痢疾杆菌的分离与鉴定课件
痢疾杆菌的分离与鉴定
濮阳市疾病预防控制中心
许银怀
第一节概述
志贺菌属（Shigellae）细菌又称痢疾杆菌，引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。
1899年由日本人志贺首先发现。
全球每年感染人次约为1.65亿，死亡110万，发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。
发展中国家发病率较高，如阿根廷990.6／10万、印度972.3／10万；发达国家相对较低，如美国6～12／10万、德国2.7／10万、法国0.3／10万；我国上世纪50～80年代发病率在46.37～1018.93／10万之间。
近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位，但在卫生状况不良的地区，发病率仍居高不下。
人群对细菌性痢疾普遍易感，各年龄组均可受到感染，5岁以下儿童发病率最高。
据估计，在临床就诊的腹泻病人中的5%～15%是志贺菌引起的，而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。
发展中国家福氏志贺菌最常见，发达国家以宋内志贺菌为主。美国
宋内志贺菌>75%，但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。
鲍氏志贺菌最先在印度发现，除印度次大陆地区较为常见外，其它地区较为少见。
细菌性痢疾发病有明显的季节性，发病高峰为夏秋季，通常在7～9月份。
细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容：
细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据；
缺乏快速、简便的病原学诊断方法，细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍；
志贺菌耐药性谱的不断扩大，细菌性痢疾抗菌治疗难度加大；
洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化；
目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。
第二节病原学
一、抗原分类
志贺菌属细菌有菌体（O）抗原，某些新分离菌株有表面（K）抗原。
(一) 菌体（O）抗原
1.型特异性抗原：多糖，光滑型菌株主要抗原；分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。
2.群特异性抗原：光滑型菌株次要抗原，主要存在于B群，籍此将菌型分
为多种亚型。
(二)表面(K)抗原
常在新分离的A、C、D群各血清型及B群的2a型、6型细菌中出现。
K抗原存在时，可阻止菌体抗原与相应免疫血清发生凝集；需经100℃30分钟加热破坏后露出菌体抗原，与相应的免疫血清发生凝集。
二、血清分群
(一)A群(志贺痢疾杆菌):有12个血清型;具有K抗原菌株可阻碍O抗原的
凝集;在我国常见的为2型(又称司密斯杆菌)，1型较少见，其余各型更为罕见。
(二)B群（福氏痢疾杆菌）
具有型、群抗原；型抗原存在于同型菌株中；群抗原有多种，存在于B群各菌型中。
近年1C（I:7）、2b（Ⅱ:3,4;7）、3c（Ⅲ:6）、4c（Ⅳ:7,8）及4型（Ⅳ:-）等新型菌株出现。
目前有6个血清型，（14个亚型及2个变种)。
(三)C群(鲍氏痢疾杆菌):18个血清型。
(四)D群(宋内痢疾杆菌):仅一个血清型(Ⅰ、Ⅱ相);Ⅰ相(光滑型菌落)多从急性期感染病人标本中分离;Ⅱ相亦称R型(粗糙型菌落)常从慢性患者或带菌者检出。
三、属间抗原关系
志贺菌属与埃希菌属的O抗原关系非常密切，有近半数的菌型与大肠埃希氏菌的某些O抗原完全相同；相同抗原菌属间存在血清交叉凝集反应。
表1 志贺菌属与大肠埃希菌的O抗原关系
四、菌群分布与变迁
菌群分布与变迁因国家、地区、年份不同而异。
40年代前A群是优势流行菌,60年代初几乎销声匿迹，但1969-1970年突然在中美地区暴发，1972-1978年又在南亚的孟加拉国连年发生流行，继之印度、斯里兰卡、马尔代夫、尼泊尔、不丹、缅甸、泰国等地区和国家受到侵袭。
D群从60年代起在许多工业发达国家跃居首位。
国内过去流行菌型为2a为主;近年来4、4c、5b、1a等菌型呈上升趋势；城市D群为上升态势。
我国个别地区发现A1型和C18型局部暴发流行。
五、溶原性
噬菌体对相应的细菌具有特异性裂解作用,温和噬菌体DNA侵入宿主细胞后，整合于宿主细胞的染色体DNA上，称为前噬菌体；
前噬菌体与宿主细胞的染色体同时复制，这个过程称为溶原化；
被感染的细菌称为溶原性细菌。
溶原性细菌对于相同的噬菌体具有免疫力，并获得一些新的性状，称为溶原性转换。
该转换可导致福氏志贺菌型抗原和群抗原发生广泛的变异。
六、变异性
(一) S-R变异
志贺菌属菌落可由光滑型变异成为粗糙型(S-R变异)，并常伴有生化反应、抗原构造和致病性的变异。
在慢性痢疾病人或恢复期病人体内，菌株可变异成为不典型菌株。
部分变异菌株可通过10％的胆汁肉汤培养发生返祖，成为典型菌株。
因而在分离这类细菌时注意要反复多次地检查。
(二) 抗原变异(溶原性转换)
根据溶原性转换变种和细胞壁多糖免疫化学分析,福氏志贺菌除6型菌外其它型、亚型以及变种都是由一个种所产生的许多溶原性的变种。
y变种是非溶原性的前体型，当被六种不同的噬菌体溶原化后，可以变为各型福氏菌的a亚型或x变种，这是第一次溶原化；
一次溶原化的培养物，还可以发生第二次溶原化，变为各型福氏菌的b亚型。
福氏型特异性抗原Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ和群7,8抗原，均以y变种群3,4抗原多糖为前体型，经温和噬菌体溶原性转换而来。
噬菌体(Φ)7,8溶原化的结果是使群7,8抗原变为x变种，同时群3,4抗原成为隐蔽状态；
前体型经ΦⅡ、ΦⅤ、ΦⅠ、ΦⅣ溶原化结果，则是相应型抗原的产生，分别变为2a、5a、1a、4a等型。其中x变种、2a型和5a 型还可以经第二次的溶原化，变为2b型和5b型。
群6抗原是群4抗原乙酰化（ΦⅢ,6溶原性转换）所致；型Ⅲ抗原为群3,4复合抗原乙酰化的结果。福氏1a型和4a型的群4抗原乙酰化后出现群6抗原，变为1b型和4b型，但此时型Ⅲ抗原成为隐蔽状态,仅当型抗原Ⅰ、Ⅳ消失时显现。
宋内志贺菌Ⅰ相抗原受控于一个140Mda大质粒，若质粒丢失，Ⅰ相抗原不能合成，菌则从Ⅰ相转变为Ⅱ相。
(三) 毒力变异
志贺菌的2型肠毒素（ShET-2）、粘附性、侵袭力、胞内繁殖、细胞间扩散等活性编码基因均存在于一个140Mda的质粒上，其表达受染色体上多个基因的调控。该调控基因的变异或大质粒的丢失，均可造成毒菌株的毒力减弱或消失。
七、致病性
(一)侵袭力：菌毛-有利于菌粘附至肠粘膜
(二)毒素：↗通透性增加
内毒素→局部→作用于肠壁
↘↘粘膜炎症、溃疡
全身→内毒素血症
外毒素（A群1型）→与内毒素协同作用
↘加重局部和全身症状 志贺菌具有抗酸性，能顺利通过胃酸屏障进入肠道，侵袭于结肠粘膜上皮细胞，引起炎症反应。
有研究表明最小感染剂量为10个CFU。
产生的SHET1肠毒素是染色体编码毒素，主要见于福氏志贺菌；
SHET2是质粒编码毒素，志贺菌和侵袭性大肠杆菌均能产生。
痢疾志贺菌可产生志贺毒素（ST），为染色体编码，由1个A亚单位和5个B亚单位构成，具有肠毒性、细胞毒性和神经毒性。
第三节实验室分离
一、标本的采集和运送
(一) 标本的采集
腹泻病人粪便标本：
监测点人员发现疑似病人和腹泻病人后，立即发给病人洁净塑料袋，要求其接取自然排出的可疑粪便部分立即送检；
婴幼、儿童则让其父母协助其坐排于罩有干净塑料袋的痰盂内(要求勿混入尿液)。
用2个棉拭子分别在大便中可疑部分多点蘸取并旋转棉拭子使全部蘸满大便（约1-2克）。
将绵拭子插入装有Cary-Blair运送培养基的采样管中(注意培养基应埋住粪便拭子)，手接触的棉签尾部在管口处折断丢弃。
编号后将采样管置4℃冰箱或冷藏包中保存。
