植酸酶及其基因工程改造研究进展
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生命科学仪器 2009 第7 卷/4 月刊
综述
1 植酸及植酸酶
植酸(Phytic acid)，又称肌醇六磷酸，是植物籽
实中磷的主要贮存形式。在谷物、豆类、油料等作物
的籽实中，磷的基本储存形式是植酸磷，其含量高达
种子干重的1%~3%，约占植物中总磷的60%~80%。但
是以植酸磷形式存在的磷却因单胃动物体内缺乏能分
解植酸（六磷酸肌醇）的酶而难以被吸收和利用，其
利用率仅在0~40%，从而造成了许多问题[1，2]。首
先，因为饲料中的磷源不能被有效利用，必须在饲料
中另外添加无机磷（主要磷酸氢钙）以满足动物对磷
的需求。其次，植物性饲料中85% 左右的磷没法被单
胃动物吸收和利用，从而直接排出体外，粪便中大量
的磷使水源和土壤遭受严重污染。再次，植酸磷还是
一种抗营养因子，它在动物胃肠道的消化过程中会与
多种金属离子以及蛋白质螯合成相应的不溶性复合物，
使一些消化酶的作用受到抑制，多种微量元素和氨基
酸的利用率下降，降低了动物对以上营养物质的生物
利用率。第四，目前饲料生产中用于生产磷酸氢钙的
原料是磷矿、石灰和硫酸，全球磷矿的资源有限，且
生产1t 磷酸氢钙成品就要排出约1t 以上的废物(磷石
膏)，大型磷酸氢钙生产企业一天的产量在数百吨以
上，每天排出的废物数量更大，企业附近磷石膏堆积
成垃圾山，磷石膏容易下滑而成为附近的安全隐患，
而硫酸也造成严重的空气、水源和土壤的污染；另一
方面，饲料中添加无机磷将造成磷源的浪费，饲料成
本增加[ 1 ，2 ]。
植酸酶是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸的
一类酶的总称，自然界存在很多能水解植酸盐的酶类，
统称“植酸酶”。植酸酶广泛存在于动植物组织和微生
物细胞中，在植物中主要存在于谷物和豆科植物的种
摘要 植酸酶做为一种新型的酶制剂，引起了国内外研究者的极大关注。植酸酶广泛存在于动植物组织和微生物细
胞中，分解植酸磷，降低磷的排放量。文章综述了植酸酶的分类、理化性质、作用机理、菌种选育，并着重讨论了近
年来植酸酶基因工程改造等问题。
关键词 植酸酶; 基因工程；
植酸酶及其基因工程改造研究进展
武燕平 刘霞1 张彦杰2 罗俊彩2 王燕1 杨平平1
( 1 山东轻工业学院，山东济南 250353；2 山东理工大学，山东淄博 255049)
作者介绍：武燕平（1 9 8 3 - ），女，山东菏泽人，山东轻工业学院研究生。
“通讯作者”：杨平平,男，教授，E-mail:jiannanypp@https://www.360docs.net/doc/345295284.html,
子和花粉中，而在动物中主要存在于脊椎动物的红细
胞和血浆以及哺乳动物的小肠内。产植酸酶的微生物
有细菌、酵母和真菌等
，饲料中使用的植酸酶主要来
自真菌，比如黑曲酶(Aspergillus sp. ) ，其生产的植酸
酶被认为是活性最强的[3，4]。
植酸酶按结构的不同主要可以分为三类:霉菌及部
分细菌来源的PhyA 与PhyB、Bacillus subtilis 来源的
PhyC、玉米植酸酶[2]。3 - 植酸酶( EC. 3. 1. 3. 8) PhyA
与6 - 植酸酶( EC. 3. 1. 3. 26) PhyB属于同一酶家族，
它们具有一个共同的活性部位保守序列RHGXRXP ，
并且它们的酶活性不需要辅助因子(如: 金属离子等) 来
维持[4]。PhyC 是Kerovuo 等[6]从Bacillus subtilis 中纯
化出来的植酸酶，该分子的三维模型近似于有6 个叶
片螺旋的基本形式。PhyC 没有通常植酸酶活性中心的
保守序列RHGXRXP ，而且需要Ca2 + 维持催化活性及
稳定性[7]。
2008年2月， 欧盟发出了磷资源的红色预警， 我
国专家称中国的磷资源也只能开采20 年。世界能源危
机加重， 原料价格普遍上涨， 环保压力日益昭显， 这无
疑为植酸酶的发展提供良机， 科技的发展将促使植酸
酶生产与应用进入一个新的发展时期。如何从“植酸
酶之困”转变为“植酸酶之盛”， 是每个从业者应该思
考的问题。
2 植酸酶的理化性质
2.1植酸酶的分子量
植酸酶的物理性质植酸酶的分子量依来源不同差异
很大，主要分布在35～200 KDa 之间，最大达700 KDa ，
最小仅10～13 KDa。Quan等[12]从Cladosporium sp. FP - 1 分
离出一种低分子量植酸酶，大约32. 6 kDa。大多数植
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综述
酸酶都为单体蛋白，但Segueil2ha 等[13]发现酵母S.
