《基因工程》课程综合实验转基因斑马鱼的构建
《基因工程》课程综合实验转基因斑马鱼的构建
实施方案
《基因工程》课程综合实验教学在专业培养目标中的定位与目标
《基因工程》是生命科学学院等各专业的专业主干课，在这些专业的本科生教学打算中占有极为重要的地位。《基因工程》也是我们学校基地班和生技专业的专业必修课，差不多有10余年的开课历史。全国其他高等综合院校都十分重视《基因工程》课程建设，绝大多数院校都将《基因工程》作为学校精品课程进行建设。湖南师范大学大学在《基因工程》教学和研究方面具有坚实的基础，2008年《基因工程》建设成为了湖南省精品课程，从而为我校《基因工程》的教学改革提供了契机。
基因工程是以遗传学为理论基础的一门实践性专门强的学科，是生物学科中一门体系还欠完整却进展十分迅速的学科，对探究生命的本质、推动整个生物学科的进展起着庞大的作用；同时又是一门紧密联系生产实际的实验科学，对新品种选育和良种繁育、遗传疾病防治等都具有重要的应用价值。通过《基因工程》的学习，使学生把握基因工程的差不多原理、差不多方法和最新进展动态；通过《基因工程》课程综合实验教学，使学生熟悉基因工程的差不多操作方法，注重对学生的实验操作技能的培养。
基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建教学大纲
课程名称：基因工程（实践课程部分）
课程编号：
面向专业：生物技术、生物科学、基地班
课程总学时：理论51学时，实验34学时_
实验学时：34_
课程学分：理论3学分，实践2学分
一、实验目的
本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的要紧环节的差不多原理和差不多技术进行系统地学习和把握，培养学生基因工程差不多实验操作、实验设计、实验结果分析和创新实验能力，通过基因工程综合实验的开设，注重学生综合素养和实践能力的培养。
二、实验内容、学时分配与组织
三、教学治理模式与注意事项
1．学生在实验前必须认真复习课程有关内容，预习实验指导书。
2．指导教师适当讲解相关理论及注意事项，提示具体的实验方法和操作，演示重要仪器的使用。
3．实验小组人数为4人，由学生独立操作。每个实验的时刻依照实验流程本身决定，长短不一，但需要集中的时刻。
4．要求学生把握差不多的操作方法，如实逐项记录数据，独立完成实验报告，并当天上交。
四、成绩评定与占课程总成绩的比例
1．指导教师对实验报告应认真批改，记录每一次的实验成绩。
2．依照平常实验操作成绩，给出实验操作考试成绩，以占课程总成绩30%的比例纳入课程的总成绩。
五、设备与器材配置（每组）
1．试管、试管架、可调式微量加样器等；
2．电泳仪、电泳槽、染色缸；42℃恒温水浴箱、冰浴；
3．恒温振荡箱，超静工作台。
4．手动显微注射器、体式显微镜，硼硅酸玻璃毛细管。
5．倒置显微镜、摄像系统（CCD），发圈。
6．自动水循环系统一套，孵化水槽。
六、实验指导与参考资料
1．基因工程实验指导，转基因斑马鱼的构建，湖南师范大学生命科学院遗传与发育生物学系自编，，2009年
2. 盛小禹. 基因工程实验技术教程复旦大学出版社。
3．彭秀玲.袁汉英.谢毅.王洪海. 基因工程实验技术湖南科学技术出版社。
《基因工程》课程综合实验教学可行性分析
一、转基因动物简介
转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。转基因技术涉及外源基因的组建、载体、受体、基因导入技术、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物等方面的内容。
二、斑马鱼具有实验动物诸多优点
斑马鱼实验室繁育与操控技术斑马鱼原产于印度、孟加拉等国,属鲤科。是
一种亚热带淡水观赏经济鱼类,成鱼体长大约5cm，呈黄褐色,体表从头到尾覆盖着水平方向的蓝紫色条纹,故又称蓝条鱼。雄性皮肤偏柠檬色,雌性皮肤偏银灰色,鳍条宽大,发达。
斑马鱼具有繁育能力强，一年四季都可产卵，产卵可达300～1000 粒，成活率高；卵大、卵径1～1.5mm，体外受精和发育，胚胎透亮；性成熟周期短，繁育周期短，一样7 天左右；个体小易养殖，饲养成本低等诸多优点。
1.斑马鱼受精卵可在实验室猎取。
受精前将亲鱼公、母分开饲喂2～3 天(相互之间能够看到,可在饲养箱中加一玻璃隔板,将公、母分开)，繁育时将公、母按1～2∶1比例放入产卵池中进行产卵受精。
2. 斑马鱼的卵的孵育快而方便
人工孵化受精终止后获得的受精卵要及时捞出，剔除异物。然后将受精卵移入培养箱中进行孵化，温度为25～28℃，温差不能够超过0.5℃。这期间可在解剖镜下观看胚胎的发育状况。大约通过2 天孵化，小鱼就可出膜。
3. 斑马鱼孵化后的喂养容易操纵
孵化时应注意：①虹吸出产卵池底的受精卵时要用直径1cm左右的皮软管,假如用硬质的吸管, 有可对受精卵造成损害。②孵化用水、清洗用水，水质要好，水温相差不宜过大，要保持相对恒定，对受精卵来说，剧烈的温度变化会引起胚胎死亡。③孵化期间每天要及时清除败育卵，勤换水。
刚孵出的仔鱼呈淡黄色，在解剖镜下可见到跳动的心脏，流淌的血液，腹部有一专门大的、未吸取的卵黄囊。头2～3 天仔鱼静卧于水底,，现在不需要饲喂。注意及时将卵膜和白色的死卵捞出，每天更换新水，将鱼苗置于温室内，温
度为25℃(可放在空调房间内)。3～4日龄时仔鱼可自由游泳(平游)并开始觅食，现在可用绢网取少许蛋黄在水中轻轻地搅动，至水微呈淡黄色。适当加喂钙素母片、复方ＶＢ液、土霉素等，以提高鱼苗的成活率。喂要少量多餐，日喂3～4 次。7～10 日龄时加喂草履虫，啤酒酵母等，3 周龄投喂卤虫的无节幼体,并逐步添喂配合饲料。在饲喂过程中要注意水质的变化，勤换水，少喂勤添，以确保鱼苗健康生长。
三、斑马鱼基因移植的方法可靠
基因移植的方法包括细胞质的显微注射，发生泡的显微注射，胚胎或精子的电转移，逆转录病毒感染及颗粒枪攻击等。其中显微注射法：在显微镜下，可借助显微操作仪，将毛细玻璃管直截了当插入受精卵的雄原核中(较大的原核)，注入特定的外源基因，即为基因显微注射法。此法的优点是，在一定设备和体会条件下，实验过程大为简化；任何DNA 顺序都可直截了当导入原核内，导入的外源DNA在卵裂前与受体基因组整合，其缺点在于导入的外源DNA通常以多拷贝串联的形式随机地整合于受体基因组中，阻碍其表达的正常调剂。用拉制的毛细血管针往刚受精的乱的细胞质注射DNA是制作转基因鱼的最可靠方法，其生殖系遗传和转基因表达的效率皆令人中意。因此，显微注射法仍旧是将DNA导入与基因组的最常用方法。往细胞质进行DNA显微注射产生转基因鱼的一样的步骤是：①预备育种种群；②收集受精卵；③向1-细胞胚胎细胞质注射DNA；
