最丰富，约为0.3%。 本实验用鸡蛋为原理，通过阳离子交换层析，硫酸铵沉淀，分子筛层析等步骤提取溶菌酶。 二、实验原理： 1蛋白质提取分离技术 以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代
生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、硷、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。 微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。 2.柱层析技术 柱层析技术也称柱色谱技术。一根柱子里先填充不溶性基质形成固定相，将蛋白质混合样品加到柱子上后用特别的溶剂洗脱，溶剂组成流动相。在样品从柱子上洗脱下来的过程中，根据蛋白质混合物中各组分在固定向和流动相中的分配系数不同经过多次反复分配，将不同蛋白组分逐一分离。 根据填充基质和样品分配交换原理不同，离子交换层析，凝胶过滤层析和亲和层析是三种分离蛋白质的经典层析技术。
质粒DNA测定实验报告
生物化学实验报告 姓名： 学号： 专业年级： 组别： 生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 实验日期2014-12-11 实验地点第4实验室 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.掌握PCR基因扩增的原理和操作方法 2.掌握碱裂解法提取质粒的方法 3.了解紫外吸收法检测DNA浓度与纯度的原理、方法 4.学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作 二、实验原理 （一）、第一部分聚合酶链式反应 1.PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在体外复制DNA 的过程。 1)加热使模板DNA，在高温下90℃-95变性，双链解链； 2)降低溶液温度，使合成引物在低温（35－70℃,一般低于模板Tm值的5℃ 左右），与模板DNA互补退火形成部分双链； 3)溶液反应温度升至中温72℃，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为 复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。（二）、第二部分质粒DNA提取与定量 1.质粒（Plasmid） 1)独立于细菌染色体外，能独立自主复制的闭合环状DNA分子；
2)存在于细菌，放线菌，真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。 2.碱裂解法、 1)基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异； 2)高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA变性； 3)当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶 液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心形成沉沉淀 去除。 3.离心层析柱 1)硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，不吸 附蛋白质、多糖等物质； 2)通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除； 3)低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 4.紫外光吸收法 1)物质在光的照射下会产生对光的吸收效应； 2)而且物质对光的吸收是具有选择性的； 3)各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱。 4)因此不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收，光能 量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系。 （三）、第三部分酶切鉴定 1.限制性内切酶 1)限制性内切酶（restriction endonuclease）是DNA操作过程中所使用的基本 工具； 2)特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列之内或其附近 的特异位点上，并在此切割双链DNA；
亲和层析柱使用说明
