各种表达载体介绍

pET 载体中，目标基因克隆到 T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供 T7 RNA 聚合酶来诱导表达。 Novagen 的 pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括 36 种载体类型、 15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。

优点

· 是原核蛋白表达引用最多的系统

· 在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低

· 真正的调节表达水平的“变阻器”控制

· 提供各种不同融合标签和表达系统配置

· 可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌

· 许多载体以 LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆 PCR 产物

· 许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化

阳性 pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆 PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。

pET 系统概述

pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由 Studier 等开发的 T7 启动子驱动系统， Novagen 的 pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。

控制基础表达水平

pET 系统提供 6 种载体 - 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。

宿主菌株

质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有 T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（λDE3 溶原菌）中表达目标蛋白。在λ DE3 溶原菌中， T7 RNA 聚合酶基因由 lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有 pLysS 和 pLyE 时调控会更严紧。 pLys 质粒编码 T7 溶菌酶，它是 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。 pLysS 宿主菌产生低量 T7 溶菌酶，而 pLysE 宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的λ DE3 溶原菌。

有 11 种不同DE3 溶原化宿主菌。使用最广泛的为 BL21 及其衍生菌株，它的优点在于缺失 lon 和 ompT

蛋白酶。 B834 菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用 35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。 BLR 为 recA - 衍生菌株，改善了质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。两个硫氧还蛋白还原酶 ( trxB ) 突变菌株 (AD494,BL21 trxB ) ，有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。Origami TM 和 OrigamiB 菌株为 trxB/gor 双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。 Origami 和OrigamiB 宿主菌的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。新的 Rosetta TM 菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的 tRNA ，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。其它菌株背景包括 K-12 菌株 HMS174 和 NovaBlue ，象 BLR 一样为 recA - 。这些菌株可稳定表达其产物可能导致DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。由于存在 F 附加体编码的高亲和力 lacIq 阻遏蛋白， NovaBlue 为一个有用的严紧型宿主菌。此外， Novagen 提供了λDE3 溶原化试剂盒，用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。表达高毒性基因或制备新的λ DE3 溶原菌的另一替代方法是通过 l CE6 感染提供 T7 RNA 聚合酶。虽然不如用 IPTG 诱导λ DE3 溶原菌方便，这种策略也被优先用于一些应用中。

高严紧性 T7 lac 启动子

除了在宿主菌水平选择三种基本的表达严紧性， pET 系统中 T7 启动子本身提供了两种不同的严紧性选择：普通 T7 启动子和 T7 lac 启动子。 T7 lac 启动子在启动子区下游 17bp 处含有一个 25bp 的 lac 操纵序列。该位点结合 lac 阻遏蛋白能够有效降低 T7 RNA 聚合酶的转录，这样提供了在λDE3 溶原菌中抑制基础表达的第二种基于 lacI 的机制（除了抑制 lacUV5 ）。含 T7 lac 启动子的 pET 质粒还具有它们自己的 lacI ，确保足够的阻遏蛋白结合到操纵基因位点上。

在实际应用中，为了获得最高产量的蛋白，通常应该测试多种不同的载体 / 宿主菌组合。

控制诱导的表达水平

在许多情况下，表达活性可溶性最好的蛋白依赖于宿主细胞的背景、培养条件和合适的载体配置。通常，目标蛋白活性最高的条件与产量最高的条件不一致。除了根据载体 / 宿主菌组合控制 T7 RNA 聚合酶的基础表达提供不同严紧性， pET 系统还根据诱导物（ IPTG ）浓度，对目标蛋白表达提供了真正的“变阻器”控制。 Tuner 和 OrigamiB 宿主菌的 lacY 突变使这种控制成为可能。

选择 pET 载体

所有的 pET 载体均来自 pBR322 ，但彼此间先导序列、表达信号、融合标签、相关限制性位点和其它特点有所不同。有两大类 pET 质粒，即转录载体和翻译载体：

转录载体（包括 pET-21 、 pET-23 和 pET-24 ）表达目标 RNA ，但不提供翻译信号。它们用于从自身带

有细菌翻译信号的目标基因表达蛋白。（注意：转录载体通过命名后面的一个缺失字母后缀加以区分）

翻译载体含有设计用于蛋白表达的有效翻译起始信号。许多载体在读码框 a 、 b 和 c 中带有克隆位点，分别对应于 BamH I 位点的 GGA 、 GAT 和 ATC 三联体。

选择要点

选择用于表达的 pET 载体通常涉及多种因素。考虑以下三个主要因素：

· 所表达蛋白的用途

· 所表达蛋白的已知信息

· 克隆策略

pET 载体表达的蛋白用途各种各样。例如，表达量为分析级的蛋白可用于活性研究、突变体筛选和定性、筛选配体相互作用和抗原制备。大量活性蛋白用于结构研究、试剂或亲和基质制备。许多载体适合表达用于筛选或抗原制备的分析量蛋白，然而只有载体、宿主菌和培养条件组合十分适宜才可能用于大量纯化。如果需要活性蛋白连续高产，应该试验多种载体、宿主菌和培养条件组合以找到最优化结果。

任何关于目标蛋白的已知信息都有助于载体选择。例如，一些蛋白的活性要求一个或两个末端没有外源序列。许多 pET 载体能够克隆非融合序列，然而如果特定翻译起始序列不能在大肠杆菌中有效利用，表达水平可能受影响。在这些情况下，常可用有效表达的氨基末端序列构建融合蛋白，然后在纯化后用位点特异性蛋白酶消化去除融合序列。 LIC （连接非依赖的克隆）策略对这种方法特别有用，因为克隆操作通过肠激酶和因子 Xa 能够去除所有氨基端载体编码序列。

由于限制性位点和读码框相容性的需要，克隆策略也会影响载体选择。由于许多 pET 载体具有共同的限制性位点配置，通常可能将一次制备的目标基因克隆到几个载体中。采 PCR 克隆策略时则有不同的考虑。 LIC 载体试剂盒推荐用于此目的，可通过 PCR 制备插入片段，而不需要限制性消化载体或插入片段。

溶解性和细胞定位

考虑了目标蛋白的应用和克隆策略，还应该确定目标蛋白的细胞定位和溶解性，这一点十分重要。在许多实际应用中常希望表达可溶的活性蛋白。

特定目标蛋白的溶解性取决于多种因素，包括各自的蛋白序列。在许多情况下，溶解性不是有或无的现象，

载体、宿主菌和培养条件可被用来增加或减少获得的可溶或不可溶形式的比例。 PET-32 载体系列使目标序列与通常能够增加可溶性蛋白比例的硫氧还蛋白 (Trx.Tag ) 融合。新推出的 pET-43.1 系列具有通过大量系统筛选而得到的一种过量表达时具有极高溶解性的大肠杆菌蛋白 --Nus.Tag 融合伴侣，从而进一步提高了目标蛋白的可溶性。此外， trxB 突变株 AD494 和 BL21 trxB ，或 trxB/gor OrigamiTM 和OrigamiB 菌株可用于在胞浆中形成许多真核蛋白正确折迭和活性所要求的二硫键。低温诱导（ 15 -25 ° C ）也可增加可溶性目标蛋白的比例。

