质粒提取注意事项
1. 质粒制备的基本原理是什么？
答：做过分子生物学实验的,大多数做抽提过质粒，但不是所有人都知道质粒制备的基本原理。所以有必要做一个说明，能帮助您了解和解决实验过程中遇到的一些问题。制备质粒最常用的方式是碱裂解法。质粒被转化到细菌中，单菌落接种到含有特定抗生素的培养基中，一般培养到细菌生长的平台期离心收集细胞；细菌用悬浮液（Solution I, 内含RNase A）悬浮细胞，用SDS-NaOH (Solution II)裂解。SDS是很强的去污剂，抽提出细胞膜蛋白质和磷脂，释放出细胞内物质，NaOH为强碱，使蛋白质，染色体DNA和质粒DNA变性；细胞裂解彻底后，加入酸性醋酸钾（Solution III）, 中和裂解液，同时SDS-K,变性蛋白质，变性基因组DNA和细胞碎片形成沉淀，通过离心，但是质粒DNA正确复性，仍留在上清溶液中。如何从上清液中回收DNA的方法有很多，有用苯酚/氯仿抽提的，有用乙醇沉淀的，有用核酸吸附吸附的，目的都是试图采用有效，快速的方式纯化质粒DNA。我们提供的试剂盒就是选用特异的核酸吸附材料，优化结合与洗脱条件得到高纯度质粒DNA，纯化的质粒DNA纯度和得率可以满足分子生物学实验的要求。
2. 质粒DNA 制备的关键是什么？
答：碱裂解法的关键是如何把握SDS-NaOH处理的时间。质粒制备过程中，如果质粒长时间暴露于NaOH, 质粒有可能不可逆变性，使得抽提质粒中有部分是变性质粒。这些变性质粒，不能酶切。所有一般情况下，SDS-KOH处理时间不能超过5分钟，最好在冰里处理，观察到液体变得清就可以加入中和液。
3. 质粒中基因组污染是怎么产生的？
答：基因组的产生一般是因变性和中和步骤处理不当所致。如果为了提高混合效果，混匀的动作过于剧烈，基因组DNA可能被剪切成小片段，这些小片段在后来中和过程中被复性，保留在溶液中，与质粒一起回收出来了。要降低基因组的污染，记注两点：混合动作要温和，细胞用量要合适。
4. 如何确定质粒小抽细胞的用量？
答：根据实验目的确定质粒的需求量。对于一般的克隆酶切鉴定，亚克隆、测序分析等常规分析，有几微克的DNA就够了。质粒拷贝数的高低确定接种体积的大小。高拷贝的质粒，接过2-3ml 的细胞就够了，对于中低拷贝的如pBR322,接种5ml也能满足要求。使用过过的细胞，由于细胞裂解难以彻底，时间难以把握，DNA的纯度和得率有时因吸附材料容量的限制，得率并没有显著提高，纯度反而下降。对于细胞数很大的质粒制备，需要按比例提高各溶液的用量，才能保证抽提质粒的纯度和得率。
5. 电泳分析抽提的质粒会看到什么？
答：如果您制备的质粒很脏，从电泳加样孔起，您会看依次看到微量的基因组DNA, 开环环装质粒（open circular plasmid），超螺旋质粒(Super Coiled), 变性的超螺旋质粒（denatured supercoiled plasmid）, 细菌RNA。判定质粒制备质量高低的标准是观察超螺旋质粒在整个抽提DNA中的百分比。质量高的主要部分为超螺旋质粒，没有变性超螺旋质粒和没有基因
组，没有RNA污染。
6. 质粒制备的得率是由哪些因素决定的？
答：由细胞拷贝数，细胞的用量，属主细胞类型和和纯化方式。
7.您的质粒需要什么样的纯度？
答：根据您的实验目的确定您需要的纯度。对于一般的克隆分析鉴定，用手工和试剂盒制备的DNA都能达到要求。测序需要将质粒中的非核酸类杂质和RNA的水平控制在非常低的水平。基因组的存在对测序影响不大。开环环装质粒（open circular plasmid），超螺旋质粒(Super Coiled), 变性的超螺旋质粒的测序效果基本相似。转染细胞纯度较高，用于基因治疗的最高，需要无热源，无内毒素（LPS）。
8. 为什么酶切鉴定“有插入片段”的质粒测序却发现是空的？
答：这种现象测序经常会发现，有些用户怀疑是我们搞错了。请相信，测序不可能将您的片段搞丢，测序结果是硬指标。产生这种现象的直接原因是质粒制备过程中产生了变性的超螺旋质粒，它无法被限制性内切酶酶切；而正常的超螺旋质粒，酶切后变成线性分子，迁移率变小，酶切后变性与正常超螺旋质粒之间的距离加大。变性的超螺旋质粒和正常的超螺旋质粒在酶切前靠得比较近，常被忽略。电泳分析酶切效果时，变性的超螺旋质粒常常被误认为是酶切下来的片段，导致误判。其实要判定这种假象非常容易，只要在酶切电泳分析时，增加不做酶切的对照就可以了。
9. 如何判定DNA 的纯度和浓度？
答：对于采用试剂盒抽提的DNA, 测定OD260和OD280浓度，OD260/OD280一般在1.7-1.8之间。1 OD260 = 50 μg/ml。需要注意的是，用简单手工抽提的DNA，OD260/OD280没有多大意义，由于含有水解的核酸小片段，该比值偏高。需要通过琼脂糖电泳来估计浓度。
10.为什么有些纯化的质粒时间长了会发生降解？如何解决？
答：有人将问题的责任推到试剂盒的生产商，冤枉了。产生此的原因有很多，主要原因是核酸酶的污染。除了制备过程外源带入核酸酶外，但是根据有关报道发现，质粒属主细胞的种类会影响抽提核酸的质量。理想的用于抽提高质量质粒的细胞有DH5alpha, DH1, C600, XL1-Blue；HB101, JM系列细胞内含丰富的核酸酶活性，如果您制备的质粒准备长期保存，请换属主细胞。
11. 为什么小抽可以，一放大就不行了？
答：此种情况经常会发生，常使研究人员感到很困惑。原因主要出在大规模制备时细胞接种量和方式有问题，细胞裂解时溶液的用量和处理时间把握不准所致。大规模细胞培养正确的
方式是从新鲜培养板上挑单克隆接种到2-5ml含合适抗菌素的培养基中，培养到对数期（8小时左右）；放大培养时需要将种子稀释500-1000倍继续培养12-16小时（通常是过夜培养）。摇瓶培养，摇瓶所接的培养基不要超过摇瓶总体积的25%。转速达到250转/分。
