酵母菌的死活细胞鉴定

酵母菌的死活细胞鉴别与镜检计数

一、实验目的

1.掌握鉴别酵母菌细胞死活的染色方法。

2.了解血球计数板的构造，掌握利用它进行酵母菌计数的方法。

二、实验步骤

1.酵母菌血球计数板镜检计数

1)取一块盖玻片，加盖在血球计数板中央计数室上方。

2)用滴管吸取菌悬液滴于盖玻片的边缘，通过毛细作用渗入计数室，注意不能有

气泡产生，然后放置于载物台，静止5min，使细胞全部沉降到其表面。

3)高倍镜镜检，数对角线上5个中方格中细胞的总数，再计算出菌悬液浓度。为

了减少误差，应注意对样品适当稀释，以每个小方格中平均4~6个细胞为佳；

另外，也可对同一样品重复计数，取其平均值。

附:计数板的结构及测定原理

利用血球技术板镜检技术是一种常用的计数方法。血球计数板是一块比普通载玻片厚的特质玻片，其上有四条凹槽，构成三个平台，中间比较宽，其中央又被一短横槽隔成两半，每半边各有一个计数区，其上有9个大方格，只有中央的一个大方格为计数室供计数用。这一大方格的长宽各为1mm。加盖盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的距离为0.1mm，因此计数室的容积为0.1mm3。

目前血球计数板常用的是25格×16格型，其计数室被分成25个中格，其中每个中格又分为16个小格，故计数室共有400 小格。

计数时，首先把适当浓度的菌悬液注入计数室，然后在显微镜下计数，一般数对角线上5个中方格（共80个小方格）中细胞总数再根据下式求得菌悬液的浓度

细胞个数=5000A×B

式中A---5个中方格中细胞总数

B---菌悬液的稀释倍数

三、实验结果

个数:30 37 11 25 21 24 17 27 28 25

酵母菌的死活细胞鉴定

酵母菌的死活细胞鉴别与镜检计数一、实验目的 1.掌握鉴别酵母菌细胞死活的染色方法。 2.了解血球计数板的构造，掌握利用它进行酵母菌计数的方法。二、实验步骤 1.酵母菌血球计数板镜检计数 1)取一块盖玻片，加盖在血球计数板中央计数室上方。 2)用滴管吸取菌悬液滴于盖玻片的边缘，通过毛细作用渗入计数室，注意不能有气泡产生，然后放置于载物台，静止5min，使细胞全部沉降到其表面。 3)高倍镜镜检，数对角线上5个中方格中细胞的总数，再计算出菌悬液浓度。为了减少误差，应注意对样品适当稀释，以每个小方格中平均4~6个细胞为佳；另外，也可对同一样品重复计数，取其平均值。附:计数板的结构及测定原理利用血球技术板镜检技术是一种常用的计数方法。血球计数板是一块比普通载玻片厚的特质玻片，其上有四条凹槽，构成三个平台，中间比较宽，其中央又被一短横槽隔成两半，每半边各有一个计数区，其上有9个大方格，只有中央的一个大方格为计数室供计数用。这一大方格的长宽各为1mm。加盖盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的距离为0.1mm，因此计数室的容积为0.1mm3。目前血球计数板常用的是25格×16格型，其计数室被分成25个中格，其中每个中格又分为16个小格，故计数室共有400 小格。计数时，首先把适当浓度的菌悬液注入计数室，然后在显微镜下计数，一般数对角线上5个中方格（共80个小方格）中细胞总数再根据下式求得菌悬液的浓度细胞个数=5000A×B 式中A---5个中方格中细胞总数 B---菌悬液的稀释倍数三、实验结果

个数:30 37 11 25 21 24 17 27 28 25

细胞的组成及其结构

考前回归教材—考前读一读第一部分细胞的组成及其结构 [基本图例] 细胞结构和功能 1．糖类、脂质、蛋白质和核酸共有的元素是C、H、O，除此之外，蛋白质中还含有N等元素，核酸中还含有N、P。 2．组成蛋白质的氨基酸约有20种，不同氨基酸理化性质差异的原因在于R基不同。 3．DNA和RNA在分子组成上的差异表现为DNA中含有脱氧核糖和胸腺嘧啶，而RNA中含有核糖和尿嘧啶。 4．DNA多样性的原因主要是碱基(脱氧核苷酸)的排列顺序不

同；而蛋白质多样性的原因是组成蛋白质的氨基酸的种类、数目、排列顺序以及肽链的空间结构不同。 5．熟记实验中的颜色反应：蛋白质＋双缩脲试剂→紫色； DNA＋甲基绿染液→绿色； RNA＋吡罗红(派洛宁)染液→红色；加热砖红色；还原糖＋斐林试剂――→ 脂肪＋苏丹Ⅲ(Ⅳ)染液→橘黄色(红色)；线粒体＋健那绿染液→蓝绿色。 6．乳糖和糖原只分布于动物细胞；蔗糖、麦芽糖、淀粉和纤维素只分布于植物细胞。 7．脂质主要包括脂肪、磷脂和固醇，其中固醇又包括胆固醇、性激素和维生素D等。 8.脂肪的含氢量高于糖类，因此氧化分解时，耗O2多，释放能量也多。 9.自由水/结合水的比值越大，生物新陈代谢越旺盛，但其抗逆性相对较小。 10.原核细胞没有核膜、核仁、染色体及除核糖体以外的细胞器。 11.各种生物膜都主要由脂质、蛋白质组成，细胞膜还含有少量糖类。功能越复杂的膜中，蛋白质的种类和数量越多。 12.生物膜的结构特点是具有一定的流动性，功能特性是具有选择透过性。 13.生物膜系统包括细胞膜、核膜及具膜细胞器。核糖体、中心体不是生物膜系统的组成成分。 14.内质网膜与核膜、细胞膜能直接转化，高尔基体膜与内质网