获得可溶性活性蛋白的另一策略是使蛋白外泌到胞外周质中，为折迭和二硫键形成有更适宜的环境。为了达到这一目的，通常使用带信号肽的载体。

一些纯化策略可以优化胞质中不溶性包涵体的产量。抽提包涵体并溶解，然后目标蛋白在体外重新折迭( 如使用 Novagen 的蛋白折迭试剂盒 ) 。该过程通常产生高产量初始蛋白并防止宿主细胞中的蛋白降解。然而，重新折迭成活性蛋白的效率随不同蛋白变化很大，可能相当低。 pET-31b （ + ）载体专为产生不可溶融合蛋白而设计，提供了生产小蛋白和多肽的有效方法。

满足不同需要的融合标签

如果融合序列不影响应用，生产带有 S.Tag 、 T7.Tag a 、 His.Tag a 和 HSV.Tag a 的融合蛋白会很方便后续操作，并易于通过蛋白杂交检测。这些多肽（融合序列很小），它们的检测试剂极特异和灵敏。通过使用相应树脂和缓冲液试剂盒， GST.Tag 、 S.Tag 和 T7.Tag 序列可用于亲和纯化。

使用 S.Tag 和 GST.Tag 分析试剂盒可对粗提或纯化的融合蛋白准确定量。采用一种新颖底物的FRETWorks S.Tag 分析试剂盒可通过荧光检测到少于 1fmol 的融合蛋白。

His.Tag a 序列作为纯化蛋白的融合伴侣非常有用，尤其对那些以包涵体形式表达的蛋白来说，它可以使亲和纯化可在溶解蛋白的完全变性条件下进行。

CBD.Tag a 在低费用亲和纯化中非常有用。它们也特别适用于重新折迭（特别是带有 CBD clos .Tag a 序列的 pET-34b （ + ）和 35b （ + ））。因为只有正确重新折迭的 CBDs 结合到纤维素基质上， CBIND 亲和纯化步骤能够从制备物中去除不正确折迭的分子。任何标签可用于固定目标蛋白，但由于 CBD.Tag 序列的低非特异性结合以及与纤维素基质的生物相容性，使它更适合用于这一目的。

Nus.Tag 、 Trx.Tag 和 GST.Tag 序列用来增加其融合伴侣的溶解性。 Nus.Tag 和 Trx.Tag 载体与利于在胞浆中形成二硫键的 Origami 宿主菌相容。

各种融合标签和相应 pET 载体见列表。一些 pET 载体带有数个***的融合标签，作为 5' 融合伴侣。此外，许多载体通过目标基因序列符合读码框的通读而表达末端带有不同多肽标签的融合蛋白。使用在 5' 标签和目标序列之间含有蛋白酶切割位点（凝血酶、因子 Xa 和肠激酶）的载体，可以在纯化后选择性去除一个或多个标签。 pET-30 Ek/LIC 、 pET-32 Ek/LIC 、 pET-34 Ek/LIC 和 pET-36 Ek/LIC 是细胞定位和亲和标签配置良好的代表。 pET Ek/LIC 载体 Combo 试剂盒包括所有 4 种即用型载体，可直接用于构建数种目标基因构型。

pET NusA 融合系统 43.1

在大肠杆菌中生产可溶性活性蛋白

新推出的 pET NusA 融合系统设计用于克隆和高水平表达与 495aa NusA （ Nus.Tag ）蛋白融合的多肽序列。对数据库中 4000 个以上蛋白进行可溶性建模， NusA 蛋白被确认为具有最高的可溶性。在用四种不同 NusA 融合蛋白进行的试验中，大于 85% 的表达蛋白都是可溶的。 pET-43.1 载体含有 Nus.Tag 融合伴侣并与 trx/gor 突变体 Origami 和 OrigamiB 菌株相容，有利于在胞浆中形成二硫键。使用 pET-43.1 载体和这些 trx/gor 宿主菌组合可能获得二硫键结合的蛋白。

优点

· 高可溶性的 N- 末端 Nus.Tag 融合伴侣

· 上游 His.Tag a 、 S.Tag 和可选择的 C- 末端 HSV.Tag a 、 His.Tag 融合标签

· 凝血酶和肠激酶切割位点

· 多克隆位点位于所有读码框中

· 与 AD494 和 Origami 宿主菌株相容，可促进表达蛋白的正确折迭

pET 宿主菌株感受态细胞

所有 pET 系统宿主菌以预测试的感受态细胞形式提供，可立即用于转化。

（ DE3 ）指宿主为λDE3 溶原菌，其染色体上带有一拷贝由 lacUV5 启动子控制的 T7 RNA 聚合酶基因。这类菌株适用于从克隆到 pET 载体的目标基因生产蛋白。命名为 pLysS 和 pLysE 的宿主菌带有编码 T7 溶菌酶（为 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物）的 pET 相容性质粒。带有 pLysS 的细胞产生少量溶菌酶，而 pLysE 宿主菌产生更大量酶。这些菌株用于在诱导前抑制 T7 RNA 聚合酶的基础表达，这样可以稳定编码影响细胞生长和活力的目标蛋白的 pET 重组体。带有 pLacI 的宿主菌产生额外的抑制 pETBlue 和pTriEx 载体基础表达的 lac 阻遏蛋白。λ DE3 溶原化试剂盒用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。

AD494 菌株为硫氧还蛋白还原酶 ( trxB ) 突变菌株，能够在胞浆内形成二硫键，提供了生产正确折迭的活性蛋白的潜力。 TrxB 突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的质粒。

B834 为 BL21 的亲本菌株。这些蛋白酶缺陷宿主菌为甲硫氨酸营养缺陷型，可用 35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记，从而用于结晶学研究。

BL21 应用最广的宿主菌来源，具有 lon 和 ompT 蛋白酶缺陷的优点。

BL21 TrxB 菌株在蛋白酶缺陷 BL21 背景上具有与 AD494 菌株相同的硫氧还蛋白还原酶突变 ( trxB ) 。由于 trxB 宿主有利于胞浆内二硫键形成，它们的使用可增加正确折迭的蛋白组分。 TrxB 突变可用卡那霉素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的质粒。

BLR 为 BL21 的 recA - 衍生菌株，能够改善质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列或其产物能够引起DE3 噬菌体丢失的目标质粒。

HMS174 菌株在 K-12 背景上提供了 recA 突变。与 BLR 一样，这些菌株能够稳定其产物能够引起 DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。

NovaBlue 适合用作初始克隆宿主菌的 K-12 菌株，具有高转化效率、蓝 / 白斑筛选能力（与合适质粒）和导致优质质粒 DNA 高产的 recA endA 突变。由于存在 F 附加体编码的 lacI q 阻遏蛋白， NovaBlue 的DE3 溶原菌是一个非常有用的严紧型宿主菌。

Origami 为 K-12 衍生的宿主菌，硫氧还蛋白还原酶突变 ( trxB ) 和谷胱甘肽还原酶 ( gor ) 基因均为突变，能够大大增强胞浆内二硫键的形成。研究表明即使总体表达水平相似， Origami （ DE3 ）表达的活性蛋白比其它宿主菌高 10 倍以上。 Origami 宿主菌与氨苄抗性质粒相容，可用于 pET-32 载体，硫氧还蛋白标签能够进一步增强在胞浆内形成二硫键。 TrxB 和 gor 突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的 pET 质粒。