认真填写腹泻病人粪便采样表。
监测点/村医需配备和更换的监测材料:
腹泻病人粪便采样登记表。
消毒棉签。
装有Cary-Blair运送培养基的采样管(4℃保存可备用半年)。
采便塑料袋。
冷藏包(应每日更换冰排) 。
(二) 标本的运送
采集标本后应立即通知监测点运送标本人员，或每天分中午、下午两次送交实验室。
如当天晚上采集，最长保存时间最好是48小时内。
二、实验室分离技术
(一)选择分离培养基
直接划线分离于麦康凯（MAC）及木糖赖氨酸去氧胆酸钠(XLD)，也可选志贺-沙门菌琼脂(SS) 、去氧胆酸钠硫化氢乳糖琼脂(DHL)、去氧胆酸钠柠檬酸盐琼脂(DCA)或海克顿肠道琼脂(HE)。
但慎用SS，其可抑制志贺菌1型生长常造成漏检。
表2.志贺菌及大肠菌在选择培养基上菌落生长特征
木糖赖氨酸去氧胆酸钠琼脂（XLD)：木糖；赖氨酸5g；乳糖7.5g；蔗糖
7.5g；去氧胆酸钠2.5g；硫代硫酸钠6.8g；柠檬酸铁铵；酚红。
去氧胆酸钠柠檬酸盐琼脂（DCA）:乳糖10g；去氧胆酸钠1g；柠檬酸铁1g；中性红0.03g。
(二)病原分离
用接种环多点沾取粪便标本中可疑部分,或用采样拭子涂种，直接划线分离选择琼脂平板各一块（见示意图4）；
36℃培养18～24小时。如无菌生长或接种过密应重新分离平板（可取菌苔处）（合格的分离平板菌落数>150个）。
图4 采样拭子接种平板及划线分离方法示意图
(三) 菌落生长特性
志贺菌属是需氧或兼性厌氧杆菌。
经37℃培养18～24小时，形成圆形、稍凸起、边缘整齐、表面光滑、湿润、无色、半透明、直径约2mm的较小菌落；
相对宋内菌的生长菌落较大、扁平，较不透明，易出现粗糙型菌落。
志贺痢疾杆菌1型的营养需求比较高，必须补给15种氨基酸方能生长。
(四) 生化初筛
1.可疑菌落的观察和挑选：
许多细菌在选择性培养基上被抑制，既不发育也未死亡，有的能长出肉眼看不见的小菌落。
因而在观察、挑取可疑菌落时应用接种针挑取菌落中心，避免接触培养基表面以造成污染。
2.接种生化反应管：
从选择培养平板上挑取可疑菌落3-5个，用接种针挑取菌落中心，分别接种KIA和MIU；
先接种KIA(将接种针在其斜面上划直线，随之插入底层,取出后再在斜面上划密集的横线)，不经火焰直接穿刺接种MIU培养基；
置36℃±1℃培养16～20小时后观察结果。
3.生化反应鉴别：
KIA：斜面－黄(分解乳糖产酸)／红(不分解乳糖)；
底部－红(产碱,非发酵菌)／黄(分解葡萄糖或乳糖)／产气／产H2S； MIU：动力(M)－沿接种线周围向外扩散生长呈现混浊者为阳性(用未接种MIU管对比观察)。
吲哚(I)－培养基变红为阳性。
尿素(U)－加0.5mlKovac’s试剂，数分钟内表层试剂变深红色为阳性。
表3.用克氏双糖(KIA) 和动力-吲哚-尿素(MIU)生化反应
初步鉴别痢疾志贺菌与其它肠道菌
4.注意事项：
KIA管最好用棉花塞,若用螺旋帽或硅胶塞，将盖子拧松一些,使有足够的氧气促进反应;
MIU需用橡皮胶塞盖紧，因尿素酶反应需避开氧气。经4～6小时培养可先观察MIU管尿素酶反应，若为红色多为变形杆菌；再经36±1℃过夜培养后观察反应结果。
当KIA出现A／A反应时，应检查KIA管是否塞得过紧，若太紧应将塞子松一下后，放2-3小时再观察一次。
初筛中KIA底层不产气不一定分解葡萄糖不产气，应用带倒管的单糖管复核。
KIA斜面不产酸不一定是乳糖阴性，应用单糖管观察14天才能确定阴性或迟发酵。
ONPG(半乳糖苷酶)试验阳性是迅速判定乳糖迟发酵的可靠方法；乳糖阴性的菌株，除耶氏菌ONPG为阳性外，其余均为阴性。
若KIA斜面为黄色(酸性)，则不宜做氧化酶试验(因氧化酶可被酸性pH所抑制，出现假阴性反应),此种情况应将培养物转种至不含糖的培养基上,待生长后再做氧化酶试验。
有时MIU培养基表层呈红色，应检查穿刺线是否插到底，若已穿刺到底，培养基一半以上变红则判阳性。若穿刺到底仅表层变红，可能是细菌在有氧条件下分解蛋白胨产碱变色，暂不能判为阳性，应继续培养观察。
五、血清鉴定
用生化初筛符合志贺菌反应的KIA管斜面菌苔，做志贺菌玻片凝集血清凝集；
阳性者在营养琼脂平板上分纯，挑单个菌落穿刺保存到半固体保存管
详细记录试验结果并填写菌种登记表。
(一)方法与步骤：
1.挑取KIA生化反应符合痢疾菌的培养物，首先用四种多价血清做玻片凝集反应(4种多价包括：A群1、2型；B群和D群)。凝集者则用B群多价、D群和A1、A2、血清分别凝集，阳性者再选用相应的群多价或单价因子血清做凝集。若多价血清不凝集，可能为C群或A群的3～12型，应进行C群的四种多价和A群另三种多价血清做玻片凝集。
2.福氏多价血清凝集的菌株,可先用群3,4、6和7三种因子血清检查,根据因子血清凝集反应再依次选用可能的型因子血清做凝集。
3.最近几年出现的新的血清型抗原式，目前世界上并没有统一；分离较多的国家多沿用此抗原式。部分我们国家近年出现的。
4.若四种多价血清凝集,与相应的群血清均不凝集,且菌落较粗糙，应考虑宋内Ⅱ相(R相)菌。可用宋内菌Ⅱ相（粗糙型）血清做凝集反应。
5.每次均需要做盐水凝集对照试验；尤其当发现较脆或较粘稠的菌落时，盐水对照可排除自凝菌。
6.属于本地区未报道或极少见的志贺菌型，应慎重报告并送上一级实验室或国家级实验室复核确认。
(二) 特别处理：
①一般通过血清学试验，可鉴定到群、型或亚型，但遇到不典型志贺菌（与相应的血清不凝集或凝集不完全）时，可做如下处理： 取可疑菌划线接种于营养琼脂平板，36℃18小时培育后,挑取数个菌落做玻片凝集,如不凝继续传代，也可用琼脂斜面与肉汤替
换传代，一般经5～10代后，有些菌恢复其凝集力，否则可排
除志贺菌。
②有些新鲜分离的培养物(A、C、D群各血清型及B群的2a型、6型)生化符合志贺菌反应，但与志贺菌属诊断血清不发生凝集，应考虑可能存在K抗原而阻止分型血清与菌体O抗原发生凝集，处理方法如下：
取待检菌纯培养菌一满接种环于0.5～1ml生理盐水中制成浓厚菌液，置于100℃水浴中煮沸30分钟，冷至室温后再用诊断血
清进行玻片凝集。
(三) 交叉凝集反应：
1. A3与动力+/-、产气量少大肠菌存在交叉凝集；
2.F1、F1c、F4、F4b与动力+/-、产气量少的大肠菌存在交叉凝集；
3.F4a与深红沙雷菌存在交叉凝集；
4.F4c、x变种与蜂房哈夫尼亚菌属存在交叉凝集；
5. C17与克雷伯菌属存在交叉凝集；
6. 宋内I相菌株与类志贺邻单胞菌存在交叉凝集，注意用氧化酶试
验加以鉴别。
表6 福氏志贺菌型和亚型的型抗原和群抗原鉴别表
六、鉴别试验
虽然经血清学证实、初步生化鉴定符合可基本定为志贺菌,但因部分志贺菌型与EIEC部分血清型有密切的抗原关系，而且EIEC同样具有侵袭力(可使豚鼠角膜试验阳性),因此需做相关鉴别试验。
表7 志贺菌属与具有相关抗原的EIEC生化鉴别表
腐乳中乳酸菌的分离与鉴定_王夫杰
腐乳中乳酸菌的分离与鉴定 王夫杰1,鲁绯1*,渠岩2,张建1,黄持都1 (1.北京市食品酿造研究所,北京 100050;2.中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083) 摘要:文章主要对青方、白方和红方腐乳中的乳酸菌进行了分离鉴定。从青方和白方腐乳中分别分离到乳酸菌7株和5株,红方中没有分离到乳酸菌。鉴定结果表明,白方中4株为鼠李糖乳杆菌,1株清酒乳杆菌;青方中有1株为植物乳杆菌,1株干酪乳杆菌,3株鼠李糖乳杆菌,2株清酒乳杆菌。最后,对不同菌株的耐盐性和耐酒精性进行了测试。 