【文献综述】纤维素酶的概述

文献综述

生物工程

纤维素酶的概述

【摘要】纤维素作为地球上分布广，含量丰富的碳水化合物，它的降解是自然界碳素循环的中心环节。纤维素的利用和转化对于解决目前世界能源危机，粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义。本文就纤维素酶的应用进行一个简要的概述。

【关键词】纤维素酶；纤维素酶的实际应用：应用前景

1. 纤维素的概况

1.2 纤维素酶的分类

纤维素酶的组成比较复杂,通常所说的碱性纤维素酶是具有3～10 种或更多组分构成的多组分酶。根据其作用方式一般又可将纤维素酶分为3 类: 外切β- 1, 4-葡聚糖苷酶( 简称CBH) 、内切β-1, 4- 葡聚糖苷酶( 简称EG)和β- 1, 4- 葡萄糖苷酶( 简称BG) [1]。在这3 种酶的协同作用下,纤维素最终被分解成葡萄糖。到目前为止, 还没有能够在碱性条件下分解天然纤维素的纤维素酶。碱性纤维素酶是一种单组分或多组分的酶, 只具有内切β- 1, 4- 葡聚糖苷酶( 又称CMC酶) 的活性, 有的还与中性CMC 酶组分共存[2]。

1.3 纤维素酶的作用机理

纤维素酶在提高纤维素、半纤维素分解的同时, 可促进植物细胞壁的溶解使更多的植物细胞内溶物溶解出来并能将不易消化的大分子多糖、蛋白质和脂类降解成小分子物质, 有利于动物胃肠道的消化吸收[3]。同时, 纤维素酶制剂可激活内源酶的分泌, 补充内源酶的不足, 并对内源酶进行调整, 保证动物正常的消化吸收功能, 起到防病、促生长的作用, 消除抗营养因子,促进生物健康生长。半纤维素和果胶部分溶于水后会产生粘性溶液, 增加消化物的粘度, 对内源酶造成障碍, 而添加纤维素酶可降低粘度, 增加内源酶的扩散, 提高酶与养分接触面积, 促进饲料的良好消化。而纤维素酶制剂本身是一种由蛋白酶、淀粉酶、果胶酶和纤维素酶等组成的多酶复合物, 在这种多酶复合体系中一种酶的产物可以成为另一种酶的底物, 从而使消化道内的消化作用得以顺利进行[4]。也就是说纤维素酶除直接降解纤维素, 促进其分解为易被动物所消化吸收的低分子化合物外, 还和其他酶共同作用提高奶牛对饲料营养物质的分解和消化[5]

2. 纤维素酶的一些历史及研究成果

在吴琳,景晓辉,黄俊生[3]的产纤维素酶菌株的分离，筛选和酶活性测定中，他们利用“采样—培养—分离单菌落—初筛—复筛—测OD值”的方法筛选出分解纤维素能力较强的菌株。[结果]经反复培养和划线分离从80份样品中初选出35株具有分解纤维素能力的菌株。其中10株由白转绿,长势较

好;6株深绿色,长势一般;4株绿色,长势较好。这20株都产孢子,被初步鉴定为绿色木霉。用刚果红培养基进行复筛选,得到9株透明圈较大的菌株。将这9株菌株再进行发酵培养,用DNS法进行酶活测定得到2株酶活较强的菌株。这2株菌株被鉴定为棘孢木霉。通过滤纸崩解测试筛选出20株降解纤维素能力较强的菌种。DNS法酶活测定结果表明采自甘蔗堆积处和甘蔗地的2个菌株的产酶活性最高。得到的结论采自甘蔗堆积处和甘蔗地的2个菌株可以作为降解纤维素的新菌种[7]。