收集细胞没有什么讲究，采用的速度能将细胞沉下来就可以了。速度过高，细胞悬浮比较困难。大规模碱法制备需要选用合适的细胞用量，一般原则是细胞宁少勿多，溶液宁多勿少，变性时间宁短勿长。大规模制备采用的裂解溶液与细胞重量的比例小于小抽，细胞的裂解效果成为得率和纯度高低的关键。如果裂解不完全或采用的细胞过多，很多质粒不能充分的释放出来，有些释放出来的质粒也会滞留在各种沉淀物之间无法回收。NaOH-SDS (Solution II)变性过程是关键，溶液加入后通过上下颠倒小心混匀，如果发现细胞很难变澄清，表明溶液少了，整个变性过程应控制在5-10分钟，如果条件许可，预冷所有溶液。加入合适量的中和液(Solution III)要上下颠倒小心混匀数次，让抽提物真正做到中和，使基因组DNA，蛋白质，细胞碎片充分的沉淀下来，才能保证后续可以得到高纯度的质粒。
还有一点需要强调是，接种的克隆新鲜十分关键。甘油菌，4度保存的菌液，时间很长的划板或转化板，都不是理想的种子。如果没有做过传代实验，不要直接采用甘油菌接种做大抽
质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和 SDS 溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 一、试剂准备 1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH ，10mM EDTA(pH ）。1M Tris-HCl[t1] (pH ），EDTA （pH ）10ml，葡萄糖，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。 任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。 50 mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I 中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA呢大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。 NaOH也使DNA变性，但只是个副产物，在溶液3加入后其中的醋酸和NaOH中和，质粒DNA 恢复活性 2. 溶液Ⅱ：NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置[t2] 。这是用新鲜的N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向 micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。基因组 DNA的断裂会带来麻烦。 3. 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 。5M KAc 300ml，冰醋酸，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。 溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的误解是，
提取句子主干和划分句子成分专项练习
提取句子主干和划分句子成分专项练习 1.大片大片的雪花从彤云密布的天空中飘落下来。 2.是中国现代文学的奠基人。 3.秋天比春天更富有欣欣向荣的景象。 4.天空的霞光渐渐地淡下去了。 5.淡淡的朝阳刚把树梢照亮。 6.黄继光用自己的胸膛堵住了敌人的枪口。 7.戴红领巾的小姑娘捡起了操场的许多纸片和枯黄的落叶。 8.小松鼠的一条毛茸茸的大尾巴总是向上翘着， 9.清晨，大火球似的太阳从遥远的海平面上升起来了。 10.海边的沙地上种着一望无际的碧绿的西瓜。 11.山沟的柿子树上缀满了沉甸甸的柿子。 12.夕阳落山不久，西方的天空，还燃烧着一片橘红色的晚霞。 13.隐蔽在芦苇丛里的我们看见船上载着很多货物。 14.满身是汗的渔夫吃力地拖着一张水淋淋的破鱼网。 15.李时珍是我国古代的一位伟大的医学家和药物学家。 16.多水的江南是易碎的玻璃。 17.藤野先生总是挟着一叠大大小小的书。 18.这位客人直勾勾地打量着主人的脸。 19.托尔斯泰透出一股才气。 20.科学技术是人类本性精神的最高成就。 21.这是一种别开生面的场面。
22.白色的丝线拧成细细的绳子。 23.我们喜欢倾听大雁在沼泽中集会时的鸟叫。 24.一位手里拿着照相机的记者一声不响地解掉了系在自己腰里的那条结实的粗绳子。 25.他非常诚恳地征求大家的意见。 26.汽车在望不到边际的高原上奔驰。 27.他黑生生的脸上显出一丝得意的神色。 28.豆大的汗珠不停地从脸上直往下落。 29.他踉踉跄跄地从外地赶回久别的家乡。 30.整个广漠的天幕上只有它在那里放射着令人注目的光辉。 31.鲁班是我国古代春秋时期一位著名的建筑工匠。 32.直到今天，锯子仍然是木匠们干活的主要工具。 33.全世界的科学家们都在努力探索地震灾害的规律。 34.抵御沙丘的方法是植树种草。 35.它那含泪的眼睛流露出悲苦和恐怖的神情。 36.赵州桥高度的技术水平和不朽的艺术价值，充分显示了我国劳动人民的智慧和力量。 37.她住在那个乡村的乡公所楼上。 38.老孙头早就相中了栓在老榆树底下的右眼像玻璃似的栗色小儿马。 39.苏州园林栽种和修剪树木也着眼在画意。 40.大堤出现险情这个消息很快就被登到报纸上去了。 41.一个衣服褴褛，满脸皱痕的年老水手在船上卖牡蛎。 42.近几年来，父亲和我都东奔西走地忙碌。 43.在汉江北岸，我遇到一个青年战士。
质粒提取有关问题及注意点