④鉴定携带转基因的鱼；⑤将首代动物与野生型鱼交配确证通过生殖系遗传。
为提高胚胎的存活率和获得转基因首代动物的总效率，需要用保证DNA 最佳纯度的标准方法制备DNA 构件。转基因整合的效率取决于注射的DNA 浓度，而卵的存活能力与DNA 浓度则呈相反的关系。操纵注射到细胞的DNA量
是通过DNA 浓度而不是注射DNA 溶液的体积来调剂。为代偿注射到大体积的细胞质导致DNA 的稀释，为使注射的DNA 进入细胞核达到适当的概率，而同时也使注射后的胚胎坚持令人中意存活率（50％），注射时所用DNA的浓度应配成50～200ng/ml（约大于104～106转基因靠拷贝）。
四、转基因鱼实验方法可行
1．转基因鱼制备
（1）材料
斑马鱼1细胞期受精卵
（2）仪器、用具手动显微注射器、体式显微镜、倒置显微镜、眼科镊、摄像系统（CCD）、注射针、发圈、小酒精灯、数码相机、硼硅酸玻璃毛细管（3）试剂
预备好的重组目的片段的质粒。（表达载体构建是本综合实验的重要组成部分，由于实验中心分子生物学实验室已具备表达载体构建条件及相应的技术平台，在本讨论稿中不再提出有关分子操作的实验细则）
（4）方法
①注射外源DNA的处理，注射时所用的DNA浓度应配成0.15μg/μl。
②DNA(5μl)填装入注射针，不要引入气泡，以免干扰注射。
③将成批分选和洗净的卵移到有琼脂糖的表面皿中。
④一边轻轻地用眼科镊将卵固定，将卵定位在视野中心，使动物极方向向
上。
⑤注射前小心将显微注射针定位，将针垂直定位到卵表面是穿透坚硬的卵
壳注射成功的关键。
⑥然后推动注射针，使其刺入受精卵的动物极一细胞中，将DNA注入(约
2nl) 。
⑦注射完毕，慢慢抽出注射针,将受精卵放入装有水的培养皿中，使其复原。
一样50～80％的受精卵在显微注射后仍保持健康。
2．转基因鱼的孵化。
斑马鱼在洁净的水中孵化注射后的卵，及时清除死去的卵，并记录正常发育和死亡的卵数。
斑马鱼动物模型的应用介绍
斑马鱼动物模型的应用 斑马鱼（Danio rerio）属于辐鳍亚纲（Actinopterygii）鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Danio）的一种硬骨鱼，原产于南亚，是一种常见的热带观赏鱼，因其体侧具有斑马一样暗蓝与银色相间的纹条而得名。 斑马鱼个体小，易于饲养，成体长4-5cm，雄鱼体修长，雌鱼体肥大。可在有限空间里养殖相当大的群体，可满足样本需求量大的研究。斑马鱼发育迅速，在28.5℃培养条件下受精后约40min完成第一次有丝分裂，之后大约每隔15min分裂一次，24h后主要器官原基形成，相当于28d的人类胚胎，幼鱼孵出后约3个月达到性成熟。雌雄鱼通过调控光周期控制14:10（光照:黑暗）产卵时间，成熟鱼每周可产卵一次，一尾雌鱼每次可产卵100-300枚。胚胎体外受精，体外发育，胚体透明，易于观察。受精卵直径约1mm，易于进行显微注射和细胞移植等操作。 一、斑马鱼的品系 经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库-ZFIN （http://zfin/org）里有相关的资料可供查询和下载。目前研究中常用的斑马鱼野生型品系主要为AB 品系、Tuebingen（Tu）品系、WIK 品系，斑马鱼基因组计划所用品系是Tu。AB 品系是实验室常用的斑马鱼品系，由单倍体细胞经早期加压法获得。Tu品系斑马鱼具有胚胎致死突变基因，用于基因组测序前敲除该致死突变基因。WIK品系较Tu品系具有更多的形态多样性。此外，还保存有3000多个突变品系和100多个转基因品系。这些品系资源对于利用斑马鱼开展各种科学研究起着很大的推动作用。 二、斑马鱼突变品系的筛选 斑马鱼突变的方法主要有三种：已基亚硝脲（ENU）化学诱导、γ或χ射线照射和插入诱变。ENU是一种DNA烃基化试剂，在生殖细胞减数分裂前诱导碱基对的替换，诱导产生的突变率为0.1%-0.2%，涉及单个基因的突变。射线照射导致染色体大片段的缺失或染色体重排，产生突变率达1%。插入诱变是以逆转录病毒为载体，用显微注射法将目的基因片段导入斑马鱼受精卵，整合到基因组中，干扰正常基因表达。射线照射产生的突变率是ENU 化学诱导的10倍，但由于突变涉及多个基因，突变的表型是受若干基因调控的结果，不利于基因功能的分析，因此，ENU化学诱导法是斑马鱼突变的主要方法。研究含有纯合致死
《基因工程》课程综合实验转基因斑马鱼的构建
《基因工程》课程综合实验转基因斑马鱼的构建 实施方案 《基因工程》课程综合实验教学在专业培养目标中的定位与目标 《基因工程》是生命科学学院等各专业的专业主干课，在这些专业的本科生教学打算中占有极为重要的地位。《基因工程》也是我们学校基地班和生技专业的专业必修课，差不多有10余年的开课历史。全国其他高等综合院校都十分重视《基因工程》课程建设，绝大多数院校都将《基因工程》作为学校精品课程进行建设。湖南师范大学大学在《基因工程》教学和研究方面具有坚实的基础，2008年《基因工程》建设成为了湖南省精品课程，从而为我校《基因工程》的教学改革提供了契机。 基因工程是以遗传学为理论基础的一门实践性专门强的学科，是生物学科中一门体系还欠完整却进展十分迅速的学科，对探究生命的本质、推动整个生物学科的进展起着庞大的作用；同时又是一门紧密联系生产实际的实验科学，对新品种选育和良种繁育、遗传疾病防治等都具有重要的应用价值。通过《基因工程》的学习，使学生把握基因工程的差不多原理、差不多方法和最新进展动态；通过《基因工程》课程综合实验教学，使学生熟悉基因工程的差不多操作方法，注重对学生的实验操作技能的培养。 基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建教学大纲 课程名称：基因工程（实践课程部分） 课程编号： 面向专业：生物技术、生物科学、基地班
课程总学时：理论51学时，实验34学时_ 实验学时：34_ 课程学分：理论3学分，实践2学分 一、实验目的 本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的要紧环节的差不多原理和差不多技术进行系统地学习和把握，培养学生基因工程差不多实验操作、实验设计、实验结果分析和创新实验能力，通过基因工程综合实验的开设，注重学生综合素养和实践能力的培养。 二、实验内容、学时分配与组织