Origami B 宿主菌来源于 BL21 lacZY 突变株，还带有与原始 Origami 菌株相同的 TrxB / gor 突变。Origami B 菌株集 BL21 、 Tuner 和 Origami 宿主菌的优点于一体。 TrxB 和 gor 突变可分别用卡那霉素和四环素选择，因此该菌株建议用于带氨苄抗性标记 bla 的 pET 质粒。

Rosetta 宿主菌从 BL21 衍生而来，可增强带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白的表达。该菌株通过一个相容性氯霉素抗性质粒补充密码子 AUA 、 AGG 、 AGA 、 CUA 、 CCC 和 GGA 的 tRNAs 。这样 Rosetta 菌株提供了“万能”的翻译，从而避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的表达限制。 tRNA 基因由它们的天然启动子驱动。在 Rosetta （ DE3 ） pLysS 和 Rosetta （ DE3 ） pLacI 中，稀有 tRNA 基因存在于分别带有 T7 溶菌酶和 lac 阻遏基因的同一质粒上。

Tuner 菌株为 BL21 的 lacZY 缺失突变株，能够调整培养物中所有细胞的蛋白表达水平。 lac 通透酶（ lacY ）突变使得 IPTG 均匀进入群体所有细胞，从而具有浓度依赖、水平均一的诱导表达。通过调整IPTG 浓度，表达可从极低水平调节到极强、完全诱导的表达水平（通常与 pET 载体相关）。低水平表达有时可能增强难表达蛋白的溶解性和活性。 Tuner （ DE3 ） pLacI 菌株与 pETBlue 和 pTriEx 载体的表达相容。

建议兄弟首先学习本版以前的帖子。

搬出老帖子，我们共同学习一下：

eeflying ：原核表达系统中，哪种载体最好？

原核表达没有最好，可以说一般都是在碰，

和你要表达蛋白的性质有关，也和你表达后的用途，及因此而选择的表达策略有关。

比如，

１。你是否介意有亲和标签，亲和纯化当然纯化相对容易，但有时亲和标签的存在会影响蛋白的功能，２。如果用亲和标签，用什么亲和纯化策略，his 或GSH还是染料抑或是IgG-ProteinA亲和，LAB的

IMPAC-TWIN,还是别的如转铁蛋白等，亲和层析的策略也有很多，

３。最终产物是否有必要将亲和标签去掉，如用蛋白酶切掉标签，或 IMPAC-TWIN会自己切掉，用因子X 切掉HIS,

4。表达的部位，是可溶性表达还是包涵体表达，是周质表达还是分泌表达还是分泌表达。

５。是否加入开关诱导、或是加入IPTG诱导噬菌体T7系统。

６。你表达的蛋白质是否会与细菌内某些蛋白相互作用而致表达失败。

７。如果不用亲和标签，纯化用什么方法纯化？

８。即使都考虑全了，表达也未必成功，换载体是很常见的是。

９。载体选好后，表达条件的优化，如培养温度，培养时间，IPTG浓度等，我们一般在这部用正交设计或析因设计决定。

１０。蛋白纯化条件的优化，用均匀设计或球面设计或正交设计作曲线拟合，通过导数求极值的方法优化蛋白纯化条件。

这些问题是相互关联的，在实践中可得有一段时间去摸索了。

YONG:原核表达系统中，哪种载体最好？

载体没有最好，看哪一种最合适你的实验目的。

这几年新发展的载体一般具有下列特点的一个或多个：

1）更多的融合标签选择（提供多种亲和纯化方便）

2）严紧的表达调控，更低的渗漏表达

3）分子伴侣蛋白，促进折叠和可溶性表达

此外，具有更好的质粒稳定性并能够纠正遗传密码偏爱的新的蛋白酶缺陷的宿主细胞也是一个很好的工具。最新的不一定是最好的，pBV220经常可以给出不错的表达，虽然多半是包含体。

YONG:关于表达载体

不同的载体的特点不同，主要的差别有启动子类型，质粒拷贝数等，基因本身的因素基因5’非编码区的二极结构，密码子的偏爱性等，宿主菌的特点也很重要（BL21是蛋白酶缺陷的菌株），融合表达策略也有利于顺利表达外源蛋白。这些就决定了对某一个特定的基因而言，并非所有的表达载体都适合。现在还没有谁可以用大肠杆菌成功表达每一个基因，尤其是使用指定的表达系统更是不可能。根据研究的目的以及基因和载体的特点选择表达系统，说说容易，做起来很难。

SDS-PAGE所显示的不表达很多情况下是低表达，尤其是当目的蛋白迁移率与菌体中某种丰富蛋白一致时，不高的表达带常被遮盖。Western blotting的灵敏度高，可以用来检测很低的表达。

对于某些研究来说，表达是为了在细胞内提供某种功能，不需要高表达；更多的情况是把大肠杆菌作为制备重组蛋白的细胞工厂，此时表达量具有重要意义，低表达为蛋白纯化带来困难，对于某些研究或开发来说，低表达意义不大。当然，通过western blotting检测可以排除一些基因表达中的不确定或待确定因素，而且某些时候即使是高表达，western blotting也是蛋白定性的重要指标。

YONG:请教-pET表达

我试着说一下：

1）如何获得非融合高效表达？

高效的非融合表达很多情况下是大肠杆菌表达最愿意看到的结果，如果是可溶性的，可能会让大部分研究者更加兴奋。但理想和现实是有差距的。凭心而论，你做的还是不错的，毕竟看到了高效表达，虽然是包

含体，虽然信号肽的切割情况不明，毕竟你可以拿到东西了。可以试一下包含体的复性和纯化，测测活吧！否定一个信心苦苦得出的结果要慎重呀！

下面讨论一下如何实现更高的追求：

首先是老生长谈，影响大肠杆菌表达的因素：

遗传密码偏爱性、mRNA5'二级结构、第二密码子等，参见各种综述和论坛中的帖子。

融合表达优化了上述影响表达的因素，所以更容易成功。很多药用蛋白的表达也采用了融合表达策略，可能是无奈的选择，也可能是为了获得可溶性表达或为了获得有利于初步纯化的性质并成功的解决了酶切或化学切割融合头后目的蛋白的纯化。IL-11就是这样的例子。所以非融合表达并不是一无是处，关键看有没有办法达到最后的目的。如果是药用蛋白，准备申报临床，最好保持天然的N-末端，所以蛋白酶或化学切割要非常特异，不要再N端引入新的氨基酸或导致目的蛋白N端不整齐。

非融合表达的N端的Met一般是报批容许的，虽然这不是天然的形式。非融合表达省略了切割融合头的步骤和切割后的纯化步骤，具有成本优势。非融合表达的实现首先需要分析，其次看运气，有时运气因素更多。尽可能把影响基因表达的因素都考虑到并逐个优化要花费很大的精力，但这并不能保证这种优化一定会得到理想的结果，未知的因素和因素之间的作用使得完美的优化方案非常难实现，而且基因本身的因素也不允许随心所欲的优化（比如氨基酸序列不能任意改变）。原核表达的特点就是时间短、花钱少，所以多方案的尝试和理性的分析结合是大多数研究者采用的基本策略。具体到你的实验来说，如果你是要做药用蛋白，在融合表达成功后可以a.纯化一点蛋白，看看N-末端；b.在你的融合头后面引入一个切割位点，切割后产生天然N-末端。选择策略看你们实验室的传统，怎么方便怎么做。有的实验室纯化能力强，有得上游强。不管如何，建立有效的测活方法很关键，这可以为表达策略和纯化策略提供指引。

