水通道蛋白综述与展望

水通道蛋白水通道-从原子结构到临床医学

生物膜的透水性在生理学上是一个长期存在的问题，但负责此类蛋白质的蛋白质仍然未知，直到发现水通道蛋白1（AQP1）水通道蛋白。AQP1由渗透梯度驱动的水选择性渗透。人类AQP1的原子结构最近被定义。四聚体的每个亚基含有允许水分子单文件通过但中断氢键通过质子所需的单独水孔。已经鉴定了至少10种哺乳动物水通道蛋白，并且它们被水（水通道蛋白）或水加甘油（水甘油聚糖）选择性渗透。表达位点与临床表型密切相关，从先天性白内障到肾源性尿崩症。在植物，微生物，无脊椎动物和脊椎动物中发现超过200个水通道蛋白家族成员，并且它们对这些生物体的生理学的重要性正在被揭开。

在20世纪20年代发现脂质双层提供了当沐浴在较低或较高pH或含有毒性浓度的Ca2 +或其他溶质的细胞外液中时细胞如何维持其最佳细胞内环境的解释。从1950年代开始发现离子通道，交换剂和共转运体为溶质的跨膜运动提供了分子解释。然而，长期以来，假定水的输送是由于通过脂质双层的简单扩散。来自具有高膜渗透性的多个实验系统的观察，例如两栖膀胱和哺乳动物红细胞，表明通过脂质双层的扩散不是水跨越膜的唯一途径。虽然提出了各种解释，但直到10年前发现AQP1才能知道分子水 - 特异性转运蛋白（Preston 等，1999）。

现在人们普遍同意扩散和通道介导的水分运动都存在。通过所有生物膜以相对较低的速度发生扩散。水通道蛋白水通道发现于上皮细胞的一部分10至100倍的水渗透能力。值得注意的是，水通道蛋白水通道的选择性非常高，甚至质子（H3O +）被排斥。在大多数组织中，扩散是双向的，因为水进入细胞并从细胞释放，而水通道蛋白介导的体内水流则由渗透或液压梯度引导。扩散的化学抑制剂是未知的，扩散发生在高Ea（Arrhenius活化能）。相比之下，大多数哺乳动物水通道蛋白受汞的抑制，Ea等同于大量溶液中水的扩散（?5 kcal mol_1）。

水通道蛋白的发现说明了偶发性在生物学研究中的重要性，并且引起了上游流体运输过程中水如何穿过生物膜的范式的完全转变。这个话题对正常生理学以及影响人类的多种临床疾病的病理生理学非常重要。水通道蛋白在几乎每一种生物体中被鉴定出来，包括高等哺乳动物，其他脊椎动物，无脊椎动物，植物，真细菌，原细菌和其他微生物，表明这种新认可的蛋白质家族参与了整个自然界的不同生物过程。

一、发现AQP1

红细胞Rh血型抗原不知道参与水运（Heitman＆Agre，2000），但是Rh的研究导致了水通道蛋白的偶

然发现。用于纯化Rh多肽的生物化学技术产生污染的28kDa多肽（Agre等，1987）。基于洗涤剂中的28kDa蛋白质的相对不溶性，N-月桂酰肌氨酸，开发了产生大量蛋白质的简单纯化系统。红细胞和肾近端小管 - 具有最高已知水渗透性的组织中，28kDa蛋白质显示出非常丰富（Denker等，1988）。此外，28kDa蛋白质表现为四聚体整合膜蛋白 - 通常是膜通道蛋白的特征（Smith＆Agre，1991）。使用28kDa多肽的N-末端序列克隆编码来自红细菌文库的269个氨基酸多肽的cDNA（Preston＆Agre，1991）。遗传数据库的分析显示了多种物种的同源物，包括微生物和植物，但其分子功能是未知的。“CHIP28”暂时用于描述这种蛋白质为“28kDa的通道样整合蛋白”。

二、AQP1的结构

AQP1的结构非常有力，因为它具有独特的渗透特性。推导的序列揭示了以前未描述的拓扑，两个串联重复每个由具有两个高度保守的环（B和E）的跨膜结构域形成，包含签名基序，天冬酰胺 - 脯氨酸 - 丙氨酸（NPA）。奇怪的是，重复序列被预测为相对于彼此以180度取向（图2，顶部）。通过在非洲爪蟾卵母细胞中表达AQP1的位点定向插入突变体来证实这种独特的对称性（Preston等人，19994a）。在环路E中，在接近NPA基序的Cys-189处证明了汞抑制的位点。用较大分子量的残基替换NPA侧翼残基的突变体没有表现出水渗透性，表明环E形成水孔的一部分（Preston等，1993）。当环B（Ala-73）中的NPA基序之前的相应位置被半胱氨酸取代时，水分渗透性也受到