关键词:腐乳;乳酸菌;分离;鉴定 中图分类号:T S264.25 文献标识码:B 文章编号:1000-9973(2010)07-0098-04 Separation an d identification of lactic acid bacteria isolated from Su fu WANG Fu jie1,LU Fei1*,QU Yan2,ZH ANG Jian1,H UANG Chi du1 (1.Beijing Foo d Brew ing Institute,Beijing100050,China; 2.Fo od Science and Nutr itional Engineering Co lleg e of China A gricultural U niv ersity,Beijing100083,China) Abstract:The lactic acid bacteria in gr ey Sufu、w hite Sufu and red Sufu w er e separated and identify. Seven str ains w ere isolated from gr ey Sufu,five strains w ere iso lated fr om w hite Sufu,no o ne w as i solated fr om red Sufu.The identification show ed that four str ains w ere Lactobacillus rhamnose and one w as Lactobacillus sake in white Sufu.In grey Sufu,three str ains w ere Lacto bacillus rham nose, tw o strains were Lactobacillus sake,the tw o other w ere Lactobacillus plantar um and Lactobacillus ca sei respectiv ely.At last,the salt and alco ho l tolerance of different strains w er e tested. Key words:Sufu;lactic acid bacteria;separ ation;identificatio n 乳酸菌的应用历史非常悠久,4000年前古人已有酸奶饮用的历史。随着现代微生物学的发展,食品级乳酸菌的优良特性已引起食品微生物界的关注,乳酸菌已广泛应用于乳制品、肉制品、果蔬制品、软饮料等食品。乳酸菌在酿造工业中的应用受到越来越多的关注。 腐乳是中国独创的调味品,在世界发酵食品中独树一帜,它既可单独食用,也可用来烹调风味独特的菜肴,被称为 中国奶酪 。商品腐乳中含有高水平的适度耐盐菌,其主导耐盐微生物是耐盐乳酸菌,它在腐乳的腌制和后酵过程中起着非常重要的作用,一定数量的乳酸菌在后酵过程中对腐乳风味物质的形成具有积极意义[1-5]。 乳酸菌是潜在地加快腐乳成熟和改进风味的协同菌株。研究表明,从特定食品中分离出的乳酸菌是该食品进行乳酸发酵的最佳出发菌株,因为它们比其它来源的乳酸菌具有更强的竞争力[6-8]。本文对青方、白方和红方腐乳中的乳酸菌进行了分离纯化和鉴定,旨在揭示腐乳中乳酸菌的群系分布特征,对腐乳发酵中风味乳酸菌的研究和开发提供依据,对乳酸菌应用于腐乳生产、改善腐乳风味的研究提供基础。 1 材料与方法 1.1 样品 收稿日期:2010-03-27 *通讯作者 基金项目:北京市优秀人才培养资助(20081D010*******);北京市自然科学基金(6093022)作者简介:王夫杰(1980-),女,硕士,研究方向为生物技术与发酵工程; 鲁绯,女,副教授,食品科学与工程博士。 98
双歧杆菌与乳酸菌筛选培养基
BBL培养基 双歧杆菌选择性培养基成份 蛋白胨15.0g 酵母粉2.0g 葡萄糖20.0g 可溶性淀粉0.5g 氯化钠5.0g 5%半胱氨酸10.0mL 西红柿浸出液400.0mL 吐温80 1.0mL 肝提取液80.0mL 琼脂20.0g 蒸馏水520.0mL pH7.0 MRS培养基 乳酸细菌培养基（MRS） 蛋白胨10.0 g 牛肉膏10.0 g 酵母膏 5.0 g 柠檬酸氢二铵[（NH4）2HC6H5O7] 2.0 g 葡萄糖(C6H12O6·H2O) 20.0 g 吐温80 1.0 mL 乙酸钠（CH3COONa·3H2O） 5.0 g 磷酸氢二钾（K2HPO4·3H2O） 2.0 g 硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.58 g 硫酸锰（MnSO4·H2O）0.25 g 琼脂18.0 g 蒸馏水 1 000 mL pH 6.2~6.6 当乳酸菌生长代谢出乳酸后，会使pH下降而使颜色由绿变为黄绿，也由于pH 值降低再加上抗生素及厌氧培养的作用，所以一般的微生物不容易在此培养基上生长，因此十分容易鉴别乳酸菌。 2005-03-10 08:08 消息引用收藏分享 奉上一篇实验，以供参考！ 厌氧菌的分离和培养 目前培养厌氧微生物的简便而又有效的技术包括有：厌氧箱培养技术；厌氧罐培养技术；厌氧袋培养技术；亨盖特厌氧滚管技术。这里介绍的是亨盖特厌氧滚管技术。
亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特（Hungate）于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趣完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一整套完整技术。而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。 亨盖特厌样滚管培养技术不仅可用于有益厌氧菌如双歧杆菌等的分离、与活菌培养计数，还可以用于有害***菌（如酪酸菌）或病原菌（如肉毒梭状芽孢杆菌）的分离与鉴定。 1材料 1.1 样品 双歧酸奶（液体）、双歧杆菌制剂（固体）。 1.2 培养基 改良MRS培养基，PTYG培养基。 1.3 仪器和器具 亨盖特厌氧滚管装置一套，厌氧管，厌氧瓶，滚管机，定量加样器。 2 流程 铜柱除氧→预还原培养基→稀释用液制备→稀释样品→滚管→培养→计数 3方法 3.1铜柱系统除氧 铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。此管的大小为40—400mm，两段被加工成漏斗装，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，一端连接出气管口。由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2和H2等通常都含有O2，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。此铜柱可以反复使用，并不断起到除氧的目的。当然H2源也可以由氢气发生器产生。 3.2 预还原培养基及稀释液的制备
硝化细菌的分离纯化
材料与方法 样品 检测用试剂 1、Griess 试剂 溶液I称取磺胺酸0.5g，溶于150mL醋酸溶液(30％)中，保存于棕色瓶中。 溶液II称取α-萘胺0.5g，加入50mL蒸馏水中，煮沸后，缓缓加入30％醋酸溶液150mL，保存于棕色瓶中。 格里斯试剂检验亚硝化菌方法：用滴管吸取2滴细菌培养液置于白瓷板上， 依次滴加格里斯试剂Ⅰ、Ⅱ各2滴，出现红色反应说明培养液中含有亚硝酸，有 亚硝酸细菌存在。 2、二苯胺-硫酸试剂（检测菌液中是否存在硝酸盐证明硝化细菌是否存在） 称取二苯胺1g，溶于20mL蒸馏水中，然后徐徐加入浓硫酸lOOmL，保存于棕色瓶中。 由于亚硝基、硝基均能与二苯胺试剂起蓝色显色反应，所以在测定硝基前，必须去除培养液中的亚硝基。采用尿素+浓硫酸去除亚硝基是简单有效的方法，硝化菌检验具体操作步骤：取细菌培养液lml移入干净试管中，向试管中放半药勺的尿素混匀，然后再向试管中滴加10滴浓硫酸，此时可以看到试管中有大量气泡生成，反应很强烈，不断振动试管，使反应充分进行直至没有气泡产生。然后取试管中液体两滴，置于白瓷板上，用格里斯试剂检验是否变红，如果颜色没有变化，再滴加二苯胺试剂，如果变蓝，说明有硝基产生，有硝化菌存在。培养基 1、LB（检验硝化细菌的纯度不生长表纯） 酵母粉 5g 蛋白胨 10g NaCl 10g 蒸馏水 1000ml 灭菌前pH=7.3 2、KM（检验硝化细菌的纯度不生长表纯） 酵母浸提物 0.5g 蛋白胨 0.5g 牛肉膏 0.5g 蒸馏水 1000ml 灭菌前pH=7.3 3、PDA（检验硝化细菌的纯度不生长表纯） 马铃薯(除皮) 200g 蔗糖(或葡萄糖) 20g 水 1000mL 灭菌前pH自然 硝化细菌培养基