植物细胞的活体染色与死活鉴定

姓名班级齐鲁医学班学号科目普通生物学实验题目植物细胞的活体染色与死活鉴定植物细胞的活体染色与死活鉴定实验目的： 1.了解活体染色的概念和原理 2.学会鉴别细胞的死活实验原理： ●活体染色是利用某种对植物无害的染料溶液对活细胞进行染色的技术。 ●中性红是常用的活体染料之一，它是一种弱碱性pH指示剂，变色范围在pH6.4~8.0之间（由红变黄）。在酸性条件下中性红解离度很强，带色的阳离子呈樱桃红色，在pH7以上，它不解离而以分子态溶于水呈橙黄色的溶液。 ●染色：即使是显微镜有足够的分辨率和合适的放大倍数，未经染色的组织切片或涂片常常不能直接在光镜下观察，其原因主要是标本各部分结构对光的折射率没有显著的差别。染色则是通过改变标本各部分之间对光的折射率，使其可以在光镜下观察。 ●在中性或微碱性环境中，植物的活细胞能大量吸收中性红并向液泡中排泌，由于液泡在一般情况下呈酸性反应。因此，进入液泡的中性红便解离出大量阳离子而呈现樱桃红色，在这种情况下，原生质和细胞壁一般不着色；死细胞由于原生质变性凝固，胞液不能维持在液泡内。因此，用中性红染色后，不产生液泡着色现象。相反，中性红的阳离子，却与带有一定负电荷的原生质及细胞核结合，而使原生质与细胞核染色。

姓名班级齐鲁医学班学号科目普通生物学实验题目植物细胞的活体染色与死活鉴定仪器与用具：显微镜；载玻片；盖玻片；单面刀片；尖头镊子；酒精灯；火柴；吸水纸适量。试剂： 0.03%中性红溶液；1mol/L硝酸钾溶液实验步骤： 1.切下一片较幼嫩的洋葱鳞片，用单面刀片在鳞片内侧割划成0.5cm2左右的小块，用尖头镊子将内表皮小块轻轻撕下，将制好的洋葱鳞茎内表皮放置于滴加蒸馏水的载玻片上，小心地将制片平展到载玻片上，加盖玻片，多余液体用吸水纸吸干，在显微镜下观察（注意调节光线强度） 2.另取一小块表皮，滴加0.03%的中性红溶液，染色5~10min；在蒸馏水中稍加冲洗，在载玻片上滴一滴蒸馏水，小心地将制片平展到载玻片上，加盖玻片，多余液体用吸水纸吸干，在显微镜下观察。 3.将步骤2中的活体染色制片取出几片放入pH略高于7.0的自来水中浸泡10~15min，再置于载玻片上镜检（为了确证中性红染色部位，可将上述洋葱内表皮染片浸入1mol/L的硝酸钾溶液中浸泡10min左右，然后取出观察。） 4.将步骤3中的活体制片放在酒精灯火焰上微微加热，以杀死细胞，再在显微镜下观察实验结果：第一步的观察结果：细胞呈无色透明状态，液泡充盈整个细胞，细胞彼此排列紧密，可见细胞壁。

生物化学实验报告-酵母RNA的提取与鉴定

实验五酵母RNA的提取与鉴定一、实验目的 1.掌握稀碱法分离酵母RNA的原理与操作过程。 2.了解RNA的组分并掌握定性鉴定的具体方法。二、实验原理 1.酵母核酸中RNA含量较多，DNA含量则少于2%。 2.RNA可溶于碱性溶液，当碱被中和后，可加乙醇使其沉淀，有此可得粗RNA制品。 3.用碱液提取的RNA有不同程度的降解三、实验仪器 1.离心机 2.水浴锅 3.电炉 4.烧杯 5.量筒四、实验试剂 1.干酵母粉 2.0.2%氢氧化钠溶液：2g氢氧化钠溶于蒸馏水并稀释至1000ml。 3.乙酸 4.95%乙醇 5.无水乙醚

6.10%硫酸 7.氨水 9.5%硝酸银溶液：5g硝酸银溶于蒸馏水并稀释至100ml，贮于棕色瓶中。 1.苔黑酚-三氯化铁溶液：将100mg苔黑酚溶于100ml浓盐酸中，再加入100mgFeCl 3.6H2O。临用时配制。五、实验步骤 1.RNA的提取：（1）称取2g干酵母粉于100ml烧杯中，加入 0.2%氢氧化钠溶液10ml，沸水浴加热30分钟，经常搅拌（如沸水浴过程中溶液蒸干可再加5~10ml氢氧化钠）。然后加入乙酸数滴，使提取液呈酸性（pH 试纸检验），离心10-15分钟（4000r.p.m）。（2）取上清液，加入2倍体积的95%乙醇，边加边搅，加毕，静止，待完全沉淀，过滤。（3）滤渣先用95%乙醇洗2次，每次约5毫升，再用无水乙醚洗2次，每次也约5ml。（4）洗涤时可小心地用玻璃棒搅动沉淀。乙醚滤干后，滤渣即为粗RNA，可鉴定。 2.鉴定：（1）取上述RNA约 0.5g，加10%硫酸5ml,加热至沸1—2分钟，将RNA水解。