汞的抑制。当NPA基序侧翼的残基被更大的残基取代时，观察到该环B也表现为似乎形成水孔的一部分。这些研究一起导致了AQP1亚基各自含有部分由“沙漏”形成的内部水孔（图2，底部）的建议，其由从相反的双层折叠成双层的环B和E产生的结构膜的两侧在双层传单之间的中间接触（Jung et al。，1994b）。

1992年，瑞士巴塞尔大学Biozentrum的Andreas Engel和同事们开始了长期合作，随后与日本京都大学的Yoshinori Fujiyoshi及其同事一起解决了AQP1蛋白的结构。使用通过用N-月桂酰肌氨酸预萃取膜囊泡的纯化方法，可以将高达5mg的AQP1纯化成来自一品脱人血液的同质性（Smith＆Agre，1991）。当通过透析将高浓度的蛋白质小心地重构成脂质双层体时，形成均匀的晶格（“膜晶体”），其中蛋白质保留其100％的水输送活性（Walz等人1994b）。蛋白质的四聚体组织在低分辨率下明确确定，并且其通过3D电子显微镜测定其在膜中的组织（Walz等人，1994a）。用高达60度的倾斜研磨的精细膜晶体，由我们在京都的同事开发的技术先进的电子显微镜，以3.8?分辨率产生电子密度图。使用由重组体研究建立的约束，使用AQP1的主序列进行建模产生了AQP1结构的第一个原子模型（Murata 等人，2000）。另外一种基于电子显微镜的模型以不同的主链方向以相同的螺旋排列出版（Ren et al.2001）。

与其中四个亚基围绕中心孔的离子通道不同，AQP1作为每个亚单位的四聚体存在含有自己的孔。在双层传单之间的中间孔的孔径变窄至约3埃。在这一点上，由跨膜结构域TM1,2,4和5形成的壁是疏水的，而NPA图案中的两个高度保守的Asn-76和Asn-192被并置，如在沙漏模型中预测的那样，提供极性用于氢键的残基（图3）。此外，成孔环B和E的末端部分均含有短的α-螺旋，其在膜的中心产生部分正电荷。

这种结构刚好在由残基Phe-56，His-180，Cys-189（汞抑制位点）和Arg-195所包围的2.8A的缩合物之下，Arg-195在精制的AQP1结构中是公认的（de Groot等人2001）。 Arg-195在大水通道蛋白基因家族的所有成员中几乎完全保守，并且在通道的最窄部分提供功能上重要的正电荷。 His-180在中性pH下不带电，但在较低的pH下变质子化，提供第二个正电荷。 Arg-195，His-180和来自孔螺旋的正偶极子在水渗透期间提供抵抗质子（水合氢离子）通过的强排斥电荷。

AQP1的这些结构特征很好地解释了排除较大或带电溶质的最小抗渗透能力。特别地，阻断质子传递的能力澄清了肾脏如何每天从肾小球滤液中重吸收数百升的水，同时排泄酸。重要的是，分辨率为2.2的大肠杆菌同源物GlpF的三维晶体的X射线衍射分析（Fu等人2000）允许对AQP1结构进行改进（de Groot等人，2001），其实质上与模型由2.2 A分辨率的牛AQP1的三维晶体确定（Sui et al。2001）。

实时分子动力学模拟表明，在通过NPA图案的并置Asn-76和Asn-192（de Groot＆Grubmuller，2001）期间，水的旋转发生。分子动力学研究也由其他研究者进行（Kong＆Ma，2001; Tajkhorshid et al.2002）。结构研究和分子动力学模拟对膜水输送过程带来了非常高的原子认知水平。生物医学研究领域的调查人员现在认识到，水通道蛋白提供了水通过生物膜快速和选择性运动的机制。