质粒提取常见问题解析 涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？ 参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。 原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常? 参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。解决办法： 1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。 2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。 3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！ 【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常： 1、利用你的嗅觉。只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。 2、肉眼观察活化菌株。对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。】 未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？ 参考见解： 1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。 2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。 3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。 4、碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。 5、溶液使用不当：溶液2和3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。 6、吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少LB培养液体积。 7、质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) ：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。 8、乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。 9、洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。 10、洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。
高纯度质粒小量快速提取试剂盒操作方法及步骤说明书
杭州昊鑫生物科技股份有限公司 htpp://https://www.360docs.net/doc/2f11405226.html, HighPure Plasmid Mini Kit 高纯质粒小量快速提取试剂盒 目录号：PL03 试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成保存 50次 （PL0301） 100次 （PL0302） 200次 （PL0303） 平衡液室温5ml 10ml 20ml RNaseA（10mg/ml）-20℃150μl 250μl 500μl 溶液P1 4℃15 ml 25 ml 50 ml 溶液P2 室温15 ml 25 ml 50 ml 溶液P3 室温20 ml 35 ml 70 ml 去蛋白液PE 室温16ml 31.5 ml 63 ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 漂洗液WB 室温15 ml 25ml 50ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 洗脱缓冲液EB 室温10ml 15ml 20ml 吸附柱AC 室温50个100个200个 收集管（2ml）室温50个100个200个 本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。 储存事项: 1.第一次使用时，将试剂盒所带的全部RNase A加入溶液P1后（终浓度100ug/ml） 置于2-8℃保存。如果溶液P1中RNase A失活，提取的质粒可能会有微量RNA 残留，在溶液P1中补加RNase A即可。 2.环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分 钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。 3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时 盖紧盖子。 产品介绍：
本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 产品特点： 1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附 量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。 2.独有的去蛋白液配方，可以高效去除残留的核酸酶，即使是核酸酶含量丰富的菌 株如JM系列、HB101也可以轻松去除。有效防止了质粒被核酸酶降解。 3.快速、方便，不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。获得的 质粒产量高、纯度好，可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。 注意事项 1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机， 如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。 2. 提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。