利用限制性内切酶分析法检测镰刀型细胞贫血症
利用限制性内切酶分析法检测镰刀型细胞贫血症
限制性内切酶分析法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异。当待测DNA序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异的限制性酶切片段的状态在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析诊断。
如：（2005湖北3）镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因的碱基序列发生了改变。检测这种碱基序列改变必须使用的酶是
A.解旋酶
B.DNA连接酶
C.限制性内切酶
D.RNA聚合酶
解析：根据碱基互补配对原则可采用DNA分子杂交原理或DNA探针的方法。采用加热等一定的技术手段将患者的DNA分子片段与正常人的DNA分子片段单链放在一起，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；碱基序列改变的部位则仍然是两条游离的单链。解旋酶的作用是DNA分子在复制或转录时将DNA双链解开，在本题中加热也可以解开达到目的，所以不是必须的酶；DNA连接酶和限制性内切酶都是基因工程的工具酶，一种限制性内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子的基本骨架上脱氧核糖和磷酸之间的磷酸二酯键，DNA连接酶的作用和它正好相反，是将限制酶切开的缺口缝合起来。而RNA聚合酶则是在基因转录过程中促进核糖核苷酸形成mRNA分子的酶，本题就是采用限制性内切酶分析法解题的。必须使用的酶就是限制性内切酶，故选C。
根据DNA分子杂交原理知，将患者的DNA分子片段与正常人的DNA分子片段单链放在一起，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；碱基序列改变的部位则仍然是两条游离的单链，有无双链便是区别，为什么又要用限制性内切酶将其切开再杂交呢？回答这个问题我们先看看。
2008天津30-Ⅰ下图为人β-珠蛋白基因与其mRNA杂交的示意图，①-⑦表示基因的不同功能区。
从本题看出基因的单链的编码区与其转录的成熟的mRNA之间可以杂交形成杂合链，但是它们两者之间不仅不是完全互补，相反有两个内含子对应的单链部分——③⑤所含有的上百个核苷酸，mRNA根本没有对应互补的部分，这就说明它们之间相差很大也能够杂交，只不过结果有突起部分而已，那镰刀型细胞贫血症基因和正常基因只有一个碱基发生突变，难道用正常基因转录的mRNA就不能与只突变一个碱基的基因杂交形成杂合链吗？应该是肯定可以,如果这样来检测，那镰刀型细胞贫血症基因和正常基因的检测结果是相同的，就找不到区别，无法鉴别。
所以必须采用限制性内切酶分析法来检测才有效，具体是先找到一种限制性内切酶，切开控制镰刀型细胞贫血症基因的对应部位的正常基因，这样就形成两短段，也同同一种酶来切镰刀型细胞贫血症基因，因为镰刀型细胞贫血症基因发生了一个碱基的突变，这样相同的限制性内切酶就无法切开，就还是完整的一长段，在用以上三段对应的已标记的mRNA进行杂交（此过程可以不用任何酶，通过控制温度来打开氢键和连结氢键），然后电泳，如果出现两短段的则是正常基因，如果只出现一长段则是突变基因，如果都有的说明两者都存在，可视为杂合。利用相关知识点命题的请看如下高考试题。
［2007江苏·38］单基因遗传病可以通过核酸杂交技术进行早期诊断。镰刀型细胞贫血症是一种在地中海地区发病率较高的单基因遗传病。已知红细胞正常个体的基因型为BB、Bb，镰刀型细胞贫血症患者的基因型为bb。有一对夫妇被检测出均为该致病基因的携带者，为了能生下健康的孩子，每次妊娠早期都进行产前诊断。下图为其产前核酸分子杂交诊断和结果示意图。
图注:↑限制酶酶切点·突变碱基带谱
(1)从图中可见，该基因突变是由于碱基对改变(或A变成T) 引起的。巧合的是，这个位点的突变使得原来正常基因的限制酶切割位点丢失。正常基因该区域上有3个酶切位点，突变基因上只有2个酶切位点，经限制酶切割后，凝胶电泳分离酶切片段，与探针杂交后可显示出不同的带谱，正常基因显示 2 条，突变基因显示 1 条。
(2)DNA或RNA分子探针要用放射性同位素(或荧光分子等) 等标记。利用核酸分子杂交原理，根据图中突变基因的核苷酸序列(…ACGTGTT…)，写出作为探针的核糖核苷酸序列…UGCACAA…。
(3)根据凝胶电泳带谱分析可以确定胎儿是否会患有镰刀型细胞贫血症。这对夫妇4次妊娠的胎儿Ⅱ-l～II-4中基因型BB的个体是Ⅱ一l和Ⅱ一4 ，Bb的个体是Ⅱ一3 ，bb的个体是Ⅱ一2 。
解析:比较基因B和和突变后的基因b的碱基组成，发现它们的差别仅是B基因一条链某一位点上的碱基A突变成b基因一条链某一位点上的碱基T（实质上对应的另一条链上的碱基也发生了改变）。据图观察，正常基因B经限制酶切割后，凝胶电泳分裂酶切片段，与探针杂交后可显示出不同的带谱都是二条，而突变后的基因b经限制酶切割后，与探针杂交后可显示出不同的带谱都是一条。所以，在分析推断胎儿Ⅱ-1～Ⅱ-4的基因型时，可以这样认为：基因型Bb的个体同时带有B基因和b基因，所以其应同时含有与B基因对应的二条带谱，与b基因对应的一条带谱（这也可以从Ⅰ-1和Ⅰ-2得到验证）。符合这个条件的仅有Ⅱ-3。同理，基因型为BB的个体应仅有与B基因相对应的二条带谱，符合条件的是Ⅱ-1和Ⅱ-4。bb的个体是只能是含有与b基因相对应的一条带谱，为Ⅱ-2。作为探针的必要条件之一是要易于识别，所以可用放射性同位素或荧光分子等进行标记。既可以用脱氧核苷酸链作探针，也可以用核糖核苷酸链作探针，题干中明确要求用核糖核苷酸链，所以，特别要注意当DNA链上的碱基是A时，作探针用的RNA链上的碱基应为U。
通过如上分析可知，限制性内切酶分析法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测的方法，即是酶切和核酸分子杂交两种技术的综合分析方法。核酸分子杂交技术在体外进行的时候可以不用相关酶，但是限制性内切酶无法用温度等外界环境的控制来代替。限制性内切酶分析法现在的使用很广泛，如：在柯萨奇B组病毒B1-B6型检测及分型中的应用----利用GCG软件对柯萨奇B1-B6型病毒cDNA全序列进行了限制性内切酶酶切位点的分析，目前从理论上推测该方法几乎可以检测所有遗传病的变异基因，近几年高考试题也是屡屡出现,所以提醒广大师生在高考复习备考过程中应多加重视。