物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法
《水质物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法》 编制说明 （征求意见稿） 国家环境保护总局南京环境科学研究所 2008年03月
目次 1．任务来源及工作过程 (1) 1.1任务来源 (1) 1.2工作过程 (1) 2．修订本标准的必要性及法律依据 (2) 2.1 必要性及目的意义 (2) 2.2 修订本标准的法律依据 (3) 3．标准修订的原则与技术路线 (3) 3.1 标准修订的原则 (3) 3.2技术路线 (5) 4．标准适用范围 (5) 4.1 试验方法选择 (5) 4.2 试验用鱼选择 (6) 5. 标准的主要内容说明 (6) 5.1 方法原理 (6) 5.2 试剂和材料 (6) 5.3 仪器设备 (7) 5.4 干扰及消除 (8) 5.5 样品 (8) 5.6 试验步骤 (9) 5.7 结果计算 (10) 6. 参考文献 (10)
1．任务来源及工作过程 1.1任务来源 本标准由2006年国家质检总局（国质检财函[2007]971号）和2007年国家质检总局（国质检财函[2007]9909号）和国家环保总局2006 年（环办函（2006）371 号）下达编制任务，由国家环境保护总局南京环境科学研究所负责起草，项目编号为992号。本标准是在已颁布的GB/T 13267-91《水质物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法》文本基础上修订的。 1.2工作过程 国家环境保护总局南京环境科学研究所为本标准的修订单位，根据标准修订要求成立了标准编制组，主要成员如下： 表1 编制组主要成员名单 姓名职称专业备注 周军英研究员环境生物项目负责人，制定方案 韩志华助研环境毒理主要人员，组织实施、执笔人 单正军研究员环境毒理主要人员，审定 石利利研究员环境化学主要人员，审定 卜元卿助研环境毒理主要人员，具体实施 其他略参加人 1.2.1 标准开题论证 标准修订任务下达后，国家环境保护总局南京环境科学研究所即投入了前期的调研工作，并于2007年2月12~13日在南京召开了《水质物质对淡水鱼（斑马鱼）急性毒性测定方法》标准修订开题论证会。会议邀请了浙江大学、南京大学、沈阳化工研究院等与标准制订有关的各方面专家5人，专家组认真听取了承担单位的汇报，详细审阅了承担单位提交的开题报告材料，经过充分讨论，提出了专家组意见。专家组肯定了标准编制原则、技术路线并提出了专家组修改意见，标准修订组根据专家意见对方案进行了修改和补充。
《生物实验“奇兵”---斑马鱼》说课稿(全国实验说课大赛获奖案例)
《生物实验“奇兵”---斑马鱼》说课稿 一、实验教学目标 （一）教材分析： 苏教版七年级下册 第十章第二节《人体血液循环》 第十三章第一节《保护生物圈---环境在恶化》 八年级上册 第十四章第二节《千姿百态的动物世界》 八年级下册 第二十六章第一节《远离烟酒》 培养学生实事求是的科学态度，体验科学探究的过程，增强关爱生命、保护环境的社会责任。 （二）课标分析：概述血液循环；发展科学探究能力；建立保护生物圈的意识；说明酗酒对人体健康的危害。 （三）学情分析：我校为每位生物老师配备生物学科生物实验教室，日常的生物课堂教学在生物实验教室进行，学生接触实验机会多，参与实验的积极性高，乐于探究和钻研，小组实验协作和操作能力强，不拘泥于课本实验，课后主动探索。 （四）制定目标： （一）学生发现现实中的生物学问题，针对特定的生物学现象，提出问题，做出假设，实验设计并实施方案，增强科学探究能力。 （二）《观察斑马鱼尾鳍血液流动》实验后，学生能够基于生物学事实和证据，阐述毛细血管、动脉、静脉及血管内血液流动情况，并作图，树立生命观念。 （三）学生利用结构与功能观，完成《探究鱼鳍与运动的关系》实验。了解鱼鳍在运动中的作用，提升了科学探究的能力。 （四）《探究模拟酸雨对斑马鱼生命活动的影响》，通过实验，学生学会定性定量分析实验数据，提升科学思维的能力，增强关爱生命，保护环境的社会责任。 （五）《探究酒精对斑马鱼幼鱼心率的影响》实验，培养实事求是的科学态度，树立健康的生活观、珍爱生命的意识。
（一）实验设计创新 图1一种实验材料完成课本中不同章节的多个实验 原实验中使用金鱼、植物种子、鲫鱼及水蚤，实验改进后使用斑马鱼这一种实验材料，就可以完成课本中不同章节的多个实验，做到了实验材料的循环利用，节约成本。 （二） 实验设计思路 图2 实验设计思路-思维导图
生理学实验--斑马鱼视动反应讲义
斑马鱼视动眼动反应 实验目的： 观察视觉行为学的表现 掌握评判视觉功能的行为学手段 实验原理： 行为学虽是一门古老的学科，但至今仍是神经生理研究中不可或缺(indispensable)的一个活跃领域。经典行为学实验一般不依赖或很少需要精密的测量仪器，而是靠我们去观察和思考。眼动(optokinetic response, OKR)和视动(optomotor response, OMR)反应均是视觉刺激诱发的运动行为。脊椎动物从低等的鱼、蛙到高等的灵长类和人都有此行为反应。此现象无需学习训练就易诱导、较稳定、易观察，所以作为一种客观指标广泛运用于视觉功能的检测和评价。 脊椎动物为了获得对运动图像刺激在视网膜上稳定清晰的成像，通过视觉通路和相应的运动神经参与做出生理性行为的适应调整从而能够对视觉刺激做出良好反应，这些表现涉及视动、眼动或视动性头震颤(Optokinetic head nystagmus, OKHN)。如果行为学的表现不正常，可以推测它们的固有神经连接出现异常。斑马鱼具有脊椎动物类似的视觉通路，经典的视觉行为学有眼动反应和视动反应。 眼动(光动)反应：斑马鱼在光适应一段时间后会对移动的光栅进行注视，试图确保移动视觉图像能稳定地高分辨地呈现在视网膜上。如果光栅是在一个围绕幼鱼的圆筒上移动时(图1)，斑马鱼的眼睛就会一直追随光栅直到其眼睛不能再转动，然后有一个急速的眼颤动(ocular nystagmus)以回复到最初水平。之后又进行下一个追随反应，如此循环。周围视觉环境周期性运动时引起的有规律的眼或头追踪运动(慢相运动)即为眼动反应或视动性头震颤。五天龄(5dpf) 的幼鱼视觉系统就已非常成熟(viewed in Bilotta, 2001)，适合行为学检测。该行为学指标常用于筛选与视功能相关的不同遗传背景或操作的幼鱼。 视动反应：视动反应是指斑马鱼对移动的目标有一种追逐的行为。当将成年斑马鱼放在一个圆形光栅的内部时，斑马鱼对光栅的追随行为会表现为一种圆周性运动(图2)。 图1 眼动反应装置图2 成鱼视动反应装置