castellii 植酸酶分子量为490 KDa ，它是一个四聚体蛋
白，由1 个125 KDa 的大亚基和3 个70 KDa的小亚基
组成。
2.2植酸酶的催化作用及其机理
植酸酶通过将植酸分子上的磷酸基团逐一切下，
形成IP5 ， IP4 ， IP3 ， IP2 等，最终形成的产物为肌醇和
磷酸。这个过程需要Mg2 + 参与。具体过程如下：植酸
→D - 1， 2， 4， 5， 6 - 五磷酸肌醇和D - l， 2， 4， 5 - 四磷酸
肌醇→1， 2， 5， 6 - 四磷酸肌醇→1， 2， 5 - 三磷酸肌醇或
1， 2， 6 - 三磷酸肌醇→1， 2 - 二磷酸肌醇→2 - 磷酸肌
醇。在植酸酶水解的过程中，也释放出磷酸根离子和被
植酸螯合的大量锌、铜、钙、锰等矿物元素以及蛋白质，
从而使这些营养元素成分被有效吸收。氟化物、钒酸盐、
底物植酸和底物类似物六硫酸肌醇的抑制实验和酶晶体
结构研究表明，具有不同于其他植酸酶的催化机理[5]。
不同种类植酸酶起始水解酯键不同，3 - 植酸酶
PhyA 作用于植酸时，首先从植酸的第3 碳位点开始水
解酯键而释放出无机磷，而6- 植酸酶PhyB 作用植酸
时，首先从植酸的第6 碳位点开始。Ostanin 等[14]对植
酸
酶催化机制做了详细阐述：当植酸酶的活性部位与
底物的磷酸群体接触时，活性中心RHGxRxP 中的两个
精氨酸与底物的磷酸基团相互作用，形成了酶- 底物
的复合物，RHG 中组氨酸的咪唑基对磷酸基团的磷原
子发生亲核攻击，同时C 端HD 元件中的天冬氨酸为
底物离去基团提供一个质子，使底物以醇或酚的形式
离去，磷酸基团从底物上脱离，与RHD 中组氨酸形成
磷酸- 组氨酸复合物，环境水分子中的氧原子对磷原
子再次进行亲核攻击，活性中心某一推断的残基B 为
组氨酸的咪唑基提供质子，使磷酸基团离开植酸酶分
子，RHG 中组氨酸恢复原来的状态，进行下一个磷酸
的水解。不同来源植酸酶催化机理的差别主要是由他
们空间结构导致的。
2.3 植酸酶的pH 值
不同来源植酸酶的最适pH 不同，无花果曲霉发
酵产生的植酸酶，其最适pH 分别为2.5 和5.5，从百
合花粉中提纯的植酸酶，其最适pH 为8.0，是迄今发
现的惟一的碱性植酸酶。植酸酶的最适温度一般在
40~60℃范围内，个别可高达77℃，不同来源的植酸
酶其最适温度相差较大。植酸酶有广泛的底物特异性，
由于底物特异性方面不尽相同，造成不同植酸酶效果
存在差异，比如：6-植酸酶的实际使用效果只有同等
酶活3- 植酸酶的1/2；目前微生物来源的植酸酶的最
适pH在2.0~6.0，也存在最适pH 偏碱性的植酸酶。植
物来源的植酸酶的最适pH 一般在4.8~6.0，在酸性条
件下酶活下降，甚至失活。因此不适合作为畜禽饲
料添加剂。目前研究最多的是微生物来源的植酸酶，
包括细菌、霉菌和酵母菌等[ 4 ，8 ，9 ] 。
3 植酸酶高产菌株的选育
Nelson等[18]发现无花果曲霉能产生植酸酶，体外
实验此植酸酶能水解豆粕中97%的植酸磷。同年从土
壤中分离出来的无花果曲霉NRRL3135 能产生最大的
酶活性。褚西宁[19]首次分离到产植酸酶的青霉- 变灰
青霉，活性可达到3. 12 U /g。陈红歌[20]以黑曲霉为出
发菌株，经紫外、亚硝基单独处理和复合处理，获得
一株产酶能力达2950 - 3015U /g 的高产菌株。刘德
忠等[21]以无花果曲霉2121 - 15为出发菌株，用钴60
照射诱变，获得两株产酶活力均在11.0 U/mL 以上，
比出发菌株提高168. 57% ，发酵时间缩短了45% 左
右。汪世华等[22]分离和亚硝基胍诱变选育，得到一株
植酸酶高产菌株绿色木霉LH374，产植酸酶平均可达
1580 U/g。程海娜[23]等得到一株产植酸酶较高的黑曲