在苏贝，韩峰，于文功（中国海洋大学医药学院海洋药物教育部重点实验室山东青岛266003）海洋细菌Cellulophaga sp. QY201 产内切纤维素酶发酵条件的研究中，研究人员采用的材料及方法：测酶活用羧甲基纤维素钠（CMCNa）购自Fluka；酸水解干酪素购自北京鼎国（Genview 分装）；蛋白胨、酵母提取物购自上海生工；其它试剂均为国产分析纯。TB-12R-3F 振荡摇床为日本Takasaki Scientific Instruments Co. 产品；J2-MC 冷冻离心机为Beckman 公司产品。唯一碳源基础培养基组成如下：（w/v）CMCNa 0.3 %, NaCl 3 %,（NH4）2SO4 0.2 %, Na2HPO4 0.15%, NaH2PO4 0.1 %, 100 kPa 灭菌15 分钟。粗酶液的制备：不同发酵条件下的发酵液经10000 r/min 离心10 min 后，上清液即为粗酶液。纤维素酶活力测定：取0.9 mL 1 %（w/v）CMCNa 底物（0.02 mol/L pH 7.0 磷酸盐缓冲液配制）加入0.1 mL 酶液，在50 ℃下温育10 min,迅速加入1 mL DNS 试剂，沸水浴5 min 后，迅速冷却，加5 mL 蒸馏水，于520 nm 下测定吸光值。用100℃灭活5 min 的酶液作对照。在此条件下，每分钟产生1 μmol还原糖的酶量定义为一个酶活力单位（U）。他们得到结论经发酵条件优化，确定海洋细菌Cellulophaga sp. QY201产纤维素酶的最佳培养基配方为（w/v）：CMCNa 0.5 %，CaSein0.3 % ，NaCl 3 % ，MgSO4·7H2O 0.3 % ，Na2HPO4 0.15 % ，NaHPO4 0.1 %，pH=7.0。最适培养条件为：500 mL 三角瓶装液150 mL，温度28℃，转速100 r/min,发酵时间36 h。优化后发酵液上清的酶活最高可达7.85 U/mL，约为优化前的3.5 倍。在发酵优化过程中发现，菌株Cellulophaga sp.QY201生长及产酶对NaCl 和Mg2+ 有一定的要求，表明了其海洋微生物的特性。经过优化所得的发酵培养基和培养条件使产酶量大幅度提高，且稳定性好，为纤维素酶的大规模制备以及以后的分离纯化和性质研究工作奠定了基础[8]。

在孔凯,孟宁,冯琳,李师翁(兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州730070)产纤维素酶细菌的分离鉴定及产酶特性研究里。他们利用刚果红染色鉴定法用接种针将斜面单菌落转移到复筛产酶培养基,25℃恒温培养3 d,向培养皿中加入适量1 mg/mL的刚果红溶液,染色1 h后,用1 mol/L的NaCl溶液洗脱.得到的结果是菌株的分离纯化与筛选从取自青藏高原的一份牦牛粪材料中,经稀释涂布平板分离到能在以CMC为唯一碳源的培养基中生长的菌株6株,用刚果红染色,产生透明圈直径较大的菌株有一株,给该菌命名为Tibet-YD5000-3.Tibet-YD5000-3菌落为橙黄色,圆形边缘整齐,菌落表面为低凸面.革兰氏染色表明Tibet-YD5000-3为杆状革兰氏阴性菌.他们结论是纤维素是地球上最丰富而可再生的生物聚合物。经初步统计，已发现的具有降解纤维素能力的微生物有近200 种，分布在真

菌、细菌和放线菌中。现今分泌降解纤维素酶微生物的研究主要集中在陆生菌，且集中在丝状真菌的研究上，对海洋菌的研究较少[8]。在很多平板降解圈直接分离法分离CMCase 菌株的方法中，以刚果红法为最好。其它的方法有的受底物来源的限制，有的灵敏度低需培养较长时间，有的则因杀死菌体而需用影印移植，这就造成很多不便。运用CMC平板、透明圈法和滤纸崩解法从青藏高原牦牛粪中分离到可产生胞外纤维素酶的黄杆菌属.菌株Tibet-YD5000-3.实验表明, Tibet-YD5000-3最适生长温度为20℃,最适生长pH值为8.0.Tibet-YD5000-3菌株最适产酶温度25℃,最适产酶pH值为

8.0.Tibet-YD5000-3所产纤维素酶反应最适pH值为8.0,最适反应温度30℃,经测定该菌株最适培养条件、酶最适反应条件下测得纤维素酶活为12 U/mL,具有进一步开发应用的前景.目前对黄杆菌属细菌的研究相对较少,最近的研究发现,该属细菌具有产褐藻酸酶等活性,尚未发现该属细菌具有产纤维素酶活性,我们的研究首次分离到一株产胞外纤维素酶的黄杆菌属菌株Tibet-YD5000-3,有必要对该细菌的纤维素酶基因进行分离鉴定和更深入地研究[9]。

