加压筛选试剂

MTX加压方法简介

诞生于70年代末的基因工程药物因其具有其他药物无法比拟的优点，己迅速成为制药工业中一个引人注目的领域。1995年美国基因工程药物销售额约为48亿美元，1997年超过60亿美元，年增长率达20%以上。各国政府将其视为新的经济增长热点而给予了大力支持。基因工程药物研发的主要环节包括：基因克隆和工程菌构造；重组细胞培养；目的产物分离纯化等。针对以上主要环节，研究人员正致力于高效表达、培养工艺及下游分离纯化等方面的研究。目前已有多种表达系统应用于表达具有医疗价值的蛋白质，如大肠杆菌、酵母、昆虫杆状病毒系统、哺乳动物细胞等表达系统。大多数药用蛋白都是糖蛋白，中国仓鼠卵巢细胞（CHO）是目前重组糖基蛋白生产的首选体系，已有越来越多的药用蛋白在其中获得了高效表达，部分药物已投放市场，例如EPO、G-CSF、组织型纤溶酶原激活剂t-PA、CD受体、单克隆抗体、乙型肝炎表面抗原、白介素、干扰素等。

影响重组蛋白在CHO细胞中表达的因素很多，层次也很广泛，涉及CHO细胞表达体系、表达载体系统、外源基因、表达细胞株的加压扩增与筛选、细胞大规模培养等。转录是真核基因表达调节的基本控制点，研究表明：所有提高转录水平的策略主要通过载体构建、基因转染方法和选择不同标记来调控；CHO细胞表达体系和外源基因影响mRNA的翻译；表达细胞株的加压扩增，目的在于扩增外源基因的拷贝数，从而提高表达量；筛选表达细胞株，可获得稳定的、高表达的单克隆细胞株；大规模细胞培养中，血清、溶氧、二氧化碳、氨、乳酸的浓度以及剪切力影响细胞的生长、外源蛋白的表达和纯化。深入了解和灵活运用各种影响因素，有助于重组蛋白在CHO细胞中的高效表达。

（一）CHO表达系统

1. CHO细胞表达体系

常用的CHO细胞系有两种：CHO和CHO-dhfr-。CHO表达系统是目前应用最广泛的真核表达系统之一，与其它表达系统相比，它具有许多优点：准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近天然蛋白分子；表达产物胞外分泌，便于分离纯化；具有重组基因的高效扩增和表达能力；贴壁生长，有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可进行悬浮培养或在无血清培养基中达到高密度，培养体积能达到1000L以上；CHO细胞属于成纤维细胞，很少分泌内源蛋白，利于外源蛋白的分离纯化。

改造CHO细胞，可更好地表达外源蛋白。为减少大规模细胞培养过程中凋亡的发生，将bcl-2基因（细胞凋亡抑制基因）导入细胞，bcl-2基因的过量表达能抑制Gln或氧缺乏引起的细胞凋亡，减少细胞特定营养成分的消耗，提高细胞密度和目的蛋白产量。向CHO细胞中导入p21、p27基因，可使细胞G1期延长（细胞静止），改造后细胞活力正常，营养成分消耗和代谢毒物含量有效降低，从而减少细胞凋亡、死亡，外源蛋白表达量提高，产品成本降低。

2. 载体系统

借助真核基因表达调控的理论，可将较强的顺式作用元件集中到一个载体中，使其方便高效地表达外源基因。目前，已经构建了许多真核表达载体，它们包含适当的顺式作用元件和选择标记。顺式作用元件主要有启动子—增强子元件、转录剪切和Poly A信号等；CHO 细胞表达载体中主要有两类选择标记：非扩增基因和共扩增基因。

2.1启动子和增强子

启动子是影响外源基因表达效率的关键因素。作为表达载体元件之一，启动子既需强的转录活性，又应具备较广的应用范围。细菌的主要启动子和增强子在动物细胞中不起作用，所以大多从启动效率高且生物背景清楚的病毒基因组中分离得到。SV40、LTR和CMV启动子在CHO细胞中效果良好。有研究表明：在CHO细胞中，CMV启动子的转录活性分别是SV40启动子和LTR启动子的10倍和30倍左右。来源于噬菌体的一些启动子，如T7启动子也可用于动物细胞。除了病毒来源的启动子，现在热衷于寻找细胞内源性的启动子，如肽链延长因子基因的启动子（EF-1α）、鸡胞浆β肌动蛋白启动子等。EF-1α启动子是迄今应用中最强的启动子之一。目前商业化的表达载体中主要使用SV40、CMV和EF-1α启动子。

