生物技术制药的研究进展

动物乳腺生物反应器的研究进展

班级：生物工程学号：071454116 姓名：刘俊超

摘要：动物乳腺生物反应器(Mammary Bioreactor)是一种利用动物转基因技术

在乳腺细胞中表达多肽药物、工业酶、疫苗和抗体等蛋白的技术。该技术具有低投入高产出的特点，其效率是利用以大肠杆菌和动物细胞培养技术的100倍，是一种非常有潜力的高新技术。本文综述了乳腺生物反应器的原理，研究进展与应用。

关键词：乳腺生物反应器；研究进展；应用

1乳腺生物反应器的原理

乳腺生物反应器(mammary gland bioreactor)技术是指利用乳腺特异表达的乳蛋白基因的调控序列构建表达载体，制作转基因动物，指导外源基因在动物乳腺中特异性、高效率地表达，以期从转基因动物乳汁中源源不断地获得外源活性蛋白。

乳腺生物反应器的原理是应用重组DNA技术和转基因技术，将目的基因转移到尚处于原核阶段(或1～2细胞的受精卵)的动物胚胎中，经胚胎移植得到转基因乳腺表达的个体。外源基因在乳腺特异性表达需要乳蛋白基因的一个启动子和调控区，即需要一个引导泌乳期乳蛋白基因表达的序列，这样才能将外源基因置于乳腺特异性调节序列控制之下，使其在乳腺中表达，再通过回收乳汁获得具有生物活性的目的蛋白。

2研究现状

2.1国外进展

GordonL[l] 等将重组DNA 采用显微注射方法导人小鼠受精卵，首次获得了带有外源基因的转基因小鼠。Palmiter等[2]将大鼠生长激素基因显微注射到小鼠的受精卵中，获得比普通小鼠大得多的“硕鼠”，并提出可以从转基因动物中提纯有价值的药用蛋白。此后，国外在此项技术上不断取得新的进展。荷兰的Phraming公司[3]培育出含人乳铁蛋白的转基因牛，每升牛奶中含有人乳铁蛋白1 g。英国爱丁堡制药公司[4]已培育成功含a一1一抗胰蛋白酶(AA T)的转基因羊，每升羊奶中会有此种蛋白30 g。V elander W H 等L3 报导用转基因猪生产人蛋白C的量为1 g／L。美国Genzyme Transgene公司与日本的Somitomo Metals[5]合作共同开发其产品凝血酶原Ⅲ，转基因山羊中表达量为4 g／L。美国Gen—pharm International 公司[6] 用酪蛋白启动子与人乳铁蛋白(hLF)的cDNA 融合，获得世界上第一头名为Herman 的转基因公牛，该公司可用非转基因母牛生产转基因后代，1／4后代母牛乳汁中表达了hLF。Halter等[7]人报道，在转基因羊乳腺中表达因子Ⅶ已获得成功。Bleek等[8]从转基因猪的乳汁中获得了W AP。Wa1．1iamLg]在转基因猪的乳汁中提取到人体蛋白C(hPC)，并且这种乳腺生物反应器生产的hPC具有与人血浆中分离的天然hPC相同的活性。Utomo等[10-11]将W AP驱动的rtTA 因子在小鼠乳腺上皮上大量表达。英国的PPL医疗公司[12]用基因打靶技术获得了两只定位整合的转基因苹Cuypid和Diana，并已将这一技术用于人类蛋白的开发。英国PPL公司[13]。又将人类AAT基因整合到胎儿成纤维细胞的procollagen基因座位，用转基因细胞生产克隆羊，每升乳中AAT蛋白的含量达到650 nag。最近，荷兰科学家培育成功的转基因牛含有的促红细胞生成素(EPO)，EPO能促进红细胞的生成，对肿瘤化疗以及肾脏机能下降引起的红细胞减少具有积极的治疗作用。

目前，国外在乳腺生物反应器技术研究上取得了巨大的进展，已有数十种产品在多种实

验动物特异和高效表达的技术已日渐成熟。据美国红十字会和美国遗传学会预测，到2005年仅美国的乳腺生物反应器生产的药物年销售额可达到350亿美元，到2010年，所有基因工程药物中利用乳腺生物反应器生产的份额可达到95%

2.2国内进展

我国在乳腺生物反应器研制方面起步较晚，“七五”计划中设立的“动物个体表达系统”的研究项目，该项目的主要研究目标就是在动物乳腺中表达外源基因。目前，国内许多单位对动物乳腺生物反应器进行了探索和研究，已获得了转基因鼠、兔、猪、羊、鸡等具有快速生长能力或抗病能力的畜种及乳腺生物反应器表达分泌的具有生物活性的蛋白产物[14],20世纪9O年代，国家“863”高技术计划将转基因动物乳腺生物反应器的研究列入重大项目，并与地方政府密切配合，积极支持我国科学家进行转基因羊的研究开发[15] 。潘玲等[16]在转基因小鼠乳汁中可表达人促红细胞生成素(EPO)，但乳汁中EPO含量仅为0．5 mg／mL。阎喜军等[17]刀以乳头管导入和乳腺直接导入两种转染方法获得了EPO 含量为0．64 ng／mL和0．006 ng／mL(为大鼠分娩后48 h乳汁)的转基因小鼠。张克忠[18]等以奶山羊表达人凝血Ⅳ因子，且在奶山羊乳汁中的最高含量为13．7 ng／mL。陈国祥和王建荣[5]等还分别进行了绵羊、奶山羊的BLG基因的克隆，为进一步研究药物蛋白在乳腺中的表达奠定了基础。1994年我国中科院发育研究所开展的用非病毒构件作为体细胞转基因的研究，这将可能缩短乳腺表达的时间[14]1996年10月在上海奉新动物实验场成功研制出5头有目的基因整合的转基因羊，其中1头母羊已于1997年9月产下小羊羔，进入泌乳期，乳汁中有活性的人凝血因子Ⅳ表达，这种凝血因子是治疗血友病的珍贵药物[15]引。字丽[19-20]利用卵清蛋白基因启动子和CA T报告基因构建的表达载体在鸡原代输卵管上皮实现了特异性表达。