霉AN00101 菌株，在加水量为35% 的麸皮固体培养
基，在37℃培养114 h，用3%CaCl2 进行提取，固
体发酵物酶活高达1.3×104U/g。
4 植酸酶基因工程改造
目前，植酸酶已经实现了工业化生产，但是在
饲料中的推
广和应用还相当有限，主要原因在于植酸
酶在天然材料中的含量难以大量生产以及其热不稳定
性不能完全满足饲料加工、贮藏、使用的要求。利用
基因工程的特点对其进行改造以获得人们期望的产品。
4.1植酸酶的定点突变( site - directed mutation)
定点突变在植酸酶热稳定性、表达量和酶活性提
高以及活性部位研究等方面做出巨大的贡献。Tomschy
等[15]对A. niger 植酸酶分子进行了E89D、H292N、
R297Q 定点突变，最后发现R297Q 定点突变产生的效
果非常明显，分子模型表明R297 与植酸的一个磷酸基
团直接作用。Tomschy 等( 2002) 对A.fumigatus 中与最适
pH相关的多个极性氨基酸残基(Gln27、Ser140、Asp141、
Gly277、Tyr282) 进行了研究， 初步确定了其在pH和活
性方面的作用。Mullaney 等( 2002)将来源于A.niger 的
phyA 进行Glu300Lys 点突变，获得了pH 4.0 和37℃下
活性提高了56 %的植酸酶。彭日荷等(2002)以烟曲霉
中耐高温植酸酶基因phyA 为基础， 通过定点突变将部
分密码子替换成毕赤酵母的偏爱密码， 得到的重组子
经过高密度发酵，其表达量比原始基因提高13倍，并
有很好的耐热性。谷维娜等(2007) 对A.fumigatus来源
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综述
植酸酶的Q23L 和Q23L G272E 进行突变研究，结果
发现突变酶Q23L 在pH 5.5 的比活性由51U/mg 提高
到109U/mg，突变酶Q23LG272E 在pH 3.0～4.5 和pH
6.5～7.0时的稳定性比Q23L 有所提高。贝锦龙等[30]将
黑曲霉NRRL3135 菌株的植酸酶基因中部分在毕赤酵
母中低偏爱性的密码子替换为高偏爱性的密码子，得
到phyA-as 序列，全人工合成的改良黑曲霉NRRL3135
植酸酶基因phyA-as在毕赤酵母x-33中高效表达，在
摇床培养条件下，每毫升发酵液产生165000U 植酸酶
的水平。Edward等[31]对A. niger NRRL 3135植酸酶的
位点300进行定点突变(K300E)，从而提高了植酸酶在
pH4. 0 时的活力。陈惠等[32]将植酸酶43、354、358
位的苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸分别替换为酪氨酸、
甲硫氨酸、苯丙氨酸 (F43Y，I354M ，L358F)，
得到了2 个突变体PP-NPm-1(F43Y)及PP-NPm-2
( I354M ，L358F)，对表达产物进行酶活性测定及热
稳定性检测，结果表明：突变体PP-NPm-1 最适反
应温度比未突变体PP-NPm-8 上升了3℃，75℃处
理10min，热稳定性提高15%，比活力提高11%；PPNPm-
2 最适反应温度未改变，热稳定性比PP-NPm-8 仅
提高3%，比活力降低6. 5%。对突变前后的植酸酶
空间结构进行比较预测，发现突变氨基酸Tyr43与空
间位置相邻的Asn416之间形成氢键，增强了酶的热
稳定性。
4.2植酸酶的同序概念(consensus concept)
同序概念(consensus concept) 是将已知酶的氨基酸
序列放在一起比较，借助计算机的帮
助，从中选择对
每一个氨基酸位点最保守的残基，拼成序列，然后将
最后确定的氨基酸序列翻译成相应的DNA 序列，再选