至于可溶性表达，看情况吧！如果你的包含体复性很成功，不必强求可溶性。降低诱导温度，降低菌生长速度和基因表达速度，降低总表达量，把蛋白导入周质空间和使用具有分子伴侣功能的融合等策略有助于实现可溶性表达，但都没有把握。如果你的蛋白的二硫键非常多，可溶性表达难度会较大。这些一般的原则很多综述或研究论文都有不同角度的表述，关键是结合自己的研究目的和实验室的条件灵活运用。

2）基因往表达载体中克隆失败。可能是克隆的操作问题，也可能是这种表达方式导致的表达对细胞生长有不利影响或重组后的质粒不稳定。

验证克隆操作可以通过载体自连对照解决，如果载体自连后的转化子没有或很少，说明酶切操作没有问题。如果表达产物对细胞有毒或质粒不稳定就不容易解决了，也许凭经验可以判断原因，但更换载体、宿主或表达方式可能是最常用的方法。

YONG:浅论基因表达系统的选择

因表达是基因工程的重要内容，是工业、医疗和基础研究领域的重要技术。

基因表达系统按照基因表达宿主的性质分为原核表达系统和真核表达系统两类，前者主要包括大肠杆菌表达系统和枯草杆菌表达系统等，后者主要包括酵母表达系统、丝状真菌表达系统和哺乳动物细胞表达系统等。

原核表达系统以大肠杆菌表达系统为代表，具有遗传背景清楚、成本低、表达量高和表达产物分离纯化相对简单等优点，缺点主要是蛋白质翻译后加工机制的缺乏，如二硫键的形成、蛋白糖基化和正确折叠。

简单单细胞真核生物表达系统以酵母表达系统为代表，其中甲醇酵母具有较大优势（主要包括毕赤酵母Pichia pastoris和汉森酵母Hansenula ploymorpha）。甲醇酵母表达系统主要优点有：表达量高，表达可诱导，糖基化机制接近高等真核生物，分泌蛋白易纯化，容易实现高密发酵等。缺点是并非所有基因都可以获得高表达，当然，这是几乎所有表达系统的共同问题。

哺乳动物细胞表达系统主要优点是蛋白翻译后加工机制最接近体内的天然形式，缺点是表达量通常较低，生产成本高。

表达系统选择的根据是研究和开发的目的。具体考虑以下几个方面：

目的基因的来源，如果是大肠杆菌来源的基因，选择大肠杆菌作为表达系统较好，这主要是考虑到与目的

基因来源相同的宿主对于保证蛋白的活性较有利且基因遗传密码的偏爱性较一致。

生产的成本和工艺放大要求。大肠杆菌和毕赤酵母系统生产重组蛋白的成本低，生产工艺较简单，用于规模化生产较有利。如果是研究需要小量蛋白，主要考虑目的蛋白的活性和小规模纯化制备的方便。

研究周期和可操作性。在这一点上，大肠杆菌优于酵母，酵母优于细胞。

蛋白的用途和用量。对于药品开发，这三种宿主都可以选择，但要考虑到报批的要求。如果是体内用，天然的氨基酸序列较重要，最好不要因为基因表达和蛋白纯化的便利引入融合伴侣，如果是制备抗原用于纯化和体外的活性研究则不必太严格。某些蛋白体内活性需要的剂量并不大，如angiostatin，但是，大肠杆菌或酵母表达的蛋白体内半衰期短，所以蛋白用量较大。

蛋白的天然性质。如果目的蛋白本身是分泌蛋白，则选择分泌表达较好，毕赤酵母分泌表达优势非常显著。对于大肠杆菌系统来说，其蛋白的分泌机制复杂，除了信号肽之外，有些蛋白的分泌和与成熟蛋白的序列有关，而且大肠杆菌的分泌很难进入培养基，通常是在周质空间积累。根据蛋白活性的要求，结合其天然的性质，选择表达系统是非常重要的。

知识产权的考虑。如果是研究工作，选择商品化的载体较好，因为同行对这些载体也很了解，对于用这些载体做出来的结果容易比较。如果是开发工作，选择表达系统时最好是把载体的知识产权问题考虑进去，否则可能会受制于人。

总之，选择一种合适的表达系统是开始基因表达工作前的重要步骤，选择的主要依据是研究的目的，结合各种其他参数的综合考虑。这种选择可以充分体现出研究者智慧和风格。

YONG:寻找载体

1）pThioHisA,B,C

Trc 启动子，Thioredoxin融合，IPTG诱导，也可以用NdeI进行非融合表达

https://www.360docs.net/doc/2a9513230.html,

2）pBV220

PLPR***启动子，42度热诱导，EcoRI克隆，非融合表达。

病毒所张智清、候云德等构建，国内很多实验室有。

3）pET系列

T7启动子，IPTG诱导，一般为融合表达，NdeI或NcoI非融合表达

https://www.360docs.net/doc/2a9513230.html,

4）pQE系列载体

T5启动子,IPTG诱导，融合表达

https://www.360docs.net/doc/2a9513230.html,

原核表达载体种类非常多，下表不一定全

Features of E.coli Expression Vectors

Vector Name Promoter Selection marker Tag or Fusion Partener Protease Cleavage Replicon Provider pALTER-Ex1 T7 Tet none none Promega