斑马鱼的培养及TALENs技术的应用
“斑马鱼的培养及TALENs技术的应用”预习报告 一、实验原理 1、TALENs实验技术原理 类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)是最近发展起来的一类新型的人工核酸内切酶, 它由特异性的 TALE DNA 结合结构域和非特异性的 FokⅠ核酸内切酶切割结构域组成。TALEN 能够根据用户需要切割特定的核苷酸靶序列, 造成 DNA 双链断裂, 从而诱导该靶序列产生 indel突变。 2、斑马鱼的生活习性以及作为模式生物的优势 斑马鱼是生长在印度、巴基斯坦淡水河流中的一种硬骨鱼（鲤鱼），成年鱼全身仅长4－5厘米，因全身横向分布着一道一道褐色的斑马线而得名。斑马鱼很容易在实验室饲养，一般3个月就可以达到生殖成熟期，雌鱼每次产卵200枚左右，一生可产卵数千枚，斑马鱼所产之卵经24小时即可胚胎发育成熟，仔鱼期只有1个月。更独特的是，斑马鱼的卵是透明的，整个胚胎发育在体外完成，也是透明的。 优势：显著优势在于体积小( 3cm～4 cm)，可在较小的空间大量繁殖；产卵量高(每周200多个)；发育快，许多组织在受精后24 h开始形成；成熟周期短；体外受精且胚胎透明，可在体视解剖镜下观察；单倍体、雌核发育二倍体的制作和突变体的获得均较容易；精子可以冷冻保存。所有这些特点都使斑马鱼非常适合于遗传学的研究。斑马鱼的基因组中大约含有30000个基因，这个数目与人类差不多，而且它的许多基因与人类存在一一对应的关系。它的神经中枢系统、内脏器官、血液以及视觉系统，在分子水平上85%与人相同。 二、实验目的 通过本实验可以了解TALENs实验技术的基本原理，熟悉其几个关键实验步骤的操作，学习显微注射技术，从而能够独立应用这些技术进行相关学术研究。 三、实验器材 1、实验仪器 超净工作台(细菌操作用)、细菌培养摇床、台式离心机、凝胶电泳仪、凝胶电泳槽、凝胶成像仪、水浴锅、恒温培养箱、漩涡振荡器(Vortex) 、 NanoDrop(ND-1000 Spectro pho tometer)、PCR 仪，体视显微镜、恒温培养箱、配鱼缸、台式冷冻离心机 1.3.2 耗材细菌培养皿、移液枪、移液枪枪头、Eppendorf 离心管、PCR 管、显微操作仪，倒置显微镜，拉针仪，胶头滴管，胶固定板。 2、实验试剂 NEB 限制性内切酶：BstNI-HF、KpnⅠ、NheⅠ-HF、NotⅠ-HF 或 SacⅡ、SpeⅠ-HF。试剂盒：DNA 连接试剂盒(TaKaRa, D6020)、微量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂
CRISPR(Cas9) System斑马鱼基因敲除-实验流程3
1、gRNA模板扩增：（以gRNA质粒为模板，扩增片段大小为100bp多） 40ul体系，利用保真性>= Extaq的酶扩增4管； 可以通过胶回收纯化扩增模板（四管过同一个回收柱子），或通过沉淀纯化（附件1）; 沉淀回收模板前，要进行利用5ul电泳检测是否扩增出目的条带； 以上模板皆用20ul DEPC水回溶(,反复洗柱子两次)。 2、gRNA合成： 10ul 反应温度37 3、gRNA纯化 a.加入1ul DNase I，37℃处理15min； b.加入1ul 0.5 M EDTA 8.0，65℃处理10min； c.加入57.5ul DEPC water 和 7.5ul 3M sodium Acetate solution(pH 5.2); d.加入等体积（即77ul）酚氯仿（1:1 mix）；12000rpm，15min； e.吸取上部水相到新的PCR-tube，加入等体积氯仿，12000rpm，15min； f.重复操作e； g.收集水相到new-PCR-tube，加入2倍体积无水乙醇；-20℃沉淀至少30min； h.12000rpm，15min，去除液体，留下白色gRNA沉淀； i.70%乙醇洗3次（每次12000rpm，6min）； j.去除70%，自然干燥，10-20ul DEPC water溶解；-80℃保存。 注意：以上为RNA操作，请使用灭菌未开封的tips and tubes，尽量不说话，避免RNA酶污染。以上合成与纯化过程为KIT说明书翻译得到，如使用与本实验室不同KIT，请阅读相关说明书。 4、Cas9 template 准备（酶切4h，40ul体系） 将zf-cas9-vector 线性化，即XbaI 单酶切；酶切2 tube，2.3或2.5ug/tube；过同一个胶回收柱子；20ul DEPC water 回溶，洗涤柱子两边，-20℃保存。 5、cas9-mRNA 合成 20ul 反应温度37℃，时间4.5h。 纯化： A．加入1ul DNase I，37℃处理15min； B．20ul反应体系，加入30ul LiCl； C．冰浴或-20℃沉淀至少30min； D．4℃,12000rpm,15min; E．100ul 70%乙醇洗2次（每次12000rpm，6min）； F．10ul DEPC water溶解；-80℃保存。 注意：RNA样品根据每次用量的多少分装保存，避免反复冻融，降解。一般1ul/tube保存。
斑马鱼原位杂交实验方案