用合适的表达系统对这个“人造的”目的基因进行表
达， 最终获得优于母本的新酶[20]。它不需要了解蛋白
质的三维结构，所以它属于半合理设计(semi - rational
design) 实验。Martin lehmann等采用同序技术用于创造
新的植酸酶分子，利用GCG 序列分析软件包中的PIL
EUP 程序对13 种已知真菌植酸酶氨基酸序列进行比
对，设计合成了同序植酸酶基因fcp，构建表达载体
pFP，在H.polymorpha 中表达出同序植酸酶-1。同序植
酸酶-1 的最适温度为7℃， 而亲代植酸酶的最适温度
为45～55℃， 增加了16～26℃，同序植酸酶-1Tm 为
78 ℃，比亲代植酸酶增加了15～22℃，而催化性质
与大多数亲本植酸酶相似。经定点突变发现在同序植
酸酶- 1 中有5 个氨基酸Y31、P225、M342、F346、
Y372， 表现增加同序植酸酶的热稳定性，两种残基
F296、A384 不稳定。Martin lehmann 等[30]在2002 年
为该技术提供了新的证据：在以前13 个植酸酶序列
的基础上，增加6个植酸酶的序列进行一致性技术构
造，得到的新酶phyA-10 比以前得到的phyA-1 的热
稳定性提高了7.4℃。
4.3定向进化 (directed evolution)
定向进化(directed evolution) 是酶分子改造的新策
略，它主要通过体外模拟自然进化机制，利用基因
随机突变、重组和定向筛选技术，使进化过程朝着人
们需要的方向发展。定向进化策略包括突变体库构建
和定向筛选两个过程[33]。该方法是在不需事先了解酶
的空间结构和催化机制的条件下，通过各种突变方法
向编码酶的基因中引入突变，突变的基因可以通过DNA
改组等方法进行重新组装，提高基因进化的效率，获得
一些性能改变的突变酶。最早定向进化策略—易错PCR
(error - prone PCR) 是Arnold等1993 年提出来的[34]。随
着这门技术不断成熟，至今已经涌现了很多高效的突
变重组和定向筛选技术，目前有关突变体库构建的方法
主要有: 易错PCR、DNA 改组(DNA shuffling)、体外随机引
发重组(random priming in vitro recombination， RPR)、交错延
伸( stagger extension process ， St EP)等[35～38]。而定向筛选主
要有：96 孔微板法、mRNA 展示技术(mRNA display) 、细
菌表面展示技术(Bacterialcellsurfacedisplay) 、酵母表面展
示技术( Yeast surface display) 等[39～41]。胡光星( 2002) 对
来自黑曲霉(A.nigr) 的植酸酶基因经过四轮改组后筛选到
酶活性比原始植酸酶提高12 倍的改组基因，克隆到毕
赤酵母后在50 L 发酵罐上高密度发酵，酶活单位由原
来的6.8×104 IU/mL 提高到80×105IU/mL。Garrett
等( 2004) 从植酸酶appA 的19个氨
基酸残基中32 个可能
与耐热相关的密码子中筛选耐热突变体。获得了在62℃
下1 h 有完全酶活， 而在85℃下10min仍有27 %的活
性的耐热菌株，并且在胃中的稳定性也提高3.5 倍。
定向进化运用于酶分子改造已经取得了大量突破性成
果，大量酶通过定向进化改造后成功应用于工业生
产[37]。由于表达宿主等原因，定向进化还没有运用
到植酸酶的改造中。随着人们对植酸酶在毕赤酵母
中的深入研究，发现植酸酶能在毕赤酵母中高效表
达[42～44]。所以植酸酶的定向进化必将成为植酸酶酶
工程研究的热点。魏威等( 2004) 通过随机突变的方
法，对来源于A.niger 的植酸酶基因phyA 进行了改