外源基因在哺乳动物细胞中的表达受许多因素的影响，如转录水平、转录后处理、翻译水平以及翻译后加工等方面，其中尤以转录水平的调节最为重要。在细胞中转录水平的调控是由基因的顺式作用元件与细胞内存在的反式作用因子之间的相互作用来实现，由于在特定的细胞内，反式作用因子是固定的，不可改变的，因此基因的表达主要取决于其顺式作用元件的作用。对外源基因而言，也就是决定于特定的表达载体中的启动子，一个合适的启动子可将外源基因的表达水平提高几倍甚至几十倍。但是对于特定的基因和细胞，各启动子起始转录的效率有很大的差别，因此我们认为在进行外源基因的表达研究中，应考虑选用几种不同的强启动子，才有可能获得较为理想的表达效果。与启动子相连的是增强子元件，具种、组织特异性，CHO细胞中一般采用SV40和CMV增强子。

2.2选择标记和基因扩增

CHO细胞表达载体主要有两类选择标记。一类是neo等非扩增基因，它对目的基因的拷贝数没有影响，用于构建瞬时表达载体。另一类具有基因扩增的功能，也称共扩增基因，如二氢叶酸还原酶基因（dihydrofolatereductase，dhfr），谷氨酰胺合成酶基因（glutaminesynthetase，gs）。

外源基因在CHO细胞中扩增是提高表达水平的重要策略之一。dhfr基因扩增系统最常用，当携带dhfr基因的表达质粒转染CHO细胞后，或携带dhfr基因的标志质粒与携带外源基因的表达质粒共转染CHO-dhfr-细胞后，可以得到在选择培养基生长的细胞克隆，dhfr可被叶酸类似物氨甲喋呤（Amethopterin，MTX）所抑制，不断提高MTX浓度，绝大多数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，dhfr基因均得以扩增。进行性选择抗氨甲喋呤的细胞系，结果会导致与dhfr串联在一起的外源基因的共扩增，拷贝数可增加几百到几千倍，从而使目的基因高水平表达，从而抵消氨甲喋呤的抑制效应。更重要的是，扩增的区域远远大于dhfr基因本身，即与dhfr基因相邻的DNA区域同时被扩增。但它也有缺陷，表达细胞仅限dhfr缺陷型细胞，重复筛选抗性细胞费时费力，去除选择压力后，扩增基因不稳定。细胞遗传学表明，在选择压力下，扩增基因的大小和结构处在不断变化之中。在细胞分裂的不同时间，不同的宿主细胞和选择药物使基因的扩增范围处于不断变化之中，从100～1000kb。即使是同一种细胞，选择过程不同，基因扩增的范围也不同。谷氨酰胺合成酶（GS）扩增系统是新近发展的更有效的系统，具有更高的扩增效率，但细胞长期连续培养时，生长状况不佳，DHFR系统表达水平虽较GS系统低，但细胞生长稳定。

基因扩增还可通过弱化选择标记基因表达来达到。弱化选择标记基因的表达，在使用与常规的表达载体相同的选择压力时，dhfr基因拷贝数更高，外源基因的表达水平也得到提高。如一种双顺反子载体将dhfr基因连在外源基因的3′端，从而位于外源基因3′端下游的dhfr 基因的翻译起始效率大大降低，dhfr基因表达被弱化。另一种载体将dhfr基因插入人工合成的内含子内部，两边为剪接供体SD和剪接受体SA，外源基因在内含子的下游，mRNA 剪切时，95%的dhfr mRNA被剪切掉。也有一些表达质粒不含选择基因，则必须共转染一个可表达选择基因的标志质粒，如pSV dhfr,该质粒由Psv2 dhfr去除SV40的增强子构建而成，起到弱化dhfr基因表达的作用。

2.3其它

表达载体引入天然或人工合成的内含子序列，有利于外源基因组DNA转录的mRNA

剪接内含子，增加稳定性，提高翻译效率，许多真核表达载体带有SV40的内含子。但因大多数插入的外源基因是cDNA，所以一般也用不着剪接信号。真核基因的mRNA加工需要多聚腺苷酸加尾信号（pA），实验表明，除去pA后，外源蛋白表达量降低90%。目前多采用SV40的晚期及早期pA、牛生长素基因的pA和人工合成的pA。

