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凝胶色谱法基本原理及应用

摘要：凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。本文就凝胶色谱做一个整体性的介绍。

关键词：凝胶色谱法、分析技术、原理、应用

Abstract:gel chromatography, which is known as gel permeation technology, is a quick and simple separation and analytical techniques developed in the early 1960s. It has simple equipment and simplified operation, and also it doesn’t require organic solvents and has high polymer material separation effect. It has been not only widely used by biochemistry, molecular biology, bioengineering, molecular immunology and medicine, but also used on a large scale industrial production. This paper will give a holistic introduction about gel chromatography.

Key words: gel chromatography, analytical techniques, theory, application

1.凝胶色谱介绍

凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。

凝胶色谱不但可以用于分离测定高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。凝胶色谱主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对勿子质量分布测试。目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。

2.凝胶色谱的分类

根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）。

2.1凝胶过滤色谱（GFC）

GFC一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。

凝胶渗透色谱（GFC）是一种排阻色谱（SEC），依据尺寸分离分析物。这项技术常用于聚合物的分析。SEC首先是由Lathe和Ruthven 在1955年发明的[1]。凝胶渗透色谱这个术语可追溯到Dow Chemical 公司的J.C. Moore ，他在1964年研究了这项技术并将专利柱授予Waters公司，随后Waters公司在1964

年将这项技术实现商业化[2]。通常须要分离高聚物，可分析和纯化所需要的产品。

2.1.1凝胶过滤色谱的原理[3]

凝胶色谱依据尺寸分离蛋白质、缩氨酸和低聚核苷酸。分子通过多孔性珠床，较大程度或者较小程度地扩散到珠孔中。较小的分子更多的扩散到珠孔中因而会较慢地通过床层，而较大的分子较少或者不通过珠孔因而更快地通过床层。分子量和三维形状对保留度有贡献。凝胶过滤色谱可用于分子尺寸的分析，混合物中组分的分离，或者用于脱盐或者高分子制备中缓冲液的交换。

Elgaili. A. Omer [4]认为GFC 和其它绝对分子量确定设备联用是目前快速而间接确定聚合物分子量和分子量分布的最有效技术。他认为光散射检测器利用分子散射光的强度与分子量成正比，将折光检测器连结在光散射检测器之后，当每种馏分从GFC 柱中洗脱出来时可测定其分子量。

凝胶过滤色谱柱的操作如图1所示，固定相包含惰性粒子，惰性粒子中有可控尺寸的小孔。显微镜检测发现粒子内部类似海绵。在连续流动的溶剂的影响下，含有各种分子尺寸的溶质的溶液可通过柱子。分子尺寸大于小孔的溶质分子不能通过凝胶小球，因此它们被限制在小球之间的空隙中。柱体积就大大变小。结果，比孔径大的分子洗脱很快。对能进出凝胶小球的小分子来说有很大的空间。它们通过柱层的路程延长。中等尺寸的分子以介于大分子和小分子之间的速度通过柱子。因此，一同溶质分子的洗脱顺序直接和分子大小相关[5]。

对任何能过凝胶分离的溶质来说，排除率介于0~100%，可用有效分布系数（Kav ）来表示，有效分布系数和床层体积（Vt ）, 空隙体积（Vo ）和洗脱体积（Ve ）有关。其关系可用如下方程表示：

e o av t o

V V K V V -=- Vt 和Vo 在特定的色谱条件下的固定的。因此随着特定溶质分子量的增加，Kav 也增加。如果溶质的Kav 相差很大，分配规律就很有效果，否则就很不明显。Kav 不仅不分配效果的重要参数，而且是测定蛋白质分子质量的基础。对特定的凝胶类型来说，Kav 与lgMr （Mr 代表分子量）有线性关系，Kav=?blogMr+c ，其中b 和c 为常数。我们也可以得到如下方程：Ve=?b′logMr+c′，其中b′和c′为常数。

首先，我们可以在凝胶柱中分离分子量以知的一同蛋白质分子，然后用相同的凝胶柱测定其它未知的蛋白质分子。

2.1.2凝胶过滤色谱的应用

Scott M. Gordon [6]等人用高分辨率的凝胶过滤色谱分离正常人体血浆得到17

种含磷脂的分子。Rajesh Chaudhary[7]等人利用凝胶色谱促黄体激素进行提纯，得到了很好的效果。

2.2凝胶渗透色谱（GPC）

凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物(聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等) 相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。