造， 将其导人大肠杆菌BL21(DE3) 中，构建工程菌
株BL21- PET21a(+) - phyA。结果植酸酶基因在工
程菌株中得到了高效表达，表达量达到菌体蛋白的
30% 以上，生物活性达到1500 U/mg，并且复性蛋白
质具有较好的热稳定性; 经过75～95℃，30min 的热处
理后，仍然保持了生物活性，同时有明显的热激活现
象， 热激活后最高生物活性达到5000 U/mg。
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综述
4.4杂合酶( hybrid enzyme)
杂合酶( hybrid enzyme)把来自不同酶分子的结构单
元或整个酶分子进行组合或交换以产生具有所需要性
质的优化酶杂合体结构，组合出新酶，并可产生催化
自然界不存在反应的新酶分子，作为开发序列组合进
化信息的有效手段。Jermutus 等[16]按照耐热性较好的
A. niger 植酸酶的晶体结构，将Aspergillus terreus 植酸
酶表面的一个二级结构α-螺旋用A. niger 植酸酶上相
应长度的一段序列替换，获得了酶活性未变而热稳定
性提高的新植酸酶。
5 小结
目前，植酸酶已经得到了广泛应用，但由于植
酸酶在天然材料中的含量难以大量生产以及其热不稳
定性不能完全满足饲料加工、贮藏、使用的要求，其
在饲料中的推广和应用还相当有限。目前， 植酸酶被
应用在多种动物饲料中， 以蛋鸡料中的应用最成熟。
事实上， 肉鸡和猪还有很大的发展空间， 而这类饲料对
植酸酶产品的高温稳定性要求比较高。解决高温问题
的途径有2 条: 开发高产或耐高温产品和使用液体植酸
酶。目前，液体植酸酶的生产已经不再是难题， 而喷
涂设备却是困扰其扩大的主要因素。因此，研究开发
高产或耐高温植酸酶是现在的热点问题，它将从育种
阶段解决问题，这将减少后续阶段不必要的浪费，节
约能源。
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Research Advances in Phytase and its Genetically Engineered
Yan-ping Wu1,Xia Liu1,Yan-jie Zhang2
Jun-cai Luo2,Yan Wang1,Ping-ping Yang1
(1.Shandong Institute of Light Industry;Jinan 250353 Shandong
2.Shandong University of Technology; Zibo 255049 Shandong )
Abstract Phytase caused great concern of researchers both at home and abroad as a new type of enzyme preparation.Phytase was widely in animal
and plant cells and micro-organisms,which can decompose phytase phosphorus and reduce the emissions of phosphorus. The article summarizes
the classification of phytase,physical and chemical properties, mechanism and strain selection.It also discussed the genetic engineering of phytase in
recent years.
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