SDS-PAGE试剂配方

SDS-PAGE电泳所用溶液：

30 %聚丙烯酰胺溶液(100 mL)

丙烯酰胺(Arc) 29 g

N,N’-亚甲双丙烯酰胺(Bis) 1 g

用双蒸水定容至100mL，过滤备用，4℃存放

丙稀酰胺29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g，加入去离子水定容至100mL，pH值不能超过7.0，过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。

5×Tris-甘氨酸缓冲液(1 L)

Tris碱15.1 g

甘氨酸(电泳级) 94 g

10 %SDS 50 mL

使用时稀释5倍使用

2×SDS凝胶加样缓冲液(10mL)

0.5 mol/L Tris-Cl (pH 6.8) 2 mL

10％(W/V)SDS 4 mL

甘油 2 mL

β-巯基乙醇 1.0 mL

(DTT（二硫苏糖醇）0.31g)

溴酚兰0.02g

双蒸水0.5 mL

室温存放备用

考马斯亮蓝染色液

考马斯亮蓝R-250 （G-250） 1.0 g

甲醇450 mL

冰醋酸100 mL

ddH2O 450 mL

0.2g考马斯亮蓝R250+84mL 95％乙醇+20mL冰醋酸，定容至200mL，过滤备用

考马斯亮蓝脱色液（甲醇脱色液效果好，但有毒性）

甲醇100 mL

冰醋酸100 mL

ddH2O 800 mL

医用酒精：冰醋酸：水=4.5：0.5：5(V：V：V)

SDS-PAGE所需溶液:

A液——30％丙稀酰胺（W/V）：丙稀酰胺29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g，加入去离子水定容至100mL，pH值不能超过7.0，过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。

B液——1.5mol/L Tris·HCl，pH8.8：18.17g（9.09g）Tirs碱，溶于80mL（40mL）去离子水中，加入约

3mL(1.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至8.8，定容至100mL（50mL）。

C液——1.5mol/L Tris·HCl，pH6.8：12.1g（6.05g）Tirs碱，溶于80mL（40mL）去离子水中，加入约7mL(3.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至6.8，定容至100mL（50mL）。

D液——10％SDS：10g (2g)SDS溶于去离子水中，定容至100mL(20mL)，加热至68℃助溶。

E液——10％过硫酸铵：5g(0.5g)过硫酸铵，溶于50mL(5mL)去离子水中；现配现用或分装至0.5mL离心管中冷冻备用。

F液——TEMED(N-N-N`-N`－四甲基乙二胺)原液，室温保存。

表1.配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液

10 %胶

水 1.9 4.0 5.9 7.9 9.9 11.9 15.9 19.8 30 %丙烯酰胺混合液 1.7 3.3 5.0 6.7 8.3 10.0 13.3 16.7 1.5 mol/L Tris(pH8.8) 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 10.0 12.5 10 % SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10 % 过硫酸铵0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02

表2. 配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶所用溶液

成分配制不同体积和浓度凝胶所需各成分的体积/ml

SDS-PAGE电泳标准操作流程

SDS-PAG电泳标准操作规程（网上） 3. 程序: 端平齐。放于制胶架上夹紧，下端紧贴密封条。 3.1.2分离胶的配置 3.122 灌胶混匀后用移液枪将凝胶溶液沿玻棒小心注入到长、短玻璃板间的狭缝内（胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm）。 3.1 . 2.3液封在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气，使胶面平整。静置约30min观察胶面变化，当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝固，倒掉上层水，并用滤纸吸干残留的水液。 3.1.3浓缩胶的配置混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内（分离胶上方），轻轻加入样品模板梳，小心避免气泡的出现。约30分钟，聚合完全。 3.2.1安装电泳槽将制备好的凝胶板取下，小心拔下梳子。两块10%勺凝胶板分别插到U形橡胶框的两边凹形槽中，可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，其下缘与贮槽框下缘对齐，放入电泳槽内。倒入1X tris-gly 电泳缓冲液。 3.2.2 样品处理对于蛋白样品直接取80 pl的样品，依次加上20Q 5x buffer （加了B-巯基乙醇），混匀。对于菌体或组织等固体样品，取少量样品加100ul 2x buffer （加了B-巯基乙醇）煮沸10分钟。 3.2.3 加样用移液枪取处理过的样品溶液10 p l，小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内，marker加入到其中一个槽内，为区别两块板，marker可加在不同的孔槽中。 3.2.4电泳将电泳槽放置电泳仪上，接通电源，正负极对好。电压调至约150v保持恒压。待溴酚蓝标记移动到凝胶底部时，关电源，把电泳缓冲液倒回瓶中。 3.2.5剥离胶把电泳槽取出，两块板拿下来，用刮片从长短玻片中间翘起，再把浓缩胶刮掉，取下。 3.3. 染色放于加有R250染色液的染色皿中，染液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时, 完成后染液倒掉并用水洗掉染液。 3.4. 脱色取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里，脱色液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时，本底色脱净，条带清晰可见即可，完成后倒掉脱色液。 3.5. 拍照将脱色后的胶置于透明文件夹中，把胶上面的气泡赶出（用前也可用酒精棉球擦干净文件夹），放到扫描仪上，拍照。 4. 注意事项 4.1 根据目的蛋白的大小选择合适的胶片浓度。一般为100KD-50KD选用10%交；50KD-30KD选用12%胶； 30KD-10KD选用15%交。4.2 要根据样品浓度来加样品溶解液。每加一个样品后换一支吸头或清洗吸头后再点另一个样品。4.3 制备聚丙烯酰胺凝胶时，倒胶后常漏出胶液，那是因为二块玻璃板与塑料条之间没封紧，留有空隙，所以这步要特别留心操作.4.4 电泳完毕撬板取凝胶时要小心细致不能把胶弄破。 4.5 电泳缓冲液可重复利用，如果胶上出现不正常痕迹，就要及时更换新液。 4.6 分离胶高度控制得当，确保有大约1cm左右的浓缩胶空间。过长或过短均不能得到理想的电泳结果。 4.7 电泳染色液注意进行回收再利用，一般可重复使用2-3次。4.8 AP和TEMED是催化剂，加入的量要合适，过少则凝胶聚合很慢甚至不聚合，过多则聚合过