三、AQP1的分布

1991年11月，丹麦奥胡斯大学的Soren Nielsen及其团队长期合作。我们的目标是使用光学显微镜和免疫电子显微镜在细胞和亚细胞水平的肾脏和其他组织中定位AQP1（和随后的其他水通道蛋白）。这些研究为AQP1的生理和病理作用提供了明确的证据，并且在其他部位牢固地预测了同源蛋白的存在。

自20世纪30年代荷马史密斯早期的职业生涯以来，肾脏比其他器官吸引了运输生理学家的兴趣。使用对AQP1蛋白的C末端特异性的亲和纯化抗体和N末端的第二抗体，将AQP1的位置精确地定位在近端小管的顶端刷边界和基底外侧膜（图4）和下降薄来自大鼠肾脏的Henle四肢（Nielsen等，1993c）和人（Maunsbach等，1997）。此外，蛋白质在下垂血管直肠中被鉴定（Pallone等人，1997），其定义了将大量水从管腔转移到间质，然后进入血管空间的途径。 AQP1蛋白质清楚显示仅存在于这些部位的质膜中，而不存在于细胞内部位。因此，建立了这样的范例，即通过AQP1在顶端和基底外侧血浆膜中将水输送穿过近端小管上皮和下肢细胞，其驱动力由通过特异性转运蛋白的溶质的矢量运动产生的小立场渗透梯度提供在这些膜（Nielsen＆Agre，1995）..

在其他组织中也证实了AQP1蛋白，其中包括脉络丛（脑脊髓液），前房室内的非色素上皮（房水），胆管细胞（胆汁）和毛细血管内皮等重要分泌作用，包括肺支气管循环（Nielsen等，1993b）。重要的是发现肾脏收集管道完全缺乏AQP1，可以很好的预测多种水通道蛋白质的需要。同样，唾液腺上皮缺乏AQP1蛋白，预测其他同源物的存在。

四、AQP1空人

鉴定完全缺乏AQP1蛋白质的人们证明了这种蛋白质对人体生理学的重要性。通过荧光原位杂交将AQP1基因座定位于人染色体7p14（Moon等，1993）。 Colton（Co）血型抗原以前已经连接到人类7号染色体的短臂（Zelinski等，1990）。来自具有确定的Co血型的个体的DNA的抗Co免疫沉淀研究和测序表明，Co抗原是连接第一和第二双层跨越结构域的环A的胞外位点的AQP1的多态性的结果 - Coa具有Ala -45，而较不常见的科巴Val-45（史密斯等人，1999）。据了解，缺乏Coa和Cob的人非常罕见，因为英国布里斯托尔的国际血型登记处只列出了6名亲属。 Co阴性的先证者是在怀孕期间变得敏感的妇女，导致它们具有循环的抗Co抗体。这些抗体使得这些患者不可能接受异源输血，因此每个Co无效个体都有在本地血库冷藏保存的血液单位。我们从三个不同亲属的Co无效个体获得血液，尿液和DNA，发现红细胞和尿沉渣中缺乏AQP1蛋白。发现每个亲属中的先证者对于AQP1基因（因此“AQP1 null”）的不同破坏 - 外显

子1的缺失，外显子1中的位移或第一跨膜结构域末端的不稳定突变都是纯合的Preston等人1994b）。令人惊讶的是，AQP1无效个体导致正常生活，完全不知道任何身体上的限制。

进行AQP1无效个体的仔细临床分析，以鉴定肾脏浓度和毛细血管通透性的可能的生理异常。在第一项研究中，两名不相关的AQP1无效个体在约翰霍普金斯医院进行了详细分析，在经过认可的方案之前和之后，在具有确定的终点和安全机制的情况下进行了水剥夺。基线研究是完全正常的。当口渴达24小时时，两名受试者均表现出正常的血清渗透压和正常的血清升压素水平，如预期大约6小时的渴望后升高。主要的惊喜是，即使在24小时口渴之后，AQP1无效个体也不能将尿浓缩至450mosmol以上。此外，即使在输注加压素或3％NaCl后，患者也不能将尿浓缩至450 mosmol kg_1以上，以最大限度地刺激尿浓度（King等，2001）。与AQP1无效个体相比，正常人全部通过将尿浓缩至约1000 mosmol kg_1来响应过夜口渴。