3种酵母样真菌鉴定方法的比较

1　进修生收稿日期:2001-04-103种酵母样真菌鉴定方法的比较农生洲　韦柳宏1　陈松峰 (广西壮族自治区人民医院检验科　南宁　530021) 为综合评价目前我国实验室常规手工发酵鉴定法(常规法)、生物梅里埃A T B Fug us卡鉴定法(仪器法)和近年国内开始应用的科玛嘉(CHRo M ag ar)酵母样真菌显色培养基鉴定法(显色法)等3种酵母样真菌鉴定方法的优劣。我们同时用这3种方法对实验室保存的122株酵母样真菌标准菌株进行了鉴定比较,报道如下。 1　材料与方法 1.1　菌株来源:122株实验菌为实验室历年保存的标准菌株,其中白假丝酵母菌53株,热带假丝酵母菌31株,光滑球假丝酵母菌18株,近平滑假丝酵母菌11株,克柔氏假丝酵母菌3株,季也蒙假丝酵母菌、葡萄牙假丝酵母菌各2株,粘红假丝酵母菌、酿酒假丝酵母菌各1株。 1.2　试剂:沙氏培养基和各种手工用发酵管均购自杭州天和微生物试剂公司;Fug us卡及其配套仪器A T B Ex pressio n 为法国生物梅里埃公司产品;显色培养基则购自郑州搏赛科技有限责任公司。 1.3　鉴定方法:常规法鉴定按卫生部医政司颁发的《全国临床检验操作规程》进行;Fug us卡法按配套的操作手册取菌制成悬液,加样后置37℃培养24h后上机鉴定;显色法则取F ugus卡法剩余的悬液直接接种于显色培养基制成的平板上,置37℃培养,每隔24h观察一次结果,据菌落颜色进行判定;翠绿色为白假丝酵母菌,兰灰色为热带假丝酵母菌,紫红色边缘模糊有微毛为克柔氏假丝酵母菌菌,整个菌落湿润且紫红色为光滑球假丝酵母菌,白色为其它假丝酵母菌。 2　结　果 2.1　培养鉴定耗时:常规法和仪器法需预先用沙氏培养基培养出真菌,平均耗时大约72h,再加上鉴定耗时又分别平均约需72h和24h,常规法培养鉴定总共平均约需6d,仪器法约需4d;显色法集培养与鉴定于一体,耗时平均约需4 d。 2.2　鉴定结果:122株酵母样真菌的鉴定中,三法对53株白假丝酵母菌鉴定全部正确。其它69株菌中,常规法有11株无法鉴定到种,占总株数9.0%(11/122)。此外有5株热带假丝酵母菌鉴定错误,3株错定为光滑球假丝酵母菌,2株错定为近平滑假丝酵母菌。有3株光滑球假丝酵母菌鉴定错误,1株误定为热带假丝酵母菌,2株误定为近平滑假丝酵母菌。有2株近平滑假丝酵母菌鉴定错误,1株误为热带假丝酵母菌,1株误为光滑球假丝酵母菌。除无法鉴定到种的11株菌后,鉴定错误率仍有9.0%(10/111);显色法对白假丝酵母菌等该法能鉴定的6种酵母样真菌鉴定准确率达100%,其它菌株却无法鉴定到种,占总株数4.1%(5/122); F ugus卡法全部菌株均可鉴定到种,且准确率达100%。详见表1。表1　122株酵母菌样真菌3种方法鉴定结果比较(株) 菌名菌株数常规法显色法仪器法白假丝酵母菌　53　53　53　53 热带假丝酵母菌31273131 光滑球假丝酵母菌18171818 近平滑假丝酵母菌11111111 克柔氏假丝酵母菌3133 粘红假丝酵母菌1111 季也蒙假丝酵母菌2102 葡萄牙假丝酵母菌2002 酿酒假丝酵母菌1001 2.3　成本核算:常规法鉴定每一株菌平均约需10元,仪器法平均约需50元,显色法平均约需15元。 3　讨　论当前酵母样真菌引起的临床感染正呈逐步增加之势,临床医师急需实验室准确快速地检出病原体以协助诊治[1]。纵观本试验结果,加上预先真菌培养时间常规法鉴定耗时总共需要至少6d左右,且操作繁琐,生化结果判定较困难,即使是标准菌株,结果仍极易出错。而如F ugus卡等仪器测试卡法,虽然鉴定耗时较短,操作也简便,鉴定结果准确率又高且可配套进行体外药敏试验,但因仪器和试卡均为进口产品,价格昂贵,只适合在有大量标本的大型综合性医院应用。从本研究可看出,显色法培养加鉴定耗时平均仅需48h,与应用仪器法耗时基本相等,且培养基制备方便,价格适中,结果判定简便快速准确,虽然有一部分菌株无法鉴定到种,但已能鉴定出目前临床感染95%以上的3～4种酵母样真菌感染[2],故不失为一种替代常规法在中小医院普及开展的酵母样真菌检验方法。参　考　文　献 1　周贵民,谢　灵.国内酵母菌感染和实验室诊断的现状及建议.中华医学检验杂志,1996,19(5):301-303. 2Pfaller M A,Housto n A,Co ffman S.A pplicatio n of CHR OM ag ar Ca ndida for r apid scr eening o f clinical specimens for Candida A lbicans,Candida tro picalis, Candida K rusei,and Candida(T or ulopsis)glabrata.J Clin M icr o bilo l,1996,34(1):58-61. ? 764?广西医科大学学报 JOURNA L OF GU ANGXI M EDICAL UNIVERSIT Y 　2002Oct;19(5)

1.酵母菌的形态观察及死活细胞鉴别-4学时

实验一酵母菌的形态观察及死活细胞鉴别预习内容： 1. 光学显微镜的使用（参见周德庆，微生物学实验教程第3版，23-27页） 2. 酵母菌的美蓝染色观察（参见周德庆，微生物学实验教程第3版，91-95页）预习思考题： 1. 随着物镜放大倍数的增加，视野的亮度是增强还是减弱？应如何调节？视野范围是如何变化的？ 2. 制作水浸片时如何避免产生气泡？ 3. 影响活菌数目的因素有哪些？染液浓度、染色时间及染色时的pH等因素对死活细胞数目比例有什么影响？ 4. 如何测定酵母菌死亡率？简述其原理。 5. 标本片上的某一物象，第一次看到后如何再次找到它? 一、实验目的与要求 1. 了解普通光学显微镜的构造及原理，正确掌握使用显微镜的方法； 2. 观察酵母菌的形态及出芽生殖方式； 3. 学习区分酵母菌死活细胞的实验方法； 4. 掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。二、实验原理 1. 酵母菌酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍，不必染色即可用显微镜观察其形态。但由于细胞个体大，采用涂片的方法制片有可能损伤细胞，一般通过美蓝染液水浸片或水-碘液浸片法来观察酵母细胞。大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母的形态和出芽生殖方式，并对酵母细胞进行死活染色鉴别。