2.2.1 凝胶渗透色谱法的原理

凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，內部具有网状筛孔，利用球状凝胶內的筛孔，使分子流过填充凝胶的管柱时，大分子无法进入凝胶筛孔，而只流经凝胶及管柱间的孔隙，很快就可以流出管柱，较小的分子因为进入凝胶內的筛孔，故在管柱內的停留时间较长，由此区分大小不同的分子，亦可与已知大小的分子作比较而定出一分子的分子量。一般状況下，凝胶不会吸附成份，所有欲分离物质都会被洗出，这是凝胶层析法与其它层析法不同的地方。

2.2.2 凝胶渗透色谱法的分类

目前常用的凝胶包括3个主要类型：

○1. Polydextran

Polydextran的商品名称是Sephadex，它几乎不溶于溶剂中，亲水性强，能迅速在水和电解质溶液中膨胀，在碱性的环境中十分稳定，所以可以用碱去除凝胶上的污染物。Sephadex依其吸水量有不同型号，如G-25、G-75、G-100或是G-200，G 后面的数字为凝胶吸水量再乘以10，以G-25为例，表示1克干燥的G-25凝胶可以吸水2.5 ml 。

○2. Polyacrylamide

Polyacrylamide是一种合成凝胶，商品名Bio-Gel P，干粉颗粒状，在溶剂中自动溶成胶体，依胶的分离范围不同，分成Bio-Gel P-2至Bio-Gel P-300，P后面的数字乘以1000为最大过滤限度。Polyacrylamide的化学性质不活泼，但它在极端的pH 下会被水解，水解后产生的COOH-具有离子交换的性质，因此pH 值应尽量控制在2-10之间。

○3. Agarose

商品名Separose，属于天然凝胶，依凝胶中干胶的百分含量，分为Sepharose 2B，4B和6B。Agarose gel 是一种大孔凝胶，主要用于像核酸或病毒这些分子量400,000以上的物质，因其颗粒软，在分离过程有时会阻塞管柱，造成流速减慢，又因其在摄氏50度以上会融化，故需于较低温的环境中进行层析。Agarose 做成beads后不能再脱水干燥，所以要在湿态中保存。

2.2.3凝胶和管柱的选择

凝胶的材质需为化学惰性，与分离物不能产生变性（denature）或是其它化学反应，最好具有能长期反复使用的稳定性，并可以在较大的pH和温度范围內使用。由于凝胶上的离子交换基团会吸附带电荷的物质，产生离子交换的效果，所以凝胶上最好不具有离子交换的基团。此外，凝胶要有一定的机械强度，在层析过程中才不会变形，增加机械强度也可使层析在较高压力的环境进行，缩短分离时间。

凝胶颗粒的粗细与分离效果有直接关系，颗粒细的分离效果好，但流速慢而费时，因此要依具实际的需要来选择。对于分子量较小的物质，一般采用polydextran或polyacrylamide材质的凝胶，大分子物质则使用agarose。

以Sephadex为例，Sephadex G-50可用于区分分子量1,500～30,000之分子，而Sephadex G-75 凝胶可区分分子量3,000～70,000之分子，所以若要分离分子量10,000及20,000之分子，两种都适用。

如果要分离的分子大小相差很多，则可选用柱高：直径＝5∶1～15∶1的管柱，且管柱体积要大于4～15倍的样品体积；如果要分离的物质之间分子量差异不大，则要选用柱高：直径＝20∶1～100∶1的管柱，且管柱体积要大于25～100倍的样品体积。

2.2.4凝胶的处理

商品凝胶一般是干燥的颗粒，使用前要先泡在欲使用的沖洗液中，使它充份膨胀，否则有引起凝胶柱破裂的危险。热胀法是常用的前处理法，即把浸于沖洗液中的凝胶加热，让它膨胀并除去气泡，温度够高的话（加温至近沸腾）也可消毒杀菌。凝胶处理过程不能剧烈搅拌，如此易使颗粒破裂，影响流速。