亲和层析柱使用说明货号 名称规格说明DS0101 亲和层析柱1ml 含1个空管柱，上下盖和2个筛板（亲水性，孔径50um） DS0103 亲和层析柱3ml DS0106 亲和层析柱6ml DS0110 亲和层析柱10ml DS0130 亲和层析柱30ml DS0150 亲和层析柱50ml 一、产品说明 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。它是利用生物分子间 存在很多特异性的相互作用（如抗原和抗体、酶 和底物或抑制剂、激素和受体等），通过将具有 亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质 上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另 一个分子进行分离纯化。 提供的亲和层析柱工具可应用于如下方面： ①纯化重组蛋白；②纯化抗原和抗体；③纯化多 肽；④纯化DNA；⑤糖蛋白的纯化；⑥纯化磷酸 化蛋白和肽；⑦DNA 结合蛋白的纯化；⑧去除内毒素，等。 亲和层析柱空柱管的材质为医疗级的聚丙烯，这种工程材料通过大量的应用证明具有清洁无毒，不与生物分子结合和低溶解度的优点。 亲和层析柱空柱所用的筛板是选用纯净的UHWM-PE（超高分子量聚乙烯）为原料，经独特的工艺加工而成，具有亲水性。筛板在装填时安置在填料基质的上下端，以阻挡昂贵的基质渗出。亲水性筛板采用了领先的亲水性UHWM-PE 生产技术，该筛板能保证使用重力法时的流速为1-2ml/分钟或1-2滴/秒。同时，该筛板和其它同类产品相比，不会由于亲水性基团的引入而对蛋白质产生吸附。另外，该亲水性筛板在使用过程中不易形成气泡，气泡会使流速降低，液体通过基质不均匀。
二、产品应用 1，抗体纯化 纯化抗体一般用Protein A作为纯化的配体，也可以用Protein G或Protein L或异源性抗体作为配体。 2，小分子物质提取（以提取黄曲霉毒素M1为例） 试样通过免疫亲和柱时,黄曲霉毒素M1被提取。亲和柱内含有的黄曲霉毒素M1特异性单克隆抗体交联在固体支持物上,当样品通过亲和柱时,抗体选择性的与黄曲霉毒素M1(抗原)键合，形成抗体一抗原复合体。用水洗柱除去柱内杂质,然后用洗脱剂洗脱吸附在柱上的黄曲霉毒素M1,收集洗脱液。用带有荧光检测器的高效液相色谱仪测定洗脱液中黄曲霉毒素M1含量。 3，重组蛋白纯化 近年来，随着生物技术，特别是基因工程技术的迅猛发展，重组蛋白表达和纯化越来越容易。常用的重组蛋白表达策略是把蛋白与亲和标签融合表达，利用亲和标签一步纯化出目标蛋白。此方法无需了解蛋白质的生化特性或生理活性，就可通过带标签的重组融合蛋白选择性地与层析基质上的配体结合，从而得以纯化任何蛋白质。此方法与常规的层析方法不同之处在于，无需针对不同的蛋白质开发特定的配体和方法。采用保护蛋白质结构和功能完整性的温和条件，可一步亲和层析从粗提物中纯化出重组蛋白，纯度可达90％以上。 亲和标签已成为后基因组学时代纯化重组蛋白常用手段。亲和标签系统一般具有以下特征：(a)一步的吸附纯化；(b)对三级结构和生物活性影响小；(c)可方便且专一的去除以产生天然蛋白质；(d)在纯化过程中重组蛋白的分析简便准确；(e)适用于大量的不同蛋白质。但是没有哪个标签是完美的，只能根据实际需要去自己筛选，下表是分的标签以及纯化的方案。
反演实验四
《地球物理反演概论》上机实验报告实验四：曲线拟合问题的共轭梯度法 姓名： 学号： 专业：地球物理学 指导教师：邵广周 完成时间：2017.12.26
一、实验内容 利用共轭梯度法实现下图所示的地震层析成像问题。 ???? ??????????????????????= ????????????? ? ??????????????????????????????????????? ?020******* 0000 000200020002100100100010010010001001001111000000000111000000000111987 6543 21m m m m m m m m m 二、实验要求 编制相应的程序，在计算机上实现共轭梯度算法。 三、算法原理 考虑二次最优化问题： 其中，A 为n n ?阶的对称正定矩阵，要求A 正定的目的是保证目标函数()X φ收敛且有唯一极小值。 我们可以通过计算目标函数的导数并令其等于零来求极小值，即 ()b AX X -=?φ 极小点处的X 满足： 0=-b AX 或b AX = 因此，求方程b AX =的解等效于求()X φ的极小值问题。 共轭梯度法解最优化问题是通过构造n 维向量基110,,,-n P P P 来实现的，即 0=j T i AP P j i ≠ 具有上述性质的向量则称它们是关于矩阵 A 相互共轭的向量。 X 可用向量基展开为如下形式： ()X b AX X X T T -= 2 1min φ