一般高拷贝质粒，建议 接种单菌落于1.5-4.5 ml加合适抗生素的LB培养基，过夜培养14-16个小时，可提取出多达20μg的纯净质粒。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应适当加大菌体使用量，使用5-10 ml过夜培养物，同时按比例增加P1、P2、P3的用量，其它步骤相同。 3. 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260 值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。 4. 质粒DNA确切分子大小，必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知 道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。 5. 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗 脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在－
组织蛋白提取
1. 提取蛋白裂解液配方： 25 mM HEPEs PH:7.4 5 mM EDTA 5 mM EGTA 50 mM NaCl 1 mM Na3VO3(矾酸钠) 1 mM sodium phosphophate 0.05% SDS 0.05% sodium deoxycholate (脱氧胆酸盐) 1% Triton-X 100 5 mM NaF 0.1% 2-mercaptoethanol 1 mM PMSF (1ul 100mmol/L+纯水99ul) 1uM Microcysin-LR 40ug/ml pepstatin A 40ug/ml aprotinin 40ug/ml leupeptin 2..组织蛋白提取及定量： 称量组织重量置小烧杯 用PBS清洗1-2次 加入组织裂解液【悬浮buffer储存液500ml+苯甲基磺酰氟（PMSF，有毒物）30+leapeptin （蛋白抑制酶）0.5ul于EP管混合，倒入盛组织的烧杯】 置冰上5min 用眼科剪剪碎 倒入5ml匀浆器（反复抽吸匀浆组织） 倒入或吸入EP管 离心（4°C 1000g 10min）取上清 用于蛋白定量或储存于-80°C 蛋白定量 取5ul蛋白样本+15ul去离子水（DW）+200ulBCA（A:B为50:1即196:4），分别混合样本与DW和BCA的A液与B液置于干净的96孔板上37°C，30min
酶联免疫测OD值（570nm，ELX-800型酶标仪） 由OD值计算蛋白浓度（用excel表或用下列公式计算） （OD值×987.7108－198.342）×103ng/ul；OD=样本OD值－空白对照OD值）
质粒提取
1.菌液接种到500ml培养基中，加抗生素至工作浓度，37℃，300rpm过夜 2.4000rpm，15min离心菌液收集菌体。 3.用20ml solutionⅠ溶解菌团，充分打散混合均匀。 4.称取0.1g溶菌酶加入菌液，室温放置5min。 5.加入40ml solution Ⅱ，轻轻混合至澄清,冰上放置5min。 6.加30ml solution Ⅲ，轻轻混匀，冰浴10min。 7.4000rpm，20min，离心后将上清液倒到200ml量筒里面。 8.加入0.6倍体积的异丙醇混匀并室温放置10min。10000rpm离心15min。 9.用6.5ml的TE重悬沉淀，转移到4个EP管中，13000rpm 离心5min。 10.上清转移到15ml的离心管中，加7.2gCsCl和 200ul的10mg/ml的EB，混匀。 11.在超速离心管中加样并封口。60000rpm 10℃离心16h。 12.用一个注射器在超速离心管中上面戳一个孔，留下针头，并用另外一个注射 器从红色质粒带旁边管壁戳进去，吸取1-1.5ml，装入新的离心管中。 13.加5ml TE饱和丁醇，混匀后静置各相分离后去掉上层桃红色丁醇，重复这一 步，直到下层水相中没有桃红色。转移下层水相到EP管中。 14.加入1/10体积5M的Nacl和2倍体积的无水乙醇。在-20℃下放置20min。 15.13000rpm，10min离心后去上清，重悬沉淀于1ml的TE然后转移至EP管。 16.用1倍体积的25/24/1的酚/氯仿/异戊醇抽提两次。 17.每管加1/10体积的2.5M的乙酸钠和2倍体积的乙醇， -20℃下放置20min。 13000rpm离心10min，然后用70%的乙醇轻轻润洗并晾干EP管。 18.重悬于1ml TE中，并在OD260下测量浓度。
植物组织蛋白提取方法
植物蛋白质提取方法总汇 一、植物组织蛋白质提取方法 1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清液，样品制备完成。 蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl（PH8） 45ml 2、甘油（Glycerol）75ml 3、聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g 这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！ 二、植物组织蛋白质提取方法 氯醋酸—丙酮沉淀法 1、在液氮中研磨叶片 2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。 3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm 以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。 4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。 5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。 药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS 溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。 这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！