中国部分地区人体粪便中双歧杆菌的分离鉴定及具潜在益生特性菌株的筛选
中国部分地区人体粪便中双歧杆菌的分离鉴定及具潜在益生特 性菌株的筛选 本研究采用选择性培养基对河南、四川、西藏、云南、内蒙古和新疆等地区的18份人体粪便样品中的双歧杆菌进行了分离纯化,并采用16S rRNA基因序列分析法对分离到的29株双歧杆菌进行了鉴定。以B.animalis subsp.Iactis V9为参照,通过耐酸性、人工消化液和胆盐耐受试验,筛选出胃肠道转运过程中耐受性较好的4株双歧杆菌。 并对筛选出的双歧杆菌进行了脱脂乳发酵特性和贮藏特性的研究。试验结果表明,从18位中国部分地区健康人体粪便中分离得到29株双歧杆菌,经16S rRNA 基因序列分析法将IMAUFB064、IMAUFB065和IMAUFB091等9株菌鉴定为B. longum,其中河南6株、四川2株和新疆1株；将IMAUFB071、IMAUFB073、IMAUFB084、IMAUFB090和IMAUFB092等20株菌鉴定为B.pseudocatenulatum,其中四川9株、西藏7株、云南3株和内蒙古1株。 29株双歧杆菌中有24株在pH3.0、3.5和4.0的改良MRS培养液中生长良好,初筛出的24株双歧杆菌分别经pH3.0、2.5、2.0人工胃液消化3h后,存活率高于V9(84.97%)的菌株有2株,分别为IMAUFB084(85.98%)和MAUFB073(85.66%),占总菌数的6.90%,各菌株在不同pH值人工胃液中耐受性有显著差异 (P<0.05),随着pH值的降低,供试菌株对模拟人工胃液的耐受性也随之降低。4株复筛出的双歧杆菌在人工肠液消化8h后,其中MAUFB090的存活率为101.8%,高于V9(97.84%),MAUFB073(97.19%)、IMAUFB084(94.38%)和IMAUFB064(89.93%)都低于V9的存活率。 4株双歧杆菌均能耐受2.0%胆盐浓度,但各菌株的延迟时间差异显著
大肠杆菌分离鉴定及药敏实验方案
鸡致病性大肠杆菌的分离培养及药敏实验 实验基本步骤：样品→肝、脾触片革兰氏染色镜检→普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板分离培养→革兰氏染色镜检、生化实验鉴定→普通肉汤培养基增殖培养→药敏实验。 1 病料采集 1.1 准备材料：试管、载玻片、手术刀、手术剪、结扎绳、记号笔、冰块、泡沫箱、口罩、手套（该灭菌的都进行高压蒸汽灭菌）、冰箱。 1.2 取材部位：血液、肝脏、脾脏、肠内容物，若有鸡胚感染则去鸡胚及卵黄物。 1.3 操作方法：将病死鸡浸泡在消毒剂溶液中，打开腹腔，无菌采集肝脏、脾脏放于事先准备好的灭菌试管内，将带有肠内容物的肠管两端结扎放于灭菌是试管内。将有明显病变的脏器入肝、脾进行触片，做好标记。都贴上标签，标示采集样品，来源地，采集时间，采集人。将装有病料的试管放在放有冰袋的泡沫箱中，及时返回实验室，置于4℃冰箱待检。 2 菌的分离培养及鉴定 2.1 准备材料：光学显微镜、革兰氏染色液、载玻片、手术刀、接种环、平皿、恒温箱、高压锅、摇床、酒精灯、葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖等微量生化发酵管，蛋白胨水（蛋白胨(或胰蛋白胨)20g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL pH7.4），葡萄糖蛋白胨水溶液（每100 mL蛋白胨水中加入葡萄糖1g）、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、VP指示剂、超净台。 培养基： A. 普通琼脂培养基（牛肉粉 3g、蛋白胨 10g、氯化钠 5g、琼脂 20g、蒸馏水1000ml，ph7.3±0.1）， B. 麦康凯琼脂培养基（蛋白胨20g、牛胆盐5g、氯化钠5g、琼脂15g，乳糖10g、结晶紫0.001g、中性红0.025g，ph7.2±0.2。）， C. 营养肉汤培养基（牛肉粉 3g、蛋白胨 10g、氯化钠 5g、蒸馏水1000ml，ph7.2±0.2）。 2．2 样品触片镜检 涂片镜检：取触片,进行革兰氏染色镜检。 2.2.1在玻片上滴加草酸铵结晶紫染色液，作用1min，水洗。 2.2.2 加革兰氏碘液于玻片上媒染，作用1min，水洗。
硝化细菌的分离与鉴定范文
硝化细菌的分离与鉴定 要筛选生长速度快、硝化作用强的硝化细菌用于水产养殖水处理。硝化细菌包括亚硝化 菌和硝化菌两个生理菌群，分别可将水中的氨态氮转化为亚硝酸盐和硝酸盐。实验结果 表明经5周培养，亚硝化菌可使培养液中的氨氮含量下降到60％，硝化菌可使培养液中的亚硝酸盐含量下降到60％。实验可通过测定培养液中亚硝酸盐的含量变化来测定细菌的氨转化作用或硝化作用。 关键词：硝化菌，亚硝化菌，硝化作用，筛选。 氨氮和亚硝酸盐都是在水产养殖过程中产生的有毒物质，且亚硝酸盐还是强烈的治癌物质，因此如何降解这两种物质，是科学工作者近年来的工作重点。 硝化细菌是一类具有硝化作用的化能自养菌，包括硝化菌和亚硝化菌两个生理菌群，其 主要特性是自养性，生长速率低，好氧性，依附性和产酸性等。可通过NH4+→NO2- → NO3-这一过程将NH4+转化为NO3-。能有效降低水体中氨氮及亚硝酸氮的含量，对水产养 殖业及环境保护具有重要意义。硝化细菌是生物硝化脱氨中起主要作用的微生物，直接 影响硝化效果和生物脱氨的效率。 研究表明，水体中硝化细菌的浓度对生物脱氨具有十分重要的意义，由于大多数硝化细 菌生长缓慢，硝化及脱氨效果欠佳，处理水产养殖污水的效果不是很好。因此筛选出生 长速率高硝化作用强度大的硝化细菌有很大的用途。 本文对硝化细菌的研究主要在富集培养和固定化细胞方面，能够有效提高硝化细菌的产 率和硝化细菌的利用率。通过富集培养的硝化细菌浓度是未经富集培养的12.5～20.0倍 ，利用细胞固定化技术可使氨氮去除率提高16.5个百分点。国外在硝化细菌的培养方面 的研究已有一些专利技术，其中一些已形成工业化生产，但产品价格较昂贵，并且必须 不断向反应器中补充流失的硝化细菌。硝化作用包括两个步骤：氨转化为亚硝酸盐和亚 硝酸盐转化为硝酸盐，这两个步骤分别由亚硝化菌和硝化菌完成，至今还未发现有能将 氨直接转化为硝酸盐的细菌。 氨和亚硝酸分别是亚硝化菌和硝化菌的唯一能源。对于硝化细菌来说生长环境中的温度 对其影响较大，pH值和盐度的影响相对较小。大多数硝化细菌的合适生长温度为10～38
乳酸菌菌种分离筛选方法
乳酸菌菌种的分离筛选方法 乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。 通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。 乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类 时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。 嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无 鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。 乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状， 一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。 乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。 培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。 乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常 添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。 一.筛选方法： 1.溶钙圈法： 利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。 其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸， 以维持培养基的PH。 筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养