SDSPAGE电泳试剂配制

SDS-PAGE电泳试剂 1) 30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲基双丙烯酰（Bis）1.0g，混匀后加ddH 2 O， 37O C溶解,定容至100 mL,棕色瓶存于4O C； 2) 1.5M Tris-HCl(pH 8.8)：Tris 18.17g加ddH 2 O溶解,浓盐酸调pH至8.0,定容至100mL； 3) 1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11g加ddH 2 O溶解,浓盐酸调pH至6.8,定容至100 mL； 4) 4?分离胶缓冲液： 0.4gSDS溶于1.5M Tris-HCl(pH 8.8)，定容至100mL； 5) 4?浓缩胶缓冲液： 0.4gSDS溶于1M Tris-HCl(pH 6.8)，定容至100mL； 6) 10?电泳缓冲液(pH 8.3)： Tris 3.029g，甘氨酸14.415g，SDS 1g加ddH 2 O溶解,定容至100mL； 7) 10%过硫酸铵（Aps,现配）：1g AP加ddH 2 O至10mL； 8) 2?SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH 6.8)2.5mL，?-巯基乙醇1.0mL，SDS 0.6g，甘油2.0 mL，0.1%溴酚兰 1.0 mL，ddH 2 O 3.5mL； 9) 考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰R 2501.25g，甲醇225 mL，冰醋酸50 mL，ddH 2 O 225mL； 10) 脱色液: 甲醇、冰醋酸、ddH 2 O以2∶1∶7配制而成； 11) 分离胶(12.5%): ddH 2 O 4mL，30%储备胶5 mL， 4?分离胶缓冲液3mL, 10% Aps 0.1mL(现配)，TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μL； 12) 浓缩胶（5％）：ddH 2 O 2.65mL，30%储备胶0.85mL，4?浓缩胶缓冲液1.25mL， 10%Aps 50μL，TEMED 5μL。 Tricine（三羟甲基氨基甘氨酸）- SDS - PAGE蛋白质电泳 1 Tricine - SDS - PAGE蛋白质电泳溶液准备

SDS-PAGE凝胶配制试剂盒

SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒简介：聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis ， SDS-PAGE)，其原理在于聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开，主要用于分离蛋白质和寡核苷酸。 SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒不仅可用于配制SDS-PAGE 凝胶，也可配制非变性(native)PAGE 凝胶，具体配制的量应根据器具大小决定。组成：操作步骤(仅供参考)： 1、配制10%过硫酸铵：直接在Ammonium Persulfate 中加入蒸馏水，充分溶解，分装成小份储存于-20℃或4℃。注意：一般用1.5mlEP 管分装成0.5-1ml 每支，-20℃保存，每支使用2-3次即弃用。短期使用时，可保存于4℃，1周有效。 2、根据目的蛋白分子量大小选择合适的凝胶浓度，按照下表配制分离胶(下层胶)：不同浓度的SDS-PAGE 分离胶的最佳分离范围： SDS-PAGE 分离胶浓度最佳分离范围 6%胶 50-150kD 8%胶 30-90kD 10%胶 20-80kD 12%胶 12-60kD 15%胶 10-40kD 成分配制不同体积SDS-PAGE 分离胶所需各成分的体积(ml) 编号名称 PE0018 30T Storage 试剂(A): 30% Acr-Bis(29:1) 100ml 4℃ 避光试剂(B): 1.5M Tris-HCl(pH8.8) 100ml RT 试剂(C): 10% SDS 5ml RT 试剂(D): Ammonium Persulfate 0.5g RT 试剂(E): TEMED 2×1ml 4℃ 避光使用说明书 1份