镰刀型细胞贫血症
生化PBL病例2 11临本2班第二小组 1．血红蛋白的ɑ-链和β-维持血红蛋白的空间结构有何特点？维持血红蛋白四级空间的力量包括哪些化学键？ (1) 血红蛋白是由四条多肽链组成的──二条α链(每条α链含141个氨基酸残基)和二条β链(每条β链含146个氨基酸残基)。每条多肽链的螺旋结构形成一个疏水性的空间，可保护血红素分子不与水接触，Fe2+不被氧化。Fe2+位于血红素卟啉环的中央，与卟啉环的4个吡咯基、O2及多肽链上的组氨酸形成六配位体。每个血红蛋白分子可逆结合4个氧分子，每克血红蛋白可结合1.34 mL氧气。（2）范德华力、氢键、离子键和疏水键作用还有亚基间的二硫键。 ——选自【血液病】黄晓军主编及生物化学教材 2．镰刀细胞性贫血的分子基础是什么（基因和蛋白质的改变）?用什么方法可以诊断？ 根本原因是基因的改变，第十七位的碱基T由A代替，最终导致翻译出的蛋白质改变，即导致细胞镰化的直接原因，原本的谷氨酸被缬氨酸所代替，谷氨酸为带负电荷的极性亲水氨基酸，而缬氨酸为不带电荷的非极性疏水氨基酸，这种疏水性导致导致血红蛋白的溶解度大大降低，当氧分压低时(如血液流至毛细血管处)，HbS会形成棒状凝胶结构，使红细胞扭曲成镰刀状，红细胞的变形性降低可引起溶血。 [诊断]可应用镰刀试验，血红蛋白溶解性，电泳及色层柱析法等，并结合临床表现作出诊断。3．为什么患者的红细胞会变成镰刀状？ 正常的谷氨酸被缬氨酸代替，缬氨酸是一个疏水氨基酸，这样的氨基酸分子暴露在血红蛋白分子外部是不利的。由于这样的疏水作用，血红蛋白分子的这个位点不易与水结合，水溶性降低，众多的血红蛋白分子相互聚集沉淀，形成纤维状的纤维沉淀。这样的结果是使得红细胞的形态结构发生变化，红细胞特有的圆饼状结构消失，变成扁平细长的镰刀型细胞。4．患者产生症状（贫血、疼痛等）的病理学基础是什么？ 僵硬的镰形红细胞难以通过微循环，加上凝胶化结构使血液粘滞性增加，阻塞微循环引起局部缺血缺氧，甚至坏死，产生剧痛。根据血管闭塞的部位不同，导致不同器官的病变，如肝、肾、脑、心损伤等．又由于这种镰变红细胞的变形性降低，易在脾和肝阻留破坏，出现溶血性贫血症状。 ——选自【医学遗传学】第二版446页5．镰刀细胞性贫血在世界范围内的分布有何特点？ 非洲和美洲的黑人为主，杂合子状态者占非洲黑人的20%，美国黑人群的8% ，此外也见于希腊、意大利、土耳其、中东、土著印第安人及上述民族长期通婚的人群。杂合子之间通婚，其1/4 子女为纯合子。而在我国见于两广及香港、台湾。本病多见于非洲、美洲黑人，也见于中东、希腊、土籍印第安人及与上述民族长期通婚的人群。1987年我国首次报道此病?，但其亲代系非洲黑人。 6．镰刀细胞性贫血的血红蛋白在电泳行为上与正常血红蛋白有何差别？ 正常血红蛋白电泳区带：HbA＞95%，HbF＜2%，HbA2为1.0%~3.1%。通过与健康人血红蛋白电泳图谱进行比较，可发现异常血红蛋白区带，如HbH、HbE、HbBarts、HbS 、HbD 和HbC等异常血红蛋白。镰状细胞贫血血红蛋白电泳显示HbS占80%以上，HbF增多至2%~15%，HbA2正常，而HbA缺如。 7．人血红蛋白（HbA)由哪些肽链组成？这些肽链在一级结构上有何差别？ 由两条α肽链（每条α链含141个氨基酸残基）和两条β肽链（每条β链含146个氨基酸残基）组成
简述镰刀型细胞贫血症是怎样引起的其检测机理是什么文档
机理： 镰刀型细胞贫血症是一种遗传性贫血症，属隐性遗传。是基因突变产生的血红蛋白质分子结构改变的一种分子病。正常的血红蛋白是由两条α链和两条β链构成的四聚体，其中每条肽链都以非共价键与一个血红素相连接。α链由141个氨基酸组成，β链由146个氨基酸组成。镰刀型细胞贫血症患者的血红蛋白的分子结构与正常人的血红蛋白的分子结构不同。 英格兰姆发现镰刀型细胞贫血症是因为链中第六个氨基酸发生变化引起的。正常健康的人第六个氨基酸是谷氨酸，而患镰刀型贫血症的人则由一个缬氨酸代替谷氨酸。 一般用来诊断及侦测镰刀型贫血症患者的分析测试包括： ·全血球计数分析(Complete blood count , CBC) ·S血红素筛选测试(Hemoglobin S screening test) ·血红素电泳分析(Hemoglobin electrophoresis) ·镰形细胞分析测试(Sickle cell test)用聚合酶链反应(PCR)和寡核苷酸探针(ASO)方法或采用PCR和限制性内切酶. 疾病检查 1.外周血血红蛋白为50～100g/L，危象时进一步降低。网织红细胞计数常在10%以上。红细胞大小不均，多染性、嗜碱性点彩细胞增多可见有核红细胞、靶形红细胞异形红细胞、Howell-Jolly小体。镰状红细胞并不多见，若发现则有助于诊断通常采用“镰变试验”检查有无镰状细胞。红细胞渗透脆性显著降低白细胞和血小板计数一般正常。 2.骨髓象示红系显著增生，但在再生障碍危象时增生低下，在巨幼细胞危象时有巨幼细胞变 3.血清胆红素轻～中度增高，溶血危象时显著增高。本病的溶血虽以血管外溶血为主，但也存在着血管内溶血。 4.血浆结合珠蛋白降低，血浆游离血红蛋白可能增高。 5.红细胞半衰期测定显示红细胞生存时间明显缩短至5～15天[正常为(28±5)天] 6.血红蛋白电泳显示HbS占80%以上HbF增多至2%～15%，HbA2正常，而HbA缺如。 其它辅助检查：根据病情、临床表现、症状、体征选择做心电图、X线、CTMRI、B 超、生化等检查。片段长度多态性(RFLP)方法，在妊娠早期即可作产前诊断，防止纯合子患儿的出生。 二、填空题 1．现代生物技术的核心技术是基因工程。 2．常用的DNA连接酶是T4 DNA连接酶。 3．组织培养中分化产生的具有芽端和根端类似合子胚的构造的位点称为胚状体。4．一般植物培养基pＨ值为 5.6-5.8 。 5．农杆菌侵染植物后，能够进入并整合到植物基因组上的DNA是T-DNA。 6．微生物发酵过程中常用于控制发酵液pH的生理酸性和碱性物质分别是硫酸铵和氨水。 7．酶的固定化类型有吸附固定化、包埋固定化、共价固定化、交联固定化和微囊固定化。8．植物脱毒的基本方法是茎尖脱毒。
镰刀型细胞贫血症发病机理研究综述 闫红博
