最新高效液相色谱法测定维生素C

高效液相色谱法测定维生素C的含量

【摘要】高效液相色谱法已经成为解决生命科学、医药学发展中各种难题的重要手段，在实验室中也广泛应用于物质的定性定量分析。本实验中利用高效液相色谱法对维生素C进行定量分析，所采用的定量分析方法为外标法，通过做出标准溶液浓度与峰面积的标准曲线进而对样品中的维生素C进行定量检测。

【关键词】高效液相色谱法、维生素C、含量

1、引言

维生素 C（Vitamin C, Vc）又叫抗坏血酸，是一种水溶性维生素。Vc 在体内参与多种反应，如氧化还原过程，在生物氧化和还原作用以及细胞呼吸中起重要作用。人体内缺乏 Vc 时容易导致坏血病。同时，由于 Vc 是一种水溶性的强有力抗氧化剂并参与胶原蛋白的合成，它同时还具有防癌、预防动脉硬化、治疗贫血、抗氧化和提高人体免疫力等功效。Vc 在蔬果中普遍存在，尤其是柑桔类水果中含量较高。樱桃、番石榴、辣椒、猕猴桃等水果中 Vc 含量在 50-300 mg/100 g。

溶于流动相（mobile phase）中的各组分经过固定相时，由于与固定相（stationary phase）发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。高效液相色谱法（High performance Liquid Chromatography，HPLC）是在经典液相色谱法的基础上，于 60 年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法（High Pressure Liquid Chromatography，HPLC）。HPLC 系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部件。有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、预柱或保护柱、柱温控制器等，现代 HPLC 仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。制备型 HPLC 仪还备有自动馏分收集装置。

2、HPLC测定维生素C的含量

2.1、仪器试剂

2.1.1、仪器

高效液相色谱仪（Agilent1260），色谱柱：C18 柱 (250 mm×4.6 mm, I.D.5 μm)；平头进样器。

2.1.2、试剂

乙腈（色谱纯），冰乙酸，维生素 C，磷酸二氢钾等均为分析纯，实验用水为超纯水。

Vc 标准溶液：快速准确称取 0.025 g Vc，用 1 mol/L 乙酸溶液溶解，定量转移至250 mL 容量瓶中，用 1 mol/L 乙酸溶液定容，得到 100 mg/L 标准溶液备用，现用现配。

2.1.3、色谱条件

流动相： 3%的乙腈-0.05 mol/L水溶液（v/v）；流速 1 mL/min；柱温 30℃，紫外检测波长 265 nm；进样量10 μL。

2.2、实验步骤

2.2.1、样品处理

1、按操作说明开启液相色谱仪，设定方法参数。

2、样品准备：取 10 片维生素 C 片，研匀。准确称取 0.02g，用 1 mol/L 乙酸溶液溶解，定量转移至 50 mL 容量瓶中，用 1 mol/L 乙酸溶液定容，用0.45μm滤膜过滤。

3、标准曲线绘制：分别配制 5，20，50，80，100 mg/L 的 Vc 样品溶液，待液相色谱稳定后进样分析，平行测定 3 次。以 Vc 色谱峰面积对浓度作图，绘制标准曲线。

4、定量分析：供试品溶液经0.45 μm 微孔滤膜过滤后进行 HPLC 分析。平行测定 2

次，记录其 Vc 的色谱峰面积，根据校准曲线计算维生素片中 Vc 的含量。

5、实验结束后，按要求清理好仪器。

3、数据处理

不同Vc 浓度对应色谱峰面积图表

浓度mg/L 5 20 50 80 100

峰面积mAU*S 146.73135 592.21143 1509.60181 2428.49390 3050.15918

y=30.58x-14.146

y(sample)=1892.33813

代入上式有x=62.34mg/L

4、实验结果讨论

本实验中所采用的定量分析方法为外标法，即标准校正法。该法直接，易于操作，计算简单。但是标样与测定组分为统一化合物，分离、检测条件的稳定性对定量结果影响较大。除此方法外，常用的定量分析方法还有内标法、峰面积归一化法。至于定性分析，常用的方法为保留值定性，与已知物对照定性，还有安保柳枝经验规律定性。此外还有选择性检测响应定性，色谱-结构分析仪器联用等方法。

在分析未知物时，首先要知道这个化合物化学物理常数，然后选择合适的样品处理方法，使样品有较好的萃提回收率和较少的干扰成分存在；而对于分离分析，如果使用紫外检测器，在这之前应先做个化合物的吸收波长扫描，以找出其最大吸收波长，流动相先用纯水和乙腈或甲醇在不同比例时进行调节，保证出峰时无干扰和一定的分离度，然后依据峰形和化合物的pKa值进行水相的pH值调节，以找到最佳的流动相体系。

气相色谱仪具有分离选择性好、柱效高、速度快、检测灵敏度高、试样用量少、应用广泛等特点。但气相色谱仪也具有一点局限性，在没有纯标样的条件下，对试样中未知物的定性定量较为困难，往往需要与红外光谱、质谱等结构分析仪器联用，对于飞沸点高、热稳定性差、腐蚀性和反应活性强的物质，气相色谱仪分析比较困难。

高效液相色谱法与气象色谱法相似，具有高速、高效、高选择性、高灵敏度的特点，但仪器设备相对复杂，成本较高。高效液相色谱法尚缺少灵敏度高的通用型检测器，而且使用有机溶剂作为流动相容易污染环境，梯度洗脱操作复杂。