SDS-PAGE试剂配方

SDS-PAGE电泳所用溶液： 30 %聚丙烯酰胺溶液(100 mL) 丙烯酰胺(Arc) 29 g N,N’-亚甲双丙烯酰胺(Bis) 1 g 用双蒸水定容至100mL，过滤备用，4℃存放丙稀酰胺29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g，加入去离子水定容至100mL，pH值不能超过7.0，过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。 5×Tris-甘氨酸缓冲液(1 L) Tris碱15.1 g 甘氨酸(电泳级) 94 g 10 %SDS 50 mL 使用时稀释5倍使用 2×SDS凝胶加样缓冲液(10mL) 0.5 mol/L Tris-Cl (pH 6.8) 2 mL 10％(W/V)SDS 4 mL 甘油 2 mL β-巯基乙醇 1.0 mL (DTT（二硫苏糖醇）0.31g) 溴酚兰0.02g 双蒸水0.5 mL 室温存放备用考马斯亮蓝染色液考马斯亮蓝R-250 （G-250） 1.0 g 甲醇450 mL 冰醋酸100 mL ddH2O 450 mL 0.2g考马斯亮蓝R250+84mL 95％乙醇+20mL冰醋酸，定容至200mL，过滤备用考马斯亮蓝脱色液（甲醇脱色液效果好，但有毒性）甲醇100 mL 冰醋酸100 mL ddH2O 800 mL 医用酒精：冰醋酸：水=4.5：0.5：5(V：V：V)

SDS-PAGE所需溶液: A液——30％丙稀酰胺（W/V）：丙稀酰胺29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g，加入去离子水定容至100mL，pH值不能超过7.0，过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。 B液——1.5mol/L Tris·HCl，pH8.8：18.17g（9.09g）Tirs碱，溶于80mL（40mL）去离子水中，加入约 3mL(1.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至8.8，定容至100mL（50mL）。 C液——1.5mol/L Tris·HCl，pH6.8：12.1g（6.05g）Tirs碱，溶于80mL（40mL）去离子水中，加入约7mL(3.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至6.8，定容至100mL（50mL）。 D液——10％SDS：10g (2g)SDS溶于去离子水中，定容至100mL(20mL)，加热至68℃助溶。 E液——10％过硫酸铵：5g(0.5g)过硫酸铵，溶于50mL(5mL)去离子水中；现配现用或分装至0.5mL离心管中冷冻备用。 F液——TEMED(N-N-N`-N`－四甲基乙二胺)原液，室温保存。

SDSPE电泳试剂配制

S D S P E电泳试剂配制集团文件发布号：（9816-UATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-

SDS-PAGE电泳试剂 1) 30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲基双丙烯酰（Bis）1.0g，混匀 O，37O C溶解,定容至100 mL,棕色瓶存于4O C；后加ddH 2 O溶解,浓盐酸调pH至,定容至 2) 1.5M Tris-HCl(pH ：Tris 18.17g加ddH 2 100mL； O溶解,浓盐酸调pH至,定容至100 3) 1M Tris-HCl(pH ：Tris 12.11g加ddH 2 mL； 4) 4分离胶缓冲液：溶于1.5M Tris-HCl(pH ，定容至100mL； 5) 4浓缩胶缓冲液：溶于1M Tris-HCl(pH ，定容至100mL； O溶解, 6) 10电泳缓冲液(pH ： Tris 3.029g，甘氨酸14.415g，SDS 1g加ddH 2 定容至100mL； O至10mL； 7) 10%过硫酸铵（Aps,现配）：1g AP加ddH 2 8) 2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH ，-巯基乙醇，SDS 0.6g，甘油mL，%溴酚兰 mL，ddH O ； 2 1.25g，甲醇225 mL，冰醋酸50 mL，9) 考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰R 250 ddH O 225mL； 2 O以2∶1∶7配制而成； 10) 脱色液: 甲醇、冰醋酸、ddH 2 11) 分离胶%): ddH O 4mL，30%储备胶5 mL， 4分离胶缓冲液3mL, 10% Aps 2 (现配)，TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μL； O ，30%储备胶，4浓缩胶缓冲液， 10%Aps 50μL，12) 浓缩胶（5％）：ddH 2 TEMED 5μL。 Tricine（三羟甲基氨基甘氨酸）- SDS - PAGE蛋白质电泳 1 Tricine - SDS - PAGE蛋白质电泳溶液准备