实验方案(双歧杆菌的分离)
1 双歧杆菌的分离 1.1 样品 取出生后20天母乳喂养健康婴儿粪便。 1.2 培养基 根据目前的双歧杆菌选择性培养基，以及X-Gal在这方面的应用。选择使用NPNL培养基，在其基础上添加X-Gal。 1.2.1 缓冲蛋白胨水溶液（BP） 成份：蛋白胨10g 磷酸氢二钠2g 葡萄糖5g 磷酸二氢钾2g 氯化钠5g 蒸馏水1000ml 制法：精确称取各种试剂，加人到1000ml的蒸馏水中，加热溶化后分装于250ml的三角瓶中，每瓶90ml，121℃，杀菌15min后置4℃的冰箱中备用。 1.2.2 选择性改良NPNL培养基（苏世彦） 成份：酵母膏5g 淀粉0.5g 蛋白胨10g L-半胱氨酸0.5g 胰蛋白胨5g 溶液A 10ml 大豆蛋白胨5g 溶液B 5ml 葡萄糖10g 溶液C 50ml 乳糖3g 琼脂 15g 吐温80 1g pH 7.2 牛肝提取液150ml 制法：将各成分准确量取后，分别加热溶化，混合摇匀后分装，121℃杀菌10min，备用。 溶液A：K2HPO4 10g、KH2PO4 10g溶于蒸馏水100ml。 溶液B：FeSO4·7H2O 0.2g、MgSO4·7H2O 4g、MnSO4·4H2O 0.135g、NaCl 0.2g溶于蒸馏水100ml。 溶液C：丙酸钠30g、硫酸巴龙霉素400mg、硫酸新霉素200mg、NaCl 6g溶于蒸馏水1000ml。 1.2.3 NPNL培养基(孙雪) 培养基成分及用量：牛肉浸汁粉(oxoid)3g，蛋白胨10g，胰蛋白酶5g，
植胨3g，酵母浸出汁5g，肝浸出汁150ml，葡萄糖10g，可溶性淀粉0.5g，溶液A 10ml，溶液B 5ml，吐温80 1g，盐酸半胱氨酸0.5g，琼脂15g，蒸馏水815ml，X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D- 半乳糖苷)60mg。pH 7.2，121℃，15min 高压灭菌。 溶液A：K2HPO425g，KH2PO425g，蒸馏水250ml。 溶液B：MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，MnSO40.337g，蒸馏水250ml，硫酸新霉素100μg/ml，硫酸巴龙霉素200μg/ml，萘啶酮酸15μg/ml，氯化锂3mg/ml。 1.3 分离方法 取成年人的粪便1g，放人含有9ml缓冲蛋白胨水溶液中，用液枪充分混匀，制成1:10的稀释液，摇匀后取1ml注人含有9ml缓冲蛋白胨溶液中制成1:100的稀释液，在此基础上作10-3~10-9与的稀释，由于肠道中双歧杆菌的菌数一般在109左右，所以取10-4~10-9稀释液用倾注法倒平板，每个稀释液都各取1ml分别注人到两只无菌平皿中，每个稀释度重复3个平板。待培养基凝固后倒置，将温度调至37℃进行厌氧培养48h。用缓冲蛋白胨水溶液做稀释液可以有效地保护双歧杆菌的存活，避免受外界环境因素的影响。 1.4 分离培养 在加人样品稀释液的平皿中，分别注人适量冷却至50℃左右的选择性改良NPNL培养基，然后放人37℃的恒温培养箱中厌氧培养1.4.1 培养特性与镜检特性 双歧杆菌在改良NPNL培养基上，经过厌氧培养以后，菌落直径1-2cm，圆形、凸起，表面光滑，边缘整齐，乳白色，粘稠湿润。经革兰氏染色后镜检，双歧杆菌为革兰氏阳性无芽抱杆菌，呈多形性、典型的双歧杆菌为V字型或Y型；也有直、弯、棒状、匙形等多种形态，排列成单、双、短链、X、Y、V 或栅状；其大小为2-8×0.4-0.6μm，不具英膜和鞭毛，无运动性。 培养48h 后，平板上菌落呈现深蓝色、白色、浅蓝色三种颜色。
大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定方案
大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定方案 实验原理： 1、大肠杆菌的性质： 大肠杆菌是G--无芽孢直杆菌，在大多数培养基上表现出不同的特性。在麦康凯琼脂平板上是凸起光滑湿润的粉红菌落，革兰氏染色镜检为红色短杆菌。三糖铁琼脂上的反应为斜面和底部都变黄，产气，不产生硫化氢。生化特性为发酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖，不发酵蔗糖。MR试验，吲哚试验为阳性，VP试验为阴性，不产生H2S，不能利用枸椽酸盐。半固体中沿穿刺线向四周生长。 2、沙门氏杆菌的性质： 沙门氏杆菌是G-直杆菌。在麦康凯平板上为细小半透明、圆形、无色小菌落，三糖铁斜面下层变黄色，上层仍为红色，穿刺处为变黑产生H2S。能发酵葡萄糖产酸产气，能利用枸椽酸盐，不发酵乳糖不利用蔗糖肌醇，MR阳性，VP阴性，不产吲哚，不分解尿素。 实验材料： 含有大肠杆菌和沙门氏菌的猪肝脏、培养基（琼脂平板培养基、三糖铁琼脂斜面培养基、麦康凯琼脂、生化培养基、SC）、器械（剪刀、记号笔、接种环、酒精灯、显微镜、试管、玻片、培养皿）、药品（消毒酒精、结晶紫、碘液、酸酒精、品红、松柏油） 实验内容及操作程序： 一、培养基制备： 制备普通琼脂培养基、麦康凯平板、SC增菌培养基、生化培养基，制备方法见附1.二、标本制备： （1）取新鲜猪肝脏一小块，火焰表面消毒。 （2）用浸过消毒液的剪刀剪开一个小口于消过毒的猪肝脏。 （3）用接种环在剪开的肝脏小口沾取肝脏液，分别画线于麦康凯培养基和接种于SC中，37°C恒温培养24小时。 三、细菌分离培养： （1）取出培养了24小时的麦康凯平板。挑选麦康凯平板上的凸起光滑湿润的粉红菌落染色镜检，看是否为红色短杆菌，若是，即疑似为大肠杆菌，则取其接种于另一麦康凯平板，37°C 恒温培养24小时。 （2）取出培养了24小时的SC增菌培养基，染色镜检，看是否有疑似沙门氏菌，有则取其中细菌画线接种于麦康凯平板上，37°C恒温培养24小时。 四、细菌的鉴定纯化： （1）检查疑似大肠杆菌的培养基是否长满了粉红色菌落，染色镜检。并取其分别接种于生化培养基上（葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、肌醇、枸椽酸盐、尿素、MR、VP、H2S），并做穿刺实验于三糖铁上。37°C恒温培养24小时后观察结果。若实验结果满足预期效果，则可判定为大肠杆菌，则将其接种于普通琼脂培养基上传代培养。 （2）检查疑似沙门氏菌的平板上是否长满细菌，染色镜检，看是否满足于沙门氏菌的染色特性。并取其接种于生化培养基上，并作穿刺实验于三糖铁上，37°C恒温培养24小时后观察结果，若结果满足于沙门氏菌的生化特性，则可判定为沙门氏菌，则将其接种于普通琼脂培养基上传代培养。
痢疾杆菌分离与鉴定培训
痢疾杆菌的分离与鉴定 濮阳市疾病预防控制中心 许银怀 第一节概述 志贺菌属（Shigellae）细菌又称痢疾杆菌，引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。 1899年由日本人志贺首先发现。 全球每年感染人次约为1.65亿，死亡110万，发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。 发展中国家发病率较高，如阿根廷990.6／10万、印度972.3／10万；发达国家相对较低，如美国6～12／10万、德国2.7／10万、法国0.3／10万；我国上世纪50～80年代发病率在46.37～1018.93／10万之间。 近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位，但在卫生状况不良的地区，发病率仍居高不下。 人群对细菌性痢疾普遍易感，各年龄组均可受到感染，5岁以下儿童发病率最高。 据估计，在临床就诊的腹泻病人中的5%～15%是志贺菌引起的，而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。 发展中国家福氏志贺菌最常见，发达国家以宋内志贺菌为主。美国