AQP1无效对象不是多尿的，它们没有表现出肾小球滤过率，自由水清除率或锂清除率（近端小管功能指标）的异常。浓缩缺陷被认为是由降低的薄肢体上的水输送减少和减少水输送进入和排除直肠的结合而产生的。因此，AQP1无效个体部分丧失了通过逆流机制产生有效浓缩所需的髓质高渗透压的能力。虽然这并不影响正常的日常生活，但是由于另一种疾病或环境原因，如果它们变得脱水，Co无效个体将面临危及生命的临床问题。

毛细血管内皮的腔内和外膜中AQP1的表达表明，蛋白质可能在空间和间质之间的水运动中起重要作用（Nielsen等，1993b，c）。此外，AQP1在毛细血管内皮中的表达似乎在体内受到各种刺激的积极调节。例如，大鼠肺毛细血管内皮中AQP1的表达由皮质类固醇增加至10倍，大鼠肺中的表达也在出生时精确出现（King等，1996,1997）。培养的成纤维细胞中的AQP1被泛素 - 蛋白酶体途径迅速降解（Leitch 等，2001）。认为这些过程很可能发现在人类生理学中发生。

通过第二批准的临床研究方案评估人类AQP1无效个体因血管内皮缺乏AQP1蛋白而出现生理异常的可能性。 AQP1无效个体通过高分辨率计算机断层扫描检查快速输注3 h的温热生理盐水之前和之后的肺（King et al。2002）。五个正常人和两个AQP1无效个体中的每一个在流体输注后持续肺血管充血（横截面积增加20％）。五个正常个体中的每一个表现出与早期的静脉周围水肿形成一致的细支气管壁厚度（壁面积增加高达40％）的显着增加。每个正常人都知道在以下时间内消失的中度肺充血（初期肺水肿）。令人惊讶的是，两个AQP1无效个体都没有发现增加细支气管壁厚度，也没有抱怨任何肺充血症状。

这些发现矛盾地表明缺乏AQP1可以防止急性肺水肿。然而，在诸如充血性心力衰竭的设置中，肺水肿在几小时或几天内出现。由于AQP1也是流体再摄入血管床的途径，所以这些研究预测，如果AQP1无效个体经历亚急性或慢性流体超载，则会出现严重缺陷。因此，预计AQP1无效个体不能通过将流体返回到血管空间而迅速消散水肿。虽然未经证实，在AQP1无效对象中，从肺部快速清除水可能无法完全运行，因此可能会解释为什么AQP1无效受试者非常罕见。此外，AQP1在早产儿肺中的表达降低可能对新生儿重症监护病房常见的严重呼吸系统疾病有很大的帮助。

1、多水通道蛋白

在AQP1发现之后，欧洲，日本和美国的研究小组加入了分离编码水通道蛋白的cDNA，从而将水分运输已知高度评估（由Agre等1998）。高度保守的序列的存在已经使得使用聚合酶链扩增降低严格性成为可能。从这些研究中，已经鉴定了10种哺乳动物水通道蛋白（图5）。已经出版了第十一同系物（AQP10）的序列，但仍缺乏蛋白质表达的确认（Hatakeyama等，2001）。已经对人类和实验动物进行了研究。有目标基因的小鼠

还产生了破坏（由Agre，1998年; Verkman，2000年审查）。许多研究的结果强调了这些蛋白质对基本生理学以及几种疾病状态的病理生理学的重要性。此外，遗传学数据库中已经出现了来自不同物种的200多种不同水通道蛋白序列，其中表明水通道蛋白在自然界中的

重要性。

2、AQP2加压素调节肾通道的水通道

AQP1的鉴定吸引了肾脏生理学家的直接兴趣。此外，AQP1在收集管道主体细胞中的缺乏预示着长期以来已知加压素调节水输送的位点存在同源蛋白质。使用由AQP1的高度保守的NPA基序设计的寡核苷酸引物，从收集管中分离出cDNA（Fushimi等，1993）。现在称为AQP2的这种收集管同源物被证明在非洲爪蟾卵母细胞中表达时赋予增加的透水性，并被汞的抑制。 AQP2定位在收集管主体细胞中，长期口渴大鼠的研究表明AQP2表达增强（Nielsen等，1993）。

