微生物学实验指导
农业微生物学实验指导
北京农学院食品科学系
授课教师刘一倩
高秀芝
2006年3月
实验1显微镜的使用及细菌形态的观察
1目的要求
(1)了解普通光学显微镜的构造，各部分的功能和使用方法。
(2)学习并掌握油镜的原理和使用方法，熟悉几种常见微生物的基本形态。
2普通光学显微镜的构造与油镜的工作原理
2.1普通光学显微镜的构造 显微镜的构造可分为机械装置和光学系统两大部分。机械装置包括镜座、镜筒、镜臂、物镜转换器、载物台、推进器、粗调螺旋、微调螺旋、光圈等部件；光学系统由接目镜、接物镜、聚光器、反光镜等组成(图1-1)。
(1)镜座 镜座是显微镜底座，用以支撑
全镜，呈长方形。其上装有电源开关、照明
光源、保险丝、光源滑动变阻器等。
(2)镜筒 镜筒上连接目镜、下连接转换
器，光线从筒中通过。 安装目镜的镜筒分为
可调式的单筒和固定式的双筒两种。从镜筒
上缘到物镜转换器螺旋口之间的距离称为筒
长。国际上将显微镜的标准筒长定为160mm ，
此数字标在物镜的外壳上。
(3)镜臂 连接镜筒和镜座。有的镜臂是
固定的，有的可向后方倾斜，其作用是支撑
镜筒、载物台、聚光器和调焦装置等。
(4)物镜转换器 转换器上可安装3～5
个物镜，一般是3个物镜(低倍镜、高倍镜、
油镜)。转动转换器时，可以按需要调换各种
物镜，将之推到使用位置上。
图1-1 光学显微镜构造示意图 (5)载物台 载物台呈长方形，中央有一
孔，为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推
进器。
(6)推进器 推进器由一横一纵两个推进
齿轴和齿条构成，转动其上螺旋，可使标本片
向前、后、左、右移动。研究型显微镜的纵横架杆上刻有刻度标尺，构成精密的平面坐标系。如需要重复观察已检查标本的某一物像时，可在第一次检查时记下纵横标尺的数值，下次按数值移动推进器，就可以找到原来标本的位置。
1.物镜转换器；
2.物镜；
3.游标卡尺；
4.载物台；
5.聚光器；
6.虹彩光圈；
7.光源；
8.镜座；
9.电源开关；10.光源滑动变阻器；11.粗调螺旋；12.微调螺旋；13.镜臂；14.镜筒；15.目镜；16.标本移动螺旋
(7)粗调螺旋 粗调螺旋用于粗放调节物镜和标本的距离。老式单目镜显微镜的粗调螺旋向前扭动，镜头下降接近标本。新式双目镜显微镜(如Motic 显微镜)镜检时，双手向后扭动使载物台上升，让标本接近物镜，反之则下降，标本远离物镜。使用显微镜观查标本时，主要使用粗调螺旋调节。
(8)微调螺旋 用粗调螺旋只能粗放地调节焦距，难于观察到清晰的物像，因而需要用微调螺旋做进一步调节。其每转一周，镜筒移动0.1 mm 。新式研究型显微镜粗、微螺旋为共轴式。原则上，微调螺旋每次旋转不超过一周。
(9)光圈 在聚光器下方，可任意开闭，用来调节射入聚光器光线强弱。
(10)接目镜目镜作用是将物镜放大了的实像进行第二次放大，形成虚像并映入眼帘。不同的目镜上刻有5×、10×、15×等字样，以表示该目镜的放大倍数。 普通光学显微镜常用的目镜主要是惠更斯目镜。研究型显微镜配有性能更好的目镜，如补偿目镜(K)、平场目镜(P)和广视场目镜(WF)等。照相时选用照相目镜(NFK)。
(11)接物镜物镜安装于转换器上，入射光线通过物镜时使被检物像形成第一次放大的实像。普通显微镜装有低倍镜(10×)、高倍镜(40×)和油镜(100×)三种消色差物镜，外壳上标有“Ach”字样，通常与惠更斯目镜配合便用。使用低倍镜和高倍镜时，物镜与标本间的介质是空气，称之为干燥系物镜。；而使用油镜时，物镜与标本间的介质是香柏油，称之为油浸系物镜。油镜标有HI或Oil字样及镜头下缘刻有白环或红环。检查细菌标本要用油镜。研究型显微镜配有性能更好的物镜，如复消色差物镜(Apo)、平场物镜(Plan)、平场消色差物镜(Plan Ach)、平场复消色差物镜(Plan Apo)等。
(12)聚光器由聚光透镜、升降螺旋和能调节开孔大小的虹彩光圈组成，装在载物台下面，可通过升降螺旋而起落。其作用是将光线聚光于标本之上，增强照明度。普通光学显微镜配置的都是明视场聚光器，分为阿贝聚光器、齐明聚光器和摇出聚光器三种。研究型显微镜(如Motic BA400显微镜)配有性能更好的消色差摇出式聚光器，能将聚光器上透镜从光路中摇出，满足低倍物镜(4×)大视场照明的需要。齐明聚光器虽质量最好，但不适于4倍以下的物镜。
(13)反光镜早期普通光学显微镜常用自然光检视标本，在镜座上装有反光镜，由平凹两面镜子组成。光线较强时用平面镜，光弱时用凹面镜，可自由旋转方向，以将最佳光线反射入聚光器。新式研究型显微镜镜座上装有光源，并由电流调节螺旋来调节光照强度。
2.2油镜使用的工作原理在显微镜的光学系统中，物镜的性能直接影响显微镜的分辨率。与其他物镜相比，油镜的放大倍数最大，使用也比较特殊，需在载玻片与镜头之间滴加香柏油，这主要有如下二方面的原因：
(1)增加照明亮度油镜的放大倍数虽然可达100×，但因焦距很短，镜头直径很小，进入镜头中的光线亦较少，故所需要的光照强度最大(图1-2)。当油镜头和标本玻片之间的介质为空气时，因空气折射率(n=1.00)与玻璃的折射率(n=1.55)不同，会有一部分光线被折射而不能进入镜头内，使视野更暗，物像显现不清。若在镜头与标本玻片之间滴上与玻璃的折射率相仿的油类，如香柏油(n=1.52)等，则光线不发生折射，从而增加了视野的照明亮度(图1-3)。
图1-2 物镜的焦距、工作距离和虹彩光圈的关系
图1-3 干燥系物镜A与油浸系物镜B的光线通路
(2)增加显微镜的分辨力显微镜的分辨力或分辨率是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。它与物镜的数值口径成正比，与光波长度成反比。因此，当光波波长一定时，物镜的数值口径愈大，则显微镜的分辩力愈大，被检物体的细微结构也愈清晰地区别出来。分辨力可由下列公式表示：
分辨力(最大可分辨距离)=λ/2NA
式中λ为光波波长(0.4～0.7 μm)；NA为物镜的数值口径值。它是光线投射到物镜上的最大角度(称为镜口角)的一半正弦，与介质的折射率之乘积，即NA=n·sinα。式中α为光线最大入射角的半数，它取决于物镜的直径和焦距。在实际应用中光线入射角最大只能达到120o，其半数的正弦为Sin60o=0.87。以空气为介质时，NA=1×0.87=0.87；而以香柏油为介质时，NA=1.52×0.87=1.32，故以香柏油为介质的油镜要比用空气为介质的高倍镜分辩力高，因而细菌用油镜才可观察到。
然而，显微镜的放大倍数越高，并不等于其分辨力越高。假如采用放大率为40×的高倍镜(NA=0.65)和放大率为24×的目镜，虽然总放大率为960×，但其分辩力只有0.42μm；若采用放大率为90×的油镜(NA=1.25)和放大率为9×的目镜，虽然总放大率为810×，但却能分辨出0.22μm之间的距离，因而显微镜的总放大倍数越高并不是其分辨力越高。
3实验材料
3.1菌种细菌三型、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)等染色玻片标本。
3.2溶液或试剂香柏油、二甲苯。
3.3仪器与其他用具显微镜、擦镜纸等。
4普通光学显微镜的使用流程
安置→调光源→调目镜→调聚光器→镜检(低倍镜→高倍镜→油镜) →擦物镜头→复原
5操作步骤
5.1观察前的准备
5.1.1显微镜的安置 置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘约10cm。镜检时姿势要端正。一般用左眼观察，右眼绘图或记录，两眼同时睁开，以减少眼睛疲劳。
5.1.2光源调节安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度。反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，较强的自然光源用平面镜，较弱的照明光源用凹面镜，并调节其角度，使视野内的亮度适宜、均匀。凡检查染色标本时，光线应强；检查未染色标本时，光线不宜太强，可通过光圈、聚光器、反光镜调节适宜的光线。
5.1.3双筒显微镜的目镜调节根据使用者的个人情况，双筒显微镜的目镜间距可以适当调节，而左目镜上一般还配有屈光度调节环，可以适应眼距不同或两眼视力有差异的不同观察者。
5.1.4聚光器数值孔径值的调节正确使用聚光镜才能提高镜检效果。聚光镜的主要参数是
数值孔径，它有一定的可变范围，一般聚光镜边框上的数字是代表它的最大数值孔径，通过调节聚光镜下面可变光阑的开放程度，可以得到各种不同的数值孔径，以适应不同物镜的需要。
5.2 显微镜观察 一般情况下，特别是初学者，进行显微镜观察时，应遵守从低倍镜到高倍镜，再到油镜的观察程序。因为低倍数物镜视野相对较大，易发现目标和确定检查的位置。5.2.1低倍镜观察将标本片置于载物台上，用弹簧夹固定，移动推进器，使观察对象处于物镜正下方。旋动粗调螺旋，使物镜与标本片距离约lcm(单镜筒显微镜)或0.5cm(双镜筒显微镜)，再以粗螺旋调节，使镜头缓慢升起(单镜筒)，或使载物台缓慢下降(双镜筒)，直到物像出现后再用微螺旋调节使物像清晰。然后移动标本玻片，将观察目标移至视野中心后，仔细观察与绘图。
5.2.2高倍镜观察由低倍镜直接转换成高倍镜至正下方。转换时，需用眼睛于侧面观察，避免镜头与玻片相撞。调节聚光器和光圈使视野亮度适宜，而后微调细螺旋使物像清晰。利用推进器移动标本找到需要观察的部位，并移至视野中心仔细观察或准备用油镜观察。
5.2.3油镜观察先将光圈开至最大，集光器升至最高位，调节好光源，使照明亮度最强。在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节螺旋将镜筒远离载物台，然后在标本上滴加香柏油(切勿过多，否则视野模糊)，转换油镜头，从侧面注视，小心将之浸入油滴中，使其几乎与标本片相接触为度(注意：切不可将油镜镜头压到标本，否则不仅压碎玻片，还会损坏镜头)。用粗螺旋缓慢升起镜筒(单镜筒)或下降载物台(双镜筒)，至物像出现后，再以细螺旋调至物像清晰。如果油镜已离开油面而仍未见物像，可再将镜头浸入油中，重复以上操作至物像清晰为止。
5.3显微镜用后的处理观察完毕，台起镜头，立即用擦镜纸擦去镜头上的油，再用擦镜纸蘸取少许二甲苯(香柏油溶于二甲苯)或乙醚乙醇混合液擦去镜头上的残留油迹，最后再用擦镜纸擦去残留的二甲苯。严禁用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头。用绸布清洁显微镜的金属部件。
将各部分还原，将物镜转成“八”字形，再将载物台下降至最低，降下聚光器，以免与物镜相撞，反光镜垂直于镜座。套上镜套，放回柜内或镜箱中。
6实验结果与报告
(1)分别绘出用油镜观察到的细菌的形态图。注意观察它们的个体形态、大小、排列方式。有芽孢的细菌，观察其菌体两端情况及芽孢着生位置。
7思考题
(1)观察细菌时为何使用油镜？它与干燥系物镜使用方法有何不同？使用时注意哪些问题?