宋内志贺菌>75%，但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。 鲍氏志贺菌最先在印度发现，除印度次大陆地区较为常见外，其它地区较为少见。 细菌性痢疾发病有明显的季节性，发病高峰为夏秋季，通常在7～9月份。 细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容： 细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据； 缺乏快速、简便的病原学诊断方法，细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍； 志贺菌耐药性谱的不断扩大，细菌性痢疾抗菌治疗难度加大； 洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化； 目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。 第二节病原学 一、抗原分类 志贺菌属细菌有菌体（O）抗原，某些新分离菌株有表面（K）抗原。 (一) 菌体（O）抗原 1.型特异性抗原：多糖，光滑型菌株主要抗原；分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。 2.群特异性抗原：光滑型菌株次要抗原，主要存在于B群，籍此将菌型分
乳酸菌的分离与初步鉴定
学院：漓江学院年级专业：09生物技术 组员：吴汉川200913007005 杨隆荷200913007006 李翠200913007007 王志远200913007008 乳酸菌的分离及初步鉴定 一、实验目的 1了解和掌握放线菌的菌种特性和分离方法 2初步掌握军中筛选方法设计 3掌握平菌种的选育 二、实验原理 乳酸菌是指以糖为原料，属于真细菌纲真细菌目中的乳酸细菌科。乳酸细菌科根据细胞呈球状或呈杆状，又分成乳酸杆菌族和链球菌族。 在BCG 牛乳培养基琼脂平板上，乳酸菌菌落大约1-3 mm，圆形隆起，表面光 的溶滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO 3 解圈。乳酸菌革兰氏染色呈阳性，涂片镜检细胞杆状或链球状。 乳酸杆菌呈杆状，成单杆、双杆或长丝状；乳酸杆菌，呈球状，成对或短链或长链状。乳酸菌革兰氏染色后呈蓝紫色。 平板涂布法平板涂布法是将样品经稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单个细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个但菌落代表原样品中的一个单细胞。 生理盐水：称取9g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到1000毫升。 四、实验器材与试剂 含乳酸菌的酸奶、结晶紫、卢哥氏碘液、95%乙醇、蕃红溶液、灭菌CaCO3粉末、NaCl； BCG牛乳培养基：(A)溶液：脱脂乳粉100g，水500mL，加入1.6%溴甲酚绿(B.C.G)乙醇溶液1mL，80℃灭菌20min。(B)溶液：酵母膏10g，水500mL，琼脂20g, pH6.8, 121℃湿热灭菌20min。以无菌操作趁热将(A)、(B)溶液混合均匀后倒平板。 1000ml烧瓶一个, 无菌培养皿9个, 500ml容量三角瓶2个，25ml无菌移液管1只，20ml无菌试管7只，1ml无菌移液管6只，培养基分装器一个，玻棒2根, 无菌涂布器3只，酒精灯一盏，接种环一个，天平，牛角匙，漏斗，漏斗架，载玻片，盖玻片，pH试纸若干，液体石蜡，棉塞，吸管，牛皮纸，线绳、标签等。 五、实验步骤 1.菌悬液的配制 取1洁净三角瓶，盛以225ml生理盐水；7只洁净试管，各盛9ml的生理盐水；加塞包扎于在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min，得到无菌生理盐水。
微生物学实验报告——双歧杆菌分离
微生物学实验报告 乳酸菌分离纯化——双歧杆菌的分离纯化 2012/6/5 实验目的：从酸奶等富含乳酸菌的物质中分离到具有活性的双歧杆菌并进行初步鉴定。 实验原理：双歧杆菌是动物体肠道内的正常优势生理细菌，革兰氏阳性，无芽孢，没有运动能力，最适生长温度37℃~41℃，专性厌氧。双歧杆菌的细胞呈现多样形态，有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、球形、长杆弯曲形、分枝或分叉形、棍棒状或匙形。单个或链状、V形、栅栏状排列，或聚集成星状。双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地(7)。 因为双歧杆菌是严格厌氧细菌，所以双歧杆菌的培养条件必须无氧，且培养基要具有低氧化还原电势。培养双歧杆菌最常用的方法是亨盖特厌氧滚管法(1, 5, 7)，此外还有厌氧箱法，厌氧袋法和厌氧罐法等。亨盖特厌氧滚管法是亨盖特（Hungate）于1950年发展起来的一套严格厌氧微生物的培养技术，主要原理是利用铜柱氧化除氧的滚管分离纯化法。亨盖特厌氧滚管法的优点是可以实时检查培养物，无氧效果好且花费不高，但需要专门的仪器和技术性很强的操作。本实验采用的简易厌氧罐法是一种操作简单且成本很低的方法，主要原理是利用焦性没食子酸除去厌氧罐内的氧气。该方法的缺点是焦性没食子酸与NaOH反应过程中会产生一定量的NO，可能不利于细菌的生长；此外，过量的NaOH 会将厌氧罐中的CO2一起除掉，而CO2对多数厌氧菌的生长有促进作用。另外，在同一个培养皿上接种好氧细菌（如大肠杆菌和枯草杆菌）能加强除氧的效果。 本实验所用的培养基参考了NPNL培养基(6)和BS培养基的配方，其中鱼粉、牛肉膏、酵母浸粉、胰蛋白胨的作用是提供氮源、维生素和生长因子，葡萄糖和乳糖为乳酸菌发酵提供糖类底物，磷酸氢二钾和磷酸二氢钾为酸碱缓冲剂，硫酸亚铁、硫酸锰为乳酸菌提供生长因子，氯化钠维持均衡的渗透压。如果在培养基中加入一定浓度的抗生素，比如硫酸卡那霉素（75μg/ml）、硫酸新霉素（30-200μg/ml）、硫酸巴龙霉素（20-200μg/ml）、萘啶酮酸（15或80μg/ml）、氧化锂（3mg/ml）、丙酸钠（10或15g/L）、山梨酸（0.4g/L）等，培养基就成为双歧杆菌的选择性培养基(7)。实验材料：蒙牛冠益乳（含bb-12双歧杆菌），伊利酸牛奶（ABLS益生菌），佳宝、光明原味酸牛奶，双歧杆菌乳酸菌三联活菌片（含长型双歧杆菌Bifidobacterium longum），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） 实验方法： 1.培养基 双歧杆菌琼脂培养基【蛋白胨（鱼粉）10.0g，牛肝浸粉5.0g，牛肉膏3.0g，酵母浸粉5.0g，胰蛋白胨8.0g，可溶性淀粉0.5g，磷酸氢二钾1.0g，磷酸二氢钾 1.0g，葡萄糖10.0g，乳糖3.0g，L-半胱氨酸0.5g，琼脂15g，吐温80 1g，溶液A （FeSO4·7H2O 0.2g，MgSO4·7H2O 4.0g，MnSO4·4H2O 0.135g，NaCl 0.2g 于100ml蒸馏水定容）10ml，蒸馏水定容至1L】 枯草芽孢杆菌LB琼脂培养基【胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，Nacl10g/L，琼脂粉15g/L】 2.简易厌氧罐法 将双歧杆菌琼脂培养基倒入培养皿中，待培养基冷却后，先用接种环取LB琼脂培养基上生长的枯草芽孢杆菌菌落接种在培养皿一侧，再于另一侧划线接种酸奶或三联活菌片的稀释液，按照每L容积1.0g 焦性没食子酸、10%NaOH溶液10ml加入厌氧罐后，立即以凡士林和胶带密封，置于37℃恒温培养2-3天。 图1. 实验中使用的简易厌氧罐