镰刀型细胞贫血症发病机理研究综述 闫红博 ( 华南师范大学生命科学学院，广东广州， 510631) 摘要：追溯镰刀型细胞贫血症研究历史镰刀型细胞贫血症是20世纪初才被人们发现的一种遗传病。1910年,一个黑人青年到医院看病,他的症状是发烧和肌肉疼痛,经过检查发现,他患的是当时人们尚未认识的一种特殊的贫血症,其红细胞不是正常的圆饼状,而是弯曲的镰刀状。后来,人们就把这种病称为镰刀型细胞贫血症。1949年Pauling L和Itano发现镰刀型细胞贫血症与血红蛋白结构异常相关,病人的血红蛋白所带的电荷不同于正常人的血红蛋白。与此同时,James Neel发现镰刀型细胞贫血症是一种符合孟德尔遗传规律的疾病。 关键词：镰刀型细胞贫血症发病机理 镰刀形细胞贫血症（Sickle Cell Anemia）是一种隐性基因遗传病。患病者的血液红细胞表现为镰刀状，其携带氧的功能只有正常红细胞的一半。现在医生可以用regular blood transfusion避开伤害患者的大脑来阻止这类疾病的发病，但是，迄今为止还没有能真正治愈的药物。 Sickle cell disease is caused by the substitution of a single amino acid in the hemoglobin protein of red blood cells. When the oxygen content of an affected individual's blood is low(at high altitudes or under physical stree, for instance), the sickle cell hemolgobin molecules crystallize by aggregating into long rods. the crystals deform the red cells into a sickle shape. Sickling of the cells, in turn, can lead to other symptoms. The mutliple effects of a double does of the sickle cell allele are an example of pleiotropy. The non-sickle cell counterpart of the sickle cell allele is in fact only incompletely dominant to the sickle cell allele at the level of the organism. Heterozygotes--carriers of a single sickle cell allele--are said to have sickle cell trait. Such people are usually healthy, although a fraction suffer some symptoms of sickle cell disease when there is an extended reduction of blood oxygen. 1、镰刀型细胞贫血症发病的原因 基因突变产生的血红蛋白分子结构发生改变，属于分子病。正常的血红蛋白是由两条α链和两条β链构成的四聚体，其中每条肽链都以非共价键与一个血红素相连接。α链由141个氨基酸组成，β链由146个氨基酸组成。镰刀型细胞贫血症患者的血红蛋白的分子结构与正常人的血红蛋白的分子结构不同。 2、镰刀型细胞贫血症的发病症状 镰刀型细胞贫血症患者出生半年后，症状和体征逐渐出现。由于早年发病患者多有生长和发育不良，一般状况较差，易发生感染尤其是肺炎球菌性感染，此与劳累、脾功能受
镰刀细胞性贫血
1、血红蛋白的α链和β链的空间结构有何特点？维持血红蛋白四级空间结构的力量包括哪些化学键？ 答：（1）珠蛋白按四级结构与血红素形成血红蛋白。血红蛋白的每个哑基由一条珠蛋白肽链和一个血红素分子构成，肽链在生理条件下会盘绕折叠成球形，把血红素分子包在里面．这条肽链盘绕成的球形结构义被称为珠蛋白。血红蛋白是由四条多肽链组成的──二条α链(每条α链含141个氨基酸残基)和二条β链(每条β链含146个氨基酸残基)。每条多肽链的螺旋结构形成一个疏水性的空间，可保护血红素分子不与水接触，Fe2+不被氧化。Fe2+位于血红素卟啉环的中央，与卟啉环的4个吡咯基、O2及多肽链上的组氨酸形成六配位体。每个血红蛋白分子可逆结合4个氧分子，每克血红蛋白可结合1.34 mL氧气。（2）范德华力、氢键、离子键和疏水键作用还有亚基间的二硫键。 2、镰刀细胞性贫血的分子基础是什么（基因和蛋白质的改变）？用什么方法可以诊断？ 答：分子病理是β基因发生单一碱基突变，正常β基因第6个密码子为GAG，编译谷氨酸突变后变为GTG编译缬氨酸，这种单个氨基酸的替代即形成HbS。当血氧过低时，HbS互相聚集，形成纤维状多聚体。其排列方向与细胞膜平行，并与之紧密接触，当有足够的多聚体形成时，红细胞即由双面凹盘状变成镰刀形．此过程称“镰变”。镰变的红细胞僵硬、变形性差，在微循环中易破坏而发生溶血。镰变的红细胞也可使血液黏滞性增加，血流缓慢，引起微血管堵塞，加重组织缺氧、酸中毒，从而进一步诱发更多的红细胞发生镰变。 本病的诊断并不困难重要的是要考虑到本病的可能性而不遗漏本病。根据种族和家族史镰变试验阳性血红蛋白电泳显示主要成分为HbS，再结合临床表现，即可明确诊断。 实验室检查： 1）外周血血红蛋白为50～100g/L，危象时进一步降低。网织红细胞计数常在10%以上。红细胞大小不均，多染性、嗜碱性点彩细胞增多可见有核红细胞、靶形红细胞异形红细胞、Howell-Jolly小体。镰状红细胞并不多见，若发现则有助于诊断通常采用“镰变试验”检查有无镰状细胞。红细胞渗透脆性显著降低白细胞和血小板计数一般正常。 2）骨髓象示红系显著增生，但在再生障碍危象时增生低下，在巨幼细胞危象时有巨幼细胞变 3）血清胆红素轻～中度增高，溶血危象时显著增高。本病的溶血虽以血管外溶血为主，但也存在着血管内溶血。4）血浆结合珠蛋白降低，血浆游离血红蛋白可能增高。 5）红细胞半衰期测定显示红细胞生存时间明显缩短至5～15天[正常为(28±5)天] 6）血红蛋白电泳显示HbS占80%以上HbF增多至2%～15%，HbA2正常，而HbA缺如。 