(2)普通光学显微镜的目镜与物镜的常用放大倍数有几种？显微镜的放大倍数越高，分辩力越高吗?为什么？举例说明。
(3)试列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节螺旋的误操作？
(4)根据实验体会，谈谈应如何根据所观察微生物的大小，选择不同的物镜进行有效的观察。
实验2 细菌的革兰氏染色及其形态观察
1目的要求
(1)了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
(2)学习掌握革兰氏染色技术，进一步熟练光学显微镜油镜的使用技术。
2基本原理
革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。根据细菌细胞壁的结构和化学组成的不同，经革兰氏染色后，呈现不同的染色反应，可将所有细菌区分为两大类，即革兰氏阳性菌(用G+表示)和革兰氏阴性菌(用G-表示)。当细菌用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫—碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。染色关键在于脱色剂的脱色作用。当用乙醇(或丙酮)处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。G+细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量较低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。G-细菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量较高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁通透性增大，使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
3实验材料
3.1菌种大肠杆菌（Escherichia coli）约24h营养琼脂斜面培养物，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)约18～20h营养琼脂斜面培养物。
3.2染色剂草酸铵结晶紫染色液、鲁格尔氏碘液、95％乙醇、0.5%番红(沙黄)染色液。3.3仪器与其他用具显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶(内装香柏油和二甲苯，因二甲苯有毒及容易损坏镜头，可用乙醚乙醇混合液替代二甲苯)、生理盐水、擦镜头纸、吸水滤纸、纱布、火柴、玻璃铅笔、玻片夹或镊子等。
4实验流程
涂片→干燥→固定→草酸铵结晶紫初染(1min)→水洗→碘液媒染(1min)→水洗→95%乙醇脱色(30s)→水洗→沙黄复染(1min)→水洗→滤纸吸干→镜检
5操作步骤
5.1制片取菌种培养物按简单染色法中的常规涂片、干燥、固定进行制片。注意要用活跃生长期的幼龄培养物做革兰氏染色。
5.2初染在涂片菌膜处滴加草酸铵结晶紫适量(以刚好将菌膜覆盖为宜)，染色1～2min，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色。
5.3媒染滴加碘液于涂片上，作用1min，水洗。
5.4脱色用滤纸吸去玻片上的残水，滴加95％酒精于涂片上，轻轻摆动玻片，直至乙醇脱色刚好不出现紫色为止，一般30s(如牛乳培养物用60s)后立即水洗，终止脱色。
5.5 复染 沙黄复染1～2min，水洗。
5.6镜检用滤纸吸干或自然干燥，油镜检查。G+菌呈蓝紫色，G-菌呈红色。
革兰氏染色的注意事项：①涂片不宜过厚，勿使细菌密集重叠，影响脱色效果，否则脱色不完全造成假阳性。镜检时应以视野内分散细胞的染色反应为标准。②火焰固定不宜过热，以玻片不烫手为宜，否则菌体细胞变形。③滴加染色液与酒精时一定要覆盖整个菌膜，否则部分菌膜未受处理，亦可造成假象。④乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。如脱色过度，则G+菌被误染成G-菌；而脱色不足，G-菌被误染成G+菌。在染色方法正确无误前提下，如菌龄过长，死亡或细胞壁受损伤的G+菌也会呈阴性反应，故革兰氏染色要用活跃生长期的幼龄培养物。
6示范
在示范镜下观察大肠杆菌(图2-1a)、枯草芽孢杆菌(图2-1b)、金黄色葡萄球菌(图2-1 c)、藤黄微球菌(图2-1d)、钩端螺旋菌(图2-1e)、副溶血性弧菌(图2-1f)的形态及排列方式。
(a) (b) (c)
(d) (e) (f)
图2-1 各种细菌在光学显微镜下的形态（×1 000）
7实验结果与报告 根据观察结果， 按比例大小绘出革兰氏染色制片中细菌的形态图，并说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反应。
8思考题
(1)详叙革兰氏染色的原理及操作方法，染色时应注意哪些问题?
(2)哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性?其中最关键的环节是什么?
(3)不经过复染这一步，能否区别G +菌和G -菌?
(4)为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察?
(5)当你对未知菌进行革兰氏染色时，怎样保证操作正确，结果可靠?
实验3 霉菌形态及菌落特征的观察
1目的和要求
(1)学习并掌握观察四类常见霉菌形态特征的基本方法。
(2)掌握青霉、曲霉的小室载片培养法，以便更好地观察其个体形态。
(3)观察霉菌的平板菌落特征，了解霉菌的菌落特征在丝状真菌形态学鉴定上的重要性。2基本原理
霉菌是由复杂的菌丝体组成。它分为基内菌丝或营养菌丝、气生菌丝或繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌的繁殖菌丝及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。观察霉菌的形态常用的有下列三种方法：①乳酸石炭酸棉蓝浸片法：是将培养物置于乳酸石炭酸棉蓝染色液中，制成霉菌制片。由于霉菌菌丝较粗大(约为3～10μm)，置于水中观察时，菌丝容易收缩变形，故常用乳酸石炭酸棉兰染色液制片使细胞不会变形，染液的蓝色能增强反差，并具有防腐、防干燥、防止孢子飞散作用，能保持较长时间，必要时还可用光学树胶封固，制成永久标本长期保存。但用接种针(或小镊子)挑取菌丝体时，菌体各部分结构在制片时易被破坏，不利于观察其完整形态。②小室载玻片培养法：用无菌操作将培养基琼脂薄层置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，霉菌即在载玻片和盖玻片之间的有限空间内沿盖玻片横向生长。培养一定时间后，将载玻片上的培养物置显微镜下观察。这种方法可以保持霉菌自然生长状态，便于观察到霉菌完整的营养和气生菌丝体的特化形态，例如曲霉的足细胞、顶囊，青霉的分生孢子梗、根霉的匍匐枝、假根等。此外，也便于观察不同生长时期的培养物。③玻璃纸培养法：其操作方法与放线菌的玻璃纸培养观察方法相似。此种方法用于观察不同生长阶段霉菌的形态，亦可获得良好效果。
霉菌在固体培养基上生长呈棉絮状(毛霉)、蜘蛛网状(根霉)、绒毛状(曲霉)和地毯状(青霉)的菌落。其繁殖方式多为无性繁殖和少为有性繁殖。霉菌的菌丝体及其菌落形态特征是霉菌分类、鉴定的重要依据。
3实验材料
3.1菌种黑曲霉、产黄青霉、黑根霉和总状毛霉28～30℃培养3～5d的PDA(或麦芽汁)斜面和平板培养物(点植接种)、培养根霉假根的PDA平板培养物、培养霉菌的小室载玻片培养物。
3.2培养基马铃薯葡萄糖(PDA)琼脂培养基、麦芽汁琼脂培养基。
3.3试剂与染色剂乳酸石炭酸棉蓝染色液、50％乙醇、20%甘油保湿剂、无菌生理盐水。3.4仪器与其他用具接种环、接种钩、解剖针、解剖刀、镊子、酒精灯、载玻片、盖玻片、透明胶带、圆形滤纸片、U形玻璃棒、无菌平皿、无菌细口滴管、格尺、普通光学显微镜、体视显微镜、恒温培养箱等。
4操作步骤
4.1霉菌的形态观擦
4.1.1乳酸石炭酸棉蓝浸片法 在载玻片上滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针(或小镊子)从霉菌菌落边缘处挑取少量已产孢子的霉菌菌丝，先置于50％乙醇中浸一下以洗去脱落的孢子，再置于载玻片上的染液中，用解剖针小心地将菌丝分散开。盖上盖玻片(注意勿压入气泡和移动盖玻片，以免影响观察)，置于低倍镜和高倍镜下观察四类霉菌内容如下：根霉：用低倍镜观察孢子囊梗，囊轴等，用高倍镜观察孢子囊孢子的形状，大小。将根霉斜面培养物置于显微镜载物台上，用低倍镜观察根霉的孢子囊柄、孢子囊、假根和匍匐枝。