在王全，李术娜，李红亚，雷白时，陈妍，张立静，朱宝成（河北农业大学生命科学学院，河北保定071001）的产芽孢纤维素降解细菌XN-13 菌株筛选及酶活力测定。他们试验的时间与地点：试验于2008 年在河北农业大学生命科学学院制药工程系微生物研究室进行。他们使用的实验材料：新鲜牛粪，取自河北农大牧场健康奶牛直肠或粪便。他们配制的培养基：NA培养基、NB培养基、CMC-Na 培养基、刚果红纤维素钠培养基见《微生物学实验》。生理生化鉴定培养基及试剂见《常见细菌系统鉴定手册》。研究人员使用的试剂是0.05 mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液；3,5-二硝基水杨酸显色液（DNS）；0.5%羧甲基纤维素钠溶液；0.2 mg/ml纤维素酶；2 mol/L盐酸溶液；72%硫酸溶液；中性洗涤液。他们使用的方法：（1）取新鲜牛粪10.0 g 于试管中，在水浴锅内80 ℃水浴10 min，杀死菌体。（2）称取5.0 g 处理过的牛粪，于150 ml NB培养基中170 r/min，37 ℃培养48 h。将培养后的发酵液进行梯度稀释，依次稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。分别取稀释到10-4、10-5、10-6的发酵液20~30 μl到刚果红纤维素钠平板中，三角刮涂布，37℃恒温箱中倒置培养48 h。（3）观察平板，标记出圈的菌种、测量水解圈直径并记录试验结果。复筛初筛所得菌株在液体发酵培养基中进行发酵，考察发酵代谢产物的降解活性。一方面按初筛方法考察发酵上清液的产酶能力；一方面定量测定发酵上清液酶活。将初筛得到的菌株扩培，转接到NB培养基上，置于37 ℃恒温培养24 h 以活化菌株。将活化后的菌株接种至复筛液体发酵培养液中，37 ℃静置培养48 h后，以10 000 r/min，4 ℃离心5 min，取上清液点样于刚果红平板的微孔，每孔点样100 μl。37 ℃避光培养5天后观察并记录脱色圈的有无及大小。他们做的纤维素酶活力的测定：（1）CMC酶活力测定。酶活力（U/ml）=OD×H×N×2×1000/30。是H—标准曲线系数，N—酶液稀释倍数，2—换算成每毫升酶液，1000—葡萄糖毫克数换算成微克数。精确称取分析纯无水葡萄糖100 mg，溶于蒸馏水中，定容至100 ml。将初筛的菌种分别接种于不含葡萄糖的NB培养基中170

r/min，37 ℃培养48 h。分别吸取各个菌种的发酵液1 ml 于EP 管中，10 000 r/min离心10 min后上清液即为粗酶液。在试管中加入1.0 ml 0.5%羧甲基纤维素钠溶液，1.0 ml 0.2 mg/ml 纤维素酶液，于50 ℃反应30 min 后，加入DNS试剂终止反应，沸水浴5 min，于550 nm比色并记录实验结果。以光密度为纵坐标，含糖量为横坐标，绘制标准曲线。他们做的菌株降解能力测定：取1.0000 g 样品置于烧杯中，加入2.0 mol/L HCl，70 ml 之后放入高压蒸汽灭菌锅，100 ℃保温50 min。依次用95%乙醇、无水乙醇和丙酮洗涤2 次（之前称量滤纸重量），将残渣连同漏斗置于烘箱中，干燥至恒重减去滤纸重为W2。将漏斗中残渣取出，置于烧杯中，加入72%硫酸，10 ml，20 ℃降解4 h 后，加入蒸馏水90 ml 过夜。次日，将样品抽滤，残渣洗至pH 6.5 左右，将残渣连同漏斗置于烘箱中，干燥至恒重减去滤纸重为W3。测完后，用以下公式计算分别得到各组分的含量。纤维素(%)=(W2-

W3)/W2×100纤维素降解率(%)=(对照秸秆中纤维素含量-处理后秸秆含量)/对照秸秆纤维素含量

×100。该实验的结论：试验中虽然复筛到5 株活性比较高的菌株，但是某些初筛活性很高的菌株进入复筛后，其降解活性明显降低，甚至消失，这可能是由于降解机制不同，或者是发酵条件不合适所导致的，可以换其他培养基或将培养基优化后再试，估计还可以获得降解效果不错的菌株。事实也证明了适当改变培养基配方时，以前降解活性较弱的菌株其降解活性有明显提高，这也表明发酵条件对降解物质的产生具有重要影响。秸秆纤维素和木质素的生物降解是作为秸秆发酵饲料最有前景的方法之一，在秸秆回收利用上最大幅度的增加了农作物的利用率，提高农业生产的经济效应和社会效益方面具有重大意义。另外，试验所用菌株来源于牛粪，系动物的肠道菌，对饲料的后续饲喂提供了安全保障。目前，秸秆降解所涉及的芽孢杆菌种类主要有枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilies）、嗜碱芽孢杆菌（Alkaliphlic Bacillus）、地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）等.。因此，笔者主要是针对产芽孢细菌进行筛选，这样可以增加试验成功的几率，也可以使试验成果更便捷的进行农业生产应用。当然，试验虽然筛选出纤维素酶活力较高，降解纤维素能力较强的枯草芽孢杆菌XN-13，但是离实际应用还有一段距离，还需要对很多的内容进行进一步研究。比如：发酵条件的优化、产芽孢条件的优化、降解机制研究和用基因工程方法构建、诱变产生更高效的降解菌株等多方面的研究[10]。