∑-==1 n i i i P X α 因此 ()?? ? ??-??? ????? ??=∑∑∑-=-=-=10101021n i i i T n i i i T n i i i P b P A P X αααφ 上式可写为： ()?? ? ??-=∑∑∑-=-=-=1 0101021n i i i T n i n j i T i j i P b AP P X αααφ 由于向量关于A 相互正交，上式可简化为： ()?? ? ??-=∑∑-=-=1 010221n i i i T n i i T i i P b AP P X ααφ 上式表明()X ?由n 项组成，且每一项彼此独立。因此只要保证第i 项的系数 i α使该项最小，从而使各项之和达到最小，第i 项为： i T i i T i i P b AP P αα22- 上式关于i α求导，并令导数等于零，可得使第i 项最小的最优系数i α，即 i T i i T i AP P P b =α 因此，只要我们知道关于A 共轭的一组向量基，则()X φ的最优化问题就非常容易。那么，如何构造一组共轭向量呢？ 共轭梯度算法实际上是通过迭代生成一系列解向量i X ，残差量i i AX b r -=和共轭向量基i P 。算法从00=X ，00=r ，00r P =，0 00 00AP P r r T T =α开始迭代。 假设前k 次迭代已得到解向量k X X X ,,,10 ，残差向量k r r r ,,,10 ，向量基k P P P ,,,10 和最优系数k 1 0ααα，，， 。并假设这1+k 个向量i P 关于A 共轭，向量i r 相互正交，且0=j T i P r j i ≠ 令 k k k k k k k k AP r r P X X αα-=+=++11
质粒dna的提取实验报告思考题doc
质粒dna的提取实验报告思考题 篇一：质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告及思考题 1．实验目的： （1）通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒； （2）通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术； 2．实验材料及用品 （1）实验仪器（apparatus）： 恒温培养箱（Constant temperature incubator）、恒温摇床（Constant temperature shaking table）、高速离心机（High speed centrifuge）、漩涡振荡器（Vortex mixer）、超净工作台（Bechtop）、高压灭菌锅（Autoclave）、微量加样器（Pipettes）、烧杯（ beaker）、量筒（graduated cylinder）、玻璃棒（stir bar）、微波炉（microwave）、天平（Pan balance）、电泳梳子（comb）、电泳槽（electrophoresis tank）、电泳器（Electro-phoresis System）、紫外灯（Ultraviolet transilluminator ）3）、材料与试剂（Reagents）： ①溶液I（Solution Ⅰ）： 50mmol/L 葡萄糖；25mmol/L 三羟基甲基氨基甲烷（Tris）Tris-HCl（pH8.0）；10mmol/
L 乙二胺四乙酸（EDTA） pH8.0 溶液I可成批配制，每瓶约100ml，10磅高压蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。 ②溶液Ⅱ（Solution Ⅱ）：新鲜配制，等体积混合 0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）；1% SDS （可用10％贮存液稀释配制）注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。 ③溶液III （Solution Ⅲ，100mL)：加上后混匀会形成絮状沉淀 60mL5mol/L KAc， 11.5mL 冰醋酸， 28.5mL H2O （该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L） ④TE液缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）；1 mmol/L EDTA（pH8.0） ⑤70% 乙醇； ⑥平衡酚：氯仿 1：1： 将量取25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入24 ml 氯仿和 1 ml 异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。 ⑦LB培养基： 胰化蛋白胨 10g
亲和层析