图3-1 小室载玻片培养法示意图
毛霉：用低倍镜观察孢子囊梗，囊轴等，用高倍镜观察
孢子囊孢子的形状，大小。将毛霉斜面培养物置于显微镜载
物台上，用低倍镜观察毛霉的孢子囊梗粗细、孢子囊大小、
形状、色泽等。
曲霉：在高倍镜下观察菌丝有无隔膜，分生孢子着生位
置，辩认分生孢子梗、顶囊、小梗和分生孢子。
青霉：在高倍镜下观察菌丝有无隔膜，分生孢子梗、副
枝、小梗和分生孢子的形状等。
4.1.2粘片法 取一滴棉蓝染色液置于载玻片中央，取一段
透明胶带，打开霉菌平板培养物，粘取菌体，粘面朝下，放
在染液上。镜检。
4.1.3小室载玻片培养法
(1)培养小室的灭菌 将略小于平皿底部的圆形滤纸片
1张、U 形玻璃棒、载玻片和两块盖玻片等按图7-5放入平皿内，盖上平皿盖，包扎后于121℃湿热灭菌30min ，置60
℃烘箱中烘干备用。 (2)琼脂块的制作 取已灭菌的PDA 琼脂培养基6～7ml
注入另一灭菌平皿中，使之凝固成薄层。用解剖刀切成0.5～1.0cm 2的琼脂块，并将其移至上述培养室中的载玻片上(每片放两块)(图3-1)。制作过程应注意无菌操作。
上：正面观；下：侧面观 1．平皿；2．U 形玻璃棒；3．盖玻片；4．培养物；5．载玻片；6．保湿用滤纸(3)接种和培养 用接种环或接种钩挑取很少量的青霉(曲霉、根霉、毛霉)的孢子接种于培养基四周，用无菌镊子将盖玻片覆盖在琼脂块上，并轻压使之与载玻片间留有极小缝隙，但不能紧贴载玻片，否则不透气。注意：接种量要少，尽可能将孢子分散接种在琼脂块边缘上，否则培养后菌丝过于稠密，影响观察。先在平皿的滤纸上加3～5ml 灭菌的20％甘油(用于保持平皿内的湿度)，盖上皿盖，皿盖上注明菌名、组别和接种日期，置28～30℃培养3～5d 。
(4)镜检 培养至1～2d 后，可以逐日连续观察到孢子的萌发、菌丝体的生长分化和子实体的形成过程。将小室内的载玻片取出，直接用低倍镜和高倍镜观察上述四类霉菌的形态，重点观察曲霉分生孢子头和青霉的帚状枝形态，根霉和毛霉的孢子囊和孢子囊孢子，菌丝有无隔膜等情况。
4.1.4根霉的假根观察方法 将溶化并冷却至50℃的PDA 培养基倒入无菌平皿，其量约为平皿高度的1/2。冷凝后，用接种环蘸取根霉孢子划线接种于
平板表面。倒置平皿，在皿盖内放一无菌载玻片，于28℃
培养2～3d 后，取出皿盖内的载玻片标本，在附着菌丝体的
一面盖上盖玻片，置低倍显微镜下观察假根及从根节上分化出的孢子囊梗、孢子囊、孢囊孢子和两个假根间的匍匐
菌丝等结构(图3-2)。
图3-2 根霉假根的培养4.2霉菌的菌落特征观察
在一定培养条件下(包括培养基的性状、培养温度和时间等)，不同种属的霉菌在菌落形态上显出一定的特征，用肉眼或放大镜(低倍镜)即可观察。霉菌的菌落特征内容不同于细菌和酵母菌，可根据下列要求对各种霉菌的菌落特征进行观察，并加以记录。
4.2.1菌落大小 分局限生长和蔓延生长，用格尺测量菌落的直径和高度。
4.2.2菌落的颜色 表面和反面的颜色，基质的颜色变化(有无分泌水溶性色素)。
4.2.3菌落的组织形状 分棉絮状、蜘蛛网状、绒毛状、地毯状等。
4.2.4菌落的表面形状 分同心轮纹、放射状、疏松或紧密的菌丝，有无水滴等。
5示范
(1)在示范光学显微镜下观察黑曲霉(图3-3a)、黄曲霉(图3-3b)、杂色曲霉(图3-3c)橘
青霉(图3-3d)、少根根霉(图3-3e)、蓝色犁头霉(图3-3f)在PDA琼脂培养基上纯培养的形态特征。注意观察霉菌的菌丝内有无隔膜，营养菌丝有无假根，无性孢子的种类(孢子囊孢子或分生孢子)，孢子着生位置，形状、颜色。
(a) (b) (c)
(d) (e ) (f)
图3-3 霉菌在光学显微镜下的形态(乳酸石炭酸棉蓝染色)
(2)在体视显微镜下观察黑曲霉(图3-4a)、黄曲霉(图3-4b)、杂色曲霉(图3-4c)、橘青霉(图3-4d)、黑根霉(图3-4e)、总状毛霉(图3-4f)在PDA琼脂平板上的菌落特征。注意观察菌落的大小、颜色、组织形状、表面形状等。
(a) (b) (c)
(d) (e ) (f)
图3-4 霉菌在PDA琼脂平板上的菌落特征
6实验结果与报告
(1)根据观察结果，按比例大小绘图说明根霉、毛霉、曲霉(低倍镜下)、青霉(高倍镜下)的形态特征，并标明结构名称。
(2)按照霉菌的菌落特征内容列表描述你所观察到的曲霉、青霉、根霉、毛霉的菌落特征，并识别和区别它们之间的不同之处。
(3)观察采用小室载玻片培养法培养青霉和黑曲霉的形态特征。
7思考题
(1)你主要根据哪些形态特征来区分根霉和毛霉，青霉和曲霉?列表比较它们在形态结构上的异同。
(2)根据小室载玻片培养方法的基本原理，你认为上述操作过程中的哪些步骤可以根据具
体情况作一些改进或可用其他方法替代?
实验4 土壤中微生物的分离
1目的和要求
(1)了解微生物分离与纯化的原理。
(2)掌握微生物的各种平板分离与纯化方法，
(3)重点掌握常用的平板划线分离技术和斜面接种技术。
2基本原理
纯种分离技术是食品微生物学中重要的基本技术之一。为了生产和科研的需要，人们往往需从自然界混杂的微生物群体中分离出具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其他微生物污染或因自发突变而丧失原有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组菌株。
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的最适培养基和培养条件，如培养基的营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂创造一个只利于目的菌生长而抑制其他微生物生长的环境，从而可选择性地分离目的菌。
细菌或放线菌皆喜中性或微碱性环境，但细菌比放线菌生长快。分离放线菌时，一般在样品稀释液或高氏1号培养基中添加数滴10%的酚液。酵母菌和霉菌都喜酸性环境。在分离酵母菌和霉菌时只要选择好适宜的培养基和pH值，即可抑制细菌的生长。一般在培养基临用前需添加灭菌的乳酸，以降低培养基的pH值至3.5，或添加链霉素抑制细菌的生长。有时分离霉菌时，为了抑制菌丝蔓延生长，在马丁氏培养基中还加入去氧胆酸钠。微生物四大菌类的分离培养基、培养温度、培养时间见表4-1所示。
表4-1 微生物四大菌类的分离和培养
样品来源分离对象分离方法选择稀释度培养基名称培养温度/℃培养时间/d
土样细菌倾注、涂布、划线 10-5，10-6，10-7牛肉膏蛋白胨 37 1～2
土样放线菌倾注、涂布、划线 10-3，10-4，10-5高氏1号 28 5～7
土样霉菌倾注、涂布、划线 10-2，10-3，10-4马丁氏
马铃薯蔗糖
28～30 3～5
果园土样或面肥酵母菌倾注、涂布、划线 10-4，10-5，10-6马铃薯蔗糖
马丁氏
28～30 2～3
微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。纯种(纯培养)是指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。获取单个菌落的方法可通过稀释倾注平板、稀释涂布平板或平板划线等技术完成。值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。
土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本实验将采用不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。
3实验材料
3.1菌源选定采土地点后，铲去表层土2～5cm，取5～10cm处的土样，放入灭菌的牛皮纸袋中备用。土样采集后应及时分离，否则应放在4℃冰箱中暂存。
3.2培养基牛肉膏蛋白胨、高氏1号、PDA或马丁氏琼脂培养基，制备平板和斜面试管。
3.3溶液或试剂10％酚液、无菌生理盐水(9ml/试管，99ml/150ml三角瓶，带适量玻璃珠)、链霉素、80%乳酸、75%酒精棉球。
3.4 仪器及其他用品 1ml 无菌吸管、无菌培养皿、三角形无菌玻璃涂棒、接种环、显微镜、天平、无菌称量纸、药勺、试管架、记号笔等。
4实验流程 —→倾注法—→倒平板————→
制备梯度稀释液—→ →培养→挑取单菌落→保存 —→倒平板—→涂布或划线法—→
5操作步骤
5.1 制备土壤稀释液 称取土样1g ，放入盛99ml 无菌生理盐水并带有玻璃珠的三角瓶中，振摇约20min ，使土样与水充分混合，将细胞分散，即成为10-2的土壤悬液。用一支1ml 无菌吸管从三角瓶中吸取1ml 土壤悬液加入盛有9ml 无菌生理盐水的大试管中(图4-1①)，另换一支1m1