斑马鱼全胚胎原位杂交技术 Form Dr. Kevin 第一节原位杂交技术的历史 Joseph G. Gall被誉为现代细胞生物学的一位奠基人，他在染色体结构和功能领域作出了杰出贡献，并发明了原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）。自Gall同他的研究生Mary Lou Paudue和Susan Gerbi 在1969年利用放射性标记DNA在爪蟾组织切片中检测基因表达后，原位杂交技术逐渐发展为一种能使研究人员在一个染色体上定位并确定出基因和特殊的DNA序列的强大方法，推动了分子生物学的巨大进步。 Kathleen H. Cox于1984年发明了用单链RNA探针进行原位杂交的技术。ISH技术在斑马鱼中的应用始于Westerfield等利用该技术在斑马鱼切片中检测基因的表达。同年, Nusslein-Volhard等将Cox 建立的RNA 原位杂交技术进行了改进, 用地高辛（digoxin）标记的RNA 在斑马鱼胚胎中检测基因表达。2008 年, Bernard Thisse等将该技术进一步优化, 使之更敏感, 也提高了基因表达检测的分辨率，我们在这里介绍的整胚原位杂交技术主要参照Thisse实验室2008年版本（Thisse, C. and Thisse, B., 2008, High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. protoc. 3 : 59 – 69）。 第二节原位杂交技术的原理 原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。 整胚原位杂交（whole-mount in situ hybridization）不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位。整胚原位杂交指在胚胎组织或细胞结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测组织中相应的基因片段相结合（杂交），所形成的杂交体(Hybrids）经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。该技术不仅可以用于检测基因的时空表达, 为研究该基因功能以及基因分类提供线索，还可以应用于高通量药物筛选 或突变体筛选中, 以特异表达的基因标记作为筛选的重要依据。（图5.1）
斑马鱼性腺促熟及早期发育模式
年月日姓名：专业年级：同组者 科目：发育生物学实验题目：斑马鱼性腺促熟及早期发育模式 一【目的要求】 1、通过实验操作掌握斑马鱼性腺促熟和产卵调控技术 2、通过斑马鱼早期发育的观察，巩固对硬骨鱼胚胎发生的认识 二【实验材料】 （一）器材 培养缸、控温棒、解剖镜、显微镜 (二)试剂 经太阳晒过至少一天的自来水 （三）动物 斑马鱼（Danio sp.） 三【实验内容】 （一）亲鱼培育和性腺促熟 挑选体长大于4厘米的斑马鱼放养于鱼缸中，水温保持在28℃左右，放养数量根据鱼缸中水体体积而定，密度5尾\L左右。饲喂亲鱼用的饲料有活性饲料和配合饲料两种，直接购自于观赏鱼市场，要求每天投喂4次，及时清除残饵，隔天换水，快到繁殖季节时将雌雄分养，加强管理。 （三）繁殖 繁殖前一天中午，将雌雄合养于繁殖缸里，要求雌雄比例为2:1。由于斑马鱼有食卵的习性，为防止亲鱼吞噬鱼卵，可用网孔为2-3毫米的网将亲鱼限制在繁殖缸的上半部活动，以防止亲鱼吞吃鱼卵。一般次日凌晨到中午可以产卵和受精，受精卵便沉降于缸底，将繁殖后的亲鱼及时转移至别的培养缸中，吸取缸底受精卵，剔除异物以及眼观有白色小斑点、畸形异常卵。 （三）斑马鱼胚胎发育模式 孵化期间，培养用水温度控制在25-28℃，每天要及时清除败育卵，并换水1-2次。按时观察记录斑马鱼胚胎的早期发育过程，绘制斑马鱼的胚胎发育模式图。 1、受精卵：斑马鱼的卵呈圆球形，橙黄色、微透明，直径0.8-0.9 mm。在水中，受精卵卵膜(壳膜)迅速膨胀，出现透明的卵周隙，在壳膜上可以看到呈漏斗状的卵膜孔。 2、卵裂：卵子受精后，细胞质迅速向动物极流动，并集中形成帽状的胚盘。卵裂即在胚盘范围内进行，卵裂属于不全裂，盘状卵裂。第一次分裂为经裂，分裂沟自上而下，但不到达底部，结果分为两个相等的不完整分裂球。第二次分裂仍为经裂，分裂面与第一次垂直，仍是不完全分裂，于是分成大小相似的四个分裂球。第三次分裂亦为经裂，两个分裂面在第一次分裂面两侧，并与第一次分裂面平行，形成两排，每排四个，共八个分裂球。第四次分裂仍为经裂，两个分裂面在第二次分裂面的两侧，并与第二次分裂面平行，分裂为四排每排有四个分裂球，共形成十六个分裂球。第五次分裂，有经裂也有纬裂，分裂面己不整齐，分裂球大小也不一致。以后几次分裂，分裂球愈分愈小。 3、囊胚期：由于细胞不断分裂，数目增多，细胞体积逐渐变小，分裂球层次增加，同时在胚盘与卵黄之间产生一空腔，即为胚盘下腔，此时称囊胚期，又分为囊胚早期、中期和晚期，也称高囊胚、中囊胚和低囊胚。 4、原肠胚期：囊胚晚期后，细胞逐渐向植物半球下包，胚盘变扁，开始进入原肠期。当胚盘下包到卵黄的一半时，胚环最大，背唇呈新月状，此即胚盾开始，即原肠早期。胚盘继续下包到胚胎的三分之二时，由于细胞不断集中于胚环的一处，致使该处呈一盾状隆起即
斑马鱼性腺促熟及早期发育模式
斑马鱼性腺促熟和早期发育模式 XXX,YYY,ZZZ 一、目的与要求： 1、掌握斑马鱼性腺促熟和产卵调控技术。 2、加深硬骨鱼早期形态发育模式的理解。 二、实验内容： （一）斑马鱼性腺促熟和产卵调控。 1、斑马鱼特性： 斑马鱼一般4月龄性成熟，5月龄鱼繁殖较好；繁殖周期短，一般7天左右。 雌雄分辨：雌性（偏银灰色，体形丰满，腹部膨大、松软，仰腹可见有明显的卵巢轮廓，手摸富有弹性）；雄性（偏柠檬色，腹部扁平，身材显得修长）。【如图一、图二】 图一：雄鱼图二：雌鱼 精、卵体外受精，体外发育，且速度快。发育速度与温度密切相关：在25℃的培养条件下，从受精卵到孵化约需36h；在28℃的培养条件下，从受精卵到孵化约需24h，即胚胎发育成熟。 2、斑马鱼繁殖准备： 将亲鱼雌、雄分开饲喂2～3天（要在饲养箱中加一玻璃隔板，将雌、雄分开，但同时相互之间又要能够看到），繁殖时将雌、雄按1：1或2∶1比例放入产卵池中进行产卵受精。在此过程中一般采用10h光照，14h黑暗的光周期。斑马鱼一般在混合的次日凌晨产卵，为防止亲鱼吞噬鱼卵，可用网孔2～3mm的网将亲鱼限制在产卵池的上半部活动，以防止亲鱼吞吃鱼卵。每条雌鱼可产卵300～1000粒。 （二）斑马鱼早期发育观察： 斑马鱼早期胚胎发育主要有以下七个时期（附有相应的时间）： （1）合子期Zygote Period(0-0.75h) （2）卵裂期Cleavage Period(0.75-2.2h) （3）囊胚期Blastula Period(2.25-5.25h) （4）原肠胚期Gastrula Period(5.3-10h) （5）体节期Segmentation Period(10-24h) （6）咽期Pharyngula Period(24-48h) （7）孵化期Hatching Period(48-72h)
斑马鱼相关实验操作
