AFLP实验流程protocol(精)

AFLP实验流程protocol

Step1 DNA提取（DNA extraction）

Using CTAB method （这个我们现在都是用试剂盒提取了，不知道你们用什么提取，还是发给你，AFLP对DNA纯度和浓度的要求很高，CTAB很难满足这个要求，尤其是纯度要

求）

1.裂解液的制备：检查水浴锅是否有水，打开设温65℃，将CTAB母液预热溶解，按照每

管1ml的体积取CTAB母液，加入3％PVP（即0.03g/管），加热溶解，使用前

．．．加入1～2％β-巯基乙醇（即10～20μl/管）

2.取样：称取0.02~0.025g（即20~30mg）硅胶干燥的样品，放入fastprep管中，做好标

记。※NOTE：样品在放入管中时，挑取幼嫩的叶片，尽量不要将叶脉等维管组织放入，切误将一个管中的样品溅入另一个管中。

3.打碎：将称好的样品放入fastprep打碎机中打碎，speed 5.0 time 30s, 取出加入制备好的

CTAB裂解缓冲液800μl/管，（※NOTE：裂解液的体积应该在fastprep管的一半以上，注意盖好管冒，防止裂解液在打碎和裂解的时候溢出。），混匀，使裂解液和样品充分接触，再打一次speed 5.0 time 30s。

4.裂解：水浴65℃，1h，注意在裂解的过程中每隔10min要混匀一次，（※NOTE：越到

裂解的后期动作越要温和，防止DNA剪切破碎。）

5.抽提：取出水浴样品，冷却至室温

．．．．．，加入-20℃等体积（800μl/管）氯仿：异戊醇（24：

1），手摇晃混合均匀

．．．．．．．，离心：室温，12000r/min，10min。

6.再次抽提：取上层液体约550μl，（※NOTE：尽量少取，不要将杂质一并取出）转入

一个灭菌1.5ml离心管中，做好标记，加入等体积加入－20℃等体积（800μl/管）氯

仿：异戊醇（24：1），手摇晃混合均

．．．．．．匀．，离心：4℃，14000r/min，10min。

7.初沉：取上清约。。。μl，转入一个灭菌1.5ml离心管中，做好标记，加入4℃ 0.1倍

体积NaAc （3mol/L pH 5.2）,-20℃ 0.6倍体积异丙醇，-20℃沉淀40min，离心：4℃，12000r/min，10min。

8.干燥：弃上清，用小枪头吸干，在超经工作台中倒置干燥40min。打开水浴锅37℃水

浴锅，预热TE。

9.除RNA：

10.抽提RNAse

11.再沉

12.洗涤

13.干燥

14.溶解

15.检测

Using 试剂盒

Step2 接头的制备 (Adapter preparation)

1. 溶解AdapterE1、E2至终浓度50μM （=50pmol/μl ）制成母液 AdaperM1、M2至终浓度40μM （=40pmol/μl ）制成母液

2. 制备——反应体系50μL

Incubate @95℃ 2min → @65℃ 5min → @37℃ 5min →@25℃ 5min →@4℃ ∞ @-20 ℃ 长期贮存

With lid temperature @103℃

Step3 酶切连接 (Digestion and Ligation)——反应体系（16＋4μl ）

Incubate @37℃ 3hs → @70℃ 10min → @4℃ ∞ → @-20 ℃ store With lid temperature @103℃

Step4 预扩增 (Preselective PCR amplification)

——反应体系（18＋2μl ）

Run the following cycling program:

@94℃2min →(28 cycles of @94℃45sec →@56℃45sec →@72℃1min) →@72℃10min →@4℃∞ →@-20 ℃store

With lid temperature @103℃

Step5 选择性扩增(Selective PCR amplification)

@94℃2min →(13 cycles of @94℃30sec →@65℃30sec with-0.7℃per cycle→@72℃1min) →(23 cycles of @94℃30sec →@56℃30sec →@72℃1min) @72℃5min →@4℃∞ →@4℃store

Step 6 测序检测（load onto ABI 3100）

甲酰胺9.2μl

ROX 0.3μl

选扩产物0.5μl

变性反应@94℃4min 然后放入-20℃冰箱骤冷