3. 外源基因

启动子之后是克隆的基因组DNA或cDNA。基因组DNA比cDNA表达量要高，应尽量使用基因组DNA。除此之外，可以通过下列方法增加外源基因的表达量：(1)在基因起始密码子的前后设置Kozak序列，即GCCGCCA-3/GCCA UGG+4，其中最重要的是-3位的嘌呤，其次是+4位的嘌呤。具有Kozak序列与否，翻译起始强弱会有一个数量级的差异；(2)尽量切除cDNA中的不必要序列，一方面降低转录、翻译时不必要的能量消耗，另一方面减少5′未翻译前导区和克隆中的GC尾部对表达水平的不良影响，以及减少3′未翻译区对mRNA 稳定性的不良影响；(3)拼接一个重组蛋白的信号前导肽，它可以有效地指导合成、分泌蛋白的输出等；(4)在不改变蛋白氨基酸序列的前提下，修饰个别基因的编码序列，解决密码偏性问题。实际表达中，可根据表达效果，对基因加以改造，以提高表达量。

4. 表达克隆的筛选

不同的细胞克隆，外源蛋白表达水平高低不同，原因可能有二方面，一是外源质粒片段整合入细胞染色体的位置不同，有的区域转录活性高，有的转录活性低；二是不同的细胞克隆，质粒的拷贝数是不同的。挑选高表达的单克隆细胞株一般采用两种流程：第一种方案首先通过检测外源基因的表达，逐一筛选dhfr阳性单克隆，再转到浓度持续升高的MTX之下生长，分别进行扩增；另一种方法先把dhfr阳性单克隆合并，在不断升高的MTX之下加压扩增外源基因的表达，最后挑出稳定的、高表达的单克隆细胞株。加压扩增外源基因表达，除了单纯使用dhfr扩增系统或GS扩增系统外，也可采用G418与MTX联合作用细胞，G418与MSX（methioninesulphoximine，GS抑制物）联合作用细胞，或者利用dhfr扩增系统与GS扩增系统共加压。

混合克隆的表达水平远赶不上表达较高的单个克隆，这是因为转染的CHO细胞中存在不表达或低表达的非生产细胞，并可在长期生存，甚至MTX加压时占生长优势，排斥其它高表达细胞，成为细胞群体中的主要部分，导致产量严重下降，并对MTX加压无反应。当撤除MTX，会发生外源蛋白表达量下降的情况，原因也可能在此。

5. 工程细胞大规模培养

细胞培养是现代生物学研究中应用最为广泛的技术之一。它的突出优点，一是研究对象是活的细胞，可长时期地监控、检测甚至定量评估其形态、结构和生命活动等；二是可以人为地严格控制研究条件，便于研究各种物理、化学、生物等外界因素对细胞生长、发育和分化等的影响，有利于单因子分析；三是研究的样本可以达到比较均一性。常用的细胞系均是性质均一的细胞，需要时还可采用克隆化等方法使细胞进一步纯化；四是研究的内容便于观察、检测和记录。体外培养的细胞可采用显微镜，电镜等直接观察记录，充分满足实验的要求。另外还具有研究范围比较广泛，研究费用相对经济等优点。

然而，细胞培养也有其局限性。由于培养的细胞脱离了机体复杂的环境条件，其细胞形态和功能都会发生一定程度的改变。尤其是体外反复传代、长期培养的细胞，有可能发生染色体非二倍体改变等情况。因此，应将体外培养的细胞视为一种既保持动物体内原细胞一定的性状又具有某些改变的特定的细胞群体。

由于细胞培养技术的优点是其他实验方法和技术所不能比拟的，所以近年来细胞培养技术在分子生物学、细胞生物学、遗传学、老年学、免疫学、肿瘤学和病毒学等很多领域都得到了广泛的应用，其中对于分子生物学家及细胞生物学家而言，应用细胞培养对感兴趣的基因产物进行定位、运动及功能研究变得越来越重要。在克隆一个基因后的下一步，往往是将其导入不同类型细胞，以分析其表达，测定表达对细胞生长的影响，或将高表达的基因产物纯化。

5.1 血清

利用含血清培养基生产蛋白制品有许多不利，如增加培养成本和污染机会，增加纯化难度和成本，增加产品质控指标。因此，大规模生产临床使用的生物制品，应尽量减少血清的用量，最好用无血清培养基取代。为此，应尽可能增加大规模细胞培养的接种密度，以缩短生长延滞期，提高细胞比生长速率。如果接种密度较低时，在培养开始阶段，可使用含血清培养基，待细胞密度达到一定浓度(如>106/ml)，细胞进入对数生长期，再降低血清浓度或使用无血清培养基。外源蛋白的实际产量无明显下降。许多实验表明，细胞的比生长速度相对降低时，产物的比生长速率提高，原因可能是用于细胞增殖的能量减少，有利于外源蛋白的生产。