三、组织：肠黏膜 目的：WESTERN BLOT检测凋亡相关蛋白的表达 应用TRIPURE提取蛋白质步骤： 含蛋白质上清液中加入异丙醇：（1.5ml每1mlTRIPURE用量） 倒转混匀，置室温10min 离心：12000 g，10min，4度，弃上清 加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：（2ml每1mlTRIPURE用量） 振荡，置室温20min 离心： 7500g，5 min，4度，弃上清 重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2次 沉淀中加入100％乙醇 2ml 充分振荡混匀，置室温20 min 离心： 7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀 1％SDS溶解沉淀 离心：10000g，10min，4度 取上清-20度保存（或可直接用于WESTERN BLOT） 存在的问题：加入1％SDS后沉淀不溶解，还是很大的一块，4度离心后又多了白色沉定，SDS结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。 解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2X BUFFER，然后煮5－10分钟，效果很好的。 四、植物材料：水稻苗，叶鞘，根 1、200毫克样品置于冰上磨碎 2、加lysis buffer，离心，10000rpm，4度，5min取上清 3、重复离心5min
质粒提取原理及步骤
For personal use only in study and research; not for commercial use 质粒提取原理及步骤 一、导论 已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤：1. 细菌培养物的生长。 2. 细菌的收获和裂解 3. 质粒DNA的纯化。 （一）细菌培养物的生长 从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。此时，不必造反性地扩增质粒DNA。然而，较长一代的载体(如pBR3 22)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不
同，前者大为增高。多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒
DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。 （二）细菌的收获和裂解 细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。 1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。 2)可用更剧烈的方法来分离小质粒。在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。 3)一些大肠杆菌菌株(如HB101的一些变种衍生株) 用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类，当随后用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的区带。因此很难避免质粒DNA内污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性。故从诸如HB101和TG1等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法。 4)当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株(endA+株，如HB101) 中小量制备质粒时，建议不使用煮沸法。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A，以后在温育(如用限制酶消化)时，质粒DNA会被降解。但如果通过一个附加步骤(用酚：氯仿进行抽提)可以避免此问题。 ５)目前这一代质粒的拷贝数都非常高，以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒DNA的产量，而是要降低细菌细胞在用于大量制备的溶液中所占体积。大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒DNA的量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒DNA的量大致相等。 (三)质粒DNA的纯化
质粒DNA提取方法与原理