SDS-PAGE电泳实验步骤

垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质一、实验目的学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。二、实验原理蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris —HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离子，而在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是： M r =K(10-b·m) logM r =LogK—b·R m ，式中M r ——蛋白质的分子量； logK——截距； b——斜率； R m ——相对迁移率。实验证明，蛋白质分子量在15,000—200,000的范围内，电泳迁移率与分子量

sdspage电泳试剂配制

SDS-PAGE电泳试剂 1)30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲基双丙烯酰（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100 mL,棕色瓶存于4O C； 2) 1.5M Tris-HCl(pH 8.8)：Tris 18.17g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至8.0, 定容至100mL； 3) 1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11g加ddH2O溶解,浓盐酸调pH至6.8,定容至100 mL； 4) 4?分离胶缓冲液：0.4gSDS溶于1.5M Tris-HCl(pH 8.8)，定容至100mL； 5) 4?浓缩胶缓冲液：0.4gSDS溶于1M Tris-HCl(pH 6.8)，定容至100mL； 6) 10?电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 3.029g，甘氨酸14.415g，SDS 1g加ddH2O 溶解,定容至100mL； 7) 10%过硫酸铵（Aps,现配）：1g AP加ddH2O至10mL； 8) 2?SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl(pH 6.8)2.5mL，β-巯基乙醇1.0mL，SDS 0.6g，甘油2.0 mL，0.1%溴酚兰1.0 mL，ddH2O 3.5mL； 9) 考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰R2501.25g，甲醇225 mL，冰醋酸50 mL，ddH2O 225mL； 10) 脱色液: 甲醇、冰醋酸、ddH2O以2∶1∶7配制而成； 11) 分离胶(12.5%): ddH2O 4mL，30%储备胶5 mL，4?分离胶缓冲液3mL, 10% Aps 0.1mL(现配)，TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μL； 12) 浓缩胶（5％）：ddH2O 2.65mL，30%储备胶0.85mL，4?浓缩胶缓冲液1.25mL，10%Aps 50μL，TEMED 5μL。 Tricine（三羟甲基氨基甘氨酸）- SDS - PAGE蛋白质电泳 1 Tricine - SDS - PAGE蛋白质电泳溶液准备 1）正极缓冲液(10 ×)：14g Tris 溶于400mL 重蒸水,用1. 0M HCl 调至pH8. 9 ,定容至500mL。 2）负极缓冲液(10 ×)：将60. 55g Tris ,89. 58g Tricine 及5g SDS 溶于400ml 重蒸水中,加水至终体积为500mL。 3）凝胶缓冲液(3 ×)：将181. 5g Tris ,1. 5g SDS 溶于400mL 重蒸水中,用1M

SDS-PAGE所有详细试剂配方

S D S-P A G E 30%聚丙烯酰胺溶液-----30%（w/v）Acrylamide 【组分浓度】各种组分名称配制不同体积所需各成分的体积(mL)或质量(g) 30%Acr-Bis(29:1) 1000ml 100ml 29%Acrylamide(丙烯酰胺) 290g 29g 1%BIS(N,N’-亚甲丙烯酰胺) 10g 1g 【配制方法】将29克丙烯酰胺和1克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37℃左右）的去离子水中，充分搅拌溶解，补加水至终体积为100ml。0.45μm微孔滤膜过滤除菌和杂质，储于棕色瓶，4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。【保存条件】 4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存【注意事项】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。1MTris-HCL（pH6.8）(浓缩胶buffer) 【组分浓度】1MTris-HCL 名称用量备注 Tris 12.1g 去离子水80ml 浓盐酸9ml (36%的浓盐酸)预实验已确定去离子水加入去离子水定容至100ml后，室温保存【配制方法】称量121.1gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加>0.7mL的浓HCL调节所需要的pH 值（7.4-大约0.7mL，7.6-大约0.6mL，8.0-大约0.42mL），将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。【保存条件】室温保存。【注意事项】对人体有刺激性，请注意适当防护。 1.5MTris-HCL（pH8.8）(分离胶buffer) 【组分浓度】1.5MTris-HCL 名称用量备注 Tris 18.17g 去离子水80ml 浓盐酸3ml (36%的浓盐酸)预实验已确定去离子水加入去离子水定容至100ml后，室温保存【配制方法】1L

SDSPAGE蛋白电泳手册

蛋白电泳手册 SDS-PAGE及Westernblot 蛋白电泳蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等。其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg)，分辨率高，凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用。 PAGE原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带。 SDS-PAGE原理 SDS是一种阴离子表面活性剂，能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。实验使用过程中，还加入DTT或者***，以打开蛋白间的二硫键，破坏蛋白质的四级结构。SDS—PAGE最常采用垂直板不连续系统（分离胶与浓缩胶）。