使用无血清培养墓代替含血清培养基，可克服血清带来的弊端。但失去血清中的促细胞生长因子，细胞生长减慢，密度降低，生存周期缩短，导致蛋白产最下降。因此，往往通过增加无血清培养基中的营养物质，以优化细胞培养，提高蛋白表达。用作血清替代成份的种类很多，大致可分为激素和生长因子、结合蛋白、贴壁和扩展因子及低分子量营养因子四类。有研究报道，添加BSA对促进细胞生长作用显著，丙酮酸钠、腐胺、丁酸钠有利于表达目的产物。不同的CHO工程细胞的培养基添加成份可能存在差异，一般需要自己进行摸索最优条件。

5.2 氧气和二氧化碳

一般认为动物细胞培养的适宜溶氧在10%~60%之间，过高可损伤细胞膜甚至DNA，从而导致细胞死亡。而溶氧过低又会改变细胞的代谢，降低细胞蛋白表达水平，甚至因缺氧而导致细胞逐渐死亡。胡显文等在利用多孔微载体大规模培养CHO细胞时发现，溶氧维持在

20%~45%时，对细胞表达产物和葡萄糖代谢无明显影响，但溶氧降至7%~9%时，细胞表达水平明显降低，葡萄糖代谢转化为乳酸

的比例上升，培养基的有效利用率明显降低。

随着细胞培养规模和密度的增大，可导致CO2积聚，从而对细胞产生毒性作用或者改变细胞代谢水平。CHO细胞大规模培养的生物反应器中，最适CO2水平为4%~10%。当达到14%时便会阻碍细胞生长。高CO2分压使重组CHO细胞系的生长和组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)产率均受到抑制，而且t-PA糖链中包含N-羟乙酰神经氨酸的唾液酸比例稍下降。

5.3 氮和乳酸

氨和乳酸是细胞培养过程中的主要代谢副产品。与乳酸相比，较低浓度的氨就会对重组CHO细胞产生明显的抑制作用，最终的细胞密度随着氨浓度的提高而降低。氨来源于两方面：一是直接来源于培养基，一是细胞代谢产生。二者都涉及谷氨酸胺，因此需要防止培养基中Gln自然分解，限制Gln用量，并尽量去除培养基中的氨。乳酸是细胞糖代谢的产物，高浓度的乳酸也会抑制细胞的生长。氨和乳酸对细胞的毒性作用在多种不同的细胞系均存在，不同细胞系对于这两种代谢产物的耐受性差别很大，原因可能是不同细胞系葡萄糖和谷氨酰胺代谢过程中关键酶的敏感性不同，或者在不良的生长环境下，氨基酸代谢发生改变。由于Gln和葡萄糖代谢的相互影响，因此降低培养基中葡萄糖浓度以及减少乳酸产生的同时，必须平衡葡萄糖和Gln的比例。

6. 问题和展望

外源蛋白在CHO细胞中表达的影响因素非常复杂，建立稳定、高效表达的重组CHO 细胞系并非易事。目前主要存在问题如下：重组CHO细胞生产效率低；某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化；重组CHO细胞上游构建与下游分离纯化脱节，主要表现为上游构建时着重考虑它的高效表达，而对产物的分离纯化过程考虑较少；重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下。

重组蛋白在CHO细胞中高效表达是一个涉及多学科的问题，需多个研究领域的共同合作探讨。科研人员可能把以下问题作为今后的主攻方向：提高表达水平，如寻找一些新的强启动子和合适的增强子、在载体上装配适合基因高效表达的必要元件、根据CHO细胞翻译特点，调整外源基因密码子等；注重分离纯化的问题，如改变DNA中的个别序列，使表达产物在不影响生物活性的前提下，携带有利于分离纯化的基因；细胞培养的低成本、高密度、高产量和培养设备的大型化，自动化、精巧化；分离纯化的低成本和高活性回收率等方面。

（二）CHO-dhfr-/MTX表达系统的应用

1. 表达重组人促红细胞生成素细胞的筛选

人促红细胞生成素（EPO）是人肾（成年）和肝（胎儿）合成的一种糖蛋白，是调节和维持红细胞生理循环的重要激素。它特异刺激骨髓红系细胞增殖，使机体内红细胞维持在一个正常水平。由于糖基化对EPO体内活性必不可少，因此重组EPO只能在哺乳动物细胞中表达，才能进行糖基化等翻译后修饰，从而生产有体内活性的EPO。