吸管插入10-3试管中反复吹吸10余次，进一步分散菌体(图4-1③)。注意吹吸菌液时不要过猛太快，吸时将吸管伸入管底，吹时将吸管提到接近液面以下，避免将吸管中的过滤棉花浸湿或试管内液体外溢。或者右手持稀释液试管，用左手掌敲打试管20～30次，充分振荡混匀，即成为10-3的稀释液。然后用此无菌吸管从10-
3试管中吸取1ml
加入另一盛有9ml 无菌生理盐水的试管中，另换一支1m1吸管插入10-4
试管中反复吹吸10余次，混合均匀。如此重复，连续稀释可依次制成10-3～10-7不同稀释度的土壤稀释液，整个稀释过程如图4-2所示。注意：用吸管释放稀释液时，管尖不能接触液面，并且每一个梯度的稀释液换一支吸管。
① ②
③
⑤
⑥
④ 图4-1 稀释分离无菌操作示意图 ①火焰旁从三角瓶中取出土壤悬浮液； ②拔棉塞,灼烧试管口；③火焰旁对试管中土壤悬浮液进行稀释混匀；④用吸管取稀释菌液； ⑤将稀释菌液加入无菌培养皿中； ⑥将溶化冷却至 45～50℃培养基倒入培养皿内。
依次各取1mL 每支试管均装9mL 无菌水
图4-2 稀释倾注(涂布)平板法中样品的稀释和稀释液的取样培养
5.2平板接种培养
平板分离培养法有稀释倾注平板法、稀释涂布平板法和平板划线分离法三种方法。
5.2.1稀释倾注平板法
(1)倾注平板 取无菌平皿12套，分别用记号笔标明10-2～10-7稀释度各2套。用1m1
无菌吸管分别吸取10-2～10-7的土壤稀释液各1ml (图4-1④)，
倾注相应标号的无菌平皿中(无菌操作见图4-1⑤)，每个稀释度接种两个平板。
(2)倒平板 取溶化后冷却至45～50℃(不烫手)的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏1号琼脂培养基(加入10％酚数滴)和马铃薯蔗糖琼脂培养基(每100ml 加入灭菌乳酸1ml )，按图4-2所示，分别倒入相应标号的无菌平皿约15ml (倒量已铺满皿底为限)，置水平位置迅速轻轻旋动平皿，使培养基与稀释菌液充分混匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。每个稀释度倒两个平皿。倒平板操作如图4-1⑥所示。
(3)培养 待培养基凝固后，将牛肉膏蛋白胨平板倒置于温箱中(以免培养过程皿盖冷凝水滴下，冲散已分离的菌落)，37℃培养1～2d ，高氏1号和马铃薯蔗糖平板倒置于28℃温箱中培养3～5d 。
5.2.2稀释涂布平板法
(1)倒平板 取无菌平皿12套，分别用记号笔标明10-2～10-7稀释度各2套。将牛肉膏蛋白胨、高氏1号、马铃薯蔗糖琼脂培养基分别加热溶化待冷至55～60℃时，高氏1号培养基中加入10%酚数滴，马铃薯蔗糖培养基中每100ml 加入灭菌的乳酸1ml ，混合均匀后，按图4-2所示分别倒平板，平放桌上待凝固后备用。每种培养基倒4个平皿。
图4-3 平板涂布操作图 (2)涂布平板 用1ml 无菌吸管分别由10-2～10-7土壤稀释液中各吸取0.1或0.2 ml ，按图4-2所示，依次滴加于相应标号平板培养基表面中
央位置。按图4-3所示，在火焰旁左手拿培养皿，并
用拇指将皿盖打开一缝，右手持无菌玻璃涂棒(用酒精
棉球擦拭并灼烧灭菌)于平板培养基表面上，将菌悬液
自平板中央以同心圆方向轻轻向外涂布扩散，使之均
匀分布。室温下静置5～10min ，使菌液浸入培养基。
注意：每个稀释度用一个灭菌玻璃涂棒，在由低向高
浓度涂布时，亦可不用更换玻璃涂棒。
(3)培养将牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温箱中培养1～2d，高氏1号和马铃薯蔗糖平板倒置于28℃温箱中培养3～5d。
5.2.3平板划线分离法
(1)倒平板按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和日期。
(2)平板划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述10-2的土壤悬液一环在上述3种培养基平板上划线(图4-4)，划线完毕，将牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温箱中培养1～2d(分离细菌)，高氏1号和马铃薯蔗糖平板倒置于28℃温箱中培养3～5d(分离放线菌、酵母菌和霉菌)。培养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态特征，经涂片、染色和镜检为纯种后再接种斜面。平板划线方式很多，但无论采用哪种方式，其目的都是通过划线将样品在平板上进行适当稀释，使之形成单个菌落(既由一个菌体细胞繁殖而形成的孤立群落)。常用的划线分离方式有以下两种。
连续划线法：用接种环以无菌操作挑取10-2土壤悬液一环，先在平板培养基的边缘一处反复划线涂布，然后取出接种环，烧死多余菌体。待接种环在培养基空白边缘处接触一下冷却后，而后从涂菌部位在平板上自左向右轻轻划线。当划至平皿的一半时，旋转平皿180o角，再于平皿的另一半培养基的边缘继续划线。划线时接种环面与培养基表面成30～40o角，用手腕力量在平板表面轻快地作“之”字形滑动(图4-5a)。注意接种环勿划破或嵌入培养基，前后两条划线不宜重叠，要疏密适中，以免长成菌苔，并能充分利用平板表面积。划线完毕，盖上皿盖，倒置于温箱培养。
分区划线法：用接种环以无菌操作挑取10-2土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3或4条，再转动培养皿约70o角，并将接种环上剩余菌烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线(图4-5 c)。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于温箱培养。
图4-4 两种平板划线操作图
1
2
1
2
3
4
5
1
2
3
4
（a）（b）（c）（d）
图4-5 平行划线方式示意图
a和b用于稀释液中，可连续划线；
c和d用于较浓的菌样，分数次划线，每次划线后要烧接种环，然后在划下一区。
5.3纯化培养(挑取单菌落)
5.3.1菌落特特征的观察与选择采用平板分离培养法长出的肉眼可见菌落，不同菌株的菌落形态特征各异，据此可在一定程度上鉴别微生物。从分离平板中选择目的菌株的菌落，进行纯化培养。观察菌落特征主要有：大小、表面形状、隆起度、边缘性状、菌落形状、表面光泽、菌落质地、颜色、透明度等等，有时还要结合气味观察。观察菌落特征具体内容参见实验七。
5.3.2斜面纯化培养此法是将平板分离培养得到的单菌落在无菌操作之下，分别接种到各支斜面培养基上，以便作进一步扩大培养或鉴定、保存之用。
接种前，可根据目的菌的菌落特征，选择好平板上的单菌落，并做好标记(用记号笔圈上或编号)。对所选单菌落用接种环挑取一半进行革兰氏染色，如果镜检发现没有杂菌(纯一)，则挑取另一半菌落接种于上述3种相应培养基斜面上，分别置于28℃和37℃温箱中培养1～5d，既长出菌苔。对斜面菌苔进行革兰氏染色镜检，若发现有杂菌(不纯)，则应重新选择纯一的目的菌落，重新纯化培养，或由检样开始再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养物。
具体接种方法：左手持平板，右手拿接种环。在火焰旁用拇指、食指和中指将皿盖揭开一缝，将烧过的接种环先在空白培养基处冷却，然后挑取菌落，取出带菌的接种环在火焰无菌区(10cm之内)稍等片刻，此时左手将平板放下，拿起一支斜面培养基试管，以小拇指和手掌拔出棉塞，迅速将带菌接种环伸入试管，于斜面上自下而上地曲折划线接种。注意接种过程要迅速，否则易污染空气中的杂菌，接种时勿将菌烫死和勿用力划破培养基。
6示范
(1)演示制备土壤稀释液无菌操作过程。
(1)演示稀释倾注平板法、稀释涂布平板法和连续平板划线法的无菌操作过程。
(3)演示从平板菌落接种于斜面的纯化培养操作。
7实验结果与报告
(1)所做倾注平板法、涂布平板法和平板划线法是否较好地得到了单菌落?如果不是，请分析其原因并重做。
(2)在3种不同的平板上你分离得到哪些类群的微生物?描述它们的菌落特征。
(3)将你所分离样品中单菌落菌株的菌落特征描述出来，并绘出镜检形态图。
8思考题
(1)如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养?请写出实验的主要步骤。
(2)详述平板划线分离操作过程和斜面接种方法。如果接种后经培养未长出菌落或菌苔， 是何原因?