其它辅助检查： 根据病情、临床表现、症状、体征选择做心电图、X线、CTMRI、B超、生化等检查。 3、为什么患者的红细胞会变成镰刀状？ 答：因HbA的β链上第6个氨基酸谷氨酸被缬氨酸替代形成HbS，当血氧过低时，HbS互相聚集，形成纤维状多聚体。其排列方向与细胞膜平行，并与之紧密接触，当有足够的多聚体形成时，红细胞即由双面凹盘状变成镰刀形。 4、患者产生症状（贫血、疼痛）的病理生理学基础是什么? 答：在HbS中，由于带负电的极性亲水谷氨酸被不带电的非极性疏水缬氨酸所代替，致使血红蛋白的溶解度下降。在氧张力低的毛细血管区，HbS形成管状凝胶结构(如棒状结构)，导致红细胞扭曲成镰刀状(即镰变)。这种僵硬的镰状红细胞不能通过毛细血管，加上HbS的凝胶化使血液的黏滞度增大，血流缓慢，阻塞毛细血管,引起局部组织器官缺血缺氧、酸中毒和炎症反应，产生脾肿大、胸腹疼痛(又叫做“镰形细胞痛性危象”)等临床表现。多发生于肌肉、骨骼、四肢，关节、胸腹部，尤以关节和胸腹部为常见。从而进一步诱发更多的红细胞发生镰变。这种恶性循环的结果，不仅加重溶血，还导致组织器官的损伤坏死，表现为轻重不等的小细胞或大细胞贫血。 5、镰刀细胞性贫血在世界范围内的分布有何特点？ 答：镰刀型细胞贫血症主要发生在黑色人种中,在非洲黑人中的发病率最高。人们在非洲疟疾流行的地区，发现镰刀型细胞杂合基因型个体对疟疾的感染率，比正常人低得多。这是因为镰刀型细胞杂合基因型在人体本身并不表现明显的临床贫血症状，而对寄生在红血球里的疟原虫却是致死的，红血球内轻微缺氧就足以中断疟原虫形成分生孢子，终归于死亡。因此，在疟疾流行的地区，不利的镰刀型细胞基因突变可转变为有利于防止疟疾的流行。这一实例，也说明基因突变的有害性是相对的，在一定外界条件下，有害的突变基因可以转化为有利。此外，镰刀形细胞贫血症在意大利、希腊等地中海沿岸国家和印度等地,发病人数也不少,在我国的南方地区也发现有这类病例。 6、镰刀细胞性贫血患者的血红蛋白在电泳行为上与正常的血红蛋白有何异同？ 答：常人和患者的血红蛋白的电泳图谱明显不同，而携带者的血红蛋白的电泳图谱，与由正常人的和患者的血红
镰刀型细胞贫血症基因的检测方法
湖北当阳一中沈满弟限制性内切酶分析法是利用限制性 内切酶和特异性DNA 探针来检测是否存在基因变异。当待测DNA 序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异的限制性酶切片段的状态在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析诊断。如：（2005 湖北3）镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因的碱基序列发生 了改变。检测这种碱基序列改变必须使用的酶是 A.解旋酶B.DNA 连接酶C.限制性内切酶D.RNA 聚合酶解析：根据碱基互补配对原则可采用DNA 分子杂交原理或DNA 探针的方法。采用加热等一定的技术手段将患者的DNA 分子片段与正常人的DNA 分子片段单链放在一起，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；碱基序列改变的部位则仍然是两条游离的单链。解旋酶的作用是DNA 分子在复制或转录时将DNA 双链解开，在本题中加热也可以解开达到目的，所以不是必须的酶；DNA 连接酶和限制性内切酶都是基因工程的工具酶，一种限制性内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA 分子的基本骨架上脱氧核糖和磷酸之间的磷酸二酯键，DNA 连接酶的作用和它正好相反，是将限制酶切开的缺口缝合起来。而RNA 聚合酶则是在基因转录过程中促进核糖核苷酸形成mRNA 分子的酶，本题就是采用限制性内切酶分析法解题的。必须使用的酶就是限制性内切酶，故选C。根据DNA 分
子杂交原理知，将患者的DNA 分子片段与正常人的DNA 分子片段单链放在一起，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；碱基序列改变的部位则仍然是两条游离的单链，有无双链便是区别，为什么又要用限制性内切酶将其切开再杂交呢？回答这个问题我们先看看。2008 天津30-Ⅰ下图为人β -珠蛋白基因与其mRNA 杂交的示意图，①-⑦表示基因的不同功能区。从本题看出基因的单链的编码区与其转录的成熟的mRNA 之间可以杂交形成杂合链，但是它们两者之间不仅不是完全互补，相反有两个内含子对应的单链部分——③⑤所含有的上百个核苷酸，mRNA 根本没有对应互补的部分，这就说明它们之间相差很大也能够杂交，只不过结果有突起部分而已，那镰刀型细胞贫血症基因和正常基因只有一个碱基发生突变，难道用正常基因转录的mRNA 就不能与只突变一个碱基的基因杂交形成杂合链吗？应该是肯定可以,如果这样来检测，那镰刀型细胞贫血症基因和正常基因的检测结果是相同的，就找不到区别，无法鉴别。所以必须采用限制性内切酶分析法来检测才有效，具体是先找到一种限制性内切酶，切开控制镰刀型细胞贫血症基因的对应部位的正常基因，这样就形成两短段，也同同一种酶来切镰刀型细胞贫血症基因，因为镰刀型细胞贫血症基因发生了一个碱基的突变，这样相同的 限制性内切酶就无法切开，就还是完整的一长段，在用以上
利用限制性内切酶分析法检测镰刀型细胞贫血症