pALTER-Ex2 T7 Tet none none Promega

pBAD/His araBAD Amp N-His EK pUC Invitrogen

pBAD/Myc-His araBAD Amp C-His none pUC Invitrogen

pBAD/gIII araBAD Amp C-His none ColE1 Invitrogen

pCal-n T7-lac Amp N-CBP Thr ColE1 Stratagene

pCal-n-EK T7-lac Amp N-CBP Thr，EK ColE1 Stratagene

pCal-c T7-lac Amp C-CBP Thr ColE1 Stratagene

pCal-Kc T7-lac Amp C-CBP Thr ColE1 Stratagene

pcDNA 2.1 T7 Amp none none pUC Invitrogen

pDUAL T7-lac Kan C-CBP Thr ColE1 Stratagene

pET-3a-c T7 Amp none none pBR322 Novagen

pET-9a-d T7 Kan none none pBR322 Novagen

pET-11a-d T7-lac Amp none none pBR322 Novagen

pET-12a-c T7 Amp none none pBR322 Novagen

pET-14b T7 Amp N-His Thr pBR322 Novagen

pET-15b T7-lac Amp N-His Thr pBR322 Novagen

pET-16b T7-lac Amp N-His Xa pBR322 Novagen

pET-17b T7 Amp none none pBR322 Novagen

pET-19b T7-lac Amp N-His EK pBR322 Novagen

pET-20b(+) T7 Amp signal sequence C-His none pBR322 Novagen

pET-21a-d(+) T7-lac Amp C-His none pBR322 Novagen

pET-22b(+) T7-lac Amp signal sequence C-His none pBR322 Novagen

pET-23a-d(+) T7 Amp C-His none pBR322 Novagen

pET-24a-d(+) T7-lac Kan C-His none pBR322 Novagen

pET-25b(+) T7-lac Amp signal sequence C-His none pBR322 Novagen

pET-26b(+) T7-lac Kan Signal sequence C-His none pBR322 Novagen

pET-27b(+) T7-lac Kan signal sequence C-His none pBR322 Novagen

pET-28a-c(+) T7-lac Kan N-His C-His Thr pBR322 Novagen

pET-29a-c(+) T7-lac Kan C-His Thr pBR322 Novagen

pET-30a-c(+) T7-lac Kan N-His C-His Thr EK pBR322 Novagen

pET-31b(+) T7-lac Amp C-His none pBR322 Novagen

pET-32a-c(+) T7-lac Amp internal His C-His Thr EK pBR322 Novagen

pET-33b(+) T7-lac Kan internal His C-His Thr EK pBR322 Novagen

pET-34b(+) T7-lac Kan N-CBDclos C-His Thr EK pBR322 Novagen

pET-35b(+) T7-lac Kan N-CBDclos C-His Thr Xa pBR322 Novagen

pET-36b(+) T7-lac Kan signal sequence N-CBDcenA C-His Thr EK pBR322 Novagen pET-37b(+) T7-lac Kan signal sequence N-CBDcenA C-His Thr Xa pBR322 Novagen pET-38b(+) T7-lac Kan signal sequence C-CBDcex C-His Thr pBR322 Novagen

pET-39b(+) T7-lac Kan (signal sequence) DsbA N-His C-His Thr EK pBR322 Novagen pET-40b(+) T7-lac Kan (signal sequence) DsbC N-His C-His Thr EK pBR322 Novagen pET-41a-c(+) T7-lac Kan GST N-His C-His Thr EK pBR322 Novagen

pET-42a-c(+) T7-lac Kan GST N-His C-His Thr Xa pBR322 Novagen

pET-43a-c(+) T7-lac Kan NusA C-His N-His Thr EK pBR322 Novagen

pETBlue-1 T7-lac Amp C-His none pUC Novagen

pETBlue-2 T7-lac Amp C-His none pUC Novagen

pETBlue-3 T7-lac Amp N-His C-His Thr EK pUC Novagen

pGEMEX-1 T7 Amp T7 gene 10 none Promega

pGEMEX-2 T7 Amp T7 gene 10 none Promega

pGEX-1lT tac Amp GST Thr pBR322 Pharmacia

pGEX-2T tac Amp GST Thr pBR322 Pharmacia

pGEX-2TK tac Amp GST Thr EK pBR322 Pharmacia

pGEX-3X tac Amp GST Xa pBR322 Pharmacia

pGEX-4T tac Amp GST Thr pBR322 Pharmacia

pGEX-5X tac Amp GST Xa pBR322 Pharmacia

pGEX-6P tac Amp GST Pre pBR322 Pharmacia

pHAT10/11/12 lac Amp N-HAT EK pUC Clontech

pHAT20 lac Amp N-HAT EK pUC Clontech

pHAT-GFPuv lac Amp N-GFPuv EK pUC Clontech

pKK223-3 tac Amp none none pBR322 Pharmacia

pLEX PL Amp none none pUC Invitrogen

pMAL-c2X tac Amp N-MBP Xa ColE1 NEB

pMAL-c2E tac Amp N-MBP EK ColE1 NEB

pMAL-c2G tac Amp N-MBP Gen ColE1 NEB

pMAL-p2X tac Amp N-MBP Xa ColE1 NEB

pMAL-p2E tac Amp N-MBP EK ColE1 NEB

pMAL-p2G tac Amp N-MBP Gen ColE1 NEB

pProEX HT trc Amp N-His TEV Life Technologies pPROLar.A lac-ara1 Kan N-c-Myc EK p15A Clontech pPROTet.E LtetO-1 Cam N-c-Myc EK ColE1 Clontech pQE-9 T5-lac Amp N-His none ColE1 Qiagen

pQE-16 T5-lac Amp C-His none ColE1 Qiagen

pQE-30/31/32 T5-lac Amp N-His none ColE1 Qiagen pQE-40 T5-lac Amp N-His N-DHFR none ColE1 Qiagen pQE-60 T5-lac Amp C-His none ColE1 Qiagen

pQE-70 T5-lac Amp C-His none ColE1 Qiagen

pQE-80/81/82L T5-lac Amp N-His none ColE1 Qiagen pQE-100 T5-lac Amp N-His none ColE1 Qiagen

pRSET T7 Amp N-His EK ColE1 Invitrogen

pSE280 trc Amp none none pUC Invitrogen

pSE380 trc Amp none none pUC Invitrogen

pSE420 trc Amp none none pUC Invitrogen

pThioHis trc Amp His-Patch EK Trx ColE1 Invitrogen pTrc99A trc Amp none none pBR322 Pharmacia

pTrcHis trc Amp N-His EK pUC Invitrogen

pTrcHis2 trc Amp C-His none pUC Invitrogen

pTriEx-1 T7 Amp C-His none pUC Novagen

pTriEx-2 T7-lac Amp N-His C-His Thr EK pUC Novagen pTrxFus PL Amp Trx EK ColE1 Invitrogen

原核&真核表达载体构建

原核、真核表达载体构建真核表达载体和原核表达载体的区别：主要是因为原核和真核表达系统所需的表达元件不同。比如说启动子，终止子在两种表达系统中是不一样的。带有真核表达元件的是真核载体，能在真核生物内表达；带有原核表达元件的是原核载体，能在原核生物内表达。两者都具有的为穿梭载体。㈠原核表达载体指：能携带插入的外源核酸序列进入原核细胞中进行复制的载体。原核表达载体调控原件 1.启动子启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5～10 bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10区。来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp 处，有一段由10 bp组成的区域，称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA 链。原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 2. SD序列 1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3～9 bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3￠末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列，简称SD序列。它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一，某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合，从而影响蛋白质的翻译。另外，真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG 之后，才能产生一个完整的蛋白质。 3．终止子在一个基因的3￠末端或是一个操纵子的3'末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。转录终止过程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进，RNA的延伸也停止在终止信号上，完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来。对RNA聚合酶起

克隆载体与表达载体

克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。克隆载体（Cloning vector ）：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。（这是为携带”感兴趣的外源DNA实现外源DNA勺无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。）其中，为使插入的外源 DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。是否含有表达系统元件，即启动子 -- 核糖体结合位点 -- 克隆位点 -- 转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。表达载体（ Expression vectors ）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。如表达载体 pKK223-3 是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在 mRNAk有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3?10 bp处的由3 —9bp组成的序列。这段序列富含嘌吟核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体 RNA的识另U与结合位点。根据发现者的名字，命名为 Shine-Dalgarno 序列，简称 S-D 序列。由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3 '端一部分序列互补，因此 S-D序列也叫做核糖体结合序列。真核生物存在于真核生物mRNA勺一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。加Kozark sequence（GCCACC）, Kozak sequence 是用来增强真核基因的翻译效率的。是最优化的ATG环境，避免 ribosome 出现 leaky scan ）克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。但不具备表达元件。而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的，防止渗漏表达。克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管读码框什么的，但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你的读码框不能乱了，否则就不能得到你想到的表达产物。 1. 载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector ）。2. 载体的分类按功能分成：（ 1）克隆载体 : 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。（2）表达载体：具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。按进入受体细胞类型分：（ 1 ）原核载体（ 2）真核载体（ 3）穿梭载体（ sbuttle vector ）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）.