斑马鱼人工繁殖、受精和胚胎发育 一、实验目的 了解斑马鱼的生活和繁殖习性，掌握斑马鱼人工繁殖技术，了解斑马鱼受精、胚胎发育过程和形态模式形成的特点。 二、斑马鱼的生活和繁殖习性 斑马鱼（Danio rerio）为热带鱼类，可在一年内多次产卵。在合适的养殖条件下，4月龄的斑马鱼即性成熟；性成熟后每1-2周可以产卵一次，一条雌鱼一次可以产出数百颗卵子。斑马鱼产卵受温度和光照长度的调节。最适产卵水温为28.5℃，产卵的光调节周期为光照14小时，黑暗10小时。为防止自然产卵，性成熟的雌、雄斑马鱼必须分开养殖。 斑马鱼具有下列特点： 1、繁殖周期短，不受季节限制，容易获得所需要的精子、卵子和胚胎材料。 2、小型鱼类，可在实验室高密度养殖，饲养成本低。 3、是脊椎动物，具有和人类相似的器官和组织。 4、体外受精、体外发育，胚胎培养条件简单。 5、胚胎透明，可以在活体上直接观察器官的发育。 6、发育周期短，在28.5℃温度下培养，受精后24小时即可以形成个体的基本 结构。 因此，斑马鱼现在选择作为发育生物学研究的模式动物。 三、实验器材和材料 斑马鱼养殖系统，大塑料盆（直径约58cm）两个，塑料筛框（直径约36cm）一个，中号塑料盆（直径约36cm）1个，加热棒，加气泵，12cm培养皿若干，9cm培养皿若干，数个胶头滴管。曝气水10L。性成熟雌、雄性斑马鱼。 四、实验内容和程序 实验前一天的准备： 1、在实验前一天的早上向2个大塑料盆中放大半盆干净的自来水，放入气泵和加热棒，将加热棒温度调整至28℃（每个加热棒都有差异，需要放入温度计，根据温度计指示的实际温度调节和校准温度计），以供斑马鱼催产繁殖时使用。
实验一 斑马鱼总RNA的提取
实验一斑马鱼总RNA的提取 【实验目的】 1、掌握提取总RNA的原理和技术。 2、学习和掌握控制RNA酶活性的方法。 【实验原理】 分离纯净、完整的RNA对于分子克隆的实验是很重要的，而且是进行基因表达分析的基础。在总RNA中，75-85%为rRNA（主要是28S－26S/23S和18S/16S rRNA），其余的由分子量大小和核甘酸序列各不相同的mRNA和小分子RNA如tRNA、snRNA及snoRNA等组成。mRNA一般只占总RNA的1％左右，而且由于RNA酶（核糖核酸酶，RNase）广泛存在、活性稳定，其反应也不需要辅助因子，因而在RNA的制备过程中只要存在少量的RNA酶就难以获得完整的RNA；而所制备的RNA的纯度和完整性又直接影响着RNA分析的结果，长度大于4kb的转录本本身存在的几率更小，其对于痕量RNase的降解也比小转录本更敏感，所以RNA的制备与分析操作难度极大，克隆长片段的基因更加是一门艺术。总之在所有RNA实验中，归根结底就是防止RNA酶的污染，分离到全长的RNA。 在实验中，一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。因为各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶，所以所有分离提取RNA的方案都是在能导致RNA酶变性或失活的化学环境中使RNA释放出来。另一方面要严格控制外源性RNA酶的污染。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA 酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而为避免RNA酶的污染，实验中所用到的全部溶液、玻璃器皿、塑料制品等都需特别处理。 近年来，常用的RNA酶抑制剂主要有：（1）异硫氰酸胍。异硫氰酸胍是目前被认为最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。（2）焦碳酸二乙酯（DEPC）。是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。DEPC通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性，使用浓度为0.05-0.1‰。（3）钒氧核糖核苷复合物。由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，因而能百分之百地抑制RNA酶的活性。其使用浓度为10 mmol/L。（4）RNA酶的蛋白质抑制剂（RNasin）。是一种从大鼠肝或人胎盘中分离出来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶紧密结合形成复合物从而使其失活。（5）其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。本实验采用DEPC对实验中所用到的溶液、玻璃器皿和塑料制品等进行处理。 总RNA制备的方法很多，如1）异硫氰酸胍－苯酚法，许多公司有现成的总RNA提取试剂盒（如Trizol试剂盒，其实质也是异硫氰酸胍－苯酚法），从而可快速有效地提取到高质量的总RNA。2）超离心方法，可以获得丰富且质量高的RNA。缺点是实验时间比较长，要求离心过夜。3）其它一些试剂盒，主要是利用某些特定的介质吸附RNA，驱除其它杂质以后，将纯净的RNA洗脱下来，这样就可以在短时间内获得纯净的RNA。但是价格比较昂贵。 目前，最常用的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍／酸性酚的一步法。异硫氰酸胍－苯酚法的基本过程是：先将样品（以动物的腺体或组织为例）放进匀浆器中加入异硫氰酸胍变性液进行匀浆裂解，再用酸性苯酚（水饱和酚）、氯仿抽提除去DNA和变性的蛋白质，最后用异丙醇沉淀出RNA。Trizol试剂法进一步提高了RNA的提取能力，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。该法甚至可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。本实验就简单介绍Gibcol公司的产品Trizol Reagent（Total RNA Isolation Reagent）的使用方法。不同公司的RNA提取试剂盒具体的使用方法略有不同，可参照产品使用说明书。 此外，不同组织中提取的RNA，其中残留痕量RNase污染的几率也不同，为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase 的样品（如胰脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃（用于保存RNA的甲酰胺一定不能