2. 美蓝染液美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，不仅用此法可观察酵母细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。图1：酵母菌美蓝浸片观察3min（10×40）图2：酵母菌浸片观察30min（10×40）三、实验设备及材料 1. 菌种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 或卡尔酵母(Saccharomyces calsbergensis)培养2 天左右的豆芽汁液体培养物(需稀释)。 2. 溶液或试剂：0.1%和0.05%吕氏碱性美蓝溶液(或0.01%美蓝水溶液)，革兰氏染色用碘液等。 3．器材：显微镜，擦镜纸，吸水纸，盖玻片、酒精灯、接种环、镊子、胶头滴管、小烧杯、洗瓶等等。四、实验步骤与内容 1．美蓝浸片的观察（1）在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作接种环挑取少量酵母菌放在染液中，并用接种环将其混合均匀，酒精灯上灼烧清洗接种环。

食品中霉菌和酵母分布检测和鉴定-福建疾病预防控制中心

食品中霉菌和酵母分布、检测和鉴定福建省疾病预防控制中心马群飞 1. 霉菌和酵母的基本特性霉菌和酵母这种称谓仅是为了方便起见，将小型真菌有真正菌丝的称为霉菌，没有菌丝的称酵母，并没有分类学上的依据。相对于低等的细菌来说，霉菌和酵母生长缓慢，竞争能力较弱，故霉菌和酵母常在不利于细菌生长繁殖的环境中形成优势菌群。由于霉菌和酵母的细胞较大，新陈代谢能力强，故10２～10４个酵母即可引起一克食物的变质，而细菌则需要100倍于此数的细胞。通常霉菌和酵母适合在高碳低氮有机物如植物性物质上生存。适合的pH 3～8，有些霉菌可以在pH2，酵母在pH 1.5时生活。水活度要求0.99～0.61，霉菌0.85时最适宜，某些嗜渗酵母和霉菌常引起糖果类食品的变质。一般的霉菌的生长温度为20～30℃，部分霉菌可以在不低于－7℃的温度下生长。酵母一般在0～45℃时生长。耐热能力较差，酵母细胞55～56℃几分钟就被杀死。少数霉菌的孢子（如丝衣霉）则可在90℃中耐受几分钟。霉菌和酵母很多可以耐受防腐剂。如乳酸、醋酸、CO ２和SO ２等。有些酵母酯酶活性高并能合成B族维生素。 2. 食品中酵母的常见类群在食品中能分离出各种酵母菌，但它们很可能没有什么意义，因为其中多数来源于外界的偶然污染。仅有非常有限的几个酵母属可使经过加工并正常生产工艺包装的食品腐败。比如抗SO ２熏蒸的酵母，就是饮料、葡萄酒变质的常见因素。耐受保鲜剂的毕赤酵母，高度嗜氧，可以形成泡菜和酱油的表面膜。当然，如果不按照标准的生产程序进行食品生产，那么许多外界污染的酵母都将在食品中大量繁殖，这种情况下，就谈不上优势菌群问题了，也不必进行酵母的分类鉴定。处理方法只有一个，恢复正常的生产程序。 2.1 乳制品：鲜奶易因细菌污染而腐败，酵母菌不是重要问题。当鲜奶被加工成奶油、乳酪、酸奶等制品后，由于细菌被抑制，酵母可相应地成为优势菌。它们使奶油、乳酪产生怪味和气体，使黄油产生有味物质，并可使酸奶和酸乳酪腐败。在实验室中，汉逊德巴利酵母、布提利假丝酵母、多孢丝孢酵母和红酵母均能导致固体和液体乳酪的腐败。 2.2 肉类与肉制品：通常情况下，这类制品适于细菌的生长，酵母不是引起变质的主要原因。某些德巴利酵母可使冷冻的猪、牛肉香肠和午餐肉表面出现令人不愉快的粘滑感觉。

1酵母菌的形态观察及死活细胞鉴别4学时

实验一酵母菌的形态观察及死活细胞鉴别预习内容: 1、光学显微镜的使用（参见周德庆,微生物学实验教程第3 版,23-27 页） 2、酵母菌的美蓝染色观察（参见周德庆,微生物学实验教程第3 版,91-95 页）预习思考题: 1、随着物镜放大倍数的增加,视野的亮度就是增强还就是减弱？应如何调节？视野范围就是如何变化的？ 2、制作水浸片时如何避免产生气泡？ 3、影响活菌数目的因素有哪些？染液浓度、染色时间及染色时的pH 等因素对死活细胞数目比例有什么影响？ 4、如何测定酵母菌死亡率？简述其原理。 5、标本片上的某一物象,第一次瞧到后如何再次找到它? 一、实验目的与要求 1、了解普通光学显微镜的构造及原理,正确掌握使用显微镜的方法; 2、观察酵母菌的形态及出芽生殖方式; 3、学习区分酵母菌死活细胞的实验方法; 4、掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。二、实验原理 1、酵母菌酵母菌就是不运动的单细胞真核微生物,其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍,不必染色即可用显微镜观察其形态。但由于细胞个体大,采用涂片的方法制片有可能损伤细胞,一般通过美蓝染液水浸片或水-碘液浸片法来观察酵母细胞。大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖,有的分裂繁殖;有性繁殖就是通过接合产生子囊孢子。本实验通过美蓝染液水浸片与水一碘液水浸片来观察酵母的形态与出芽生殖方式,并对酵母细胞进行死活染色鉴别。