pCambia1391Z 植物表达载体

北京华越洋?生物?首页关于我们新闻中?心产品展?示在线留?言加?入我们联系我们 pCambia1391Z pCambia1391Z 产品编号载体名称北京华越洋?生物VECT0010 pCambia1391Z pCambia 1391Z 载体基本信息出品公司:Cambia 载体名称: pCambia1391Z, pCambia 1391Z 质粒类型: 植物表达载体?高拷贝/低拷贝:低拷贝启动?子:CAMV 35S 克隆?方法 :多克隆位点，限制性内切酶载体?大?小: 11227 bp 5' 测序引物及序列:M13-F: TGTAAAACGACGGCCAGT 3' 测序引物及序列 : M13-R: CAGGAAACAGCTATGAC 载体标签: GusA 载体抗性: 卡那和潮霉素筛选标记: HPTII 详情产品分类 ?生化试剂精细化学品中间体/标准品病理实验试剂其他关键词：　热线电话：400-818-1148150 1148 1284

备注:-- 产品?目录号:1391Z 稳定性:稳定表达组成型:?非组成型病毒/?非病毒:?非病毒 pCambia 1391Z载体质粒图谱和多克隆位点信息 pCambia 1391Z载体序列 LOCUS pCAMBIA1391Z 11227 bp ds-DNA circular SYN DEFINITION Agrobacterium binary vector for plant transformation, with hygromycin- and kanamycin-resistance and LacZ-GUS genes plus the pUC9 MCS. ACCESSION AF234312 VERSION . KEYWORDS pCAMBIA1391Z SOURCE synthetic DNA construct ORGANISM synthetic DNA construct REFERENCE 1 (bases 1 to 11227) AUTHORS Cambia TITLE Direct Submission JOURNAL Exported from SnapGene Viewer COMMENT The GenBank record was corrected by inserting a G at position 4743. FEATURES Location/Qualifiers

重组表达质粒的构建——原核表达载体选择

重组表达质粒的构建——原核表达载体选择质粒载体是重组蛋白表达的关键工具，其结构如下图。重组蛋白表达，我们首先要将基因插入到表达载体上，插入的位置为多克隆位点。质粒载体上有很多的功能元件，这些元件对于蛋白的表达都是至关重要的。尽管我们经过系统的分析和预测，但是仍有很多蛋白不能顺利表达、表达量很低或者表达状态不好。这个时候我们需要尝试构建不同的表达载体以期得到最好的效果，这些载体的主要区别是启动子和融合标签的差异。蛋白表达优化主要工作也就是尝试构建不同融合表达标签，使用不同的宿主表达菌，测试不同的表达条件，筛选出最优表达体系。常用的融合标签有GST、MBP、Trx、6His、SUMO等，这些标签主要功能是促表达、促可溶、信号标记或助纯化。福因德生物可以提供以下系列载体以供科研表达研究。 1）促表达/促溶标签 2）信标标签

3）纯化标签我们选择表达载体的时候不但要考虑蛋白怎么表达成功，更要考虑蛋白怎么纯化出来，纯化的问题主要是考虑纯化标签和酶切位点的选择，下表我们列举了常见的纯化标签和酶切位点。 4）酶切位点以上为原核表达常用的标签和酶切位点,其性质也都作了简要的介绍，各专业网站或专业书籍已对此做详尽解释，科研工作者可根据具体实验设计方案，组合设计以上标签和酶切位点的使用。特别值得注意的是，选用和设计蛋白酶切位点的时候首要考虑的是序列内部有没有蛋白酶位点，同时要考虑酶切的效率和蛋白酶试剂成本。一般商业化载体，在标签蛋白与载体多克隆位点之间都设计有酶切位点。标签可设计在N-端也可在C-端,设计在N-端的优势是,可通过标签高效翻译起始位点带动插入蛋白的表达,可溶性标签的高效表达更可促进蛋白的可溶性表达;同时,大部分的蛋白内切酶的切割位点在C-端,所以标签设计在N-端可将标签切割完全。在设计标签序列与酶切位点的时候还要考虑N-端稳定性原则，也就是所谓宿主细胞的N-端规则（N-end rule）,这个要避免；同时，还应该检查是否引入了可与别的蛋白相互作用的序列或者蛋白酶切位点。

原核表达载体的重要调控元件

原核表达载体的重要调控元件启动子启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5～10 bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10区。来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp处，有一段由10 bp组成的区域，称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s 亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA链。原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lP L (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。（1）Lac启动子：它来自大肠杆菌的乳糖操纵子，是DNA分子上一段有方向的核苷酸序列，由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的基因结构所组成。Lac启动子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控。正调控通过CAP(catabolite gene activation protein)因子和cAMP 来激活启动子，促使转录进行。负调控则是由调节基因产生LacZ阻遏蛋白，该阻遏蛋白能与操纵基因结合阻止转录。乳糖及某些类似物如IPTG可与阻遏蛋白形成复合物，使其构型改变，不能与O基因结合，从而解除这种阻遏，诱导转录发生。（2）trp启动子：它来自大肠杆菌的色氨酸操纵子，其阻遏蛋白必须与色氨酸结合才有活性。当缺乏色氨酸时，该启动子开始转录。当色氨酸较丰富时，则停止转录。b-吲哚丙烯酸可竞争性抑制色氨酸与阻遏蛋白的结合，解除阻遏蛋白的活性，促使trp启动子转录。（3）Tac启动子：Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和trp都强。其中Tac 1是由Trp启动子的－35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow 盒)和Lac操纵基因构成，Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac启动子的-10区，加上Lac 操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成。Tac启动子受IPTG的诱导。

克隆载体表达载体构建详细版

一、稀释引物 1、4℃，15min、13000转离心（先等离心机降温） 2、根据OD值加DD水。 3、静置30min（冰上） 4、准备1.5毫升EP管，并加90ulDD水。 5、向EP管中加10ul引物，震荡离心，-20℃保存。二、跑MIX检测引物（20ul体系）、上引物0.8ul 下引物0.8ul Mix 10ul DNA（日本晴）1ul DD水7.4ul 三跑高保真酶（50ul体系） DNAorCDNA 2ul 上引物2ul 下引物2ul 5*buffer 10ul dNTPs 5ul DD水28ul Pfu（最后加）1ul 四胶回收流程 1、在紫外线下切胶，用牙签装入2ml的EP管中。 2、按量加XP2，放在55℃水浴锅中10min，每2min摇匀1次，涡旋，短离。 3、将液体冷却到室温，转移到平衡住中，离心10000转，1min30s，倒掉滤液。 4、加入xp2 300ul，离心10000r，1min30s，倒掉滤液。 5、加入spw700ul，离心10000r，1min，倒掉滤液（重复一次） 6、空转2min，13000r，之后换1.5mlEP管。 7、套上保鲜膜放入37℃烘箱中，30min。 8、加入DD水10ul，静置2min，离心2min，13000r，重复3次，-20℃保存。五、胶回收产物检测（10ul）体系上引物0.4ul 下引物0.4ul Mix 5ul 回收产物1ul DD水 3.2ul 六、构建blunt cloning 载体（克隆载体）（4ul 体系）胶回收产物 3.5ul Blunt cloning 0.5ul 混匀后，PCR：25℃15min 盖子温度50℃