基础生物学实验教学大纲.doc
《基础生物学》实验教学大纲 课程代码：课程名称：基础生物学 课程性质：必修课程类别：专业基础 实验项目个数：9 面向专业：生物技术 吟趟材黄诗笺主编《动物生物学实验指导》, 头报教竹：王英典、刘宁主编《植物生物学实验指导》，高等教育出版社，2001 ―、课程学时学 课程学时: 80 学分：4 实验学时：28 二、实验H的、任务、教学基本要求及考核方式 1、目的和任务： 通过木课程的学习，获得基础生物学必要的基木理论、基木知识和基木技能。了解生物的基本特性及其生命活动规律，为学习后续课程及从事于本专业有关的生物技术打下一定基础。 2、教学基本要求： 掌握基础生物学实验技术的基本操作和技能，熟练使用显微镜，并对原生生物及动植物的基木形态和结构有所了解。 3、考核方式： 操作考核：50% 理论考核：50% 三、实验项目一览表 序 实验项目名称实验 时数 实验内容及目的实验 要求 实验 类型 备注 1显微镜的使用 和细胞形态结 构观察及原生 动物和藻类植 物的形态观察 3 1 .显微镜使用的一般方法； 2.观察眼虫、草履虫、变形虫、鱼腥 藻、衣藻、团藻及寄生性原生动物的 形态结构。 必修 验证 性 显微镜 2植物的营养器 官 3 1.观察各种新鲜植物根的标本，区别 初生根与次生根，双子叶植物根与单 了叶植物的根； 2.观察裸了植物茎，被了植物茎（木 本、草本），分析其结构的区别； 3.观察各种叶子的形态结构，了解不 同生态类型的叶的区别。 必修 验证 性 显微 镜，解 剖镜
3植物的繁殖器 官 3 1 .解剖几种植物的花，认识花的结 构； 2.解剖儿种植物的果实，认识不同类 型的果实； 3.解剖几种种子，了解种子的基木结 必修 验证 性 显微 镜，解 剖镜
微生物学实验指导
实验一光学显微镜的使用及微生物形态的观察、 大小的测定和计数 一、实验目的 １、掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养 2、观察细菌、真菌、原生动物的标本装片,学会绘制生物图 3、掌握使用测微尺测量微生物大小的方法 ４、了解血球计数板的结构，掌握使用和计算方法 二、实验器材 １、显微镜 ２、微生物标本装片 ３、目、物镜测微尺 ４、血球计数板 ５、酵母菌液或霉菌孢子液 6、载波片、盖波片、烧杯、滴管、擦镜纸、香柏油、二甲苯等 三、显微镜的构造、原理及使用方法 1、构造 现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又常被称为复式显微镜,由机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置包括镜筒、转换器、载物台、镜臂、镜座、调节器;光学系统包括目镜、物镜、聚光器、电光源。显微镜的总放大倍数为目镜和物镜的放大倍数的乘积。 ２、操作 在目镜保持不变的情况下,使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下,特别是初学者，进行显微观察时应遵循从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序,因为低倍数物镜视野相对大,易发现目标及确定检查的位置。 四、微生物大小的测量原理和方法 微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体很小,只能在显微镜下来测量。用于测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和物镜测微尺。 1、目镜测微尺(图1-1）是一块圆形玻片,在玻片中央把5ｍｍ长度刻成5０等分，或把1０mm长度刻成100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上（此处正好与物镜放大的中 --
-- 间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同,目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用物镜测微尺校正，以求出在一定放大倍数下,目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 2、物镜测微尺(图１-２）是中央部分刻有精确等分线的载 玻片,一般将lmm 等分为100格,每格长ｌ０μm （即0.0ｌmm), 是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将物镜测微尺放在载 物台上,由于物镜测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经 过物镜和目镜的两次放大成象进入视野,即物镜测微尺随着显 微镜总放大倍数的放大而放大，因此从物镜测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小,所以用物镜测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度,然后移去物镜测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。 3、目镜测微尺的校正 把目镜的上透镜旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把物镜测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清物镜测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与物镜测微尺的刻度平行，移动推动器,使两尺重叠,再使两尺的“０”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度（图1－３)，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和物镜测微尺的格数。因为物镜测微尺的刻度每格长l0μｍ，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的长度。 例如目镜测微尺５小格正好与物镜测微尺5小格重叠，已知物镜测微尺每小格为ｌ0μm ，则目镜测微尺上每小格长度为=5×10μm/５=1０μm 用同法分别校正在高倍镜下和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。 由于不同显微镜及附件的放大倍数不同,因此校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件(特定的物镜、目镜、镜筒长度）进行，而且只能在特定的情况下重复使用,当更换不同放大倍数的目镜或物镜时,必须重新校正目镜测微尺每一格所代表的长度。 4、细胞大小的测定 移去物镜测微尺,换上待测菌体的装片，先在低倍镜下找到目的物,然后在高倍镜下用目镜测微尺来测量菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值,即等于该菌的长和宽。 结果计算： 长μm=平均格数×校正值 宽μｍ＝平均格数×校正值 大小表示: 宽μm ×长μｍ 五、微生物细胞数量的测定原理和方法 1、血球计数板是一块特制的厚型载玻片,载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半,每个半边上面各有一个计数区(图1-4），计数区 图1-1 目镜测微尺 图1-2 物镜测微尺 图1-3 目、物镜测微尺的校正 图1-4 血球计数板
微生物实验教案
《微生物学》实验教学教案[实验项目] 实验一微生物学试验常用玻璃仪器洗涤及干热灭菌 [教学时数] 3学时 [实验目的与要求] 1．认识微生物实验所需要的各种器皿，了解常用工具和仪器的名称、用途。 2．掌握对玻璃器皿的清洗、包扎方法与干热灭菌的操作过程。 [实验原理] 微生物学实验要求较高的无菌状态，因此，实验所用的器皿，大多数要进行消毒、灭菌从而用以培养微生物，所以对其质量、规格、洗涤和包扎方法均有一定要求。 清洁的玻璃器皿是实验得到正确结果的先决条件，包扎方法要能保证防止污染杂菌。 干热灭菌的原理，空的玻璃器皿一般用干热灭菌。干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢。与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160～170℃），时间要长（1～2h），但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。 [实验材料与设备] 1．培养皿、大试管、三角瓶6只、烧杯（500ml）2只、烧杯（1000ml）1只、小试管6只、吸管（0.2ml 2支，0.5ml 2支，1ml 2支，5ml 2支）共8支。 2．去污粉、肥皂、清洗剂、毛刷。 3．棉花、扎绳、包扎纸。 [实验步骤] （一）学习下列常用仪器的种类、规格和应用范围 1. 培养皿 由一底一盖组成一套，常用的培养皿皿底直径90 mm，高15mm,皿底皿盖均为玻璃制成。制成平板，可用于分离、纯化、鉴定菌种、活菌计数以及测定抗生素、噬菌体的效价等。 2. 试管 (1)大试管(约18mm×180mm) : 可装倒平板用的培养基，可作制备斜面用（需要大量菌体时用），装液体培养基用于微生物的振荡培养。 (2)中试管[(13～15)mm×(100～150)mm]: 装液体培养基培养细菌或做斜面用，用于细菌、霉菌、病毒等的稀释和血清学试验。 (3)小试管[(10～12)mm×100mm]:一般用于糖发酵或血清学试验，和其它需要节省材料的试验。 3.三角瓶
细胞生物学实验讲义
《细胞生物学》 实验指导 目录 实验一细胞大小测定和生物绘图法（验证性）2 实验二细胞中过氧化物酶的显示（验证性）2 实验三细胞内糖类的显示（验证性）2 实验四细胞Feulgen反应（验证性）2 实验五动物细胞培养（综合性）4 实验六细胞膜通透性的观察和细胞活力测定（创新性）4
实验一细胞大小测定和生物绘图法 一、实验目的 1. 掌握用测微尺测定细胞大小的原理和方法。 2. 掌握生物绘图的基本方法。 二、实验原理 （一）测微尺的原理 测微尺分物镜测微尺（简称物微尺或台微尺）和目镜测微尺（简称目微尺），两尺配合使用，可以测量细胞大小。目微尺是一个可以放在目镜内的特制玻璃圆片，圆片中央刻有一条直线，此线分为若干格。物微尺为一载玻片中央封固的小尺，长1mm，被等分为100格，长为0.01mm（10um）。当测量细胞大小时，不能用物微尺直接测量细胞，而只能使用目微尺。因目微尺测量的细胞是经物镜放大后的像，而它每格所代表的实际长度随物镜的放大率而变，在测量时需要先用物微尺来测定，求出某一放大率时目微尺每格所代表的实际长度，然后再用以测定细胞大小。 将物微尺放在显微镜的载物台上，小心转动目镜测微尺，移动物微尺使两尺平行，起点线重合，然后找出另一处两尺刻度重合处，记录起点线到重合线之间的各尺的刻度数（格数），按下式计算，在该放大系统下目微尺每格所代表的实际长度： 物测微尺格数 目微尺每格所代表的实际长度= ×10um 目测微尺格数 例如：目微尺是100倍，其对应的物微尺使80格，则目微尺每格所代表的实际长度为80/100=8um。 测量某一细胞时，如果目微尺测得其横径为5倍，则此细胞横径为8×5=40um。（二）生物绘图的基本要求 1. 具有高度的科学性，不得有科学性错误。形态结构要准确，比例要正确，要求真实感，立体感，精美而美观。 2. 图面要力求整洁，铅笔要保持尖锐，尽量少用橡皮。 3. 绘图大小要适宜，位置略偏左，右边留着注图。 4. 绘图的线条要光滑、匀称，点点要大小一致。 5. 绘图要完善，字体用正楷，大小要均匀，不能潦草。注图线用直尺画出，间隔要均匀，且一般多向右边引出，图注部分接近时可用折线，但注图线之间不能交叉，图注要尽量排列整齐。 6. 绘图完成后在绘图纸上方要写明实验名称、班级、姓名、时间，在图的下方注明图名及放大倍数。 三、实验材料和实验用品 1. 实验材料：口腔黏膜上皮细胞，洋葱内表皮，西红柿，芹菜，韭菜，红辣椒 2. 实验用品：普通光学显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、消毒牙签、烧杯、吸管、0.9%生理盐水、0.1%亚甲基兰、蒸馏水、吸水纸，HB及2H或3H绘图铅笔、橡皮、直尺、绘图