大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定方案
实验原理： 1、大肠杆菌的性质: 大肠杆菌是G无芽抱直杆菌，在大多数培养基上表现出不同的特性。在麦康凯琼脂平板上是凸起光滑湿润的粉红菌落，革兰氏染色镜检为红色短杆菌。三糖铁琼脂上的反应为斜面和底部都变黄，产气，不产生硫化氢。生化特性为发酵葡萄糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖，不发酵蔗糖。MR试验，口引噪试验为阳性，VP试验为阴性，不产生H 2S,不能利用xx酸盐。 半固体中沿穿刺线向四周生长。 2、沙门氏杆菌的性质： -沙门氏杆菌是G直杆菌。在麦康凯平板上为细小半透明、圆形、无色小菌落，三糖铁斜面下层变黄色，上层仍为红色，穿刺处为变黑产生H 2S。能发酵葡萄糖产酸产气，能利用枸椽酸盐，不发酵乳糖不利用蔗糖肌 醇，MR阳性，VP阴性，不产呵噪，不分解尿素。 实验材料： 含有大肠杆菌和沙门氏菌的猪肝脏、培养基（琼脂平板培养基、三糖铁琼脂斜面培养基、麦康凯琼脂、生化培养基、SQ、器械（剪刀、记号笔、接种环、酒精灯、显微镜、试管、玻片、培养皿）、药品（消毒酒精、结晶紫、碘液、酸酒精、品红、松柏油） 实验内容及操作程序： 一、培养基制备： 制备普通琼脂培养基、麦康凯平板、SC增菌培养基、生化培养基，制备方法
见附 1. 二、标本制备： (1) 取新鲜猪肝脏一小块，火焰表面消毒。 (2) 用浸过消毒液的剪刀剪开一个小口于消过毒的猪肝脏。 (3) 用接种环在剪开的肝脏小口沾取肝脏液，分别画线于麦康凯培养基和接种于SC中，37 C恒温培养24小时。 三、细菌分离培养： (1) 取出培养了24小时的麦康凯平板。挑选麦康凯平板上的凸起光滑湿润的粉红菌落染色镜检，看是否为红色短杆菌，若是，即疑似为大肠杆菌，则取其接种于另一麦康凯平板，37 C恒温培养24小时。 (2) 取出培养了24小时的SC增菌培养基，染色镜检，看是否有疑似沙门 氏菌，有则取其中细菌画线接种于麦康凯平板上，37 C恒温培养24小时。 四、细菌的鉴定纯化： (1) 检查疑似大肠杆菌的培养基是否长满了粉红色菌落，染色镜检。并取其分别接种于生化培养基上(葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、肌醇、枸椽酸盐、尿素、MR、VP、H 2S),并做穿刺实验于三糖铁上。37 C恒温培养24小时后观察结果。若实验结果满足预期效果，则可判定为大肠杆菌，则将其接种于普通琼脂培养基上传代培养。 (2) 检查疑似沙门氏菌的平板上是否长满细菌，染色镜检，看是否满足于沙门氏菌的染色特性。并取其接种于生化培养基上，并作穿刺实验于三糖铁 上，37 C恒温培养24小时后观察结果，若结果满足于沙门氏菌的生化特性，则可判定为沙门氏菌，则将其接种于普通琼脂培养基上传代培养。
一株反硝化菌的分离与鉴定
一株高效好氧反硝化菌的分离及特性研究 杨俊忠，倪砚，许尚营，徐可瀚，刘义，曾丽霞，刘德立? 华中师范大学生命科学学院，湖北省遗传调控与整合生物学重点实验室，武汉 （430079） E-mail: deliliu2002@https://www.360docs.net/doc/2b17437283.html, 摘要：利用富集培养的方法从南昌市郊某养鱼塘采样分离出22株反硝化细菌，其中8株反硝化率较高，从中选择一株效果最好的作为研究对象，命名为HS-N62。该菌在12h将培养基SC 中起始浓度为140mg/L的硝酸盐氮（NO3-N，10mmol/L）完全降解，并且没有NO2-的积累。对其生长特性进行了研究，最适生长温度的范围是30℃-37℃，最适生长的pH 值范围是6. 0～8. 0，最适C/N比为10：1，并能利用多种碳源生长。运用正交试验探讨了该菌株最适的反硝化条件。通过菌株形态观察、生理生化及16S rDNA 分子鉴定，菌株HS-N62与Pseudomonas sp.亲缘关系最为接近，同源性达99 %，初步鉴定该菌为Pseudomonas sp.。关键词：好氧反硝化；分离鉴定；特性研究 1. 引言 近几十年来，我国水产养殖业迅猛发展，但在水产养殖过程中的氨、硝酸盐、亚硝酸盐、磷酸盐等营养元素含量过高所造成的富营养化现象日益严重，结果造成大量鱼虾死亡，最终导致重大经济损失，因此，控制水体中的硝态氮和亚硝态氮成为规模化养殖成功的关键之一[1]。反硝化是将硝酸盐或亚硝酸盐还原成N O或N2的过程。传统观点认为：反硝化细菌大 2 都是兼性厌氧，细菌的反硝化作用是在无氧条件下发生。但近几年国内外的不少研究报道证明好氧反硝化菌的存在。细菌好氧反硝化的发现,突破了传统理论的认识，为生物脱氮技术提供了一种崭新的思路[2]。 具有反硝化能力的细菌就目前所知分布于50 多个属，许多菌属如假单胞菌属( Pseudomonas )、产碱菌属( Alcaligenes)和副球菌属( Paracoccus ) 都存在好氧反硝化现象[3]。本文从常年养鱼的池塘中采样筛选出多株好氧反硝化细菌，并研究了其生长条件及其反硝化效率，可为好氧反硝化脱氮的实际应用提供依据。 2. 材料与方法 2.1 培养基 富集培养基（SM，g/L）：NaNO3 0.85，丁二酸钠2.84，KH2PO4 1.36，MgSO4·7H2O 0.19，2 ml 微量元素溶液，pH 7.0～7.4。 反硝化培养基(SC，g/L)：NaNO3 0.85，丁二酸钠 4.72，酸水解酪素5.0，Na2HPO4 7.9，KH2PO4 1.5，MgSO4·7H2O 0.10，2 ml 微量元素溶液，pH 7.0～7.4。微量元素(g/L)：CuSO4·5H2O 4.0，FeSO4·7H2O 0.70，FeCl3·6H2O 7.0，CoCl3·6H2O 0.20，NaMO4·2H2O 3.4 0，CaCl2·2H2O 2.0，pH 7.0 [3-4]。 BTB培养基(g/L)：丁二酸钠4.72，NaNO3 0.85，KH2PO4 1.0，FeSO4·7H2O 0.2，MgSO4·7H2O 0.1，琼脂15，pH 7.0。 基金项目：教育部博士点基金项目(20060511002)和“211”重点学科建设项目；湖北省科技攻关计划项目(2007AA201C50，2007AA301C26)。
乳酸菌得分离、纯化与鉴定
乳酸菌得分离、纯化与鉴定 第一部分:乳酸菌得分离、纯化 一、实验器材: 1、实验药品新鲜乳酸饮料(市售)、脱脂奶粉、蔗糖、1、6%溴甲酚绿乙醇溶液(溴甲酚绿、无水乙醇)、酵母膏、琼脂、革兰氏染液(结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄)、75%乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCl、碳酸钙; 0、4gNaOH固体、4、2ml浓HCL(分析纯) 、20gCaCO3固体、酵母膏20g 、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g 、蔗糖10g; 2、仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、pH试纸、酸乳瓶、培养皿(φ9或φ12)、试管、300ml三角瓶(带玻珠)、移液管、天平、500ml锥形瓶、250ml锥形瓶、250ml烧杯。 二、实验步骤: 1、培养基配制(BCG牛乳培养基): (A)溶液:取脱脂乳粉100g,水500ml,加入1、6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml,混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅80℃灭菌20 min;(1、6%溴甲苯酚绿(BCG)乙醇溶液用1、6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中,再加水至100ml制成) (B)溶液:酵母膏10g,水500ml,CaCO3 10g,琼脂20g,加热溶解,用精密pH试纸调节pH到6、8,分装入三角瓶后在103kPa 121℃高压蒸汽灭菌20Min。 以无菌操作趁热将(A)(B)溶液均匀混合。 2、药品配制 2、1 结晶紫:结晶紫乙醇饱与液(结晶紫2g溶于20ml 95%乙醇中)20ml,1%草酸氨水溶液80ml。将两液混匀,放置24小时后过滤即可。 2、2 卢哥氏碘液:碘1g,碘化钾2g,蒸馏水300ml。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中,然后加入碘使之完全溶解,再加入蒸馏水300ml即成。 2、3 蕃红溶液:番红2、5g,95%乙醇100ml,溶解后存于密闭得棕色瓶中。用时取20ml与80ml蒸馏水混匀即可。 2、4 0、1%得吕氏美蓝染液:A液:美蓝0、3g,95%乙醇300ml;B液:0、01% KOH 100ml。混合A与B液即成,按1:100稀释即可。 2、4 生理盐水:称取9g氯化钠,溶解在少量蒸馏水中,稀释到1000毫升。 3、菌悬液得配制