原核表达步骤

Chi l 原核表达基本试验步骤将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测，其中包括：一、试剂准备（1）LB培养基。（2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O

中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。 CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。二、操作步骤（一）获得目的基因 1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。 2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。（二）构建重组表达载体 1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。 2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。我们用Soultion I连接。（三）获得含重组表达质粒的表达菌种 1、将连接产物转化大肠杆菌BL21，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。 2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。 3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

真核细胞常见表达载体

真核细胞常见表达载体真核细胞, 表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo 基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin 抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。 5、CMV4 表达载体特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。其他常用克隆Vector： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug 说明: pBluescript II kS、pUC18 &Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA片段扦入，转化lacZ基因缺乏细胞，并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时，含有外源DNA载体的细胞将

想和大家讨论讨论原核表达载体

【建议】想和大家讨论讨论原核表达载体原核表达载体，如pet系列，型号从小到大，那么多，往往让新手选择起来不知所措。所以希望和大家讨论讨论到底他们是怎么演变的，每个的优缺点，是不是号越大的就越好等新手们往往困惑不已的问题。希望下面的讨论分系列进行，如pet系列、pgex系列等这篇文章是我从网上找的关于pet载体的介绍，只要你耐心的看完，相信能有个基本的了解关于pet载体及应用。更详细的内容请高手进行补充 pET，原核表达金标准（转） pET 载体中，目标基因克隆到T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供T7 RNA 聚合酶来诱导表达。Novagen 的pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括36 种载体类型、15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。优点 ·是原核蛋白表达引用最多的系统 ·在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低 ·真正的调节表达水平的“变阻器”控制 ·提供各种不同融合标签和表达系统配置 ·可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌 ·许多载体以LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆PCR 产物 ·许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化阳性pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。 pET 系统概述 pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由Studier 等开发的T7 启动子驱动系统，Novagen 的pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。控制基础表达水平 pET 系统提供6 种载体- 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。宿主菌株质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（λ DE3 溶原菌）中表达目标蛋白。在λ DE3 溶原菌中，T7 RNA 聚合酶基因由lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有pLysS 和pLyE 时调控会更严紧。pLys 质粒编码T7 溶菌酶，

植物表达载体 Pcambia1302 序列图谱

载体质粒图谱和多克隆位点信息载体简介载体序列 LOCUS AF234298 10549 bp DNA circular SYN 24-APR-2000 DEFINITION Binary vector pCAMBIA-1302, complete sequence. ACCESSION AF234298 VERSION AF234298.1 GI:7638073

KEYWORDS . SOURCE Binary vector pCAMBIA-1302 ORGANISM Binary vector pCAMBIA-1302 other sequences; artificial sequences; vectors. REFERENCE 1 (sites) AUTHORS Hajdukiewicz,P., Svab,Z. and Maliga,P. TITLE The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation JOURNAL Plant Mol. Biol. 25 (6), 989-994 (1994) PUBMED 7919218 REFERENCE 2 (bases 1 to 10549) AUTHORS Roberts,C., Rajagopal,S., Smith,L.M., Nguyen,T.A., Yang,W., Nugrohu,S., Ravi,K.S., Vijayachandra,K., Harcourt,R.L., Dransfield,L., Desamero,N., Slamet,I., Hadjukiewicz,P., Svab,Z., Maliga,P., Mayer,J.E., Keese,P.K., Kilian,A. and Jefferson,R.A. TITLE A comprehensive set of modular vectors for advanced manipulations and efficient transformation of plants JOURNAL Unpublished REMARK Full description of constructs REFERENCE 3 (bases 1 to 10549) AUTHORS Roberts,C., Rajagopal,S., Smith,L.M., Nguyen,T.A., Yang,W., Nugrohu,S., Ravi,K.S., Vijayachandra,K., Harcourt,R.L., Dransfield,L., Desamero,N., Slamet,I., Hadjukiewicz,P., Svab,Z., Maliga,P., Mayer,J.E., Keese,P.K., Kilian,A. and Jefferson,R.A. TITLE Direct Submission

各种表达载体

表达载体一、原核细胞表达载体 1. pBAD载体: 特点; 该表达质粒含有araBAD(arabinose)操纵子的P BAD启动子和编码该启动子的正负调控子基因araC，具有紧密调控功能和高水平表达外源蛋白质的原核细胞表达载体。请注意: 1. 当要扦入其他信号肽片段，改建此载体时，请不要利用该载体上的Nde1 EcoR1 BamH1 Kpn1和 Pst1位点，以免造成重组困难，因为前述内切酶在此载体上均有二个位点，最好使用只有一个酶切位点的Sac1和Hind111位点。同时记住，如在不含任何信号肽的P BAD表达质粒扦入信号肽，其非编码N- 末端要包含核糖体结合位点(RBS)核苷酸序列。 2在使用含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒时，请应用Omp A分泌信号肽上的Sac1以及载体Hind111酶切位点，这些在载体序列上都是单个酶切位点。本公司目前有含Omp A分泌信号肽和不含任何信号肽的二种P BAD表达质粒，其多克隆位点区域图谱如下: (a)、含Omp A分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域 SD P BAD….TACCCGTTTTTTT CC….GCTAGCAGGAGGAAACG ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA CTG GCT GGT A M A E L TTC GCT ACC GTA GCC ATG GCC GAG CTC GGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTT Nco1 Sac1 Kpn1 Smal1 BamH1 (b)、不含分泌信号肽的P BAD表达质粒多克隆区域 Pst1 P BAD GCTAGCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGCCTGCAGGCATCCAAGCTT Nde1 Sac1 Smal 1 Hind111 下图显示本公司应用pBAD表达载体完成的实验结果: pBAD载体驱动大分子蛋白质在原核细胞 Origami(DE3)内高效表达 2. pCAl-n & pCAl-pelB载体特点: 该原核细胞表达载体是来源于以T7 RNA聚合酶为基础的pET载体，含有T7/LacO启动子、编码钙调素结合多肽标鉴和凝血酶切点的核苷酸序列。因此，该表达载体在E.coli BL21(DE3)或BL21(DE3)pLysS宿主菌中能高水平表达外源蛋白质、且这种表达的外源蛋白质因带有钙调素结合多肽和凝血酶切点，故该蛋白产物易于纯化和产业化。此外，本公司利用分泌信号肽PelB，构建成新型的的原核细胞表达载体Pcal-PelB。此载体表达的蛋白产物能在分泌肽PelB的指引下进入细胞周质。