尽管我国在该项技术上取得了较大进展，但还处在探索阶段，与国外还有一定差距。自国家“863”计划对“动物乳腺生物反应器应用研究”立项后，强化了资助和组织管理工作，逐步受到有关部门和企业界的重视，研究和开发的力度加强，前景非常乐观。

3存在的问题

3.1目的基因在动物基因中的整合问题

由于目的基因在动物基因中的整合是随机的，因此包括整合位点、整合的拷贝数等机制还不清楚。所以，易发生调节失控、遗传不稳定、表达率不高。

3.2转基因动物的成活率低

在目的基因的分离和改造，乳腺特异表达载体的构建及转基因技术的关键性技术上存在缺陷，无法保证对基因的定点整合，因此转基因动物常会出现繁殖力下降、胚胎早期死亡等各种生理及病理缺陷。

3.3安全性

动物体内虽然可以对外源蛋白进行翻译后修饰，但由于牛、羊等家畜存在自身机体保护系统可对所有外源性物质产生排斥反应，如出现蛋白质水解等问题。此外乳汁中可能含有的微生物及不完全修饰的多肽都对产品的安全性构成了极大的威胁，所以在分离过程中要去除所有可能引起人类变态反应的蛋白质，同时对含量低的产物加以纯化，才能得到与目的蛋白结构、功能和理化特性相同的产品。另外，要防止把动物性疾病传染给人。

4生物医药生产应用

到20世纪90年代中期，世界上已有数十家转基因动物公司，主要用于生产贵重的药用蛋白。以乳腺生物反应器生产的药用蛋白主要有：溶血检药物：组织型纤溶酶原激活剂(Tissue-type Plasminogen Activa-tor,t-PA)、尿激酶原(Prourokinase,Pro-UK)是第三代溶血栓特

效药物，它克服了链激酶(SK)和尿激酶(UK)使用时过敏及弥漫性出血的缺点，具有溶栓作用强、效果好、安全等特性。我国每年约有500多万血栓性疾病患者急需特效的溶血栓药物。早在20世纪80年代国外已建立了t-PA转基因羊。我国业已建立了t-PA和Pro-UK乳腺定位表达的转基因鼠，并在乳汁中得到了表达产物。作者也构建了不同的t-PA乳腺定位表达载体，并在家兔乳腺中得到表达。这就为进一步建立大型转基因动物奠定了坚实的基础。细胞因子：具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等多种功能的干扰素(IFN)、白细胞介素(IL)、肿瘤坏死因子(TNF)等细胞因子早在20世纪80年代及90年代初期已被克隆并在小鼠乳腺中得到表达。另一种用于肾性贫血、再生障碍性贫血、感染性贫血的细胞因子—人促红细胞生成素(HumanErythro-protein,EPO)转基因小鼠已构建成功，乳汁中EPO含量达0.5ug/ml。EPO 能刺激人的红系造血干细胞的增殖分化，调节和维持血液红细胞的生理水平，在医学上具有重要医疗价值。目前国外主要用CHO细胞表达制备，一旦EPO能在大型哺乳动物乳腺中生产，其经济效益将不可估量。出血性疾病治疗药物：血友病是严重威胁人类健康的遗传性出血性疾病。目前血友病病人在治疗时只能采用由人血制备的凝血因子Ⅸ等浓缩样品，制备费用昂贵，且存在AIDS和肝炎病毒等感染的危险。凝血因子Ⅷ和Ⅸ在内源性凝血过程中起着重要作用，这两种因子的基因缺失或缺陷，是血友病(A型或B型)发病的主要原因。凝血因子Ⅷ已在猪乳腺中得到表达，值得欣慰的是我国也研制出凝血因子Ⅸ的转基因羊，并在乳汁中检测到了具有活性的凝血因子Ⅸ。这对我国乳腺生物反应器的开发利用具有重要意义。

5展望

动物乳腺生物反应器开创了现代生物制药产业的新途径，现已成为生物反应器技术中研究最为活跃、最具有商业化发展前景的领域之一。随着社会各界对转基因动物生产药用蛋白认识的不断深入，利用动物细胞核移植与基因打靶技术培育的动物乳腺生物反应器生产的药用蛋白必将投入市场，造福于人类社会。总之，转基因动物乳腺生物反应器用于药用蛋白的市场潜力是巨大的，具有广阔的开发应用前景!

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