索引蛋白电泳（SDS-PAGE）…………………… 电泳试剂总表……………………………………………………制胶……………………………… 上样及电泳…………………… 染色蛋白提取蛋白定量 Bradford蛋白浓度测定试剂盒使用说明 BCA蛋白浓度测定试剂盒使用说明 Lowry蛋白浓度测定试剂盒使用说明蛋白分子量标准（图）考马斯蛋白胶快速染色液 Westernblot WesternblottingDAB检测试剂盒 WesternblottingECL化学发光检测试剂盒

SDS-PAGE电泳标准操作流程(最新整理)

SDS-PAGE电泳标准操作规程（网上） 3.程序： 3.1. 制胶 3.1.1组装胶架将洁净、无水的玻片对齐，形成空腔，插入塑料框的凹槽中，注意箭头向上，并确保下端平齐。放于制胶架上夹紧，下端紧贴密封条。 3.1.2 分离胶的配置 3.1.2.1 10%分离胶配方如下表： 10%胶蒸馏水30%Acr- Bis(29:1)1.5M Tris-Hcl PH 8.8 10%SDS10%AP (过硫酸铵) TEMED 5 ml 1.3 ml 1.7 ml 1.9 ml0.05 ml0.05 ml0.007ml 3.1.2.2 灌胶混匀后用移液枪将凝胶溶液沿玻棒小心注入到长、短玻璃板间的狭缝内(胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm)。 3.1．2.3液封在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气，使胶面平整。静置约30min观察胶面变化，当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝固，倒掉上层水，并用滤纸吸干残留的水液。 3.1.3浓缩胶的配置 3.1.3.1 5%浓缩胶配方下表： 5%胶蒸馏水30%Acr-Bis(29:1)0.5M Tris-Hcl PH 6.810%SDS10%AP (过硫酸铵) TEMED 2 ml 1.4 ml0.3 3 ml0.25ml0.02 ml0.02 ml0.02 ml 3.1.3.2插入制胶梳混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内(分离胶上方)，轻轻加入样品模板梳，小心避免气泡的出现。约30分钟，聚合完全。 3.2. 电泳 3.2.1 安装电泳槽将制备好的凝胶板取下，小心拔下梳子。两块10%的凝胶板分别插到U形橡胶框的两边凹形槽中，可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，其下缘与贮槽框下缘对齐，放入电泳槽内。倒入1X tris-gly电泳缓冲液。 3.2.2 样品处理对于蛋白样品直接取80μl的样品，依次加上20μl 5x buffer (加了B-巯基乙醇)，混匀。对于菌体或组织等固体样品，取少量样品加100ul 2x buffer (加了B-巯基乙醇)煮沸10分钟。 3.2.3 加样用移液枪取处理过的样品溶液10μl，小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内，marker 加入到其中一个槽内，为区别两块板，marker可加在不同的孔槽中。 3.2.4 电泳将电泳槽放置电泳仪上，接通电源，正负极对好。电压调至约150v保持恒压。待溴酚蓝标记移动到凝胶底部时，关电源，把电泳缓冲液倒回瓶中。 3.2.5剥离胶把电泳槽取出，两块板拿下来，用刮片从长短玻片中间翘起，再把浓缩胶刮掉，取下。 3.3. 染色放于加有R250染色液的染色皿中，染液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时，完成后染液倒掉并用水洗掉染液。 3.4.脱色取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里，脱色液漫过胶即可，置于摇床上，转速约为45r/min，时间约1小时，本底色脱净，条带清晰可见即可，完成后倒掉脱色液。 3.5.拍照将脱色后的胶置于透明文件夹中，把胶上面的气泡赶出（用前也可用酒精棉球擦干净文件夹），放到扫描仪上，拍照。 4. 注意事项 4.1 根据目的蛋白的大小选择合适的胶片浓度。一般为100KD-50KD选用10%胶；50KD-30KD选用12%胶；30KD- 10KD选用15%胶。4.2 要根据样品浓度来加样品溶解液。每加一个样品后换一支吸头或清洗吸头后再点另一个样品。4.3 制备聚丙烯酰胺凝胶时，倒胶后常漏出胶液，那是因为二块玻璃板与塑料条之间没封紧，留有空隙，所以这步要特别留心操作.4.4 电泳完毕撬板取凝胶时要小心细致不能把胶弄破。 4.5 电泳缓冲液可重复利用，如果胶上出现不正常痕迹，就要及时更换新液。4.6 分离胶高度控制得当，确保有大约1cm左右的浓缩胶空间。过长或过短均不能得到理想的电泳结果。4.7 电泳染色液注意进行回收再利用，一般可重复使用2-3次。4.8 AP和TEMED是催化剂，加入的量要合适，过少则凝胶聚合很慢甚至不聚合，过多则聚合过快，影响倒胶。