几种新型植物基因表达载体的构建方法

几种新型植物基因表达载体的构建方法摘要:利用基因工程技术手段研究基因功能过程中，构建基因表达载体处于转基因植物的主导地位，采用合适的构建方法会使实验效果事半功倍。植物基因表达载体的构建方法除了传统构建法、Gateway 技术、三段T-DNA 法、一步克隆法等，还有近年来出现的几种新型的载体构建方法：基于竞争性连接原理快速构建小片段基因表达载体；Micro RNA 前体PCR 置换法适用于构建小分子RNA 表达载体；重组融合PCR 法特别适用于插入片段中含有较多限制性酶切位点的载体构建；利用In-Fusion 试剂盒可以将任何目的片段插入一个线性化载体的某个区域；构建多片段复杂载体可采用不依赖序列和连接的克隆方法(Sequence and ligation-independent cloning, SLIC) 法；Gibson 等温拼接法。本文将在总结分析前人工作的基础上，分析这6种新方法的特点，期望通过这几种新的方法给植物基因工程表达载体的构建提供新的思路。关键词: Micro RNA 前体PCR 置换法，In-Fusion 试剂盒法，重组融合PCR 法，Gibson 等温拼接法，Golden Gate 拼接法基因克隆、载体构建是植物功能基因组研究中的常规步骤[ 1 ]。而载体构建是基因工程和分子生物学研究中常用的基础技术。随着植物基因工程技术的发展，适合于不同研究目的各种载体系统应运而生，其中在转基因植物中最常用的是质粒载体。传统的载体构建方法在进行构建多片段拼接的复杂载体时，需要精心选择酶切位点[ 2 ]，有时还需要构建多个中间载体，操作比较麻烦，费时费力，因此寻找简单、高效、快捷的载体构建方法具有重要的现实意义。从1969 年Arber 等发现了限制性内切酶，载体的构建方法逐步发展，从传统构建方法到

基因表达载体和重组质粒的区别

载体，质粒，基因表达载体3者有何不同？载体是一种运输工具，细胞膜上的蛋白质也是一种载体，其识别很单一，也因此有了选择透过性。质粒是一种小型环状DNA，广泛存在于微生物中，一般的基因工程中，质粒被用来当做目的基因的运载体，也是一种运输工具。基因表达载体是目的基因和运载体连接后的产物。基因表达载体和重组质粒的区别基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体，首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端（部分限制性内切酶可切割出平末端，拥有相同效果）。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，首先碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键，再加入适量DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA分子。这个重组的DNA分子也叫重组质粒。就是这样。简单的说，重组质粒是基因表达载体的一种。生物学上marker是什么意思从文字上说，标记（Marker），染色体上一个可以被识别的区域（比如限制性内切酶的酶切点，基因的位置等）。标记的遗传能够被检测出来。标记可以是染色体上有表达功能的部分（比如基因），也可以是没有编码蛋白质功能但遗传特性能够被检测出来的部分从实验上说，marker有两种，一种是基因marker，一种是蛋白质marker。两种marker分别是进行琼脂糖凝胶电泳和SDS-PAGE（蛋白质电泳）所用的标准参照物，用以指示目的基因或者蛋白的大小。一般常称呼的marker都是指基因marker，即DNA marker DNA Marker 作为一种分子标记(Marker)，构建分子图谱。分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。 DNA Marker 是分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA 分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。现在常用的DNA MARKER有两种，一种是病毒等DNA经过酶切获得的，分子量大小有零有整，另外一种是固定数值的，比如100BP，200BP等。两种MARKER都不难制作，对于第一种，稍微难一些，主要是要获得病毒等大的基因组片段，然后用适当的酶切，切割完全以后，就能得到相应的图谱。第二中实际上很简单，如果你手头有任何一个载体，而且它的序列完全清楚，那么可以采用PCR的方法获得一系列大小不同的片段，比如上游引物可以使用一个，然后用数数的方法确定下游100BP处的下游引物，扩增出的就是100BP的片段，200BP处的引物就是200BP的片段，依此类推，可以获得一系列不同大小的片段，扩增后，把它们放到一起，就获得了自制的MARKER了

原核表达步骤

pCambia35s-ECFP植物表达载体

pCambia35s--‐ECFP 编号载体名称北京华越洋生物VECT1010 pCambia35s--‐ECFP pCambia35s--‐ECFP载体基本信息出品公司: --‐--‐ 载体名称: pcambia35s--‐ECFP 质粒类型: 植物双元表达载体高拷贝/低拷贝: --‐--‐ 启动子: --‐--‐ 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: --‐--‐ 5' 测序引物及序列: --‐--‐ 3' 测序引物及序列: --‐--‐ 载体标签: ECFP 载体抗性: --‐--‐ 筛选标记: --‐--‐ 备注: --‐--‐ 产品目录号: --‐--‐ 稳定性: --‐--‐ 组成型: --‐--‐ 病毒/非病毒: --‐--‐ 其他植物载体质粒： pBI101 pDF15 pBI121 pEarleyGate 100 pBI221 pEarleyGate 101 pBI221--‐GFP pEarleyGate 102 pBin19 pEarleyGate 103 pBINPLUS pEarleyGate 104 pCambia0105.1R pEarleyGate 201 pCambia0305.1 pEarleyGate 202 pCambia0305.2 pEarleyGate 203 pCambia0380 pEarleyGate 204 pCambia0390 pEarleyGate 205 pCambia1105.1 pEarleyGate 301 pCambia1105.1R pEarleyGate 302 pCambia1200 pEarleyGate 303 pCambia1201 pEarleyGate 304 pCambia1281Z pFGC5941 pCambia1291Z pGA643 pCambia1300 pGreen

真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体

真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体标签：真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统摘要: 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是： ①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制; ②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及; ③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。 1.酵母表达系统最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母，后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Candida Bodini，Pichia Pastris3种。以Pichia Pastoris应用最多。

为什么要先构建克隆载体再用表达载体

为什么要先构建克隆载体再用表达载体构建克隆载体是大量扩增DNA片段，用以测序、酶切和改造等对DNA实施的后续操作，构建表达载体是大量得到翻译产物——蛋白质。为什么要先构建克隆载体，再用表达载体，我猜是因为： ①得到大量的DNA，虽然PCR也可以，但PCR扩增有出错率、但你每做一次常规的PCR，而且每次都要重新提DNA和RNA才行，而且，PCR反应的试剂盒又不便宜，用PCR来制备大量DNA有点得不偿失。尽管构建克隆载体也存在操作复杂（相对于PCR），成功率不是极高，而且还要筛选，但一旦你重组成功并转入了大肠杆菌，你就可以保存了，你想什么时候用，摇个菌，就可以制备到大量的DNA。 ②测序需要。你想转表达，你首先得确定你扩增的目的片段是不是你要的，不要以为你设计了个特异性引物，然后跟你mark的长度就可以确定了，这也只是推测，在科学上不严谨。扩增出的基因片段保险起见或者经费允许，要拿去测序，而一般送测的序列都是构建到载体上的序列，克隆载体上一般也都带有测序引物，已确定这就是你要的那条序列。你要写论文必须要给人真凭实据。先构建克隆载体再构建表达载体并不是一个必须的选择，如果你的扩增PCR目的条带很亮，而且单一性很好，我建议你可以直接克隆进入表达载体。很多人选择先构建克隆载体，是因为在扩增基因时目的条带模糊，特异性不好，这样将基因连接到克隆载体上就可以便于挑去单克隆进行测序，增加测序的准确度，从而确认自己克隆基因序列的正确性。单纯的PCR产物往往是一些各种PCR片段的混合物，直接送过去测序，往往导致测序信号峰很杂，有时候并不能测出想要的信号序列。同时保存的PCR片段比较容易降解，而构建好克隆载体后形成的质粒是很容易扩增和保存的。先构建克隆载体，一是为了便于测序，确认克隆序列正确，二是为了便于基因PCR片段的保存。怎么构建克隆载体和表达载体？首先根据你的实验需要选择相应的载体。其次分析你的基因序列以及载体序列上的酶切位点，切记在载体上所选择的酶切位点要和你