2020年(生物科技行业)普通生物学基础实验A教学大纲(生科)动物生物学
（生物科技行业）普通生物学基础实验A教学大纲（生科）动物生物学
普通生物学基础实验A2教学大纲 课程编号：08207313 学时：34 学分：1 开课对象：生物科学系本科生 课程类别：专业必修课 课程英文译名：BasicalbiologyexperimentA2 一、教学任务和目的 本课程是高校生物类壹年级本科生的专业基础课。本课程从加强基础、培养能力、提高素质的教学目标出发，建立壹个科学、合理的动物生物学实验教学课程体系。使学生通过本课程实验教学，不只是加深理解和巩固所学理论知识，而是更能切实掌握动物生物学基本实验技能，正确使用常规仪器，学会正确记录，分析讨论实验结果，初步综合运用已学实验技术方法设计简单实验。在实验教学中，同时加强对学生进行科学素质和良好的实验室工作习惯的训练。为继续培养具有创新精神和实践能力的高素质人才奠定良好的基础。 二、教学基本要求 以动物生物学实验的基本操作、基本技能和基本理论为基础，精选重组验证性实验，增加综合性实验及知识范围，操作难度适宜的自选实验的比例，引导、指导学生初步设计实验。建立壹个既和理论课有壹定互补作用，又具有相对独立性的科学、合理、实用性强的实验教学课程体系。 在切实培养提高学生实践能力的同时，理论联系实际地培养学生独立思考、综合分析、推理判断的能力，科学思维能力和创新意识，以及科学求实的态度，相互协作的团队精神。 三、教学内容 本课程实验教学内容在突出基本实验技能训练为先导的基础上，以进化上有重要地位门
类的代表动物（实验动物）为材料，贯穿生物学原理，由简单到综合，由基础性到提高层次的实验，构成包括基本实验—综合性实验—自选性和设计实验3个层次的实验教学课程体系。本课程总共34学时，1学分。 实验壹动物细胞、组织的制片和观察 实验目的 1、了解普通光学显微镜的基本构造，能够规范和较熟练地使用和维护。 2、学习掌握涂片法制作动物细胞显微玻片标本，动物组织平铺片等临时装片和涂片的制 作方法。 3、了解动物细胞的基本结构。 4、掌握动物的4类基本组织结构特点及其结构和机能的关系。 实验内容 1、双筒光学显微镜的构造和使用和维护方法。 2、制备口腔粘膜细胞标本，观察细胞形态结构。 3、制备和观察蛙的肠系膜平铺片、蝗虫的肌肉组织分离片、血涂片。 4、利用显微镜观察动物4类组织玻片标本。 实验主要仪器设备及材料 双筒光学显微镜，无菌牙签，解剖器材，玻片，注射器，染色缸，蛙，蝗虫 7%生理盐水，0.9%生理盐水，0.1M碘液或0.1%亚甲基蓝，1%硝酸银，甲醇，姬母萨染液。 实验二原生动物系列实验 实验目的 1、学习在显微镜下对运动活泼的原生动物的观察和实验方法。
《微生物学》课程教学大纲
《微生物学》课程教学大纲 课程名称：微生物学 课程类型: 必修课 总学时： 108 讲课学时： 54 实验学时：54 学分：3 适用对象: 生物工程专业 先修课程：普通生物学，生物化学 一、课程性质、目的和任务 微生物学是生命科学的一个重要分支，是生物工程专业的一个重要的学科基础必修课。通过本课程的学习，使学生掌握微生物学在生命科学领域发展中的作用；微生物的主要类群；微生物的生长规律及控制；病毒的结构、复制、防治；了解微生物学的研究方法和手段；培养学生“综合”生物学的科学思想，从而使学生能够运用“综合”思想解决生物学中的问题，为学生学习有关后续课程提供必要的理论基础。 二、教学基本要求 通过本课程的学习，要求学生系统掌握微生物学在生命科学领域发展中的作用；微生物的主要类群；微生物的生长规律及控制；了解微生物学的研究方法和手段。 三、教学内容及要求 （一）绪论 1.教学基本内容： （1）微生物与人类； （2）微生物的发现和微生物学的建立与发展； （3）微生物的类群及特点； （4）微生物学研究对象与任务； （5）本课程的目的、要求及范围。 2.要求：通过教学，引导学生走进微生物世界，了解微生物的概念和作用以及它们与人类的特殊关系；明确微生物学作为一门独立学科在生命科学发展中的重要作用和地位；展望未来，激发学生的学习兴趣和明确肩负的重任。 （二）微生物细胞的结构和功能——原核微生物 1.教学基本内容： （1）细菌的形态、结构和繁殖，细菌的群体形态； （2）放线菌的形态、结构和繁殖，放线菌的群体形态； （3）蓝细菌的形态、结构和繁殖；（3～5部分用图表形式概要描述）
（4）支原体、立克次氏体和衣原体的形态、结构、功能和繁殖； （5）古生菌的概念、细胞形态和细胞结构。 2.要求：掌握细菌、放线菌的个体形态、细胞结构、化学组成、群体形态特征、繁殖方式。了解蓝细菌、支原体、立克次氏体、衣原体及古生菌的基本结构特点和生活特性。 （三）微生物细胞的结构和功能——真核微生物 1.教学基本内容： （1）真核微生物的概述； （2）酵母菌的形态、结构和繁殖，酵母菌的群体形态； （3）霉菌的形态、结构和繁殖方式，重点以青霉和曲霉为主，霉菌的群体形态； 2.要求：掌握酵母菌、霉菌的个体形态、结构、群体形态特征、繁殖方式。 （四）病毒 1.教学基本内容： （1）病毒的定义和特点； （2）病毒的形态、种类、结构和化学组成与功能；（重点） （3）病毒的复制和感染；（重点） （4）病毒与宿主的相互作用；（重点与难点） （5）亚病毒因子； （6）病毒与实践：危害人类健康的病毒。 2.要求：了解病毒类群的划分，掌握病毒的形态、结构、化学组成，重点掌握病毒的复制及病毒与宿主的相互作用。 （五）微生物的营养 1.教学基本内容： （1）微生物细胞的化学组成和营养物质及其生理功能； （2）微生物的营养类型（光能营养型微生物和化能营养型微生物）； （3）微生物吸收营养的方式（单纯扩散、促进扩散、主动运送和膜泡运输）； （4）选用和设计培养基的原则和方法、培养基的类型及应用。（重点与难点） 2.要求：掌握微生物所需营养素、微生物营养类型、吸收营养的方式，学会培养微生物的各类型的培养基配制原则及其应用。 （六）微生物的代谢 1.教学基本内容： （1）微生物产能代谢 异养微生物的生物氧化，自养微生物的生物氧化，光能营养微生物的能量转换过程，能量转换方式（2）微生物特有的耗能代谢——二氧化碳的固定，固氮作用，肽聚糖的合成及其它
《分子生物学》实验指导(2015-2016)
《分子生物学》实验指导 实验1 总DNA提取 生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。 由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇 2、TE缓冲液（pH8.0） 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V） 4、95％乙醇 5、液氮 [实验步骤] 1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。 3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，
《微生物学》学习指南
《微生物学》学习指南 一、课程的基本情况 本课程总学时：104 学时，其中理论教学：40学时，实验教学40学时，实习周教学1周（24学时），一个学期内完成全部授课内容。 《微生物学》课程是我校微生物技术及应用、生物技术及应用、食品加工技术、饲料与动物营养、食品安全与质量管理等9个专业的必修课程。《微生物学》是建立在学生学完《化学应用技术》、《生物化学》等课程之后开设的课程，是一门实践性较强的专业基础课。是微生物技术及应用专业、生物技术及应用专业和酿酒技术专业的核心主干课程。 本课程的主要内容：微生物形态观察、微生物培养、微生物生长测定、微生物分离纯化及鉴定、微生物检测、微生物育种和微生物的保藏。本课程的主要任务是使学生掌握微生物的形态构造、营养代谢、生长控制、遗传变异等方面的基本理论知识，掌握无菌操作技术、微生物的分离和培养技术、微生物鉴定技术、工业微生物菌种选育及保藏技术等关键技能，学习无菌操作室、微生物菌种室的建设，并掌握微生物技术常用仪器和设备的运行与维护，并培养学生之间的团结协作及沟通能力。学完该课程，为学生今后的学习及工作奠定坚实的基础。二、基本学习方法 《微生物学》课程理论、实践性均强，内容丰富，知识点琐碎，技能训练要求严格，许多学生反映该学科难学。因此，如何教与学好这门学科是很值得探讨的问题。这需要师生共同努力，教与学相辅相承。 1.明确目的是前提 要学好一门课程，首先要充分认识学科的性质及其重要性，才会有学习的动力，由“要我学”变为“我要学”，这样，你才能认真地、刻苦地去钻研它。这就要求你要听好第一堂即“认识微生物和微生物学”的讲解，明确学习的目的，激发学习的兴趣。明确微生物学与人们的生产生活联系非常紧密，与多学科联系紧密，有“桥梁”学科之称。如后续的发酵工艺课中的酶制剂、微生态制剂、酒
微生物学实验报告
2012级制药专业 工业微生物学实验报告 姓名: 刘甜甜学号: 2012304090 班级: 制药12-2班指导老师：王健 日期：2014.6.11
一、实验目的 1、抑制或杀死微生物的一些物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的原理。 2、掌握物理、化学及生物的因素抑菌、杀菌的试验方法。 3、了解细菌的形态特征、染色特点。 4、了解细菌在普通培养基、选择培养基、血平板上的菌落特征。 5、掌握细菌分离划线培养的方法。 6、掌握细菌的初步生化反应。 7、掌握细菌密集划线法，掌握细菌K-B药敏纸片法。 二、实验内容 1 细菌Gram’s stain染色，镜检，观察记录细菌形态和特色特征 1.1 实验原理：染色原理：G+菌与Gˉ菌细胞壁不同，G+菌比Gˉ菌细胞内核糖核酸镁盐含量高，G+菌比Gˉ等电点低。 1.2 实验步骤： 1.2.1.制片：○1涂片：取半滴生理盐水置一洁净玻片上，以无菌操作技术自平板上去菌落少许，与生理盐水混匀，均匀涂布约1cm2大小，自然干燥； ②固定：取含菌膜的玻片与酒精灯火焰上来回三次，使菌膜牢固附于玻片表面； 1.2.2染色：①初染：取结晶紫一到两滴覆盖于菌膜表面，轻微摇动，维持30〃~40〃,细流水冲洗，切勿直接冲洗涂片区域； ②媒染：取卢氏碘液1~2滴覆盖菌膜表面，轻微摇动，维持30〃~40〃,用上法细流水冲洗； ③脱色：取95%酒精2~3滴于菌膜表面，轻微摇动，局部接近无色即可, 用上法细流水冲洗； ④复染：取1：10稀释石炭酸复红覆盖涂片区域，轻微摇动，用上法细流水冲洗； ⑤吸水纸初步吸干玻片水分，然后自然干燥； 1.2.3 镜检：于涂片区域加半滴香波油，油镜（100倍目镜）下。 图1：Gram’s stain（1000×）图2：染色试验 三、分离培养 1实验原理：四区划线法是把混杂着在一起的微生物或同一微生物群体的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养繁殖后生成个菌落。有时这些单菌落并非由单个细胞繁殖而来，故必须反复分离多次才能得到纯种。其原理是微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。