质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA 发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。 一、试剂准备 1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。1M Tris-HCl (pH 8.0）1 2.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。 任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。50 mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。 NaOH也使DNA变性，但只是个副产物，在溶液3加入后其中的醋酸和NaOH中和，质粒DNA恢复活性 2. 溶液Ⅱ：0.2N NaOH，1% SDS。2N NaOH 1ml，10%SDS 1ml，加ddH2O至10ml。使用前临时配置。 这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向 micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS 也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS 呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。基因组 DNA 的断裂会带来麻烦。 3.溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液，pH 4.8。5M KAc 300ml，冰醋酸 57.5ml，加ddH2O至500ml。4℃保存备用。 溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往1%的 SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1％的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是
质粒提取操作步骤
操作步骤： 本实验方法适用于从1-10ml过夜培养的大肠杆菌菌液中提取质粒。提取量受菌株、质粒拷贝数、菌液体积和培养时间、培养基类型等因素的综合影响。 1.收菌：将过夜培养（37℃，12-16小时）的菌液于室温≧10,000g 离心1-2分钟，彻底弃除上清。 注意：高拷贝质粒建议使用≦5ml菌液；菌液用量过大不仅不能增加质粒产量，反而会因裂解不完全或杂质封闭硅胶膜而降低产量；培养时间不宜过长，否则会增加开环结构质粒的比例。。 2.重悬：加入250μl含RNase A的细胞悬浮液（S1），充分混悬震荡 或用枪头反复抽打使细菌彻底分散悬浮。 3.裂解：加入250μl细胞裂解液（S2），轻轻上下颠倒混合5次，室 温静置1-5分钟，待细菌充分裂解，溶液变半透明。 注意：避免剧烈震荡导致基因组DNA裂解，裂解时间不能超过5分钟。 4.中和：加入350μl中和缓冲液（S3），轻轻上下颠倒混合5次，充 分混匀，避免剧烈震荡。室温下≧12,000g离心10分钟。 5.DNA结合：小心吸取上清，转移到插入收集管的离心吸附柱内，室 温下≧12,000g离心1分钟，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中。 6.清洗：加入500μl漂洗液（WB,请确认已加入乙醇！）于离心吸附 柱中，室温下≧12,000g离心30秒，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中。 7.再次清洗：加入500μl漂洗液（WB）于离心吸附柱中，室温下≧ 12,000g离心30秒，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插
回收集管中。将离心吸附柱开盖再次离心2分钟，彻底除去残余漂洗液。 8.洗脱：小心取出离心吸附柱，将其套入一个新的1.5ml灭菌离心 管中。向硅胶吸附膜的中央加入100μl洗脱缓冲液（EB），室温放置1分钟后，≧12,000g离心1分钟收集质粒DNA。 注意：为提高质粒浓度，最低可使用30μl的EB溶液，离心收集后壳将洗脱的质粒溶液再次加入离心吸附柱中重复洗脱；使用100μlEB溶液则无需二次洗脱；对6kb以上的质粒，可使用预先加热至55℃的EB溶液洗脱以提高产量；EB溶液不含EDTA，故不会影响荧光测序等后续反应；如必须使用无菌去离子水洗脱，需注意其pH值是否接近中性，否则应使用NaOH溶液将pH值调节至7.0-8.5之间。 9.储存：弃除离心吸附柱，纯化的质粒可直接用于后续反应或于 -20℃长期保存。 注意：经检测，本试剂盒从endAˉ菌株（如DH5α，TOP10，XL1-blue等）中提取的质粒反复冻融20次无降解；如需在4℃长期保存或者保存从endA+菌株（如JM109，HB101，BL21等）中提取的质粒，可向每100μl质粒溶液中加入11μl的10×TE溶液，但含EDTA的质粒溶液不可用作荧光测序模板。
蛋白提取方法
?1 材料与方法 1、1 材料 1、1、１组织与细胞得来源: ?１。1、2 仪器设备?机械组织匀浆器?低温高速离心机(＞40,０0０g) 超速离心机?超生细胞破碎仪 超纯水装置 ??1、1。3 试剂 三氯醋酸(TCＡ) 丙酮 二硫苏糖醇(DＴT) ?尿素?CＨAＰS?PMSF?EDTA ?乙醇?磷酸 考马斯亮蓝Ｒ3５0 ?抑肽素Ａ?亮肽素 试剂纯度均应就是分析纯或以上。? 1。１、４溶液配制?(1) PBS: ?NａCl８g,KCl 0、2 g,Na２HPＯ4 1。44 g,ＫH2PO4,溶于800 ml水中,用HCl调pＨ至7.4,用纯水定容至1 L; ?(2)ＥDTA 储存液: 18.61g Na2EDTA?2Ｈ２O,溶于70 ml纯水中,用10 mol/L NaOH调节ｐH值至8.0(约需2 g ＮａＯH颗粒),定容为100 ml、可高压灭菌后分装备用;?(３) 亮肽素储存液(50 μg/ｍl,100×) １0mｇ/ml溶于水,-75℃保存;使用时配成50 μg/ｍl储液,-２0℃保存; (4) 抑肽素储存液(7０μg／ml,10０×) 1 mg／ｍl溶于甲醇,—75℃保存;使用时配成７0 μg/ml储液,-2０℃保存; (5) PＭＳＦ储存液(１０ｍM,100×): １７.4mｇPMＳF,溶于１ml异丙醇中,—２0℃保存。?