利用限制性内切酶分析法检测镰刀型细胞贫血症 限制性内切酶分析法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异。当待测DNA序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异的限制性酶切片段的状态在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析诊断。 如：（2005湖北3）镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因的碱基序列发生了改变。检测这种碱基序列改变必须使用的酶是 A.解旋酶 B.DNA连接酶 C.限制性内切酶 D.RNA聚合酶 解析：根据碱基互补配对原则可采用DNA分子杂交原理或DNA探针的方法。采用加热等一定的技术手段将患者的DNA分子片段与正常人的DNA分子片段单链放在一起，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；碱基序列改变的部位则仍然是两条游离的单链。解旋酶的作用是DNA分子在复制或转录时将DNA双链解开，在本题中加热也可以解开达到目的，所以不是必须的酶；DNA连接酶和限制性内切酶都是基因工程的工具酶，一种限制性内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子的基本骨架上脱氧核糖和磷酸之间的磷酸二酯键，DNA连接酶的作用和它正好相反，是将限制酶切开的缺口缝合起来。而RNA聚合酶则是在基因转录过程中促进核糖核苷酸形成mRNA分子的酶，本题就是采用限制性内切酶分析法解题的。必须使用的酶就是限制性内切酶，故选C。 根据DNA分子杂交原理知，将患者的DNA分子片段与正常人的DNA分子片段单链放在一起，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；碱基序列改变的部位则仍然是两条游离的单链，有无双链便是区别，为什么又要用限制性内切酶将其切开再杂交呢？回答这个问题我们先看看。 2008天津30-Ⅰ下图为人β-珠蛋白基因与其mRNA杂交的示意图，①-⑦表示基因的不同功能区。 从本题看出基因的单链的编码区与其转录的成熟的mRNA之间可以杂交形成杂合链，但是它们两者之间不仅不是完全互补，相反有两个内含子对应的单链部分——③⑤所含有的上百个核苷酸，mRNA根本没有对应互补的部分，这就说明它们之间相差很大也能够杂交，只不过结果有突起部分而已，那镰刀型细胞贫血症基因和正常基因只有一个碱基发生突变，难道用正常基因转录的mRNA就不能与只突变一个碱基的基因杂交形成杂合链吗？应该是肯定可以,如果这样来检测，那镰刀型细胞贫血症基因和正常基因的检测结果是相同的，就找不到区别，无法鉴别。 所以必须采用限制性内切酶分析法来检测才有效，具体是先找到一种限制性内切酶，切开控制镰刀型细胞贫血症基因的对应部位的正常基因，这样就形成两短段，也同同一种酶来切镰刀型细胞贫血症基因，因为镰刀型细胞贫血症基因发生了一个碱基的突变，这样相同的限制性内切酶就无法切开，就还是完整的一长段，在用以上三段对应的已标记的mRNA进行杂交（此过程可以不用任何酶，通过控制温度来打开氢键和连结氢键），然后电泳，如果出现两短段的则是正常基因，如果只出现一长段则是突变基因，如果都有的说明两者都存在，可视为杂合。利用相关知识点命题的请看如下高考试题。
生物化学病例教学法镰刀型红细胞贫血
镰刀型红细胞贫血 2011-1-4 21:15:42 病例：一位15岁的美籍非洲妇女到急诊室就诊，主诉双侧大腿和臀部疼痛一天，并且不断加重，服用布洛芬不能解除其疼痛症状。患者否认最近有外伤和剧烈运动史。但她最近感觉疲劳和小便时尿道经常有灼烧感。患者既往有症状，有时需要住院。检查发现，体温正常，没有急性疼痛。其家族其他成员没有类似的表现。患者结膜和口腔稍微苍白，双侧大腿外观正常，但有非特异性的大腿前部疼痛，其他体征正常。患者的白细胞计数升高，为17,000/mm3，而其血红蛋白含量低，为71/L。尿液分析显示有大量的白细胞。 ?15岁的美籍非洲妇女 ?双侧大腿和臀部疼痛一天 ?布洛芬不能解除其疼痛症状 ?感觉疲劳和小便时尿道经常有灼烧感 ?结膜和口腔稍微苍白，双侧大腿外观正常，但有非特异性的大腿前部疼痛，其他体征正常 ?白细胞计数升高，为17,000/mm3，而其血红蛋白含量低，为71/L。尿液分析显示有大量的白细胞?初步诊断：镰刀细胞性贫血 分析：是一种常染色体隐性等位基因出现突变的遗传病。患病者的血液红细胞表现为镰刀状，其携带氧的功能只有正常红细胞的一半。，不能产生正常血红蛋白的遗传疾病。它在非洲和美洲黑人中甚为普遍。这种疾病名称的由来是由于患者的血红细胞变成镰刀形及出现贫血现象。 1.蛋白质一级结构是空间构象的基础 2.重要蛋白质的氨基酸序列改变即可引起疾病 正常人的血红蛋白β亚基的第6位氨基酸是谷氨酸，而镰刀形贫血患者的血红蛋白中，谷氨酸变成了缬氨酸即酸性氨基酸被中性氨基酸替代，仅此一个氨基酸之差，原是水溶性的血红蛋白，就聚集成丝，相互黏着，导致红细胞变形成镰刀状而极易破碎，产生贫血。 分子基础：单碱基替代，缺失、插入。血红蛋白中一个谷氨酸被缬氨酸替代，导致血红蛋白在低氧条件下发生折叠，红细胞形态发生改变成镰刀型。 症状： 1.劳累、有贫血、黄疸和肝、脾大 2.心、肺功能常受损，可发生充血性心力衰竭。 3. 渗尿血尿、多尿 4.下肢皮肤慢性溃疡是常见的体征。 5.有时也会出现肾脏、脾脏或脑部供血不足的情况，从而造成这些器官受损 镰刀型细胞贫血症主要发生在黑色人种中,在非洲黑人中的发病率最高。人们在非洲疟疾流行的地区，发现镰刀型细胞杂合基因型个体对疟疾的感染率，比正常人低得多。这是因为镰刀型细胞杂合基因型在人体本身并不表现明显的临床贫血症状，而对寄生在红血球里的疟原虫却是致死的，红血球内轻微缺氧就足以中断疟原虫形成分生孢子，终归于死亡。因此，在疟疾流行的地区，不利的镰刀型细胞基因突变可转变为有利于防止疟疾的流行。这一实例，也说明基因突变的有害性是相对的，在一定外界条件下，有害的突变基因可以转化为有利。 此外，镰刀形细胞贫血症在意大利、希腊等地中海沿岸国家和印度等地,发病人数也不少,在我国的南方地区也发现有这类病例。
镰刀型细胞贫血症
镰刀型细胞贫血症 是一种遗传性贫血症，属隐性遗传。是基因突变产生的血红蛋白质分子结构改变的一种分子病。患者的红细胞缺氧时变成镰刀形（正常的是圆盘形），失去输氧的功能，很多红血球还会所以而破裂造成严重贫血，甚至引起病人死亡。镰刀型细胞贫血症的突变基因，是1949年确定的，随着分子遗传学的进展，到1957年终于由英国学者英格兰姆阐明了它的分子机制。原来正常成人血红蛋白是由二条链和二条链相互结合成的四聚体，链和链分别由141和146个氨基酸顺序连结构成。英格兰姆发现镰刀型细胞贫血症是因为链中第六个氨基酸发生变化引起的。正常健康的人第六个氨基酸是谷氨酸，而患镰刀型贫血症的人则由一个缬氨酸代替谷氨酸。英格兰姆的这个发现，使遗传机制的研究从基因水平深入到分子水平，在不到20年的时间里，就发现了100多种血红蛋白的分子突变型，都是因为蛋白质多肽链上个别氨基酸变化引起的分子突变。蛋白质多肽链中个别氨基酸的变化，归根到底是遗传物质DNA中个别碱基的改变。如镰刀型细胞贫血症，就是遗传物质DNA中一个CTT变成CAT，即其中一个碱基T变成A，以致产生病变。患者常有严重而剧烈的骨骼、关节和腹部疼痛的感觉。这种病常见于非洲和美洲黑人。人们在非洲疟疾流行的地区，发现镰刀型细胞杂合基因型个体对疟疾的感染率，比正常人低得多。这是因为镰刀型细胞杂合基因型在人体本身并不表现明显的临床贫血症状，而对寄生在红血球里的疟原虫却是致死的，红血球内轻微缺氧就足以中断疟原虫形成分生孢子，终归于死亡。所以，在疟疾流行的地区，不利的镰刀型细胞基因突变可转变为有利于防止疟疾的流行。这个实例，也说明基因突变的有害性是相对的，在一定外界条件下，有害的突变基因能够转化为有利。