微生物学教程期末复习
微生物学教程期末复习文档编制序号：[KK8UY-LL9IO69-TTO6M3-MTOL89-FTT688]
一、名词解释：微生物:微生物是形体微小、单细胞或个体结构简单的多细胞、甚或无细胞结构，用肉眼看不见或看不清的低等生物的总称。 微生物学:微生物学是一门在细胞、分子或群体水平上研究微生物的形态构造、生理代谢、遗传变异、生态分布和分类进化等生命活动基本规 律，并将其应用于工业发酵、医药卫生、生物工程和环境保护等实践 领域的科学，其根本任务是发掘、利用、改善和保护有益微生物，控 制、消灭或改造有害微生物，为人类社会的进步服务。 原核生物：即广义的细菌，指一大类细胞核无核膜包裹，只存在称作核区的裸露DNA的原始 细菌：是一类细胞细短、结构简单、胞壁坚韧、多以二分裂方式繁殖和水生性较强的原核生物。 病毒：是超显微的，无细胞结构，专性活细胞内寄生，在活细胞外具一般化学大分子特征，一旦进入宿主细胞又具有生命特征。 烈性噬菌体：凡在短时间内能连续完成吸附、侵入、增殖、成熟、裂解这五个阶段而实现其繁殖的噬菌体，称为烈性噬菌体。 C/N比：所谓C/N是指在微生物培养基中所含的碳源中碳原子的摩尔数与氮源中氮原子的摩尔数之比。 生长因子：一类对微生物正常代谢必不可少且又不能从简单的碳、氮源自行合成的所需极微量的有机物。
培养基：是一种人工配制的适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合养料，它具备微生物所需的六大营养元素，且其间比例合适。 基因：是生物体内一切具有复制能力的最小遗传功能单位，其物质基础是一条以直线排列、具有特定核苷酸序列的核酸片段。 纯培养：微生物学中将在实验条件下从一个单细胞繁殖得到的后代称为纯培养。 次生代谢产物：指某些微生物的生长到稳定期前后，以结构简单、代谢途径明确、产量较大的初生代谢作前体，通过复杂的次生代谢途径所合成的各种结构复杂化学物。 发酵：无氧条件下，底物脱氢后产生的还原力不经呼吸链而直接传递给某一中间代谢物的低效产能反应。 抗生素：微生物在其生命过程中所产生的一类低分子量代谢产物，在很低浓度下就能抑制或杀死其它微生物的生长。 最小抑制浓度:表示抗生素的抗菌活性，单位是g/ml。 抗菌谱：抗生素的作用对象有一定范围，这种作用范围称该抗生素的抗菌谱。广谱：对多种微生物有作用（如：土霉素、四环素）； 窄谱：仅对某一类微生物有作用（如：多粘菌素） 生态学（ecology）：是一门研究生命系统结构，及其与环境系统间相互作用规律的科学。 微生物生态学：是生态学的一个分支，它的研究对象是微生物与其周围生物和非生物环境条件相互作用的规律。
生物技术实验报告
生物技术实验报告 篇一：生物技术实验报告 组别：第六组 组员：苏琳伟、陈治、陈家和、陈硅 报告人：陈硅 学号：10349069 词汇&释义： Parafilm 封口膜 Chloroform 氯仿（三氯甲烷） Isopropanol 异丙醇 DEPC 焦碳酸二乙酯 TRIZOLa mono-phasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate Phenol苯酚 isthiocyanate 异硫氰酸胍 MCS multiple cloning site （polycloning site） 注：MSC是DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有
多个限制内切酶识别位点。能为外源DNA提供多种可插入的位置或插入方案。 实验任务： 1. 从猪肌肉纤维中提取RNA; 2. 2对RNA上EGFP基因密码子片段进行RT-PCR扩增; 3. 将经RT-PCR技术扩增的cDNA与插入载体质粒，并将其转化入大肠杆菌进行克隆； 4. 从大肠杆菌中提取含目的基因的载体质粒。 实验目的: 1.掌握提取纯化总RNA的原理和技术； 2.掌握RT-PCR原理和技术； 3.掌握TA克隆原理和技术。 实验原理： A．总RNA提取和纯化 RNA 分离的最关键因素是尽量减少RNA 酶的污染。但RNA 酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性RNA 酶外，环境中也存在大量RNA 酶。因此在提取RNA 时，应尽量创造一个无RNA 酶的环境，包括去除外源性RNA 酶污染和抑制内源性RNA 酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去
除外源性RNA 酶，通过RNA 酶的阻抑蛋白Rnasin 和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性RNA 酶。 Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，是一种由苯酚和异硫氰酸胍组成的单相溶液它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，裂解细胞并释放出RNA,酸性条件使RNA与DNA分离,加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。 无论是人、动物、植物还是细菌组织，各种样品最大使用量（1ml Trizol），动物组织( 50mg)，植物组织(100 mg)，丝状真菌( 100mg)，动物细胞(5×106～1×107)，酵母(1×107) 。 TRIZOL试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA 的析出。例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带，（mRNA和hnRNA成分）两条优势核糖体RNA 条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之间 (tRNA, 5S)。当抽提的RNA用TE稀释时其
微生物学实验指导(10.10)
实验一显微镜的使用及细菌的革兰氏染色 一、实验目的和内容 （一）实验目的 1. 复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油镜的使用方法。 2. 初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色的步骤 （二）实验内容 1．学习油浸系物镜的使用方法。 2．制作细菌染色装片。 3．进行革兰氏染色法操作。 4．用油镜观察大肠杆菌和苏云金杆菌染色装片。 二、实验原理 （一）油镜的基本原理 普通光学显微镜包括低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜。油镜是一种高倍放大的物镜，一般都刻有放大倍数，如95×、100×等。油镜头上常刻有OI（Oil，Immersion）或HI（Homogeneous immersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记，而且油镜的镜身较高倍镜和低倍镜为长。在低倍物镜、高倍物镜和油镜3种物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numberal aperture）最大，而工作距离最短（图3-1）。 图1-1 显微镜物镜参数图 显微镜的分辨率是指显微镜能分辨出物体两点间最小距离（D）的能力。D值愈小表明分辨率愈高。D值与光线的波长（λ）成正比，与物镜的数值孔径（NA）成反比.
从上式可看出，缩短光波长和增大数值孔径都可提高分辨率。数值孔径指光线投射到物镜上的最大角度（称镜口角，α）的一半正弦与介质折射率（n）的乘积。影响数值孔径大小的因数，一是镜口角，二是介质的折射率。 当镜与装片之间的介质为空气时，由于空气（n＝1.0）与玻璃（n＝1.52）的折射率不同，光线会发生折射，不仅使进入物镜的光线减少，降低了视野的照明度，而且会减少镜口角。当以香柏油（n＝1.515）为介质时，由于它的折射率与玻璃相近，光线经过载玻片后可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射，不仅增加了视野的照明废，更重要的是通过增加数值孔径提高分辨率，因而可以使物像明亮清晰。 （二）革兰氏染色 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain Gram创立的，是细菌学中最重要的鉴别染色法，其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。
微生物学实验
微生物学实验 实验一常用培养基的制备、灭菌与消毒 一、实验目的 了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；了解常见灭菌、清毒基本原理及方法；掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法。 二、实验原理 培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。 干热天菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。 三、试剂与器材 1.器材试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天 平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。 2.试剂牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂 四、实验内容 1.称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查 2.干热灭菌：装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物 3.高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒 压→降压回零→排汽→取物→无菌检查 4.过滤除菌：组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌 五、关键步骤及注意事项 1.要严格按配方配制。 2.调pH不要过头。