斑马鱼饲养设备
斑马鱼以其体积小、饲养便捷和科研用处大，而成为众多科研场所的常客。饲养设备作为斑马鱼的家，也已经成为实验室常见的仪器设备。关于饲养设备，相信很多人都不了解，下面将简单介绍一下。 一、产品特点 养殖缸底部有“V”形导流槽设计，固体沉淀物能聚集到“V”形导流槽中，随流水被带出水槽，能有效排出残饵及鱼类排泄物。 0.8L养殖缸，目前市面上比较少有的0.8L养殖水槽，专为基因筛选设计。水槽体积小，空间利用率高，可比较大程度地满足用户实验用的数量要求和分组需要，同时节省药物的使用量。 3L养殖缸设有芯片插口及二维码面贴处，新型的养殖水槽设有芯片插口及二维码面贴处，可配电子芯片及二维码，实验人员通过手持设备或服务器端即可对养殖缸的记录内容进行编辑，建立斑马鱼信息库数字化管理系统。 不锈钢预过滤器，模具一次成型，定期清洗便可长期使用，不再需要过滤棉，大大节省了耗材费用，降低了设备的运行成本。 流水式盖板，与传统的盖板不同，本盖板在表面做出一个缓坡状的下水口，将进水管放在盖板的坡面上，养殖水沿着坡面缓慢流入缸内。 二、技术参数 1. 系统支架：不锈钢316L材质。 2. 养殖缸（可选）：PC材质，注塑一次成型，食品级、耐高温高压（国际标准），抗摔性强，防漏坚固。养殖水槽采用自洁性设计，能有效进行水体交换，每个养殖缸供水单独可控。现有规格：0.8L、1.5L、3L、10L、20L； 3. 水循环装置：包含供水、供气管路，循环泵，增氧泵，斑马鱼专用出水、出气调节阀； 4. 水处理装置（设有不锈钢网预过滤器，代替传统的过滤棉，节省耗材费用，降低运行成本）：包含过滤系统（四级过滤）、紫外
线杀菌系统、加热系统等； 5. 全自动控制系统：可自动控制水循环、紫外杀菌、温度调节、曝气等； 6. 鱼缸配置： 三．设备选配 1. 光照：T5灯管，微电脑时控开关，可根据实验需要进行光照时间的设置，自动开启或关闭，有记忆性； 2. 冷暖机：制冷范围10-30℃； 3. 净水供水单元：出水量4种规格可选，80L/H、250L/H、500L/H、1000L/H； 4. pH及电导率调节仪：可监测和调节pH和电导率，pH调节范围7.2-7.6，电导率调节范围500-550μS/cm。 上海海圣生物实验设备有限公司成立于1997年，是一家从事水生物养殖设备制造的专业生产型企业，专为各高等院校、研究院所度身设计、制造水生物实验养殖系统，如中国水产科学研究生院东海水产研究所、黄海水产研究所、北京大学等。近年来，海圣在斑马鱼养殖设备研发上取得新进展，开发出二代新品，既提升了性能又降低了运行成本。海圣拥有完善的售后服务体系，保修期内免费上门维修，48小时内到达现场。定期回访及维护设备，积极听取和处理反馈意见，提供终身技术支持及配件。它不断吸收国内外先进技术，积极完善生产工艺，获得多项专利，已通过了ISO9001:2015质量管理体系认证、ISO14001:2015环境管理体系认证和ISO 45001:2018职业健康安全管理体系认证，养殖设备达FDA检测标准，无毒无害，质量有保证！
斑马鱼常见病
斑马鱼常见鱼病 鱼病种类很多。按照发生原因的不同，大体分为两类：一类是非感染性疾病，一类是感染性疾病。两类疾病对斑马鱼的健康均可形成严重的危害。其中以感染性疾病造成的危害较为严重，常常可形成大规模的爆发或感染，严重影响斑马鱼的质量和实验结果的准确性。斑马鱼属于鲤科鱼类。感染鲤科鱼类动物的病原均有可能感染斑马鱼。本章将对斑马鱼中常见疾病及可能的应对方法做一个简单的介绍。 第一节细菌性疾病 1、分支杆菌病 病原：海分支杆菌（M. marinum）、脓肿分支杆菌（M. abscessus）、龟分支杆菌(M. Chelonae)、偶发分支杆菌(M. Fortuitum)、草分支杆菌(M. Peregrinum) 和嗜血分支杆菌(M. Haemophilum)等。分支杆菌属是一类细长或略带弯曲的需氧杆菌，该属细菌一般不易着色，需要进行抗酸性染色，此外染色时需要加温或者延长染色时间。该病能引起鱼结核病。 临床症状和病变：溃疡、出血、头部周围充血、鱼鳞凸起，鱼鳍磨损，皮肤或者鳃苍白等。内脏器官会有白色结节出现（图3.1）。 图3.1分支杆菌感染病理图。 左侧，宝刀鱼头肾组织感染分支杆菌产生的白色肉芽肿；中间，分支杆菌感染产生的肉芽肿切片（其切片内含有空腔的巨噬细胞）；右侧，分支杆菌感染雨肠道切片的抗酸染色（抗酸菌染色呈红色，非抗酸菌染色呈蓝色） 显微观察与诊断：诊断时根据上诉症状，再取内脏中的小结节做涂片，进行抗酸染色后如发现长杆形的抗酸菌，基本就可以确诊。也可根据分支杆菌16S rDNA基因保守序列设计引物，PCR扩增一段924bp的特异性片段，对其测序就可快速得出鉴定结果。 防治：一般来说分支杆菌感染很难用抗生素进行根治，有文献报道50 ppm卡拉霉素对其有一定的控制作用。此外，优化饲养条件对其预防也有一定作用。 2、细菌性败血症 病原：嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、温和气单胞菌(Aeromonassobria），河弧菌生物变种（Vibrio fluvialis），产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)，豚鼠气单胞菌（A.caviae）等气单胞菌属。气单胞菌属均为革兰氏阴性菌，其中是嗜水气单胞菌能产生外毒素，具有溶血性、肠毒性及细胞毒性。 临床症状和病变：体表及内脏充血, 出血, 突眼, 腹部膨大,有淡黄色或红色腹水, 肝、脾、肾肿大, 花肝, 脾紫黑色, 严重贫血等。
分子生物学实验技术斑马鱼胚胎显微注射实验步骤