ＤTT储存液(1 M): ?０。31ｇDTT溶于2 ｍlＨ2O中,-20℃保存(DTT或含有DTT得溶液不能进行高压处理,可过滤除菌)。?(7) 裂解液: Lysis bufｆｅr Ａ (９M ｕｒeａ,４%ｗ/v ＣＨAＰS, 1％w／v DTT, ０.5％CA and a cｏｃktaiｌof ｐｒoteａｓｅinhibitｏrs)??Lysｉs buffer B (7 M urｅa, 2M ｔhiｏuｒea,4% w/v ＣHＡＰS, 1％w／v DTT,０、５% CA ａnｄａcocktaiｌoｆｐroteａse inhｉbitors) ?Lysｉｓbｕｆｆer C 40 ｍＭTrｉs－base (ｐH 9。5)iｎｕltrapｕｒe H2O Ｌyｓis buffer D (8 Ｍurｅa, 4％CHＡＰS, 4０mM Tris(ｂasｅ), 40 ml) ?Lyｓｉs buffer E ?(５M urea, 2 M tｈioｕreａ, 2％SB3-10, 2％CHAPS,１% w/v DTT, 0、５% CＡandａcocktａｉl ｏｆproteaｓe inhibitors) 100μL SDＳsaｍple solｕｔion (1% w/v SDＳ, 0、3７５M Ｔｒiｓ－HCl, pH8。8, 50 mM DTＴ,２5％v／ｖgly ?LysiｓbｕfｆeｒＦ? ｃeroｌ) ●CA、蛋白酶抑制剂混合物与DＴT在临用前加入。?蛋白酶抑制剂混合物［3]?成分终浓度?蛋白酶抑制剂混合物 PMSF 35 μg/ml oｒ 1 mM EDTA 0、３mg/ml (1 ｍM) 抑肽素 0。7 μg/ｍl?亮肽素 0、5μg／ｍl? 1.2 方法?1。1.1组织蛋白提取方法 １、２.1。1三氯醋酸/丙酮沉淀法[1］?(1)冰上取材,称湿重,置液氮中冻存或直接进行下一步; (2)在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织; ?(３)将粉末悬浮于含DTT(0。2％w／v)得10％三氯醋酸(w/v)得丙酮溶液中; (4)蛋白–２0℃沉淀过夜; ?(5)35０00×g(6℃)离心30min; ?将沉淀重悬于含０.2％DTT得预冷丙酮中; ?(7)-2０℃放置1h; 350０0×g(6℃)离心30min; (9)在通风橱中让丙酮充分挥发,得到干燥得沉淀; 15℃,40000×ｇ,离心1hr; (10)在裂解液中重新溶解沉淀(5０－10０ｍg组织需要1ml裂解液); ?( ) 11 (12)用Ｂraｄｆoｒd法[2］测定上清得蛋白浓度,分装后置–75℃保存。?1、2、1。2超速离心法?(1)取材; ?(2)用研钵在液氮冷冻条件下将样品
质粒抽提原理和详细操作步骤
质粒抽提,实验室必备技能之一 质粒 质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA 分子。 质粒抽提 从细菌中分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和 TritonX-100（一般很少使用）可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或 Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA）的两条链不会相互分开。当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。 质粒抽提最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高、适用面广、快速和纯度高等特点。当然，碱裂解法也有缺陷：容易导致不可逆的变性。要降低不可逆的变性，就要控制好碱裂解的时间。 碱裂解法抽提质粒需要用到以下三种溶液 溶液Ⅰ 50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8.0），在15 psi 压力下蒸汽灭菌15 min，4℃保存。 溶液Ⅱ 0.2 mmol/L NaOH（从10 mmol/L 贮存液中现用现稀释），10 g/L SDS（室温保存）。 溶液Ⅲ
提取蛋白的常规方法
1、原料的选择 早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。但至目前经 常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料， - 105 - 蛋白质提取与制备Protein Extraction and Preparation 因而对提取要求更复杂一些。 原料的选择主要依据实验目的定。从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成 本低的原料。尽量要新鲜原料。但有时这几方面不同时具备。含量丰富但来源困难，或含量 来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。一般要注意种属 的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。要事前调查 制备的难易情况。若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。如利用胰蛋白酶水解 蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属 必须一定。研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但 使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。可能时尽量用全年均可采到的原料。