3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70oC 以下放物、取物。 4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零 取物。 5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快， 滤膜要注意清洗保存。 六、思考题 1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是 无菌的? 2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么? 3.培养微生物的培养基应具备哪些条件?为什么? 4.培养基的配制原则是什么? 实验二土壤中微生物分离纯化培养 一、实验目的 掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征；进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术；掌握微生物培养方法。 二、实验原理 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法稀释涂布平板法步骤：倒平板－制备土壤污水稀释液－涂布－培养－挑菌落；平板划线法步骤：倒平板－标记培养基名称－划线。 三、试剂与器材 1.器材盛9m1无菌水的试管、盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角 烧瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、酒精灯、无菌培养皿、显微镜、血细胞计数板等。 2.试剂牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，查氏培养基 四、实验内容
微生物学教程周德庆第三版重点17章
绪论微生物与人类 微生物是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称。个体微小(一般小于0。1nm）、构造简单。 微生物种类：①原核类：细菌（真细菌，古生菌)，放线菌，蓝细菌，枝原体，立克次氏体，衣原体。②真核类：真菌(酵母菌，霉菌，蕈[xun]菌）,原生动物，显微藻类.③非细胞类：病毒，亚病毒(类病毒，拟病毒，朊病毒）。 微生物五大共性：体积小，面积大；吸收多,转化快；生长旺,繁殖快；适应强，易变异；分布广，种类多。 第一章原核生物的形态、构造和功能 一般构造:细胞壁，细胞膜,细胞质，核区.特殊构造：鞭毛，菌毛,性菌毛，糖被（包括荚膜和粘液层）和芽孢，伴孢晶体。 细胞壁是细胞的外被，主要成分肽聚糖。功能：①固定细胞外形和提高机械强度②为细胞生长、分裂和鞭毛运动所必需③阻拦大分子有害物质（某些抗生素和水解酶）进入细胞④赋予细菌特定的抗原性以及对抗生素和噬菌体的敏感性⑤与革兰氏染色反应密切相关革兰氏阳性细菌细胞壁：磷壁酸，脂磷壁酸,肽聚糖。厚度大（20层）,90%肽聚糖和10％磷壁酸。 革兰氏阴性细菌细胞壁：肽聚糖，脂蛋白，磷脂，脂多糖，孔蛋白，外膜蛋白。壁薄，层次多，成分复杂，机械强度较弱。 革兰氏染色法：涂片固定→结晶紫初染→碘液媒染→乙醇脱色→番红覆染 阳性菌：紫色.阴性菌:红色。 缺壁细菌1。实验室中形成：①自发缺壁突变：L型细菌。②人工方法去壁：彻底除尽（原生质体）、部分去除(球状体）2.自然界长期进化中形成：枝原体。 L型细菌:专指稳定的L型即那些实验室或宿主体内通过自发突变而形成的遗传性稳定的细胞壁缺损菌株。 芽孢形成：①DNA浓缩，形成束状染色体；②细胞膜内陷，细胞发生不对称分裂，其中小体积部分即为前芽孢；③前芽孢的双层隔膜形成,这时芽孢的抗热性提高；④在上述两层隔膜间充填芽孢肽聚糖后,合成DPA-Ca（吡啶2，6—二羟酸钙）,开始形成皮层，再经脱水，使折光率提高；芽孢衣合成结束;⑥皮层合成完成，芽孢成熟,抗热性出现；⑦芽孢囊裂解,芽孢游离外出. 渗透调节皮层膨胀学说:芽孢的耐热性在于芽孢衣对多价阳离子和水分的透性很差以及皮层的离子强度很高，这就使皮层产生了极高的渗透压去夺取芽孢核心中的水分，其结果造成皮层的充分膨胀和核心的高度失水，正是这种失水的核心才赋予了芽孢极强的耐热性。 放线菌：是一类主要呈菌丝状生长和一孢子繁殖的陆生性较强的原核生物。也可以将其定义为一类主要呈丝状生长和以孢子繁殖的革兰氏阳性细菌。 枝原体,立克次氏体，衣原体寄生性逐步增强，是介于细菌和病毒间的一类原核生物。 枝原体的特点：①细胞很小,光镜下勉强可见；②细胞膜含甾[zai］醇，比其他原核生物的膜更坚韧；③因无细胞壁，故呈革兰氏阴性细菌且形态易变，对渗透压较敏感,对抑制细胞壁合成的抗生素不敏感；④菌落小（0.1~1。0mm），在固体培养基表面呈特有的“油煎蛋”状;⑤以二分裂和出芽等方式繁殖；⑥能在含血清、酵母菌和甾醇等营养丰富的培养基
微生物学实验报告
微生物学实验报告 (格式标准) (生命科学专业) 教师:黎勇 目录索引 实验一油镜的使用与细菌的简单染色法 3 实验二细菌的革氏染色与芽孢染色 5 实验三常用培养基的配制7 实验四酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别8 实验五、微生物大小的测定与显微计数10 实验六环境中微生物的检测与分离纯化11 实验七细菌鉴定中常用的生理生化反应12 实验八(综合实验)化能异养微生物的分离与纯化13 课程名称: 微生物学实验班级:化生系生命科学本科 实验日期: 指导教师:黎勇 实验一油镜的使用与细菌的简单染色法 〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术;观察细菌的基本形态;学习观察细菌的运动性的基本方法。 〔基本原理〕 1、 N·A=n·sinα 2、 D=λ/2N、A 3、目镜可提高放大倍数,但有效放大率取决于镜口率。已经分辨的物体不放大瞧不清,未分辨物放得再大也瞧不清。 4、用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时,可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。 〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸;细菌、放线菌等固定装片;培养18小时左右的B、subtilis、 S、arueus 菌斜面培养物;无菌水、生理盐水。 〔方法步骤〕: (一) 油镜的使用 镜检装片在中倍(或高倍镜)下找到目的物,并使位于视野正中聚光镜上升到最高位置,虹彩光圈开到最大,镜头转开成八字形在玻片的镜检部位(光斑处)滴一滴香柏油油镜转入正下方侧视小心上升载物台(缩短镜头与装片距离,镜头浸入油中,至油圈不扩大为止镜头几与装片接触) 粗调器徐徐下降载物台(密切注视视野,当捕捉到物像时,立即用细调器校正) 仔细观察并绘图 取出装片,清洗油镜:擦镜纸拭去镜头上的香柏油擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留(用手指辅助,迅速拭擦一、二次) 用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯(2-3次)。 (二) 细菌的简单染色法:涂片干燥火焰固定染色水洗干燥油镜观察 (三) 细菌运动性的观察取洁净盖玻片,四周涂上凡士林滴加一小滴菌悬液凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上翻转观察 〔结果分析〕 1、画一圆圈表示视野,选取所观察的微生物绘图,注意特殊结构、形状与排列。(描绘时按视野实际大小5－10倍绘制)
微生物学实验
实验一实验室和人体表面微生物的检查 一实验目的 1 证明实验室环境与体表存在微生物 2 比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型 3 体会无菌操作的重要性 二实验原理 平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在适宜温度下培养，1-2d内每一菌体能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小、表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑等。因此可通过平板培养基来检查环境中微生物的数量和类型。 三、器材 1、培养基牛肉膏蛋白胨琼脂平板 2、仪器或其他用具无菌水、灭菌棉签（装在试管内），接种环，试管架，酒精灯，记号笔，废物缸。 四、操作步骤 1、写标签 任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号（包括班级、姓名、日期、样品来源等），字尽量小些，写在皿底的一边，不要写在当中，以免影响观察结果。 注：培养皿的记号一般写在皿底上，如果写在皿盖上，同时观察两个以上培养皿的结果，打开皿盖时容易混淆。 2、实验室细菌检查 （1）空气 将一个肉膏蛋白胨琼脂平板放在实验台上，移去皿盖，使琼脂培养基表面暴露在空气中，将另一块肉膏蛋白胨琼脂平板放在洁净工作台内或无人走动的实验室中，移去皿盖，1h后盖上两个皿盖。 （2）实验台 ①用记号笔在皿底外面中央画一直线，再在此线中间处画一垂直线。 ②取棉签 左手拿含有棉签的试管，在火焰旁用右手的手掌边缘和小指、无名指夹持棉塞，将其取出，将管口很快地通过酒精灯的火焰，烧灼管口；轻轻地倾斜试管，用右手的拇指和食指将棉签小心地取出。放回棉塞，并将空试管放在试管架上。 ③弄湿棉签 左手取灭菌水试管，如上法拔出棉塞并烧灼管口，将棉签插入水中，再提出水面，在管壁上挤压一下以除去过多的水分，小心将棉签取出，烧灼管口，放回棉塞，并将灭菌水试管放在试管架上。 ④取样将湿棉签在实验台面或门旋钮上擦拭约2cm2的范围。 ⑤接种在火焰旁用左手拇指和食指或中指使平皿开启成一缝。再将棉签伸入，在琼脂表面顶端接种（滚动一下），立即闭合皿盖。将原放棉签的空试管拔出棉塞，烧灼管口，插入用过的棉签，将试管放回试管架。
生物制品学实验指导
生物制品技术实验指导 生物工程系
目录 实验规则 (2) 实验一、猪瘟、口蹄疫抗体间接血凝实验 (3) 实验二、鸡新城疫灭活疫苗的制备—照蛋及接毒 (4) 实验三、鸡新城疫灭活疫苗的制备—鸡胚收毒及测效价 (5) 实验四、鸡新城疫灭活疫苗的制备—油乳苗的制备 (6) 实验五、氢氧化铝和蜂胶的制备 (7) 实验六、法氏囊炎病高免卵黄抗体的制备 (8) 实验七、法氏囊炎病高免卵黄抗体效价的测定 (9) 实验八、兔瘟灭活苗的制备 (10) 实验九、大肠杆菌自家灭活疫苗的制备 (11) 实验十、动物实验 (12) 实验十一、鸡白痢平板抗原的制备及使用 (15) 实验十二、免疫血清的制备 (16) 实验十二、细菌冷冻真空干燥实验 (18) 1
实验规则 实验中所用材料，多具有传染性（如病原微生物、含病原微生物的血、尿、便、痰、脓汁及感染动物等），在实验过程中，必须严肃认真地进行无菌操作，以保证结果准确，防止实验室感染，防止病原微生物污染环境。必须遵守以下各项。 1、实验前必须预习实验指导书。若经提问发现没有预习者，须在教师指定的时间内预习完毕，方得参加实验。、进实验室不得将书包、衣物等放在实验台上，不必需的物品勿携入室内。 2、实验室内严禁饮食、吸烟及用嘴舔湿铅笔及瓶签，、如发生感染或污染等意外时，应立即报告指导老师，进行紧急处理。 5、保持实验室安静，不得谈笑喧哗，不许搞其他动作，以免影响他人实验。实验进行时不准随意进出。实验室中物品未经许可不准带出室外。 6、清洗仪器、用具、材料时，须将固形物倒入指定容器内，不得直接倒入水槽，以免造成水管堵塞。 7、实验过程中，须按操作规程仔细操作，注意观察试验结果，应及时记录。不得抄写他人的实验实习记录，否则，须重做。如有疑问，应向指导教师询问清楚后方可进行。 8、实验完毕后，须将玻璃仪器、用具等清洗干净，按原来的位置摆设放置，如有破损须报告指导教师，并填写仪器损坏登记簿。关好门窗水电，用消毒液洗手后离去。 10、实验结束后，由值日生负责打扫实验室，保持室内整洁，注意关上水、电、窗、门。 2