美蓝就是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，不仅用此法可观察酵母细胞形态,也可用来鉴别酵母菌的死细胞与活细胞。图1：酵母菌美蓝浸片观察3min(10 X40)图2:酵母菌美蓝浸片观察30min(10 X40) 三、实验设备及材料 1、菌种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisia? 或卡尔酵母(Saccharomyces calsbergensi培养2天左右的豆芽汁液体培养物(需稀释)。 2、溶液或试剂：0、1%与0、05%吕氏碱性美蓝溶液(或0、01%美蓝水溶液), 革兰氏染色用碘液等。 3?器材:显微镜，擦镜纸，吸水纸,盖玻片、酒精灯、接种环、镊子、胶头滴管、小烧杯、洗瓶等等。四、实验步骤与内容 1. 美蓝浸片的观察 (1) 在载玻片中央加一滴0、1%吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作接种环挑取少量酵母菌放在染液中，并用接种环将其混合均匀，酒精灯上灼烧清洗接种环。注:染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡。用接种环将菌体与染液混合时，不要剧烈涂抹，以免破坏细胞。 (2) 用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上，用吸水纸吸取多余的液体。 2、美蓝染液

台盼蓝染色鉴别死活细胞的原理

台盼蓝染色鉴别死活细胞的原理通常认为细胞膜丧失完整性，细胞即可被认为已经死亡。台盼蓝(Trypan Blue)是检测细胞膜完整性最常用的生物染色试剂。健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而死亡的细胞，膜的完整性丧失，通透性增加，细胞可被台盼蓝染成蓝色。依据此原理，细胞经台盼蓝染色后，可通过显微镜，直接镜下计数或拍照后计数，实现对细胞存活率比较精确的定量分析。染色原理: 正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内；而丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。因此，借助台盼蓝染色可以非常简便、快速地区分活细胞和死细胞。台盼蓝拒染法台盼蓝拒染法是利用台盼蓝只能将死细胞染成蓝色而活细胞不能被染上的方法检测细胞存活率的一种快速简便的方法。染色原理: 正常细胞具有完整的细胞膜结构，而死亡的细胞其细胞膜结构被破坏。台盼蓝无法通过正常的细胞膜因而正常的细胞不被台盼蓝染上，而死细胞则可被台盼蓝染成蓝色。流程: （1）将对数生长期的细胞浓度调整为1~10×10细胞/ml，按10~10个细胞接种于96孔板，每孔100 μl；（2）培养细胞24小时后，对其进行不同处理，每个处理设三个平行对照；（3）收集细胞，经台盼蓝染色，在倒置显微镜下计数蓝染及不染色细胞，计算细胞存活率；（4）结果统计：镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。根据下式求细胞活力：活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100 注意事项:

台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰计数。科研试剂，广泛应用于分子生物学，药理学等科研方面，严禁用于人体。本品为生物染色剂，在细胞毒性试验中用于检测死亡细胞和垂死细胞，也可用于细胞活性的常规评估。如病毒检验，注入循环系统可使肾小管着色，哺乳动物、低等脊椎动物和昆虫的各种组织活体染色。台盼蓝染色的主要（原理）步骤： 1. 用Hanks液配制0.1%台盼蓝溶液； 2. 用0.5%胰蛋白酶：0.2%EDTA=1：1混合液来消化培养的贴壁细胞； 3. 再加入适量Hanks液制成细胞悬液； 4. 将待染色细胞稀释至所需浓度（方法及浓度范围与细胞计数相同）； 5. 每0.1ml细胞悬液约加新鲜配制的染液一小滴，室温下染3—5min； 6. 染色过的细胞材料，取一滴细胞悬液置玻片上，加盖玻片后放高倍镜下观察； 7. 死亡的细胞着浅蓝色并膨大，无光泽。活细胞不着色并保持正常形态，有光泽； 8. 计数1000个细胞中的活细胞和死细胞数目； 9. 统计未染色细胞。可按公式计算出细胞活率。细胞活率（%）=未染色的细胞数/观察的细胞总数×100。死细胞的细胞膜无屏障作用，台盼蓝马上进入细胞而显蓝色。活细胞细胞膜有选择透性，对台盼蓝的透性小，进入细胞慢。若染色时间过长，台盼蓝可能通过胞吞或胞饮作用进入细胞。通常认为细胞膜丧失完整性,细胞即可被认为已经死亡.台盼蓝(Trypan Blue)是检测细胞膜完整性最常用的生物染色试剂.健康的正常细胞能够排斥台盼蓝,而死亡的细胞,膜的完整性丧失,通透性增加,细胞可被台盼蓝染成蓝色.依据此原理,细胞经台盼蓝染色后,可通过显微镜,直接镜下计数或拍照后计数,实现对细胞存活率比较精确的定量分析。作为细胞染色剂之一的台盼蓝(Trypan Blue)已被证明受到活体细胞的排斥，而死亡细胞摄入染料显示蓝色。通过常用的光学显微镜可以观察到细胞染色情况，同时可以定量计数，但是该染色无法区别自杀细胞还是坏死细胞。