对 动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。 2、前处理 a、细胞的破碎 材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验，则应冷 冻保存。除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先 将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难 易不一，使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即 可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。 ⑴机械方法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达 10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两 个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间
质粒提取原理和方法
质粒DNA提取的原理及方法 碱裂解法质粒DNA提取原理 质粒DNA提取主要包括以下几个方面：如何将细胞裂解释放质粒DNA，如何将质粒DNA和基因组DNA分离开来，如何去除RNA污染，如何去除蛋白质和其它杂质。 质粒提取方法中，最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高，适用面广，快速，纯度高等特点。其原理是： 强碱性条件下，质粒DNA和基因组DNA同时从细胞中释放出来，并发生变性。在pH中性，并有高盐浓度存在的条件下，质粒DNA会迅速发生复性，仍为可溶性状态，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，在去垢剂SDS作用下，染色体DNA与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，通过离心去除沉淀后，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA，用异丙醇或乙醇沉淀可将之纯化出来。 BIOMIGA公司质粒DNA纯化系列试剂盒，采用碱裂解法质粒提取原理，在高盐环境下，采用硅胶膜特异性的吸附质粒DNA，而蛋白质不被吸附，最后用低盐洗脱液将DNA从膜上洗脱下来，方法简单，快速，质量好，收获量高。 影响质粒提取的因素 影响质粒提取的因素有很多种，如质粒拷贝数，宿主菌株的种类，细菌的培养时间、培养基种类、培养条件等等。 质粒拷贝数 质粒DNA最终收获量取决于质粒的拷贝数和质粒的大小。BIOMIGA 公司质粒DNA提取系列试剂盒，操作步骤适用于高拷贝数质粒的纯化，对于低拷贝质粒纯化提取，应加大起始菌液量的体积，并且相应地增加各种缓冲液的用量。 下表给出一些常用质粒载体的拷贝数： 质粒种类 复制起点 拷贝数 1 mL菌液质粒DNA收获量(μg) pSC101 pSC101 5 pACYC P15A
10-12 pSuperCos pMB1 10-20 pBR322 pMB1 15-20 pGEMR Muted pMB1 300-400 6-7 pBluescriptR ColE1 300-500 6-8 pUC Muted pMB1 500-700 8-12 宿主菌株 宿主菌株的种类将会影响质粒的收获量。含内源核酸酶的宿主菌株，如JM101, JM110, HB101, TG1以及它们的衍生菌株，通常因为内源核酸酶的存在，或者在提取过程中释放出来的核酸酶的作用下，将会显著影响最终收获量，或者纯化到的质粒容易降解，推荐客户将质粒转化至不含内源核酸酶的宿主菌株中，如Top10, DH5a进行质粒纯化。 如果从含内源核酸酶的宿主菌株中纯化质粒DNA，请用试剂盒附送的核酸酶去除溶液，去除核酸酶的污染。或选用HP系列试剂盒进行质粒的纯化。 下表给出一些常用的宿主菌株种类：
划分句子成分和提取句子主干
划分句子成分及提取句子主干教学设计 【教学目标】 1、认识单句各成分及其语法功用。 2、能够对一般性单句作正确的成分划分并掌握其基本方法步骤。 3、能准确提取句子主干，领会句子基本要义。 【教学重、难点】 1、划分句子成分的方法步骤。 2、宾语的判定。 3、 【教学方法】 1、自主学习，交流疑难。 2、练习中总结方法规律。 【教学过程】 一、自主学习单句成分简表。 1、温故预热:判断短语类型竞答游戏。 心潮澎湃能够战胜困难非常高兴三番五次激动人心 激动不已管得很紧红旗飘飘浮绿泛金茫茫风雪 2、结合实例揣摩各成分的语法功用，勾画疑难。 3、就疑难问题互相交流解疑，教师着重讲清宾语与补语的辨析。 4、两人一组，任选句子中的某一成分进行提问比赛，定时两分钟，答对多者胜，及时纠错。
二、在实例综合划分中总结划分句子成分的方法步骤。 1、师生共同用符号为以下两个句子划分成分： 躺着的那位病人津津有味地听着这一切。 在那次著名的试验中，两个重量不同的铁球，同时落到地上。 2、总结划分句子成分的方法步骤： 第一步:划出主谓界线，分清主谓两部分。 第二步：找出主谓部分各自的中心语。 第三步：依照谓语动词是否支配后面内容判定是否有宾语，如有宾语，就划出宾语及宾语中心语。 第四步：依照与中心语的关系，划出中心语之外的其它成分。 3、总结认识句子主干： ①主干就是去掉定状补等修饰限制补充成分后剩余的中心语的组合。 ②主干是这个句子基本要义的表达，它是通顺合理的。 4、运用方法进行练习。 ①选出对下边句子成分分析正确的一项。（） 十几年来，延安机场上送行的情景时时出现在眼前。 A.这个句子的主语中心语是“情景”，谓语中心语是“出现”，宾语是“在眼前”。 B.这个句子的主语中心语是“延安机场”，谓语中心语是“出现”，补语是“在眼前”。 C.这个句子的主语中心语是“情景”，谓语中心语是“出现”，补语是“在眼前”。