构建表达质粒，取10μg纯化后的表达质粒转染含5ml F12的25cm2培养皿中的

CHO-dhfr-细胞，48h后，经胰蛋白酶消化后进行细胞计数，用F12培养液将其稀释成1×

104cells/ml，置37℃CO2培养箱中培养，当细胞形态恢复正常后，换用DMEM培养液，置CO2培养箱中继续培养，约15d后出现肉眼可见的细胞克隆。此时可用弯头吸管挑取细胞克隆至96孔细胞培养板中培养，同时在培养液中添加MTX，其初浓度为1×10-7mol/L，细胞充分适应并恢复正常生长后，提高MTX的浓度为4×10-7mol/L，继续培养，至16×10-7mol/L、64×10-7mol/L，依次4×递增。为提高EPO的表达效率，在MTX加压的过程中选择条件培养基α-MEM代替DMEM。在加压过程中，不能耐受MTX高压的细胞逐渐死亡，能耐受MTX高压的细胞存活下来。随着加压的进行，细胞表现出比正常生长速度慢一些的生长趋势，但能在2-3d内恢复正常，并且传代后继续正常生长。在适当的时候将96孔板内的细胞转入24孔细胞培养板中，然后再转入30ml细胞培养瓶中培养，至此细胞克隆工作即告完成。在挑选克隆的过程中，应挑取加压后表达水平提高较明显的细胞株，而非一开始表达量较高的细胞。在收集培养液的前2d，改用无血清培养液维持。

2. 表达人组织型纤溶酶原激活剂t-PA细胞的筛选

人组织型纤溶酶原激活剂t-PA在人体凝血与纤溶平衡中发挥着重要的作用，它与血栓主要成分纤维蛋白有较强的亲和力，可选择性的溶解血栓。但t-PA在自然界含量甚微，难以大量制备，基因工程手段在哺乳动物细胞中高效表达t-PA是大量获得的一种有效途径。第一个由重组哺乳动物细胞规模化生产的医用蛋白就是治疗急性心肌梗塞的溶血栓药物：人组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）。同样采用dhfr-MTX系统表达，受体细胞选用CHO系统。

采用电击介导法转染CHO-dhfr-细胞系，混合加压筛选高表达克隆株。流程如下：

CHO-dhfr-细胞2×107个+表达质粒200μg+鲑精DNA 200μg

电击（电容760μF、电压250V、放电时间1000ms）

完全培养基（细胞恢复2d后1：5传代）

选择培养基(选择转染细胞4～5d)

1×10-9mol/L MTX加压

约14后克隆出现

胰酶消化混合克隆，逐步提高MTX浓度到2×10-8mol/L

30d

用5×10-8mol/L MTX选择培养基逐级稀释传代

14d

挑选单克隆细胞，测表达水平

将高表达阳性克隆株扩展，在1×10-7mol/L MTX下再亚克隆

获得高效稳定表达克隆株

以往表达研究中，dhfr标记基因的SV40早期启动子上游含有SV40 enhancer，dhfr基因表达良好，MTX浓度一般要提高到1×10-6mol/L才能得到t-PA较高水平表达，细胞常会产生抗MTX的突变，限制了进一步提高MTX浓度来实现外源基因的高效表达。去掉促进dhfr 基因转录enhancer，dhfr表达能力减弱，在较低MTX浓度下，就能迫使dhfr与外源基因共扩增，获得较高水平的t-PA表达，且提高表达水平的潜能较大。本研究在1×10-7mol/L MTX 较低浓度下获得了FrGGI较高水平的表达，得到了预期目的。

3. 重组人干扰素rhIFN-β在CHO细胞上的表达

重组人干扰素rhIFN-β是具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节作用的重要细胞因子，主要由成纤维细胞和某些上皮细胞产生的一种糖蛋白。CHO细胞与大肠杆菌表达的IFN-β相比，具有较高的抗病毒比活性，较小的副作用以及较长的半衰期。据报道，IFN-β的基因与SV40早期启动子融合，与选择性dhfr标记基因共转染二氢叶酸还原酶基因缺陷的CHO细胞，通过增加MTX浓度，挑选抗性CHO细胞的转化体，目的基因和选择标记基因被扩增。建立的CHO细胞系，每24h可分泌IFN-β200,000～300,000IU/ml，并且不需要诱导，表达量10倍于人成纤维细胞诱导产生的量。该细胞产生的IFN-β经过纯化后，与人成纤维细胞产生的IFN-β具有相同的理化特性和抗病毒比活性。