Tricine-SDS-PAGE凝胶配制试剂盒

Tricine-SDS-PAGE 凝胶配制试剂盒简介：聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis ，SDS-PAGE)原理在于聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯酰胺凝胶；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开，主要用于分离蛋白质和寡核苷酸。常规SDS-PAGE 凝胶电泳适用于分离大分子蛋白，对于小分子量的蛋白或多肽，分辨率大大降低。 Leagene Tricine-SDS-PAGE 电泳能够较好的分离10KD 以下的蛋白或多肽，是电泳法分离多肽的主要方法，具体配制的量应根据器具大小决定。电泳分离后可直接考马斯亮蓝染色、银染等。组成：操作步骤(仅供参考)： 1、配制10%过硫酸铵(APS)：直接在Ammonium Persulfate 中加入蒸馏水，充分溶解，分装成小份储存于-20℃或4℃。注意：一般用1.5mlEP 管分装成0.5-1ml 每支，-20℃保存，每支使用2-3次即弃用。短期使用时，可保存于4℃，1周有效。 2、根据目的蛋白分子量大小选择合适的凝胶浓度，按照附表配制分离胶： ①将不同体积的蒸馏水、49.5%T 6%C 、Gel buffer 、Glycerol 加入到离心管中充分混合。 ②加入APS 和TEMED ，立即涡旋混匀，以使溶液充分混匀。 ③在凝胶模具中迅速灌入适量分离胶溶液(1mm mini-gel ，分离胶溶液加约4ml ），然后在分离胶溶液上轻轻覆盖一层水层，使凝胶表面保持平整。 ④静置，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合。 3、根据目的蛋白分子量大小选择合适的凝胶浓度，按照附表配制夹层胶：编号名称 PE0019 30T Storage 试剂(A): 49.5%T 3%C 20ml 4℃ 试剂(B): 49.5%T 6%C 60ml 4℃ 试剂(C): Gel buffer 90ml 4℃ 试剂(D): Glycerol 20ml RT 试剂(E): Ammonium Persulfate 0.3g RT 试剂(F): TEMED 2×1ml 4℃ 避光使用说明书 1份

SDS-PAGE所有详细试剂配方

SDS-PAGE 30%聚丙烯酰胺溶液-----30%（w/v ）Acrylamide 【组分浓度】【配制方法】将29克丙烯酰胺和1克N,N’ -亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml 温热（37℃左右）的去离子水中，充分搅拌溶解，补加水至终体积为100ml 。μm 微孔滤膜过滤除菌和杂质，储于棕色瓶，4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存。严格核实PH 不得超过，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。【保存条件】 4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存【注意事项】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。 1MTris-HCL （）(浓缩胶buffer) 【组分浓度】1MTris-HCL 【配制方法】

称量碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加>的浓HCL调节所需要的pH值（大约，大约，大约），将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH 值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低个单位。【保存条件】室温保存。【注意事项】对人体有刺激性，请注意适当防护。（）(分离胶buffer) 【组分浓度】【配制方法】1L 称量碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加浓HCL调节所需要的pH值=，将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。（LTris-HCL:和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C 保存。）【保存条件】室温保存【注意事项】应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低个单位。 10%十二烷基硫酸钠SDS溶液-----10%(w/v)SDS 【组分浓度】10%(w/v)SDS

凝胶电泳各试剂配制

凝胶电泳各试剂配制（1）10000mg/L苄嘧磺隆母液：称取60%的苄嘧磺隆颗粒500mg于灭菌的棕色试剂瓶，再加入30mL灭菌的蒸馏水，每次使用前混匀再吸取。（2）10000mg/L乙草胺母液：吸取500ul 89%的乙草胺，再加入49mL分析纯甲醇溶解。（3）30%丙烯酰胺混合液（50ml）：称取丙烯酰胺14.5g，甲叉双丙烯胺酰胺O 30ml溶解，定容到50ml，于棕色瓶中4℃保存。 0.5g，加ddH 2 （4）1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8(100ml):称取Tris18.17g于烧杯中加入ddH2O 80ml溶解，用浓盐酸于25℃下调pH为8.8，定容到100ml，高温灭菌室温保存。（5）1.5mol/L Tris-HCl pH 6.8（50ml）：称取Tris 9.08g于烧杯中加入O 30ml溶解，用浓盐酸于25℃下调pH为6.8，定容到50ml，高温灭菌室温 ddH 2 保存。（6）10%SDS：称取2gSDS粉末于20ml水中37℃1h水浴。（7）TEMED（四乙基乙二胺）原液（8）10%过硫酸铵:称取0.15g过硫酸铵溶于1.5mldH2O中，4℃保存，一星期可用。（9）2×样品缓冲液（10ml）：2.5ml 1.5mol/L的Tris-HCl(pH6.8),0.5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇，2ml 1%溴酚蓝，2.5ml蒸馏水。配好后按每管500ul分装好与-20℃保存待用。（10）Tris-甘氨酸电极缓冲液（5×）：称取Tris 15.1g，甘氨酸94g，SDS 5g，加蒸馏水约800ml，溶解后用蒸馏水定容至1000ml。临用前稀释10倍。（11）50%甘油：水：甘油=1:1，高温灭菌，4℃保存。