死活细胞的鉴定方法

活细胞的鉴定在生物学和医学上具有很重要的意义。细胞培养过程中要随时记录细胞的生长情况，需要经常测定细胞的存活率；在肿瘤细胞的研究中，为了检验各种药物对肿瘤细胞的杀伤力，也需要测定肿瘤细胞的存活率。在临床医学中死活细胞的鉴定也有很大的应用，例如为了检测某一男子的生育能力，测定精子细胞的存活力是比较常用的办法。死活细胞的鉴定方法有很多种，常用的有染色法和仪器分析法。染色法是常用的细胞死活鉴定方法，简便，易于操作。但是通过直接的形态观察来鉴别细胞死活，实验结果很容易受操作者的主观因素的影响，存在一定的误差，所以，在实际操作中也常采用一些仪器来进行精确的批量检测。不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异。常用的方法包括染色法和仪器分析法。 1 染色法染色法分化学染色法和荧光染色法，根据染色机理的不同，染料或使死细胞着色，或使活细胞着色。死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括：死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后，细胞膜受损，通透性增加。常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质。台盼蓝，又称锥蓝，是一种阴离子型染料，不能透过完整的细胞膜。所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色，而活细胞不被着色。甲基蓝有类似的染色机理。植物细胞的质壁分离也可鉴定死活。死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据。美蓝是一种无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。由于活细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型，因此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们的无还原能力或还原能力极弱，使美蓝处于氧化态，从而被染成蓝色或淡蓝色。荧光素双醋酸酯（FDA）是一种常用的培养动植物细胞以及植物细胞原生质体的生活力鉴定染料，其染色机理也利用了死活细胞在代谢上的差异：FDA本身

细胞工程复习题及答案

细胞工程复习题一、名词解释 1.细胞工程：以生物细胞、组织或器官为研究对象，运用工程学原理，按照预定目标，改变生物性状,生产生物产品，为人类生产或生活服务的科学。 2.外植体：指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料 3.植物组织培养：将植物的器官、组织或细胞，在无菌条件下接种于人工配置的培养基上，使其细胞分裂、增值、分化、发育，甚至形成完整植株的方法。 4.愈伤组织：在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在外植体切面上产生。 5．离体无性繁殖:简称离体繁殖，是指利用组织培养方法进行植物离体培养，在短期内获得大量遗传性一致个体的方法。 6．继代培养：更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料（愈伤组织.芽等）。 7.体细胞杂交：（原生质体融合）指在人工控制条件下不经过有性过程，两种体细胞原生质体相互融合产生杂种的方法。 8 细胞分化：即由于细胞的分工而导致的细胞结构和功能的改变，或发育方式改变的过程。 9 细胞脱分化：培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程就是细胞脱分化。 10 细胞再分化：即脱分化后的分生细胞在特定的条件下，重新恢复细胞分化能力，并经历器官发生形成单极性的芽或根，或经历胚胎发生形成双极性的胚状体，进一步发育成完整植物体，这一过程成为细胞再分化。 11 人工种子：指植物离体培养中产生的胚状体或不定芽包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中所形成的能发芽出苗的颗粒体。 12 植物细胞全能性：指植物体的每一个活细胞都具有该植物的全套遗传信息，具备发育完整植株的潜在能力。 13 胚状体：在离体培养过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构。

酵母菌死活鉴定和显微镜检测

实验二酵母菌的死活鉴定和显微镜计数一、实验目的学习血球计数板使用的原理与方法，学习区别死活酵母的方法。二、原理测定微生物数量方法很多，通常采用的有显微直接计数和平板计数法。镜检计数法适用于各种单细胞菌体的纯培养悬浮液，菌体较大的酵母或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌采用彼得罗夫?霍泽细菌计数板，两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察，而血球计数板较厚，不能使用油镜，故细菌不易看清。血球计数板的构造血球计数板是一块特制厚玻片。玻片上由四道槽构成三个平台，中间的平台分成两半，其上各刻一个相同而有一定面积的小方格网。方格的刻度有两种规格。一种是25×16，称为希里格式血球计数板，分为25大格，每大格又分为16小格；另一种是16×25，称为麦氏血球计数板，分16大格，每大格分为25小格。总数都是400小格（如图所示）。每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为1/400mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，所以每个计数室（大方格）的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3，使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格（或中方格）中微生物的数量，再换算成每毫升（或每克样品）中微生物细菌的数量。

三、实验材料 1、菌种：酵母菌 2、仪器：显微镜、血球计数板 3、材料：盖玻片、吸水纸、滴管 4、染料：美蓝染液四、实验步骤和内容 1、视待测菌液浓度，加无菌水做适当稀释，以每小格菌数5-10个为宜，准确计算稀释倍数。 2、取清洁干燥的血球计数板，加盖玻片盖住网格和两边的槽。 3、将待测菌液充分摇匀后，用无菌吸管吸少许，由盖玻片边缘或槽内加入计数板来回推压盖玻片，使其紧贴在计数板上，计数室内不能有气泡。静置5-10分钟。 4、在低倍镜下找到小方格网后更换高倍镜观察计数，上下调动细螺旋，以便看到小室内不同深度的菌体。位于分格线上的菌体，只数两条边上的，其余两边不计数。如数上线就不数下线，数左边线就不数右边线。由于菌体在计数室中处于不同的空间位置，要在不同的焦距下才能看到，因为观察时必须不断调节微调螺旋，方能数到全部菌体，防止遗漏。凡酵母菌芽体达到母细胞一半时，即可作为两个菌体计算。 5、计数时若使用刻度为25×16（大格）的计数板，则数四角的4个大格（即100小格）内的菌数。如用刻度为16×25（大格）的计数板，除数四角的4个大格外，还需数中央1个大格的菌数（即80小格）。 6、每个样品重复计数2-3次，取其平均值，按下式计算样品中的菌数。刻度为25×16（大格）的计数板：

细胞死活鉴定

姓名陈傲蕾系年级13级生科组别同组者科目细胞生物学实验题目细胞培养与细胞死活鉴定学号【实验目的】 1、回顾细胞培养的有关知识； 2、学习小鼠脾细胞的分离技术及简单的细胞培养技术 3、掌握无菌操作的具体过程及无菌操作台的使用； 4、了解细胞原代培养的基本方法及操作过程； 5、学习掌握染色法鉴别细胞的生死状态的原理及方法； 6、学习使用血球计数板对细胞总数及活细胞数进行计数； 7、学习实验过程的详细描述及实验记录。【实验原理】细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异：①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。②代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧

微生物分类鉴定

第三节微生物的分类鉴定方法一、微生物鉴定的依据获得纯化的微生物分离菌株后，首先判定是原核微生物还是真核微生物，这实际上在分离过程中所使用的方法和选择性培养基已经决定了分离菌株的大类的归属，从平板菌落的特征和液体培养的性状都可加以判定。然后，如是原核微生物，便可根据表14-3 所示的经典分类鉴定指标进行鉴定，如条件允许，可做碳源利用的BIOLOG-GN 分析和16S rDNA 序列分析。多项结果结合起来确定分离菌株的属和种。表14-3 微生物经典分类鉴定方法的指标依据二、微生物鉴定的技术与方法根据目前微生物分类学中使用的技术和方法，可把它们分成四个不同的水平：①细胞形态和行为水平，②细胞组分水平，③蛋白质水平，④基因组水平；在微生物分类学发展的早期，主要的分类鉴定指标是以在细胞形态和习性为主，可称为经典的分类鉴定法。其他三种实验技术主要是60 年代以后采用的，称为化学分类和遗传学分类法，这些方法再加上数值分类鉴定法，可称为现代的分类鉴定方法。（一）、经典分类鉴定法经典分类法是一百多年来进行微生物分类的传统方法。其特点是人为地选择几种形态生理生化特征进行分类，并在分类中将表型特征分为主、次。一般在科以上分类单位以形态特征、科以下分类单位以形态结合生理生化特征加以区分。最后，采用双歧法整理实验结果，排列一个个的分类单元，形成双歧检索表（图14-4 ）。 A. 能在60 o C 以上生长 B. 细胞大，宽度1.3~1.8mm ……………………………………… 1. 热微菌属 ( Thermomicrobium )

BB. 细胞小，宽度0.4~0.8mm C. 能以葡萄糖为碳源生长 D. 能在pH4.5 生长…………………………………………… 2. 热酸菌属 ( Acidothermus ) DD. 不能在pH4.5 生长………………………………………………… 3. 栖热菌属 ( Thermus ) CC. 不能以葡萄糖为唯一碳源……………………… 4. 栖热嗜油菌属( 栖热嗜狮菌属Thermoleophilum ) AA. 不能在60 o C 以上生长图14-4 双歧法检索表例样应用BIOLOG-GN 仪检测分离菌株对众多碳源的利用情况判断分离菌株的分类地位，近年来也时有应用。在BIOLOG-GN 仪上有96 个小孔，其中95 孔内分装有95 种不同碳源的缓冲液，1 孔为无碳源的缓冲液对照，各孔接入适宜菌浓度和液量的分离菌株培养物，定温培养，每日定时读取BIOLOG-GN 仪计算机上各碳源利用情况，一般为时1 周，BIOLOG-GN 仪可显示出该鉴定菌株的最可能归属。（二）、数值分类法又称阿德逊氏分类法() 。它的特点是根据较多的特征进行分类，一般为50 ～60 个，多者可达100 个以上，在分类上，每一个特性的地位都是均等重要。通常是以形态、生理生化特征，对环境的反应和忍受性以及生态特性为依据。最后，将所测菌株两两进行比较，并借用电子计算机计算出菌株间的总相似值，列出相似值矩阵( 图14-5) 。为便于观察，应将矩阵重新安排，使相似度高的菌株列在一起，然后将矩阵图转换成树状谱(dendrogram)( 图14-6) ，再结合主观上的判断( 如划分类似程度大于85 ％者为同种，大于65 ％者为同属等) ，排列出—个个分类群。图14-5 显示6 个细菌菌株的遗传相似矩阵图

酵母菌分类方法研究张金龙

酵母菌分类方法研究学生姓名：张金龙系别：农学系专业班级：生物技术2班学号： 0701024228 指导老师：卢显芝 2010年6月

摘要：酵母菌是一个复杂的类群,其分类系统经数代酵母菌分类学家的努力正日趋完善,分类学方法也随着科学技术的进步而不断深化, 尤其是近年来发展起来的分子分类学方法给整个生物系统学和进化研究方法注入了活力,也使酵母菌的系统发育研究更接近于生物起源的本质。关键词：酵母菌分类方法化学分子生物学技术酵母菌是一类单细胞的真核微生物的通俗名称，并非是系统分类单元。酵母菌属于真菌，是具有核膜与核仁分化的较高等的微生物，细胞内有线粒体等较复已杂的细胞结构。目前已知有1000多种酵母，根据酵母菌产生孢子（子囊孢子和担孢子）的能力，可将酵母菌分成3类：形成孢子的株系属于子囊菌和担子菌。不形成孢子但主要通过芽殖来繁殖的称为不完全真菌。在真菌分类系统中分别属于子囊菌纲、担子菌纲和半知菌类。[1]与其他微生物相比，尤其是细菌和丝状真菌，酵母菌的种数很少，但是其分布范围却很广泛。酵母菌大多数为腐生，生活在含糖量较高和偏酸性的环境中，如水果、蔬菜、花蜜及植物叶子上，尤其是果园、葡萄园和菜园的土壤中较多。由于酵母菌拥有丰富的酶系统和蛋白质，对高糖环境、高碳环境、高渗透压环境等具有较强适应性，可以为其他生物体提供营养物质，可以代谢重金属或者降解某些难降解的物质，维持生态环境的稳定。[2]因此分类研究作为其他各方面研究的基础，研究手段不断改进，分类系统不断更新。其中大致有三种分类方法：传统分类方法、化学分类方法、分子生物学分类方法。 1 传统分类方法传统分类学方法是酵母菌分类学方法的基础 ,包括形态学特征和生理生化特征。形态学特征包括宏观特征(菌落特征)、微观特征(细胞形态、无性繁殖方式、有性生殖方式、孢子类型、假菌丝的形成)等；生理生化特征包括对糖发酵和碳、氮源化合物同化的能力 ,对外源维生素的依赖性和不同温度下的生长能力等生理学特性。经典分类学方法在酵母菌分类学中占有重要地位 ,当前权威的酵母鉴定系统就是在此基础上建立并发展起来的。然而,它存在的局限性也是不容忽视的。酵母菌形态学特征可能随着培养基的改变而发生变化,因此必须采用标准化方法;有些种类或结构不同的碳水化合物具有相同的代谢途径 ,它们所反映的遗传基础是有限的;有些双糖、寡糖和多糖代