将重组质粒转化大肠杆菌DH5α，扩大培养后，抽提质粒用紫外分光光度计定量消化并计数CHO细胞，取1.0×105～3.0×105cells孔于24孔板的各孔中，使转染时细胞能长满90%～95%，加0.5ml无抗生素血清的培养基培养的细胞。每孔转染的细胞，稀释0.8～1.0μg DNA于50μl无血清培养基中；稀释1～3μl LF2000试剂于OPTI MEMI培养基中，室温孵育5min。LF2000试剂稀释后，30min内与DNA合并，室温孵育20min形成DNA LF2000试剂复合物。DNA LF2000试剂复合物（100μl）直接加到各孔中，前后轻摇细胞板以混合。37℃、CO2孵箱内孵育24～48h直到转移基因表达，不必除去复合物和换培养基。转染后24h，以1∶10或更高的稀释度传细胞到新鲜的培养基中。转染后2～3d，抗生素加压，使用400μg/ml的G418浓度，用含抗生素的选择培养基换液，每周2次。10～14d后，可见抗性克隆。待克隆长至合适大小时，用Costar毛细管挑取单克隆到96孔板，逐渐转移到24孔板、6孔板，直到小方瓶。并用抗病毒活性测定筛选阳性克隆，将表达量较高的细胞株，传代扩增冻存。

在小方瓶中培养挑选细胞，逐步增加MTX浓度，从1.0×10-8、5.0×10-8、1.0×10-7、3.0×10-7及6.0×10-7mol/L。每一浓度至少维持两代，以防止抗MTX细胞系产生，而dhfr 及外源基因并没有得到扩增。每个浓度细胞的适应时间约为2周，适应后继续传代2次，冻存2管种子细胞，留2管继续加压。并留取细胞培养上清以检测IFN-β的表达。最终选择生长状态良好、稳定高产的细胞株作为生产备选细胞株。

4. 嵌合抗CD-20抗体分子在CHO细胞中的表达

抗CD-20 单克隆抗体Rituximab在治疗B淋巴细胞瘤方面已表现出显著的临床效果。CHO-dhfr-细胞的转染采用质脂体转染法，将表达载体共转染CHO-dhfr-细胞，细胞被转染24小时后换新鲜的IMDM选择培养基（含10%的透析胎牛血清，500mg/L的G418），每4天换一次液，直至细胞克隆形成。

将生长稳定的转染细胞系，在选择培养基中加入10-8mol/L MTX，培养2～3周后继续以10倍的MTX浓度梯度加压培养，直至MTX浓度达到10-6mol/L。

5. 抗HBsAg人IgG（重组乙肝疫苗）在CHO细胞中的表达

多年来，对CHO细胞疫苗的研究已取得很大进展。CHO细胞疫苗已取代乙肝疫苗大量用于人体。CHO细胞缺失二氢叶酸还原酶（dhfr），经转染可将dhfr重组到CHO细胞中，含有dhfr表达载体的重组CHO细胞，经过MTX培养筛选可克隆出表达乙肝细胞疫苗的重组CHO细胞，该细胞生长快，易于单层或悬浮培养。

将转染完成后的CHO细胞按1∶5密度接种于含10%小牛血清，700μg/ml G418的DMEM培养基，约2周后将筛选到的阳性克隆用胰酶消化，接种到10%小牛血清和0.005μM MTX的DMEM培养基中进行基因扩增，待细胞在该浓度的MTX环境中充分适应后，按0.02μM，0.1μM，0.5μM，2.0μM的顺序依次增加MTX的浓度，利用夹心ELISA法检测抗体的表达情况。选取2个高效表达克隆株进行加压培养。加压期间不断用夹心ELISA 检测嵌合抗体的表达情况来决定MTX的浓度改变时间。

6. 表达人粒细胞集落刺激因子（hG-CSF）的CHO细胞的筛选

人粒细胞集落刺激因子（hG-CSF）是一种造血生长因子，对粒细胞减少症具有显著功效，天然hG-CSF cDNA由于其本身的结构特点，很难在大肠杆菌中高效表达，基因工程技术可大量生产药用重组hG-CSF（rG-CSF）。

将G-CSF重组质粒转化大肠杆菌，挑选阳性克隆提取质粒，经电击法转染CHO细胞。转染一周的CHO细胞经过0.05%胰蛋白酶消化，用CHO选择培养基将细胞配成1.0×