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S D S-P A G E 30%聚丙烯酰胺溶液-----30%（w/v）Acrylamide 【组分浓度】各种组分名称配制不同体积所需各成分的体积(mL)或质量(g) 30%Acr-Bis(29:1) 1000ml 100ml 29%Acrylamide(丙烯酰胺) 290g 29g 1%BIS(N,N’-亚甲丙烯酰胺) 10g 1g 【配制方法】将29克丙烯酰胺和1克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37℃左右）的去离子水中，充分搅拌溶解，补加水至终体积为100ml。0.45μｍ微孔滤膜过滤除菌和杂质，储于棕色瓶，4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。【保存条件】 4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存【注意事项】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。 1MTris-HCL（pH6.8）(浓缩胶buffer) 【组分浓度】1MTris-HCL 名称用量备注 Tris 12.1g 去离子水80ml 浓盐酸9ml (36%的浓盐酸)预实验已确定去离子水加入去离子水定容至100ml后，室温保存【配制方法】称量121.1gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加>0.7mL的浓HCL调节所需要的pH 值（7.4-大约0.7mL，7.6-大约0.6mL，8.0-大约0.42mL），将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。【保存条件】室温保存。【注意事项】对人体有刺激性，请注意适当防护。 1.5MTris-HCL（pH8.8）(分离胶buffer) 【组分浓度】1.5MTris-HCL 名称用量备注 Tris 18.17g 去离子水80ml 浓盐酸3ml (36%的浓盐酸)预实验已确定去离子水加入去离子水定容至100ml后，室温保存【配制方法】1L

SDSPAGE所有详细试剂配方精修订

S D S P A G E所有详细试剂配方 SANY标准化小组 #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#

SDS-PAGE 30%聚丙烯酰胺溶液-----30%（w/v）Acrylamide 将29克丙烯酰胺和1克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37℃左右）的去离子水中，充分搅拌溶解，补加水至终体积为100ml。0.45μm微孔滤膜过滤除菌和杂质，储于棕色瓶，4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。【保存条件】 4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存【注意事项】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。 1MTris-HCL（pH6.8）(浓缩胶buffer) 称量121.1gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加>0.7mL的浓HCL调节所需要的pH值（7.4-大约0.7mL，7.6-大约0.6mL，8.0-大约0.42mL），将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。【保存条件】室温保存。【注意事项】对人体有刺激性，请注意适当防护。 1.5MTris-HCL（pH8.8）(分离胶buffer)

称量181.7gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加浓HCL调节所需要的pH值=8.8，将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。（1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL 混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。）【保存条件】室温保存【注意事项】应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。 10%十二烷基硫酸钠SDS溶液-----10%(w/v)SDS 称取2g高纯度的SDS置于100~200ml烧杯中，加入约16ml的去离子水，68℃加热溶解，滴加浓盐酸调节PH至7.2，定容至20ml后，室温保存【保存条件】室温保存【注意事项】对人体有害，请注意防护。 10%过硫酸铵溶液-----10%(w/v)AP 称取0.1g过硫酸铵置于1.5ml离心管，加1mL去离子水吹打溶解，4℃保存【保存条件】 4℃保存【注意事项】 10%过硫酸铵溶液在4℃保存时，可使用2周左右，超过期限会失去催化作用 5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液-----5×Tris-Glycinebuffer（SDS-PAGE电泳缓冲液）称取15.1gTris，94.0g甘氨酸（glycine），5.0gSDS，用800ml蒸馏水或去离子水溶解，充分搅拌溶解，定容至1000ml，室温保存。得0.125mol/LTris-1.25mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释5倍。

SDS-PAGE所有详细试剂配方

创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* SDS-PAGE 30%聚丙烯酰胺溶液-----30%（w/v）Acrylamide 将29克丙烯酰胺和1克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37℃左右）的去离子水中，充分搅拌溶解，补加水至终体积为100ml。0.45μm微孔滤膜过滤除菌和杂质，储于棕色瓶，4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。【保存条件】 4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存【注意事项】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。 1MTris-HCL（pH6.8）(浓缩胶buffer) 称量121.1gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加>0.7mL的浓HCL调节所需要的pH值（7.4-大约0.7mL，7.6-大约0.6mL，8.0-大约0.42mL），将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。【保存条件】