死活细胞的鉴别word版

（一）、死活细胞的鉴别生活细胞近似无色透明，用普通光镜无法观察其形态，需用相差显微镜来观察。染色排除法：组织培养中检查死活细胞最常用的是“染色排除法”这类方法简单但不甚严格，它只能判断细胞的代谢死亡，不反映细胞能否增殖。由于未经过固定、专门染色，所以看不到死活细胞的形态差别。所用染料的分类：一般的生物染料不能穿过活细胞膜只有细胞被固定或细胞膜被破坏，染料才能进入细胞膜。第一类：死细胞着色，使死细胞着色的大部分是酸性染料。它们不容易穿透活细胞的质膜，进入胞内，但却能渗透死亡的细胞，使之着色。如①台盼兰（Trypan blue）：0.5-1%的台盼兰，pH7.0-7.2，每毫升细胞悬液加 0.1ml 染液，2 分钟后镜检，活细胞没有染上，死细胞全部被染成蓝色。②苯胺兰(Aniline’ black)： 0.05%的苯胺黑以 1：10 的量与细胞悬液混匀，1-2 分钟后，死细胞被染成黑色。 ③伊红 Y：细胞悬液与细胞悬液混喝，2 分钟后死细胞被染成桃红色。等。第二类：活细胞着色，多为碱性染料，如中性红、健那绿、亚甲蓝、甲苯胺蓝等。它们是一些无毒或毒性很小的染料，由于电性吸引而堆积在细胞中某一特定的结构上从而显色，即它们解离后带正电，其中有的染料可与胞内某些结构专一性的结合。 ①1%结晶紫染色生理 1%结晶紫盐水与细胞悬液 1：2 混合，立即镜检，或细胞被染成蓝紫色，而死细胞不着色。属于活细胞染料。活细胞染料无毒，无物理、化学变化，基本上不影响细胞的生命活动。 ②用呀啶橙染色可以鉴别出细胞固定前的死活状态。丫啶橙是一种与 DNA 和 RNA 都能结合的荧光染料，在兰光或紫外光激发下，DNA 可激发出 530nm 的荧光发射峰，RNA 可激发出 640nm 的荧光发射峰，它与双链 DNA 的结合方式是潜入双链之间，而与单链 DNA 和 RNA 则由静电吸引堆积在磷酸根上。在蓝光的激发下，细胞核发亮绿色荧光，核仁和胞质 RNA Page 9发桔红色荧光。因此，原来的活细胞经固定、染色后细胞核呈亮绿色，核仁和散布在细胞质中的 RNA 呈桔红色，胞质其余部分为淡红褐色。死亡的细胞，因物质发生变形，其核呈暗绿色，胞质整个呈暗绿色。但丫啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但由于经过细胞固定抑制了这种结合，从而主要显示出的是 DNA 和 RNA 两种核酸。本次实验即选用活细胞染料健那绿来显示线粒体。（二）细胞核和染色体的染色 Giemsa 染色：姬姆萨是常用的染料，可观察核、染色体。醋酸地依红染色：可显示有丝分裂染色体的微细结构，如次缢痕、染色质丝的螺旋化等。该染料同时具有固定和染色的作用，因此也可用来坐快速检查有丝分裂指数。（细胞涂片，0.075 mol 的 KCI 低渗 5-10 分钟，使细胞膨胀，染色体分裂；甲醇固定 10 分钟，空气干燥，滴加 2%醋酸地衣红，染 10-20 分钟后即可观察。（三）细胞器的特殊染色

07 动物细胞培养及死活细胞鉴别

山东大学实验报告2018年5月21日 ________________________________________ _________________________ 姓名：丁志康系年级：2016级组别：周一下午科目：细胞生物学实验题目：动物细胞培养及死活细胞鉴别学号：201600140055 一、目的要求 1.学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2.了解并掌握进行动物细胞原代培养的实验方法。 3.了解动物细胞培养的原理及注意事项。 4.学习细胞生死状态鉴别的方法。 5.了解细胞生死状态鉴别的原理。 6.熟悉和掌握各种鉴别细胞生死状态方法的判定特征。 7.掌握细胞计数方法，计算细胞存活率二、实验原理 1、细胞培养细胞培养技术指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术，也叫细胞克隆技术。细胞培养技术可以由一个细胞经过一段时间的培养得到大批的简单的单细胞或极少分化的多细胞，通过细胞培养可以得到大量的细胞或细胞代谢产物。细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。细胞培养具有其他生物技术无可比拟的优点：培养条件易改变和控制，便于单因子分析；便于人们直接对细胞内结构，细胞生长及发育等过程的观察。在生物学的各个领域已被广泛应用。但细胞培养也存在一定的局限性：细胞的培养是在脱离了机体的外界环境之中，与体内环境存在一定的差别，因此细胞培养过程中观察到的现象有时难以正确反映机体内的状况。 2、细胞死活鉴定细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。活细胞和死亡细胞在生理机能和性质上主要存在以下差异： ①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶（PI）或溴化乙啶（EB）等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。