AQP2的功能和分布通过收集管的分析明确定义（Nielsen等人，1999）。在不加血管加压素的情况下，在分离的灌注大鼠收集管中，加入100pM血管加压素后，以及在除去药剂后测量水输送。收集导管固定，AQP2蛋白通过免疫金电子显微镜定位（图6）。通过这种方法，显示AQP2在很大程度上局限于基础状态的细胞内囊泡，但是加压素诱导重新分配到顶膜，伴随着透水性增加五倍。当加压素被去除时，AQP2被重新外化，水渗透率恢复到基线。随后显示AQP2通过受体激活的腺苷酸环化酶 - 蛋白激酶A的蛋白质的C末端胞质结构域中的Ser-256磷酸化被胞吐所影响（Katsura等，1995; Christensen等，2000）。随后，AQP3显示存在于主细胞的基底外侧膜（Ecelbarger 等，1995）。顶端膜中的AQP2和基底外侧膜中的AQP3一起提供了透过细胞的途径，使水从内腔通过收集管移动到间质中。

这些研究表明AQP2可能参与某些类型的肾源性尿崩症（NDI）。以前已显示这种重要的临床疾病是由X连锁NDI中加压素的V2受体编码基因的突变引起的（Bichet，1998）。荷兰奈梅亨大学的调查人员以前已经确定了在编码V2的基因中没有突变的隐性遗传性NDI患者。通过对结构AQP2基因进行测序，他们鉴定了AQP2的跨膜和孔形成结构域的突变（Deen等，1994）。这些突变导致保留在内质网中的AQP2蛋白错误折叠。随后，确定了具有显着遗传的NDI的家族，并且发现突变位点位于远离PKA磷酸化位点的两个残基（Mulders等人，1998）。有趣的是，突变蛋白与野生型AQP2低聚，复合物保留在高尔基体中。

重要和经常遇到的水分平衡障碍的动物模型已经被多个研究组显示出来，包括AQP2蛋白的异常表达（参见Schrier等，1998; Yamamoto ＆Sasaki，1998; Kwon等，2001）。发现AQP2在具有多尿症，包括经典尿崩症（血管加压素简单缺乏），锂疗法（通常用于治疗双相情感障碍）），阻塞后（经常经尿道前列腺切除术），低钾血症（后果）的抗高血压药物），甚至夜间遗尿。相比之下，AQP2被发现在流体保留状态如充血性心力衰竭，ADH不适综合征，肝硬化甚至怀孕中过度表达。因此，AQP2的继发性疾病对临床医学的实践至关重要。此外，这些研究预测，水通道蛋白家族的其他成员将被鉴定，并且这些水通道蛋白参与由表达蛋白质的位点预测的其他重要的临床疾病。

3、肾脏收集管的AQP6门控离子通道

水通道蛋白的功能谱通过发现AQP6而扩大。尽管AQP6可能存在于收集管外部的组织中，但是AQP6抗体的交叉反应性已经排除了对非肾组织的严格研究。尽管如此，AQP6在酸性转运蛋白被限制在细胞内部位的肾收集管中已被明确鉴定（Yasui et al。，1999b）。进一步的分析表明，AQP6与细胞内囊泡中H + -ATPase一起共定位，但在质膜中不共定位（Yasui et al.1999a）。

AQP6不是一个简单的水道。当在非洲爪蟾卵母细胞中表达时，AQP6位于卵母细胞质膜中，其表现出最小的透水性。尽管抑制水渗透性，预期的结果先前已被其他人报道，但用氯化汞处理AQP6卵母细胞未能降低透水性（Ma et al.1996）。非常令人惊讶的是，我们发现低浓度的氯化汞增加了透水性并引起伴随的膜电流（Yasui et al。，1999a）。因此，虽然AQP6的主要序列最接近AQP2和AQP5（都被氯化汞抑制），但AQP6的结构必须具有功能上的重要差异。

AQP6在含有H + -ATPase的细胞内囊泡中的位置（Yasui et al。，1999b）表明在酸的分泌中起作用。重要的是，AQP6离子电流在低pH下迅速且可逆地活化，证实AQP6可能参与被插入细胞的酸分泌。暴露于慢性酸中毒的大鼠的研究未见AQP6表达的变化，但慢性碱中毒和水分负荷导致AQP6表达显着增加（Promeneur等，2000）。 AQP6携带的膜电流对于阴离子是相对选择性的，单通道研究表明发生快速闪烁。通过对编码AQP6的基因进行靶向破坏的小鼠的分析进一步描

述这些研究（M.Yasui，未发表的观察）。目前认为，AQP6可能与某些形式的酸碱紊乱有关。