斑马鱼胚胎显微注射实验步骤： 显微注射是指在显微镜下操作的微量注射技术。可将细胞的某一部分(如细胞核、细胞质或细胞器)或外源物质(如外源基因、DNA片段、信使核糖核酸、蛋白质等)通过玻璃毛细管拉成的细针，注射到细胞质或细胞核内。是研究各种生物分子的作用、制作转基因动物、克隆动物等的重要技术。显微注射应用的范围非常广泛，从辅助（体外）细胞受精技术至分子和细胞基本组分的转运都需使用这一技术，比较典型的是将某些物质注射进细胞中以操作和/或监测某种特定的存活细胞中的基本机体生物化学状态。这些可以注射进细胞的物质包括有：各种细胞器、激酶、组织化学标志物（比如辣根过氧化物酶或者荧光黄）、蛋白质、代谢物质、微磁头、离子、抗体、基因、分子生物学的mRNA和DNA等等。运用这一技术，也可以实现用于单个细胞或一组细胞的较少量（皮升至毫升）药剂或药物的精确输送（微灌注），例如药理学的药物检验。斑马鱼个体小，养殖成本低，能大规模繁殖，胚胎透明，体外发育，肉眼可见，因此斑马鱼胚胎是很好的开展显微注射的材料。 1、主要试剂的配制 （1）胚胎培养液的配制 称取0.8g NaCl、0.04g KCl、0.00358g Na2HPO4、0.006g KH2PO4、0.144g CaCl2、0.246g MgSO4?7H2O、0.35g NaHCO3、0.06g 青霉素、0.1g 链霉素加入含有800mL 灭菌水的1L烧杯中，搅拌至完全溶解，再用灭菌水定容至1L。（2）显微注射指示剂的配制 称取0.1克酚红溶于5ml灭菌的蒸馏水中，配制成2％的母液。先用1mm滤膜过滤后，再用0.22mm的滤膜再次过滤，然后储存在-20℃冰箱里备用。 2、显微注射操作 （1）注射针头的拉制：装上一根直径为1mm的毛细管，拧紧左右两侧的夹子，做好固定，并使其中间部位对准加热丝。设定参数为：Heat-600, Pull-55, Velocity-80, Time-10。然后按开始键，等待毛细管被拉成两个所需的微注射针头。 （2）琼脂糖注射槽的制作：称取0.4g琼脂糖，溶于30ml胚胎培养液中，在微波炉中加热溶解后，先倒入约10ml琼脂糖溶液到6cm的玻璃培养皿中，然后将注射槽模型轻轻放置于胶面上，再倒入约20ml。琼脂糖凝固后，取出注射
斑马鱼实验报告
斑马鱼胚胎发育实验报告 斑马鱼(zebra fish)，体长约4公分，具暗蓝与银色纵条纹，由于其基因与人类87%相似，因此广泛应用与生命科学的研究。对水质要求不高，孵出后约3个月达到性成熟，成熟鱼每隔几天可产卵一次。卵子体外受精，体外发育，胚胎发育同步且速度快，胚体透明。发育温度要求在25-31℃之间。斑马鱼的繁殖周期约7天左右，受精卵经2-3天可孵出仔鱼，一年可连续繁殖6-7次，而且产卵量高。 斑马鱼的胚胎发育分为7个阶段：1.合子期；2。分裂期；3.囊胚期；4.原肠胚期；5.体节期；6.咽囊期；7.孵化期。 1.合子期：合子是一个包括卵黄和细胞质的半透明混合物，在动物极存在一个小的清晰的 细胞质断层，即细胞泡的残余。 2.卵裂期:该时期的特点是细胞分裂间期短；细胞变小；不等裂。斑马鱼的受精卵为端黄卵， 卵裂局限于胚盘部分，为不完全卵裂。斑马鱼受精后40分左右卵裂开始，平均约每隔15分卵裂一次。 3.囊胚期：从第八次卵裂开始，就进入囊胚期，与其他真骨鱼不同的是，斑马鱼的囊胚 期不形成囊胚期腔，只在胚盘的下层细胞的一些小的细胞形成一些细胞外间隙；同时细胞分裂周期开始延长，标志着中胚囊转换开始。 4.原肠胚期：原肠作用是指囊胚细胞有规则的移动，在此时期斑马鱼的生殖层开始形成， 斑马鱼的原肠运动主要为外包。 5.体节期：最显著的特征是近轴中胚层节律性分节形成体节。此外，还有眼原基和耳原基 开始出现：脑神经外胚层变厚；脊索细胞开始延展到胚胎尾部 6.咽囊期：体轴从原来的弯曲变为伸直；鳍条开始发育 7.孵化期：完成基本器官系统的快速形态发生。 以下是对各时期鱼卵的观察记录： 左上和左下示未分裂情况合子期 右下示1细胞时期
斑马鱼LD50鱼类(斑马鱼)急性毒性(重铬酸钾)实验报告
鱼类(斑马鱼)急性毒性(重铬酸钾)实验报告 一、实验目的与实验要求 1、通过本实验，熟悉和掌握急性毒性试验的设计、条件、操作步骤，以及 试验结果的计算、分析和报告等全过程。 2、掌握常用的动物染毒途径和方法。掌握急性毒性实验设计，操作方法， 结果判定。 3、了解一次或24小时内多次给予受试化学物后，动物所产生的急性毒性反 应及其严重程度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原因，观察受试物毒 性反应与剂量的关系，求出半数致死量。能较熟练地计算出LC50及毒性判定。 4、对比观察毒物对斑马鱼的作用。 5、体验开放式实验教学，培养生物实验意识，提高学习的主动性、获取实 验知识的能力和撰写实验报告水平。 二、实验方案 1、实验仪器 天平、手套、50mL烧杯、量筒、培养皿、鱼缸、曝气装置 2、实验药品 斑马鱼100条、重铬酸钾、鱼食 3、实验原理 (1)方法的设置 鱼类毒性实验方法可以分为静态法和动态法两大类。本实验采用静态法，以96小时为一试验周期，在24、48、72、96小时记录斑马 鱼的死亡率，确定斑马鱼死亡50%时的受试物浓度。半数致死浓度用 24h LC50、48h LC50、72h LC50和96h LC50表示，并记录无死亡的最 大浓度和导致鱼类全部死亡的最小实验浓度。 (2)受试药物 受试毒物要为常见毒物，并在水体中会存在，对鱼类养殖的影响较为严重。另外受试毒物在水中应要稳定，不易分解，易溶解等。
(3)受试鱼类 实验鱼类一般选择对污染物敏感，在生态类群中具有代表性，经济价值比较高，来源丰富、取材方便、遗传稳定，生物学背景资料 丰富，大小适中，在室内条件下易于饲养和繁殖的种类。 斑马鱼是国际上通用的鱼类急性毒性实验鱼种。建议的实验温度21-25℃，建议实验鱼的全长2.0?1cm。 (4)研究意义 鱼类是水生食物链的顶级生物，也是水体中最为重要的经济动物。 在污染水体中，当污染物达到一定浓度时，就会引起鱼类各种中毒反 应，例如行为失常，组织器官病变，生理功能紊乱乃至死亡。在人为 控制条件下，进行各种鱼类毒性实验，不仅用于化学品毒性强度测定、 水体污染程度、废水及其处理效果检查，而且也为制定水质标准、 评价环境质量和管理废水排放提供科学依据。因此，开展鱼类急性毒 性实验的研究，对实验结果给出正确合理的评价，对于我国水资源保 护具有重要意义。 4、实验步骤 (1)预实验 正式实验前必须对实验用鱼进行驯养，然后根据预实验得出的结果(以上部分内容可另行安排实验时间)，在包括使鱼全部死亡的最低 浓度和96h鱼类全部存活的最高浓度之间至少应设置5个浓度组。每 个实验浓度组应至少设3个平行系列，每一系列设一个空白对照。 (2)正式试验 浓度系列：每组分别取0，50，100，150mg/L重铬酸钾加入鱼缸水中，充分混匀。 在实验开始后3h或6h观察各处理组鱼的状况，并记录实验鱼的异常行为〈如鱼体侧翻、失去平衡，游泳能力和呼吸功能减弱，色素 沉积等〉。 至少在24h、48h、72h和96h后检查受试鱼的状况，并做记录。 如果受试鱼没有任何肉眼可见的运动，如鳃的扇动、碰触尾柄后无反