105cells/ml，置24孔培养板中进行筛选培养，每隔3~4天更换一次新鲜培养液，经过3~4

周的选择性培养，取长满2/3细胞孔的上清，测定其中G-CSF含量，筛选出表达G-CSF的CHO细胞。采用MTX加压系统继续筛选高表达G-CSF的CHO细胞。MTX浓度依次为0.02，

0.08，0.32，1.28，5.12μM 4倍递增，获得高表达G-CSF的CHO细胞。当MTX浓度到达

1.0μM时，G-CSF含量达到最高峰10.52×104IU/ml。

7. 嵌合抗体在CHO细胞中的表达

嵌合抗体是利用DNA重组技术将鼠单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达出人鼠嵌合抗体，其人源化程度达到70%左右，完整地保留了异源单抗的可变区，最大限度地保持了其亲和活性，降低了免疫原性。但由于人鼠嵌合抗体仍然保留了30%的鼠源性，可诱发人抗小鼠反应HAMA（人抗鼠抗体）。因此需要构建新型的嵌合抗体真核高效表达载体。为此我们采用基因工程技术对鼠单抗进行人源化改造，利用二氢叶酸还原酶基因（dhfr）在氨甲喋呤加压下扩增而使其邻近的基因随之扩增的原理，将单抗的可变区基因克隆到含有弱化启动子驱动选择标志基因的真核高效表达载体中，构建抗人/鼠嵌合抗体基因，并在CHO细胞中实现了稳定高产量表达。

将1×106个CHO-dhfr-细胞接种于25cm2培养瓶中，加IMDM完全培养基于50ml/L，CO2 37℃培养36h。采用Lipofectin诱导转染，同时转染空载体作为对照。转染用的DNA

为4μg，Lip为10ml。转染后6h，换含100ml/L的透析血清的IMDM培养基培养（不含次黄嘌呤和胸腺嘧啶）。3d后换液，用300nmol/L MTX进行加压筛选，待2星期左右出现阳性细胞克隆时，扩大培养进行后续实验。

8. 其它

（1）Epstein－Barr病毒膜抗原在CHO细胞的表达

（2）人白细胞介素在CHO细胞表达

（3）表达人α防御素细胞株筛选

（4）猪瘟病毒E0基因在CHO细胞中的表达

CHO-dhfr-/MTX表达体系在真核表达系统中应用十分广泛。这几个方面的应用在重组载体构建、CHO-dhfr-细胞转染、高效表达细胞株的筛选和重组蛋白的诱导表达等方面与另7个应用均有相似之处。不做另行介绍。

（三）讨论

有些天然的具有生物活性的蛋白类物质，在人类疾病的治疗中发挥着巨大的作用。但是这些活性物质，有些在自然界中含量很少，满足不了人们的需要；有些含异源蛋白太多，纯化难度大等缺点，基因工程药物的产生解决了这些难题，具有跨时代的意义，是生物技术水平发展的重要标志之一。重组蛋白质药物具有活性高、用量少、易于规模化生产等优点，是国内外生物药物开发的重点。

细胞表达源蛋白最重要的是要保持其天然结构及活性。而早期的原核表达系统不能分泌有活性的蛋白，都是以内涵体的形式存在的，真核表达系统因为具有转录后的修饰加工功能，包括蛋白折叠、二硫键形成、亚基多聚化、肚链裂解、蛋白磷酸化以及N型和O型糖基化等，因而表达的重组蛋白在结构和功能方面更接近于天然的蛋白分子，具有生物活性，可分泌胞外。CHO细胞是外源蛋白表达运用得较为成功的哺乳动物细胞，其用于外源基因表达也具有很多优点，如外源基因能够稳定整合于细胞染色体内，易于规模化培养等。

由于CHO-dhfr-细胞自身缺失二氢叶酸还原酶（dhfr），无法自身合成四氢叶酸，所以必须在添加了次黄嘌呤（hypoxanthine）、胸腺嘧啶（Thymidine）和甘氨酸的培养液中才能得以存活。而通过目的基因与dhfr基因共转染，不仅得到在不含上述添加剂的培养基上也能生长的细胞克隆，更为重要的是由于dhfr可被叶酸类似物MTX所抑制，在MTX浓度选择压力下，dhfr基因必须扩增到很多的拷贝数才能生存，从而得到抗MTX细胞系；又由于与dhfr基因共转染的目的基因倾向于同它一起整合到细胞染色体上的同一区域，所以编码外源重组蛋白的序列片段也随着dhfr基因的扩增而扩增，我们就得到了能大量表达外源蛋白的细胞克隆，这在基因工程抗体及各种基因工程蛋白的表达中是可行度很高的一种措施。