食品中双歧杆菌检验方法
食品中双歧杆菌检验方法 环凯针对目前乳制品行业及质量监测单位检验双歧杆菌的需求及情况，对双歧杆菌检验相应的培养基进行了改进，使得双歧杆菌检出率较之前有很大的改进。扩充并完善了相关的微生物检测试剂，使得技术操作人员能更准确、快捷的检测出目标菌。 环凯依据GB 4789.34-2012食品卫生微生物学检验双歧杆菌检验，推出成套的双歧杆菌检验解决方案，为生产企业及检验单位提供方便。 图1：GB 4789.34-2012双歧杆菌检验流程图 表1：实验操作所用培养基及生化试剂 功能阶段实 验 序 产品序 号 产品名称规格类别
号 稀释液1 CP0630 生理盐水 225mL× 10袋 盒（袋装） 平板分离2 027330 双歧杆菌琼脂培养基（BBL 琼脂培养基） 250g 瓶（干粉） 生理生化 3 029010 革兰氏染色液 10mL×4 支 盒 4 029161 过氧化氢酶试剂 2mL×10 支 盒（西林 瓶） 5 027340 PYG液体培养基基础250g 瓶（干粉）SR0300 PYG液体培养基配套试剂 （A、B各一支添加于100 ml 基础培养基中） 2种×5支 /盒 盒（西林 瓶） 6 027350 TPY液体培养基250g 瓶（干粉） 7 029010 革兰氏染色液 10mL×4 支 盒 8 029080 甘油 2mL×10 支 盒（西林 瓶） 9 075060 D-阿拉伯糖20支 盒（西林 瓶） 10 075400 D-核糖20支 盒（西林 瓶） 11 075070 D-木糖20支 盒（西林 瓶） 12 075080 D-半乳糖20支 盒（西林 瓶） 13 075010 D-葡萄糖20支 盒（西林 瓶） 14 075550 D-果糖20支 盒（西林 瓶） 15 075380 D-甘露糖20支 盒（西林 瓶） 16 075110 L-鼠李糖20支 盒（西林 瓶） 17 075100 卫矛醇20支 盒（西林 瓶） 18 075120 肌醇20支 盒（西林 瓶）
大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验
河南农业大学 本科生毕业论文(设计) 题目鸡大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验学院牧医工程学院 专业班级2011届动物医学专升本3班学生姓名王张凡 指导教师许兰菊(教授) 撰写日期：2011年5月10 日
鸡大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验 王张凡 （2011届动物医学专升本3班） 摘要：为了对巩义某鸡场疑似鸡大肠杆菌病的鸡群进行确诊，并为有效防治提供依据，本研究利用细菌学检验方法对采集的典型病料进行细菌分离鉴定和细菌药敏试验。通过细菌分离培养、形态学观察、生化试验、动物试验和血清学试验。结果表明：该鸡群中分离到的病原菌为鸡大肠杆菌。动物攻毒试验结果表明：分离的鸡大肠杆菌具有明显的致病作用，雏鸡发病率为100%(5/5)，死亡率达60%(3/5)。血清学鉴定结果显示，该分离菌血清型为O1。药敏试验结果表明：该细菌对头孢曲松、头孢唑林、阿米卡星、复方新诺明（磺胺甲恶唑）、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、氨苄西林、米诺环素和庆大霉素均敏感，对阿莫西林和阿奇霉素为中度敏感;但对罗红霉素和四环素耐药。本研究结果对准确诊断和有效防治该病提供了依据和条件。 关键词：鸡；大肠杆菌；分离鉴定；药敏试验 Isolation, Identification and Antibiotic Sensitivity Test of Chicken Escherichia Coli wang zhangfan (Class 3 of Veterinary Medicine, Graduated in 2011) Abstract:In order to make a definite diagnosis for the suspend Chicken Escherichia Coli about chicken house from Gongyi and provide a reference for effective prevention and treatment. The bacteria was isolated and identified from typical samples and antibiotic sensitivity test was also adopted. By bacterial separate cultures, morphological observation, biochemical tests, animal experiment and serological tests, the pathogen of this chickens is pathogenic E.coli bacteria. The result of animal experiment showed: this Escherichia coli had obviously pathogenic; the morbidity of chicklings was 100%(5/5) and the mortality was 60%(3/5).Serological testing results indicated: the serotype of this strain was O1. The antibiotic sensitivity test results illuminated: the sensitivity of the strain to ceftriaxone、cefazolin and other 8 kinds of drug were sensitive; and the drug sensitivity to amoxicillin and azithromycin are intermediate;but the strain were drug resistant to roxithromycin and acheomycin. This research provided a scientific basis and qualification for exact diagnosis and effective prevention and treatment to Escherichia coli. Key word:Chicken,Escherichia Coli, Isolation and Identification, Antibiotic Sensitivity Test 鸡大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌(avian pathgenicity E．coli，APEC)引起的急性或慢性细菌性传染病，各种日龄的鸡均可发病，但雏鸡和产蛋鸡更易发病，其常与其他疾病混合