镰刀形红细胞贫血症
3.为什么患者的红细胞变成镰刀状？ ?镰刀形红细胞贫血症是一种严重的溶血性疾病,其特点是在氧分压低的情况下,红细胞就由正常的双凹圆饼状变成镰刀形。产生镰刀形细胞贫血症的直接原因：正常的血红蛋白是由两条α链和两条β链构成的四聚体，其中每条肽链都以非共价键与一个血红蛋白相连接。α链由141个氨基酸组成，β链由146个氨基酸组成。镰刀型细胞贫血症患者的血红蛋白的分子结构与正常人的血红蛋白的分子结构不同。位于β链上从N末端开始的第6位的氨基酸，在正常的血红蛋白分子中是谷氨酸，在病态的分子中却被缬氨酸所代替。由于带负电的极性亲水谷氨酸被不带电的非极性疏水缬氨酸所代替，致使血红蛋白的溶解度下降。在氧张力低的毛细血管区，血红蛋白形成管状凝胶结构(如棒状结构)，导致红细胞扭曲成镰刀状(即镰变)。 当血液脱氧合（不携氧）时，镰刀形细胞大大增多。这种细胞极脆，易破损造成血液血红蛋白低水平。更严重的后果是某些器官的毛细血管被这些长形异常细胞堵塞，这是许多镰刀形红细胞贫血症病人早死的主要原因。镰刀形红细胞贫血病是从双亲处接受Hb突变基因的一种遗传病。只从父母一方得到此异常基因，则仅有约1％的红细胞镰刀形化，这种人只有轻微的镰刀形红细胞贫血症症状，如避免强烈的运动或其他使循环系统紧张的状态，可过完全正常的生活。镰刀形红细胞贫血症是一种“分子病”，即分子结构、特别是蛋白质分子结构发生遗传性变化而造成的病变。异常血红蛋白β链的第6位谷氨酸被缬氨酸所代替。这个疏水氨基酸正好适合另一血红蛋白分子β链EF角上的“口袋”，这使两条血红蛋白链互相“锁”在一起，最终与其他血红蛋白链共同形成一个不溶的长柱形螺旋纤维束，使红细胞扭旋成镰刀形。至于为什么脱氧合血红蛋白镰刀形化而氧合血红蛋白（携氧）不镰刀形化？可以简单解释为：在氧合形式中，血红蛋白亚基的重新排列使β链的口袋不能接受相邻的血红蛋白分子。根本原因：基因突变 4.患者产生症状（贫血、疼痛等）的病理生理学基础是什么？ 正常的血红蛋白是由两条α链和两条β链构成的四聚体，其中每条肽链都以非共价键与一个血红素相连接。α链由141个氨基酸组成，β链由146个氨基酸组成。镰刀型细胞贫血症患者的血红蛋白的分子结构与正常人的血红蛋白的分子结构不同。1956年，英格拉姆(Ingram)等人用胰蛋白酶把正常的血红蛋白(HbA)和镰形细胞的血红蛋白(HbS)在相同条件下切成肽段，通过对比二者的滤纸电泳双向层析谱，发现有一个肽段的位置不同。这是β链N末端的一段肽链。也就是说，HbS和HbA的α链是完全相同的，
镰刀型细胞贫血症研究进展
镰刀型细胞贫血症研究进展 摘要：追溯镰刀型细胞贫血症研究历史，镰刀型细胞贫血症是20世纪初才被人们发现的一种遗传病。1949年Pauling L和Itano发现镰刀型细胞贫血症与血红蛋白结构异常相关,病人的血红蛋白所带的电荷不同于正常人的血红蛋白。与此同时,James Neel发现镰刀型细胞贫血症是一种符合孟德尔遗传规律的疾病。红细胞中的HbS脱氧后经疏水作用聚合成束状纤维,引起膜蛋白异常激活,Cl- -K+共转移及Ca2+依赖型K+通道活力增强,K+外流,使细胞脱水变形。HbS的浓度、脱氧程度及HbF浓度影响HbS束状纤维形成过程,而K+通道抑制剂氯三苯甲咪唑、Hb F合成的促进羟基脲均可抑制该过程,成为治疗本病的常选药物。 镰刀形红细胞贫血(Sickle Cell Anemia,SCA)是一种经常出现疼痛危象的严重贫血病。自1910年发现该病，直到1949年Pauling等才证实SCA是一种血红蛋白异常的“分子病”。利用电泳指纹图谱早就证明了SCA患者HbS发生了β6Glu→Val突变[1]。至此，才弄清SCA 的分子基础。红细胞镰变的初期是可逆的，给予氧可逆转镰变过程。但当镰变已严重损害红细胞膜后，镰变就变为不可逆，即使将这种细胞置于有氧条件下，红细胞仍保持镰状。镰变的红细胞僵硬，变形性差，可受血管的机制破坏和单核巨噬系统吞噬而发生溶血。镰变的红细胞还可使血液黏滞性增加，血流缓慢，加之变形性差，易堵塞毛细血管引起局部缺氧和炎症反应导致相应部位产生疼痛危象，多发生于肌肉、骨骼、四肢关节、胸腹部，尤以关节和胸腹部为常见[2]。现就目前国外对SCA的发病机理及治疗研究的近况综述如下: 1 SCA的病理： 正常成人RBC中的血红蛋白主要是HbA(α2β2)，另有少量HbA2（α2β2一糖基)及微量的HbF(α2γ2)，而纯合子的SCA患者，HbS含量高达95 %，杂合子约占35 %，后者一般并不表现出临床症状。SCA的发病过程可分为三个阶段，即大量HbS脱氧聚合，并由此诱发细胞膜损伤、细胞失水变形。此外，SCA患者的红细胞(sRBC)与毛细血管内皮细胞粘连性增加，尤其是脱落到血液中的血管内皮细胞对粘附过程的促进作用，也加剧了血管阻塞及溶血反应[3]。 1.1HbS聚成束状纤维HbS的溶解性不及HbA等，而脱氧后的HbS溶解性又进一步 降低，易于通过疏水作用聚集成束的纤维状结构。在电镜下观察发现，束状纤维均沿变形的sRBC长轴方向排列，并指向变形后的sRBC突出部分。每条束状纤维约由14条链扭转而成，其中的每条链实际上是由两条HbS链借疏水作用并排交错组成。 HbS束状纤维的形成主要由sRBC中HbS的浓度、脱氧程度以及HbF浓度这三大因素决定的。当sRBC流经毛细血管发生脱氧作用时，脱氧后的HbS成为聚集作用的中心，并随着脱氧程度的加深，HbS束状纤维变粗变长，最终同sRBC的膜蛋白相互作用，影响细胞膜的通透性。但通常sRBC在微循环中的时间很短暂，不易形成束状纤维。从这也可以看出HbS愈多，愈易形成HbS束状纤维，自然SCA纯合子最易发病。HbF可增强1$S的溶解性。实验发现，将两者等量混合，HbS的溶解度将提高近一倍。显然HbF有阻止HbS的聚集作用的能力。研究表明，这主要是HbF