固相萃取柱空柱 逗点生物提供的固相萃取柱空柱是制作固相萃取柱的基础工具，柱体选用高纯度医疗级的聚丙烯制成，筛板选用纯净的超高分子量聚乙烯加工而成，有广泛的溶剂兼容性。 30ml和50ml空柱管可以制备Flash柱。 我们提供用于制备固相萃取柱的筛板和空萃取柱，为科研研究服务，也为生产厂家提供配套。 点击了解详细规格 固相萃取柱空柱分类 固相萃取柱空柱，包括针筒型小柱、串联柱和离心柱等。 针筒型小柱串联柱离心柱 固相萃取柱空柱构成 装柱套件一般由柱体和筛板两部分构成，特殊应用时还需要盖子和推杆。 固相萃取柱空柱装柱步骤 1、装下筛板 用装柱工具把筛板顶入柱体，再用装柱工具把筛板推到柱体底部。 2、加装填料 柱体垂直，将长颈漏斗置入柱体中，在漏斗中加入所需填料，轻轻提起漏斗，轻敲使填料上表面平齐。 注意：① 长颈漏斗的颈要有足够的长度，最好能基本接近下筛板；② 漏斗提起时应避免填料粘在柱体内壁上。 3、装上筛板 保持柱体垂直，用装柱工具把筛板顶入柱体，再用装柱工具把筛板推到填料上表面。 注意：当填料上表面和上筛板之间还有空隙时，垂直状态轻敲柱体，再次用装柱工具把筛板推到适当位置。 产品选购指南 点击查看大图
亲和层析柱空柱 点击查看原图 产品/服务：其它实验耗材 品牌：biocomma 型号：1ml,3ml,6ml,10ml，30ml,50ml 规格：1ml,3ml,6ml,10ml，30ml,50ml 单价： 最小起订量： 供货总量： 发货期限：自买家付款之日起 3 天内发货
有效期至： 2011-06-28 最后更新： 2010-09-19 浏览次数： 129 产品详细说明 亲和层析柱解决方案 亲和层析柱用筛板 逗点生物提供的亲和层析柱用筛板是选用纯净的超高分子量聚乙烯为原料，经独特的工艺加工而成。 高分子聚乙烯能耐受酸碱和一般的有机溶剂，对大部分的生物分子不会产生吸附，是固相萃取柱、亲和层析柱筛板最常使用的材料。 亲和层析柱空柱 亲和层析柱空柱管由医疗级的聚丙烯制成，这种工程材料通过大量的应用证明具有清洁无毒，不与生物分子结合和低溶解度的优点。 亲和层析柱空柱管容量为3ml 、6ml 、10ml 、30ml 、50ml 。 亲和层析柱空柱 亲和层析是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。 如抗原和抗体，蛋白质A 与-些抗体，重组蛋白质和一些金属离子之间，均具有专一的亲和力，在一定条件下能紧密结合成复合物，而这种结合又是可逆的，改变条件可相互解离。 当把可结合的一对分子的一方(称配体)结合在惰性载体上使其固相化，另一方随流动相流经该载体，双方即结合为一整体。然后设法将它们解离，从而得到与配体有特异结合能力的某一特定的物质。 亲和层析柱空柱概述 逗点生物提供的亲和层析柱空柱是专门为实验室小批量纯化抗体、重组蛋白或其它分子而设计，方便进一步进行科学研究。 亲和层析柱空柱所用的柱子为聚丙烯塑料，这种工程材料通过大量的应用证明具有清洁无毒，不与生物分子结合和低溶解度的优点。 亲和层析柱空柱所用的筛板是选用纯净的UHWMPE 为原料，经独特的工艺加工而成，具有亲水性。筛板在装填时安置在填料基质的上下端，以阻挡昂贵的基质渗出。 亲水性筛板采用了逗点生物领先的亲水性UHWMPE 生产技术，该筛板能保证使用重力法时的流速为1-2ml/分钟或1-2滴/秒。同时，该筛板和其它供应商相比，不会由于亲水性基团的引入而对蛋白质产生吸附。另外，该亲水性筛板在使用过程中不易形成气泡，气泡会使流速降低， 液体通过基质不均匀。 亲和层析柱空柱可配套针筒注射器、装柱推杆和联接管，方便柱子的装填并和蠕动泵等设备配套使用。 亲和层析柱空柱用于抗体纯化 金黄色葡萄球菌蛋白A(Protein A,SPA)能与人及多种哺乳动物血清IgG 分子中的Fc 片段结合，结合的亲和性次序依次是猪、狗、兔、人、猴、鼠、小鼠及牛。 SPA 除与IgG 结合外，还能与血清中少量的IgM 和IgA 结合，SPA 菌对各类免疫球蛋白的吸附率：IgG 为90%～98%，IgM 为2%～30%，IgA 为1.5%～20%。 纯化抗体一般用Protein A 作为纯化的配体，也可以用Protein G,Protein L 或异源性抗体作为配体。 点击查看大图
亲和层析技术
亲和层析技术 （一）原理 亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。 此法具有高效、快速、简便等优点。 （二）载体的基本要求和选择 理想的载体应具有下列基本条件：①不溶于水，但高度亲水；②惰性物质，非特异性吸附少；③具有相当量的化学基团可供活化；④理化性质稳定；⑤机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好，最好为多孔的网状结构，使大分子能自由通过；⑦能抵抗微生物和醇的作用。 可以做为固相载体的有皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素和琼脂糖。在这些载体中，皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特异性吸附。纤维素的非特异性吸附强。聚丙稀酰胺凝胶是目前的首选优良载体。 琼脂糖凝胶的优点是亲水性强，理化性质稳定，不受细菌和酶的作用，具有疏松的网状结构，在缓冲液离子浓度大于0.05Mol/L时，对蛋白质几乎没有非特异性吸附。