3 纤维素酶的应用

3.1 纤维素没在食品工业上的应用

3.1.1 纤维素酶在酿酒工业上的应用

在进行酒精发酵时添加纤维素酶可显著提高酒精和白酒的出酒率及原料的利用率, 降低溶液的黏度, 缩短发酵时间, 而且酒的口感醇香, 杂醇油含量低[11]。纤维素酶提高出酒率的原因可能有两方面: 一是原料中部分纤维素分解成葡萄糖供酵母使用; 另外, 由于纤维素酶对植物细胞壁的分解, 有利于淀粉的释放和被利用。将纤维素酶应用于啤酒工业的麦芽生产中可增加麦粒溶解性, 加快发

芽, 减少糖化液中单一葡萄糖含量, 改进过滤性能, 有利于酒精蒸馏。用纤维素酶预处理啤酒糟, 可提高啤酒糟蛋白酶解率10%以上; 纤维素酶在清香型优质白酒中的应用, 出酒率可提高13%, 而且不影响酒的感官品质; 在日本清酒生产中, 浸米时加入0.02%～0.1%的纤维素酶浸泡17 h,米的溶解性好, 糖化发酵顺利, 酒渣少, 出酒率高[12]。

3.1.2 纤维素酶在酱油酿造中的应用

在酱油的酿造过程中添加纤维素酶, 可使大豆类原料的细胞膜膨胀软化破坏, 使包藏在细胞中的蛋白质和碳水化合物释放, 这样既可提高酱油浓度, 改善酱油质量, 又可缩短生产周期, 提高生产率, 并且使其各项主要指标均提高3%。采用固体制曲、固态酒精发酵和固态[13]。

3.1.3 纤维素酶在醋酸发酵生产中的应用

醋酸发酵生产工艺对纤维素酶在食醋酿造方面的应用进行了系统研究, 结果表明纤维素酶添加量为10～50 umol/min, 产酒精量比CK 提高7.5%～23.8%, 食醋产量提高0.25～1.36kg, 主料出品率提高5.1%～27.2%[14]。

3.2 纤维素酶在农牧业上的应用

3.2.1 纤维素酶在养殖业中的应用

在瘤胃微生物区系结构正常的情况下,添加纤维素酶能以几倍的效率提高粗纤维和其他营养物质的酵解强度,提高消化吸收水平。在瘤胃发生病理变化即微生物区系失去平衡进入腐解过程时,高活性纤维素酶能迅速调整微生物区系结构,恢复平衡关系和正常酵解、吸收、合成过程[15]。有试验表明在瘤胃正常状态下,添加纤维素酶饲喂奶牛5昼夜以后,其粪便干物质和饲喂前相比,减少了30 %左右;1周以后,封闭牛舍氨气含量下降70 %左右,粗饲料采食量提高10 %-20 %,粪便中蛋白质提高8 %-10 %,尿中尿素下降58-9 %(赵长友,1993)。有试验表明,在奶牛饲料中添加纤维素酶可在降低采食量的同时,提高增重和产奶量,提高饲料报酬,而在产奶量增加的同时对乳脂率没有明显影响。纤维素酶在降低采食量的同时提高产奶量的主要原因是:反刍动物的摄食量主要受血液内的挥发性脂肪酸(VFA)浓度的调节。挥发性脂肪酸是纤维素的分解产物,外源性纤维素酶增加了瘤胃中挥发性脂肪酸的生成量,而瘤胃对挥发性脂肪酸的吸收较快,大量的挥发性脂肪酸进入血液,并随其浓度的升高反馈性作用于食物调节中枢,导致采食量下降。一般认为奶牛的产奶量和乳脂率呈负相关,而试验表明在奶牛日粮中添加纤维素酶后,随着产奶量的上升乳脂率呈上升趋势。这说明纤维素酶通过提高奶牛血液中的各种营养物质的含量,增强乳腺细胞对各种营养物质的摄取能力,从而维持乳中的各种营养物质的含量始终处于平衡状态[16]。

除肠道中的微生物可以降解部分纤维素外,单胃动物不能分泌断裂β-1,4糖苷键的内源酶,所以饲料中含有的纤维素对单胃动物而言几乎不具有营养价值。此外,由于纤维素的交错、缠绕和粘附,阻碍营养物质的消化和吸收并影响肠道微生物菌群的平衡。因此在单胃动物日粮中添加纤维素酶具有