上面也提到影响重组蛋白在CHO细胞中表达的因素很多，涉及CHO细胞表达体系、表达载体系统、外源基因、表达细胞株的加压扩增与筛选、细胞大规模培养等。我认为表达载体的构建是影响细胞能否表达的关键问题，因为dhfr基因及邻近区段染色体DNA拷贝数是共扩增的关系，因此必须将外源基因片段整合到dhfr基因的上游或者下游，位置不能太远，否则无论如何筛选也得不到表达外源基因产物的细胞，因此说它是能否表达的关键，当然其它步骤也不能忽略，如CHO-dhfr-细胞转染、使用强启动子等。如果构建成功可以产生外源蛋白，那么筛选高表达的细胞株等操作就是提高外源蛋白表达量的问题，使外源蛋白高效表达，也是很有意义的，为大规模培养奠定基础。

MTX筛选扩增系统，常需在MTX选择压力下，经过长期的筛选。因此MTX加压筛选是需要时间和耐心的，但是细胞培养的条件要合适，如培养基的选用（CHO细胞一般采用F-12培养基），营养成分的适量（L-谷氨酰胺），培养液的新鲜等，首先要保证细胞正常的生长和存活，这样才能缩短加压筛选的周期。另外也要等细胞适应这个压力并恢复正常生长后再继续加压，提高MTX浓度，可以成倍数递增，待细胞适应新的压力并恢复正常生长时再继续，同时还要保存每个MTX浓度下的细胞种子。因为在此后的细胞培养的过程中，随着MTX的撤离和细胞传代次数的增加，转染细胞高表达抗体的能力常会逐渐下降甚至丧失。因此，即使是来源于同一细胞株的各个亚克隆细胞之间，其抗体表达量也常不均一。CHO转染细胞的这种不稳定性，可能是由于细胞内外源基因拷贝数的丢失或转录效率下降等所致。对此尚有待进行深入地研究。但这一现象提示，在筛选建株的早期，应采取措施及早鉴定各个细胞克隆表达的稳定性，并及时大量保存稳定高表达的细胞种子，或适时地对细胞株用MTX再加压和克隆化筛选，以保持转染细胞高表达抗体的能力。应及时用MTX对细胞株进行再加压筛选，以保持细胞稳定表达抗体的能力。

有报道称加压方式对表达量的提高和细胞株表达的稳定性有较大的影响。小梯度多次加压有利于最终得到高表达细胞株，且细胞株表达稳定，比大幅度快速加压能够得到表达水平更高的克隆。大幅度加压可以在短期内得到高表达克隆株细胞，但是最终表达水平并不比小幅度多次加压得到的细胞株表达量高，而且细胞株表达往往不稳定，在撤掉筛选压力后，表达水平往往下降。在大幅度加压筛选过程中，可能由于种种原因dhfr基因发生突变，突变后的DHFR对MTX的亲和力降低，因而突变细胞株的基因扩增倍数也低，目的基因无法高表达，更易产生非生产性克隆。

在细胞需要大量增殖时可采用高浓度的血清，以尽快提高细胞的密度。在大规模培养的过程中，要收集培养液，纯化产品时，为避免血清对生物活性的抑制作用和防止对后续试验的干扰，应选用了完全无血清、低蛋白的和便于外源重组蛋白表达的CHO专用无血清培养基。

使用无血清培养基代替含血清的培养基，可克服有血清的弊端，但失去了血清中丰富的促细胞生长的因子，细胞在无血清培养基中的生长常常减慢，密度降低和生存周期缩短，因而可使表达产物产量下降。因此，人们往往通过增加无血清培养基中的营养物质，以达到优化培养细胞、提高外源基因表达的目的。这些营养物质包括：促贴壁物质、促生长因子及激素、酶抑制剂、结合蛋白和转运蛋白、微量元素等。

在大规模培养过程中防止微生物的污染也是一个世界性的问题。体外生长的细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，因此培养基应达到无化学物质污染、无微生物污染（如细菌、真菌、支原体、病毒等）、无其他对细胞产生损伤作用的生物活性物质污染（如抗体、补体）。对于天然培养基，污染主要来源于取材过程及生物材料本身，应当严格选材，严格操作。对于合成培养基，污染主要来源于配制过程，配制所用的水，器皿应十分洁净，配制后应严格过滤除菌。同时在组织细胞培养工作中，要保持环境的洁净；严格控制实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基冲加入适量的抗生素等。