镰刀型细胞贫血症基因的检测要领
湖北当阳一中 沈满弟 限制性内切酶分析法是利用限制性 内切酶和特异性DNA 探针来检测是否存在基因变异。 当 待测DNA 序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点 的改变，其特异的限制性酶切片 段的状态在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析诊断。 如：（2005 湖北 3）镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因的碱基序列发生了改变。 检测这种碱基序列改变必须使用的酶是 A.解旋酶 B.DNA 连接酶 C.限制性内切酶 D.RNA 聚合酶 解析：根据碱基互补配对原则可采用DNA 分子杂交原理或DNA 探针的方法。采用加热等 一定的技术手段将患者的DNA 分子片段与正常人的DNA 分子片段单链放在一起，互补的碱基 序列就会结合在一起，形成杂合双链区；碱基序列改变的部位则仍然是两条游离的单链。解 旋酶的作用是DNA 分子在复制或转录时将DNA 双链解开，在本题中加热也可以解开达到目的， 所以不是必须的酶；DNA 连接酶和限制性内切酶都是基因工程的工具酶，一种限制性内切酶 只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA 分子的基本骨架上脱氧核糖和 磷酸之间的磷酸二酯键， DNA 连接酶的作用和它正好相反，是将限制酶切开的缺口 缝合起来。 而RNA 聚合酶则是在基因转录过程中促进核 糖核苷酸形成mRNA 分子的酶，本题就是采用限 制性内 切酶分析法解题的。必须使用的酶就是限制性内切酶，故、管路敷设技术通过管线不仅可以解决吊顶层配置不规范高中资料试卷问题，而且可保障各类管路习题到位。在管路敷设过程中，要加强看护关于管路高中资料试卷连接管口处理高中资料试卷弯扁度固定盒位置保护层防腐跨接地线弯曲半径标等，要求技术交底。管线敷设技术中包含线槽、管架等多项方式，为解决高中语文电气课件中管壁薄、接口不严等问题，合理利用管线敷设技术。线缆敷设原则：在分线盒处，当不同电压回路交叉时，应采用金属隔板进行隔开处理；同一线槽内强电回路须同时切断习题电源，线缆敷设完毕，要进行检查和检测处理。、电气课件中调试对全部高中资料试卷电气设备，在安装过程中以及安装结束后进行 高中资料试卷调整试验；通电检查所有设备高中资料试卷相互作用与相互关系，根据生产工艺高中资料试卷要求，对电气设备进行空载与带负荷下高中资料试卷调控试验；对设备进行调整使其在正常工况下与过度工作下都可以正常工作；对于继电保护进行整核对定值，审核与校对图纸，编写复杂设备与装置高中资料试卷调试方案，编写重要设备高中资料试卷试验方案以及系统启动方案；对整套启动过程中高中资料试卷电气设备进行调试工作并且进行过关运行高中资料试卷技术指导。对于调试过程中高中资料试卷技术问题，作为调试人员，需要在事前掌握图纸资料、设备制造厂家出具高中资料试卷试验报告与相关技术资料，并且了解现场设备高中资料试卷布置情况与有关高中资料试卷电气系统接线等情况 ，然后根据规范与规程规定，制定设备调试高中资料试卷方案。 、电气设备调试高中资料试卷技术电力保护装置调试技术，电力保护高中资料试卷配置技术是指机组在进行继电保护高中资料试卷总体配置时，需要在最大限度内来确保机组高中资料试卷安全，并且尽可能地缩小故障高中资料试卷破坏范围，或者对某些异常高中资料试卷工况进行自动处理，尤其要避免错误高中资料试卷保护装置动作，并且拒绝动作，来避免不必要高中资料试卷突然停机。因此，电力高中资料试卷保护装置调试技术，要求电力保护装置做到准确灵活。对于差动保护装置高中资料试卷调试技术是指发电机一变压器组在发生内部故障时，需要进行外部电源高中资料试卷切除从而采用高中资料试卷主要保护装置。
镰刀状细胞贫血症
镰刀状细胞贫血症案例分 析报告 学院：基础医学院 专业：七年制临床 任课老师：吴艺舟 组员：徐欢赵晓燕陈露承璐潇李嘉慧 2014年3月
目录 1.案例内容摘要及初步分析--------------------2 2.镰状细胞贫血的发病机制--------------------5 3.镰状细胞贫血的辅助检查及意义--------------8 4.镰状细胞贫血的治疗方法-------------------11 5.对患病女性的生育问题的讨论---------------14 6.组员分工及参考文献-----------------------18
前言 镰刀形红细胞贫血症（Sickle Cell Anemia）是血红蛋白分子遗传缺陷造成的一种疾病，病人的大部分红细胞呈镰刀状。其特点是病人的血红蛋白β—亚基N端的第六个氨基酸残基是缬氨酸，而不是下正常的谷氨酸残基,因此镰刀型细胞贫血病是一种分子病。它是一种遗传性贫血症，属隐性遗传。是基因突变产生的血红蛋白质分子结构改变的一种分子病。患者的红细胞缺氧时变成镰刀形（正常的是圆盘形），失去输氧的功能,许多红血球还会因此而破裂造成严重贫血，甚至引起病人死亡。 本次案例主要探讨镰刀状细胞贫血症的发病机制，包括其分子机制及病理机制，通过该案例我们还进一步了解了镰刀状细胞贫血症的治疗及预防患者后代患病方法。 1.案例内容摘要及初步分析 本节为对案例内容的讨论结果汇总，部分检查与疾病的具体原因在后面几节详述。 1.1 第一幕 1.1.1 内容 Helen，18岁，埃塞尔比亚人。去西藏旅游，到达当天，双侧大腿和臀部突然疼痛，当天晚上疼痛突然加重，服用布洛芬（止痛药）无缓解。十多年前，检查出有明显的贫血，经常出现头晕、头疼的症状。易患感冒并伴有贫血的加重。去西藏前，无外伤，无剧烈运动史。 入院后，做检查，结果如下： 体格检查：体温36.8℃，睑结膜、口腔稍微苍白；双侧大腿外观无异常。 辅助检查：①外周血红细胞：血红蛋白70g/L(正常值110~150g/L)，网织红细胞计数14%（正常0.5%~1.5%）；红细胞大小不均，呈多染性，嗜碱性点彩红细胞增多，可见有核红细胞、靶形红细胞、异形红细胞及Howell-Jolly小体，部分红细胞呈镰刀形，镰变试验阳性。②血红蛋白电泳：HbS占82%，HbF占17%（正常1%~2%），HbA2占1%（正常1%~2%），HbA缺如（正常为95%以上）。③骨髓：红系显著增生。④红细胞半衰期测定：红细胞生存时间15天。（正常为18天±5天）。 根据上述检查结果，诊断为镰刀状细胞贫血症。 1.1.2 分析 第一幕主要为患者的病征以及各项检查，根据头晕、头疼、双侧大腿和臀部的疼痛的症状以及红细胞形态、各类红细胞分布和镰变试验，诊断为镰刀状细胞贫血症。