将凝胶裝入管柱的方法有很多种，实验室常用的方法是先在柱中加入约1/3 体积的沖洗液，边轻轻搅拌边将凝胶悬浮液倒入其中，等到底部沉积约1~2公分的凝胶后，打开下方出口让水流出，上面不断加入悬浮液，等到沉积到离顶部约3～5公分处停止，让3～5倍柱床体积的缓冲液流过层析柱。若用polydextran 的凝胶，可放入有颜色的蛋白质（如cytochrome c）流过管柱，看看色带是否均匀下降，不均匀或出现气泡，凝胶均需倒出重新填裝。

冲洗缓冲液仅需留高于柱床2公分左右，多余的可用滴管吸去，再将出口打开使冲洗液流到距表面1～2公分，关闭出口，用滴管缓缓加入样品再打开出口，样品完全渗入凝胶內后，加入约4公分冲洗液，出口处接上收集瓶开始层析。

由于polydextran 和agarose都属于多糖类，一旦微生物生长过多，分泌的酶会水解凝胶使其性质改变，为了防止这种情況发生，凝胶最好采用真空或低温保存，但温度不能过低使凝胶冻结。加入抑菌剂（chlohexidine, chlorbutol, phenylmercuric salts, NaOH等）也是常用的方法。长时间不用的凝胶可用干燥保存法，也就是把使用过的凝胶用水除去碎颗粒和杂质，再用不同浓度的酒精，由70%、90%到95%逐步脱水，在摄氏60～80度下烘干，不能加热的Sepharose则用乙醚洗涤干燥。

2.2.5凝胶渗透色谱法的应用

Yongqing Ma等人[8]利用凝胶渗透色谱法和固相萃取法对生物样本的萃取液净化以除去类脂化合物和其它干扰物质，获得了很好的效果。

Kaisu R. Riihinen等人[9]在10米长的低压的凝胶色谱柱利用葡聚糖凝胶LH-20从越橘中制备纯化槲皮甙取得了很好的效果。

参考文献

[1] Lathe, G.H.; Ruthven, C.R.J. The Separation of Substance and Estimation of their Relative Molecular Sizes by the use of Columns of Starch in Water. Biochem [J]. 1956, 62,:665–674. [2] Moore, J.C. Gel permeation chromatography. I. A new method for molecular weight distribution of high polymers. J. Polym. Sci., 1964, 2, 835-843.

[3] Skoog, D.A. Principles of Instrumental Analysis, 6th ed.; Thompson Brooks/Cole: Belmont, CA, 2006, Chapter 28.

[4] Use of Gel Permeation Chromatography in Studies of Acacia Polyacantha Gum，Gezira j. of eng. & applied . sci. 6 (1) :125 – 140 (2011)

[5] Soon-Jae Lee1, Serji N. Amirkhanian2, and Bradley J. Putman3. Characterization of Recycled Aged RAP Binders Containing Crumb Rubber Modifier Using Gel Permeation Chromatography[J]. 2009, 8(21):382-391

[6] Scott M. Gordon, Jingyuan Deng, L. Jason Lu, and W. Sean Davidson. Proteomic Characterization of Human Plasma High Density Lipoprotein Fractionated by Gel Filtration Chromatography. J. Proteome Res. 2010, 9 (10):5239–5249.

[7] Rajesh Chaudhary, Sulakshana Jain, K. Muralidhar, M.N. Gupta. Purification of bubaline luteinizing hormone by gel filtration chromatography in the presence of blue dextran. Process Biochemistry, 2006.3, 41(3):562-566.

[8] Yongqing Ma, Kunyan Cui, Feng Zeng, Jiaxin Wen, Hong Liu, Fang Zhu, Gangfeng Ouyang, Tiangang Luan, Zunxiang Zeng. Microwave-assisted extraction combined with gel permeation chromatography and silica gel cleanup followed by gas chromatography–mass spectrometry for the determination of organophosphorus flame retardants and plasticizers in biological samples. Analytica Chimica Acta, In Press, Accepted Manuscript, Available online 13 May 2013.

[9] Kaisu R. Riihinen, Tanja G?decke, Guido F. Pauli. Purification of berry flavonol glycosides by long-bed gel permeation Chromatography. ournal of Environmental Management, 2013, 116:27-35