室温保存。【注意事项】对人体有刺激性，请注意适当防护。创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 1.5MTris-HCL（pH8.8）(分离胶buffer) 称量181.7gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌溶解，加浓HCL调节所需要的pH值=8.8，将溶液定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。（1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。）【保存条件】室温保存【注意事项】应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。 10%十二烷基硫酸钠SDS溶液-----10%(w/v)SDS 称取2g高纯度的SDS置于100~200ml烧杯中，加入约16ml的去离子水，68℃加热溶解，滴加浓盐酸调节PH至7.2，定容至20ml后，室温保存【保存条件】室温保存【注意事项】对人体有害，请注意防护。

SDS-PAGE蛋白电泳方法

SDS-PAGE . 实验原理 SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质 -SDS 复合物。在一定条件下， SDS 与大多数蛋白质的结合比例为1.4:1。由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。基于上述原因，蛋白质 -SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关，也就是蛋白质 Mr 的函数。二 . 试剂器材 30%凝胶贮液(100mL):称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内 4C贮存，每过1-2个月应重新配制；注意:丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCI，pH 8.8，100mL):称取Tris 18.2g溶于约80mL 双蒸水，用6mol/L的HCI调整pH值至8.8,加双蒸水定容到100mL，4 C 贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8，100mL):称取Tris 6.0g溶于约 80mL双蒸水，用1mol/L的HCI调整pH值至6.8,加双蒸水定容到100mL，4 C 贮存；电泳缓冲液(1L):称取试剂Tris 3.03嗣甘氨酸14.4g置于500mL烧杯中，向烧杯中加入约400mL双蒸水充分溶解，再加入10%SDS溶液1.0mL，以双蒸水定容至1L伯然pH值为8.3,无需再调)，4 C贮存，可重复使用5-6次； 2X加样缓冲液(10mL):取下列试剂置于10mL塑料离心管中

SDS-PAGE凝胶电泳操作

一、常规试剂的配制 1.30%聚丙烯酰胺贮液：丙烯酰胺150g ,甲叉双丙烯酰胺4g,双蒸水500ml,滤纸过滤后，棕色瓶避光4 C保存； 2.L，pH Tris-HCI 分离胶缓冲液：Tris，用1mol/L HCl定容至100ml，棕色瓶避光4 C 保存； 3.L, pH Tris-HCl 分离胶缓冲液：12g Tris，用1mol/L 调pH至100ml，棕色瓶避光4 C 保存； 4.10% SDS溶液：10g SDS加水定容至100ml，完全溶解室温保存； 5.10% AP溶液：AP （过硫酸铵）加水定容至1ml，用前新鲜配制； 6.1X SDS-PAGE电泳缓冲液：25mM Tris （L），192mM甘氨酸（L ），%SDS（ 1g/L ），pH ; 7.染色液：考马斯亮蓝R-250 溶解于45ml 甲醇，45ml 水，10ml 冰醋酸，过滤除去杂质； 8.脱色液：45ml 甲醇，45ml 水，10ml 冰醋酸； 9.固定液：50ml 甲醇，40ml 水，10ml 冰醋酸； 10.2X SDS-PAGEh样缓冲液：10%SDS，Tris-HCl （pH ），甘油，1% 溴酚兰10 卩L，3 - 疏基乙醇100卩L，加水定容至1ml，分装后-20 C保存。二、样品的处理 1.蛋白含量较低的酶制剂或原料样品（1 ）粉剂（或颗粒）样品称取样品1g，加入3-5ml蒸馏水进行搅拌溶解仆（搅拌时间可根据实际情况进行增减），4000rpm离心10min，取离心上清液等体积加入20%的三氯乙酸聚沉30min，离心，弃去离心上清液，用70%的丙酮溶液洗涤沉淀，4000rpm离心10min，重复洗涤3-5次，将丙酮洗涤液吹干，加入适量（1-3ml ）PBS溶解沉淀，溶解液即可用于电泳实验。（2）液体样品液体样品经离心后，取离心上清液等体积加入20%的三氯乙酸聚沉30min，离心，弃去离心上清液，用70%勺丙酮溶液洗涤沉淀，4000rpm离心10min，重复洗涤3-5次，将丙酮洗涤液吹干，加入适量（1-3ml ）PBS溶解沉淀，溶解液即可用于电泳实验。 2.蛋白含量相对较高勺酶制剂或原料样品（1 ）粉剂（或颗粒）样品称取样品1g，加入3-5ml蒸馏水进行搅拌溶解仆（搅拌时间可根据实际情况进行增减），4000rpm离心10min，取离心上清液用于电泳实验。（2）液体样品液体样品经离心后，取离心上清液用于电泳实验。