使用限制性内切酶分析法检测镰刀型细胞贫血症基因
使用限制性内切酶分析法检测镰刀型细胞贫血症基因 限制性内切酶分析法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异。当待测DNA序列中发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其特异的限制性酶切片段的状态在电泳迁移率上也会随之改变，借此可作出分析诊断。 如：（2005湖北3）镰刀型细胞贫血症的病因是血红蛋白基因的碱基序列发生了改变。检测这种碱基序列改变必须使用的酶是 A.解旋酶 B.DNA连接酶 C.限制性内切酶 D.RNA聚合酶 解析：根据碱基互补配对原则可采用DNA分子杂交原理或DNA探针的方法。采用加热等一定的技术手段将患者的DNA分子片段与正常人的DNA分子片段单链放在一起，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；碱基序列改变的部位则仍然是两条游离的单链。解旋酶的作用是DNA分子在复制或转录时将DNA双链解开，在本题中加热也可以解开达到目的，所以不是必须的酶；DNA连接酶和限制性内切酶都是基因工程的工具酶，一种限制性内切酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子的基本骨架上脱氧核糖和磷酸之间的磷酸二酯键，DNA连接酶的作用和它正好相反，是将限制酶切开的缺口缝合起来。而RNA聚合酶则是在基因转录过程中促进核糖核苷酸形成mRNA分子的酶，本题就是采用限制性内切酶分析法解题的。必须使用的酶就是限制性内切酶，故选C。 根据DNA分子杂交原理知，将患者的DNA分子片段与正常人的DNA分子片段单链放在一起，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；碱基序列改变的部位则仍然是两条游离的单链，有无双链便是区别，为什么又要用限制性内切酶将其切开再杂交呢？回答这个问题我们先看看。 2008天津30-Ⅰ下图为人β-珠蛋白基因与其mRNA杂交的示意图，①-⑦表示基因的不同功能区。 从本题看出基因的单链的编码区与其转录的成熟的mRNA之间可以杂交形成杂合链，但是它们两者之间不仅不是完全互补，相反有两个内含子对应的单链部分——③⑤所含有的上百个核苷酸，mRNA根本没有对应互补的部分，这就说明它们之间相差很大也能够杂交，只不过结果有突起部分而已，那镰刀型细胞贫血症基因和正常基因只有一个碱基发生突变，难道用正常基因转录的mRNA就不能与只突变一个碱基的基因杂交形成杂合链吗？应该是肯定可以,如果这样来检测，那镰刀型细胞贫血症基因和正常基因的检测结果是相同的，就找不到区别，无法鉴别。 所以必须采用限制性内切酶分析法来检测才有效，具体是先找到一种限制性内切酶，切开控制镰刀型细胞贫血症基因的对应部位的正常基因，这样就形成两短段，也同同一种酶来切镰刀型细胞贫血症基因，因为镰刀型细胞贫血症基因发生了一个碱基的突变，这样相同的限制性内切酶就无法切开，就还是完整的一长段，在用以上三段对应的已标记的mRNA进行杂交（此过程可以不用任何酶，通过控制温度来打开氢键和连结氢键），然后电泳，如果出现两短段的则是正常基因，如果只出现一长段则是突变基因，如果都有的说明两者都存在，可视为杂合。利用相关知识点命题的请看如下高考试题。 ［2007江苏·38］单基因遗传病可以通过核酸杂交技术进行早期诊断。镰刀型细胞贫血症是一种在地中海地区发病率较高的单基因遗传病。已知红细胞正常个体的基因型为BB、Bb，镰
人教版高中生物必修2-5.1拓展资料：镰刀型细胞贫血症
镰刀型细胞贫血症 镰刀型细胞贫血症是20世纪初被人们发现的一种遗传病。1910年，一个黑人青年到医院看病，他的症状是发烧和肌肉酸痛。经过检查发现，他患的是当时人们尚未认识的一种特殊的贫血症，他的红细胞不是正常的圆饼状，而是弯曲的镰刀状。后来，人们就把这种病称为镰刀型细胞贫血症。镰刀型细胞贫血症主要发生在黑色人种中，在非洲黑人中的发病率最高，在意大利、希腊等地中海沿岸国家和印度等地，发病人数也不少，在我国的南方地区也发现有这类病例。 1928年，人们就已经了解到镰刀型细胞贫血症是一种遗传病。后来证实，它是一种常染色体隐性遗传病。1949年，一位曾经两次获得诺贝尔奖的美国著名化学家鲍林（L·C·Pauling），在美国的《科学》杂志上发表了题为《镰刀型细胞贫血症——分子病》的研究报告。他在文章中写道：“在我们的研究开始之时，有证据表明红细胞镰变的过程可能是与红细胞内血红蛋白的状态和性质密切相关的。”鲍林将正常人、镰刀型细胞贫血症患者和镰刀型细胞贫血症基因携带者的血红蛋白，分别放在一定的缓冲溶液中进行电泳，发现正常人和患者的血红蛋白的电泳图谱明显不同，而携带者的血红蛋白的电泳图谱，与由正常人的和患者的血红蛋白以1∶1的比例配成的混合物的电泳图谱非常相似。鲍林推测镰刀型细胞贫血症是由于血红蛋白分子的缺陷造成的。 正常的血红蛋白是由两条α链和两条β链构成的四聚体，其中每条肽链都以非共价键与一个血红素相连接。α链由141个氨基酸组成，β链由146个氨基酸组成。镰刀型细胞贫血症患者的血红蛋白的分子结构与正常人的血红蛋白的分子结构不同。1956年，英格拉姆（Ingram）等人用胰蛋白酶把正常的血红蛋白（HbA）和镰刀型细胞的血红蛋白（HbS）在相同条件下切成肽段，通过对比二者的滤纸电泳双向层析谱，发现有一个肽段的位置不同。也就是说，HbS和HbA的α链是完全相同的，所不同的只是β链上从N末端开始的第6位的氨基酸残基，在正常的HbA分子中是谷氨酸，在病态的HbS分子中却被缬氨酸所代替。 在HbS中，由于带负电的极性亲水谷氨酸被不带电的非极性疏水缬氨酸所代替，致使血红蛋白的溶解度下降。在氧张力低的毛细血管区，HbS形成管状凝胶结构（如棒状结构），导致红细胞扭曲成镰刀状（即镰变）。僵硬的镰状红细胞不能通过毛细血管，加上HbS的凝胶化使血液的黏滞度增大，阻塞毛细血管，引