琼脂糖凝胶极易被溴化氢活化，活化后性质稳定，能经受层析的各种条件，如0.1Mol/L NaOH或1Mol/L HCl处理2h~3h及蛋白质变性剂7Mol/L尿素或6Mol/L盐酸胍处理，不引起性质改变，故易于再生和反复使用。 琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose，含糖浓度为2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。因为Sepharose 4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。 （三）试剂与配制 1．Sepharose 4B 2．CNBr（剧毒）
地球物理反演理论
地球物理反演理论 一、解释下列概念 1.分辨矩阵 数据分辨矩阵描述了使用估计的模型参数得到的数据预测值与数据观测值的拟合程度，可以表示为[][]pre est g obs g obs obs d Gm G G d GG d Nd --====，其中，方阵g N GG -=称为数据分辨矩阵。它不是数据的函数, 而仅仅是数据核G （它体现了模型及实验的几何特征）以及对问题所施加的任何先验信息的函数。 模型分辨矩阵是数据核和对问题所附加的先验信息的函数，与数据的真实值无关，可以表示为()()est g obs g true g ture ture m G d G Gm G G m Rm ---====，其中R 称为模型分辨矩阵。 2.协方差 模型参数的协方差取决于数据的协方差以及由数据误差映射成模型参数误差的方式。其映射只是数据核和其广义逆的函数, 而与数据本身无关。 在地球物理反演问题中,许多问题属于混定形式。在这种情况下,既要保证模型参数的高分辨率, 又要得到很小的模型协方差是不可能的,两者不可兼得,只 有采取折衷的办法。可以通过选择一个使分辨率展布与方差大小加权之和取极小的广义逆来研究这一问题: ()(1)(cov )u aspread R size m α+- 如果令加权参数α接近1,那么广义逆的模型分辨矩阵将具有很小的展布,但是模型参数将具有很大的方差。而如果令α接近0,那么模型参数将具有相对较小的方差, 但是其分辨率将具有很大的展布。 3.适定与不适定问题 适定问题是指满足下列三个要求的问题：①解是存在的；②解是惟一的；③解连续依赖于定解条件。这三个要求中，只要有一个不满足，则称之为不适定问题 4.正则化 用一组与原不适定问题相“邻近”的适定问题的解去逼近原问题的解,这种方法称为正则化方法。对于方程c Gm d =，若其是不稳定的，则可以表述为()T T c G G I m G d α+=，其中α称为正则参数，其正则解为1()T T c m G G I G d α-=+。这种方法叫做正则化方法。 5.多解性 由于观测数据并非无限,以及观测数据具有误差,使解具有多解性。 6.稳定性 反演问题就是从数据空间到模型空间的映射问题，如果数据空间有一个小范围的变化，相应于模型空间存在一个大范围的变化，则成这种映射或反演是不稳定的。实践证明，地球物理学中的反演问题都是不稳定的，只是严重程度不同罢了。
生物制药综合性实验实验报告
广东药学院 基因工程（跨课程）综合性实验论文 姓名 班级 学号 指导教师 广东药学院 生命科学与生物制药学院生物制药研究所
目录 摘要 (2) 前言 (3) 一、材料与方法 (3) 1.1 材料 (3) 1.1.1 重组蛋白质药物单元的实验材料 (3) 1.1.2重组DNA药物单元的实验材料 (3) 1.2 方法 (4) 1.2.1 重组蛋白质药物单元 (4) 1.2.1.1 工程菌构建（已由老师完成） (4) 1.2.1.2 工程菌表达筛选 (6) 1.2.1.3 制备IL-18工程菌甘油种 (8) 1.2.1.4 GST工程菌生长曲线分析 (8) 1.2.1.5 GST工程菌表达影响因素试验 (8) 1.2.1.6 表达进程分析 (9) 1.2.1.7 凝胶扫描分析 (9) 1.2.1.8 发酵工艺（观摩） (9) 1.2.2 重组DNA药物单元 (9) 1.2.2.1 质粒TCRVα12.2-Vβ7.1-EYFP的大规模制备 (9) 1.2.2.2 TCR质粒-脂质体复合物制备与分析 (10) 1.2.2.3 TCR体外转染活性检测 (11) 1.2.2.4 TCR转染体内试验 (12) 二、结果与讨论 (12) 2.1 重组蛋白质单元结果与讨论 (12) 2.1.1 IL-18工程菌表达筛选SDS-PAGE (12) 2.1.2 GST工程菌生长曲线分析 (14) 2.1.3表达影响因素试验 (15) 2.1.4 表达进程试验 (16) 2.2 重组DNA药物单元结果与讨论 (18) 2.2.1质粒阴离子交换层析纯化 (18) 2.2.2 质粒柱层析样品琼脂糖电泳分析 (19) 2.2.3 质粒-脂质体复合物制备 (20) 2.2.4 TCR转染基因表达荧光检测 (20) 2.2.5 TCR体外转染活性检测 (21) 2.2.6 TCR转染体内试验 (23) 三、小结 (25) 致谢 (25)