营养和保健的双重功效[17]。

肉鸡　在日粮中添加纤维素酶饲喂肉鸡可使肉鸡饲料消耗量下降16-25 %,体重增加2-88 %,料肉比降低10-18 %(尹清强等,1993)。Francesh等(1994)同时使用纤维素酶、葡聚糖酶、木聚糖酶喂以大麦饲料为基础的雏鸡,结果使饲料消耗降低2-9 %,体重提高1-3 %。秦江明等(1996)对饲喂添加纤维素酶的肉鸡进行各阶段的体重分析,结果试验鸡于2周末、4周末体重在各日粮间差异极显著,说明酶制剂对肉鸡前期的生长作用显著;6周末、8周末试验鸡体重在各日粮间也呈增高趋势。说明添加外源酶制剂补充了内源酶的不足,因而在肉鸡发育前期具有更显著的效果[18]。

蛋鸡　王怀凡等(1995)在蛋鸡常规饲料中添加0·1 %复合纤维素酶,试验组的产蛋率比对照组提高10·8 %,蛋重提高1·7 %,料蛋比下降14·6 %。徐奇支等(1998)用纤维素酶添加日粮饲喂蛋鸡,对蛋形指数、蛋壳厚度未产生明显影响,但添加0·1 %和0·5 %的纤维素酶降低了破蛋率。

猪　王尧等(1995)用前期含草粉10 %、后期含草粉15 %的日粮添加纤维素酶喂肥育猪,试验组比对照组日增重提高0·255 kg,料肉比下降0·24,每头每日增加效益0·95元[19]。

3.3 纤维素酶在纺织上的应用

纤维素酶在染整上广泛应用, 特别在棉织物整理上, 经过纤维素酶整理后, 棉织物的手感和外观获得很大的改善。由于织物表面的绒毛被除去, 处理后织物更光洁, 颜色更鲜艳。根据处理的目的不同, 可进行生化抛光、柔软滑爽、改善光泽以及石磨水洗等加工[20]。纤维素纤维织物用纤维素酶处理都伴随着纤维的减量或失重, 并引起许多性能变化。减量处理主要是改善织物的柔软度、弹性和悬垂性。减量加工大多数采用液体染色机和水洗机。棉织物经过纤维素酶整理后, 手感和外观可以有很大的改善。因为织物表面的绒毛被去除, 处理后的织物更光洁、颜色更鲜艳。织物的硬挺度和刚性降低, 光滑度和悬垂性提高, 使织物获得更好的手感。因此在保证处理效果的同时, 避免织物强力过度损失就显得非常重要[21]。

4. 纤维素酶实际应用中存在的问题

纤维素酶作为畜禽饲料添加剂,从作用机理和实际生产中看,均能说明是个良好的添加剂[22]。但目前在应用方面还存在一些问题。如:1同种类动物不同发育阶段的酶系变化,以及饲喂纤维素复合酶后对动物消化酶系分泌的影响,需深入研究。2各种动物的最佳添加量。3加工、贮存对酶活的影响,以及饲料中的其他物质对纤维素酶的影响,都需深入研究。此外,添加纤维素酶后由于营养物质的利用率提高,如何对原有配方进行修订也是值得研究的问题[23]。

5. 纤维素酶的发展前景

据统计, 1995 年, 世界工业酶的销售量大于10 亿美元; 预计到2005 年, 销量将达到17~20 亿美元, 而1999年实际达到16 亿美元。工业酶总供应量的60% 来自于欧洲, 其余40% 来自于美国和

日本, 而且大约75% 的工业酶是水解酶, 其中糖苷水解酶居第二位。目前纤维素酶的应用还主要集中在微生物纤维素酶的应用上[24]。现在纤维素酶已被广泛地应用于食品、酿酒、饲料加工、纺织、洗衣、农业等多个领域中。随着人们对纤维素酶研究工作的深入, 纤维素酶必将在食品、饲料、环境保护、能源和资源开发等各个领域中发挥越来越大的作用。如何加大对纤维素酶研究和开发的科技投入和经费投入, 改变目前规模小、工艺设备落后、菌种酶活低、生产成本高、生产技术水平低下的现状,尽快采用各种行之有效的高新技术, 发展具有中国自己知识产权的新酶种、新产品、新剂型, 满足市场的需求是当务之急。同时, 动物纤维素酶与微生物酶系有所不同,作为一个新的纤维素酶体系, 它的研究也具有重大的理论价值, 因此, 可能成为纤维素酶研究的热点[25]。

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