蛋白纯化-Ni亲和层析柱法
Ni亲和层析柱法纯化带组氨酸标签的重组蛋白 纯化设备： 纯化仪：?KTA purifier(GE Healthcare, Uppsala, Sweden) Ni亲和层析柱：HisTrap TM HP-5 mL (GE Healthcare, , Uppsala, Sweden) 试剂： 所有上柱的试剂均需经μM孔径过滤器过滤并超声波震荡除气处理方可使用。 Binding Buffer：20 mM Na2HPO4-NaH2PO4, pH , 500 mM NaCl, 5 mM 咪唑 Elution Buffer：20 mM Na2HPO4-NaH2PO4, pH , 500 mM NaCl, 500 mM 咪唑 Stripping Buffer: 20 mM Na2HPO4-NaH2PO4, pH , 500 mM NaCl, 50 mM EDTA 20%乙醇：200 mL无水乙醇，加蒸馏水定容至1L NiSO4: 称取 NiSO4·6H2O，加蒸馏水溶解，定容至100 mL 操作步骤： 1 样品前处理 取诱导后菌液50 mL，4℃、5000 rpmin离心10 min收集菌体，以25 mL Binding Buffer 重悬菌体，冰浴下超声波破碎至澄清，4℃、12000 rpmin离心25 min，取上清，经μM孔径过滤器过滤后待用。 2 Ni柱前处理 上样前，使用10倍柱体积的Binding Buffer以5 mL/min的流速平衡镍柱。 3 上样 经离心、过滤处理后的样品以1 mL/min的流速通过衡流泵加载到平衡后的Ni柱上，收集穿透液，可反复上样以提高样品的挂柱效率。 4 平衡上样后的Ni柱 将已结合目的蛋白的Ni柱回接到?KTA purifier上，用10倍柱体积的Binding Buffer 以5 mL/min的流速再次平衡镍柱以去除未结合上的蛋白。 5 梯度洗脱 以梯度的Elution Buffer/Binding Buffer混合液洗脱Ni柱(梯度的界定因蛋白而不同，可经预实验确定)，流速为 5 mL/min，并监测OD280值，收集蛋白吸收峰对应的洗脱液，经
监理工程师公路工程继教考试及答案
1.单选题【本题型共60道题】 1.钢板桩的机械性能和尺寸应符合(D)。 A．实际要求 B．施工要求 C．设计要求 D．规定要求 2.建筑工程恢复施工时，应当向发证机关报告；中止施工满1年的工程恢复施工前，建设单位应当()。 A．重新办理开工报告的批准手续 B．重新申请领取施工许可证 C．报发证机关核验施工许可证 D．向发证机关申请延期施工许可证 3.根据强夯加固土体的触变恢复机理，强夯施工结束后应间隔一定时间方能对地基加固质量进行检验，以免所测结果偏小而影响对强夯加固效果的评估。对碎石土和砂土地基，其间隔时间可取() A．1-2周 B．1.5-2周 C．2-3周 D．2.5-3周 4.对加固后的振冲碎石桩复合地基效果检验的测试可在打完桩()天后进行。 A．10 B．15
C．20 D．30 5.干密度的定义是()。 A．干土重／土总体积 B．干土重／土颗粒体积 C．干土重／土中空隙的体积 D．干土重／原土体总重 6.根据《公路工程施工监理招标投标管理办法》，招标文件中招标人要求投标人提交投标担保的，投标人应当按照要求的金额和形式提交。投标保证金金额一般不得超过()人民币。 A．2万元 B．3万元 C．5万元 D．10万元 7.灌注混凝土拌合物应有良好的和易性，应保持足够的流动性，其坍落度应为()mm。 A．150～180 B．160～200 C．180～220 D．180～200 8.根据《道路交通标志和标线》的规定，交通标志在进行外观鉴定过程中，当标志板在粘贴底膜时，横向不宜有拼接，竖向拼接，上膜应压接下膜，压接宽度不应小于()mm。 A．5
B．10 C．15 D．20 9.监理工程师在实施进度控制过程中，下列工作中不正确的做法是()。 A．检查和记录工程实际进度情况并与进度计划对比； B．绘制有关工程的形象进度图表，建立进度台帐； C．通过下达监理指令、召开工地例会、各种层次的专题协调会议，督促施工单位按期完成进度计划； D．发现实际进度滞后于计划进度时，指挥施工单位采取调整措施。 10.当土的自由膨胀率δef值大于()时，大多数情况下可鉴别为膨胀土。因此，我国《膨胀土地区建筑技术规范》规定，除采用上述特征对膨胀土进行判别以外，认为膨胀土的δef ＞()。但值得注意的是，有许多膨胀土的δef值常小于()。 A．40% B．30% C．45% D．35% 11.深大基坑土方开挖施工开挖形式的确定，应以利于基坑安全稳定为原则，兼顾其他因素，基坑开挖过程中应注意减少()对基坑支护结构的不利影响 A．支撑变换 B．挖撑銜接 C．工序銜接 D．时空效应 12.高桥墩施工滑模宜灌筑注低流动度或半干硬性混凝土，灌筑注时应分层、分段对称地进