细胞传代操作记录
细胞传代操作记录
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细胞生物学作业
细胞生物学作业（专升本） 1.如何理解细胞生物学与医学的关系？ 是医学学科的基础课程。 研究细胞生物学是医学研究的必修课，在细胞免疫，识别，和分泌各种物质以及胞间运输等各方面都与人类个体息息相关，细胞是人体最基本的生命系统，是人体代谢免疫等各种生命活动的承担者，细胞构成组织，细胞所需要的各种营养物质也是人体所必须的，细胞普遍衰老也是人体衰老的象征，从一个细胞就具有人类所以的遗传物质，我们加以利用，人为培养出一些器官组织，或者从大肠杆菌从植入人的激素基因，制造胰岛素，进行基因工程，细胞对人体稳态的调整也具有重要作用，如效应T细胞可以杀死人体的癌细胞 和多种病变细胞，癌细胞有不死性，讲癌细胞与人体效应B细胞融合可以获得杂交的无限 分泌抗体的瘤性B细胞，对人体有利无害。 2.原核细胞和真核细胞有哪些异同？ 相同点：有细胞膜细胞质，均有核糖体，均以DNA为遗传物质。 不同点： 1、细胞壁成分：原核细胞为肽聚糖、真核细胞为纤维素和果胶； 2、细胞器种类：原核细胞只有核糖体；真核细胞有核糖体、线粒体、叶绿体、高尔基体、内质网、溶酶体等细胞器； 3、原核细胞无染色体，真核细胞有染色体； 4、细胞大小：原核细胞小、真核细胞大。 3.试述细胞膜液态镶嵌模型的主要内容。 1脂双分子层构成膜的主体，它既有固体（晶体）的有序性又有液体的流动性。2膜蛋白分子以各种形式与脂双分子层结合，有的贯穿其中，有的镶嵌在其表面。
3膜糖类（糖脂和糖蛋白）分布在非细胞质侧，形成糖萼。 4该模型强调了膜的流动性和不对称性。 4.细胞膜的生物学意义有哪些？ 意义：细胞的流动性在细胞信号传导和物质跨膜运输等病原微生物侵染过程中有重要作用；不对称性（主要是指膜蛋白）是生物膜执行复杂的、在时间与空间上有序的各种生理功能的保证。 5.试述Na+-K+泵的工作原理及其生理学意义。 工作原理 钠钾泵位于动物细胞的质膜上，由2个α和2个β亚基组成四聚体，β亚基是糖基化的多肽，并不直接参与离子跨膜转运，但帮助在内质网新合成的α亚基进行折叠。1.细胞内侧α亚基与Na+结合促进ATP水解，α亚基上的一个天冬氨酸残基磷酸化引起α亚基构象发生变化，将Na+泵出细胞。 2.同时细胞外的K+与α亚基的另外一点结合，使其磷酸化，α亚基构象再度发生变化，将K+泵入细胞。 3.完成整个循环。从整个转运过程中α亚基的磷酸化发生在Na+结合后，去磷酸化发生在与K+结合后。每个循环消耗一个ATP，可以逆电化学梯度泵出3个Na+和泵入2个K+。 生理功能 1.维持细胞膜电位 膜电位是膜两侧的离子浓度不同形成的，细胞在静息状态时膜电位质膜内侧为负，外侧为正。每一个工作循环下来。钠钾泵从细胞泵出3个Na+并且泵入2个K+。结果对膜电位的形成了一定作用。 2.维持动物细胞渗透平衡 动物细胞内含有多种溶质，包括多种阴离子和阳离子。没有钠钾泵的工作将Na+
细胞传代培养的原理及操作步骤,细胞冻存,细胞复苏
细胞传代培养的原理及操作步骤 （一）原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 （二）细胞传代培养具体操作 1、细胞：贴壁细胞株 2、操作步骤 1）将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另外两到三瓶中，实践培养液塞好橡皮塞，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 细胞冻存 1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射15min；培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水 浴箱37℃预热备用；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的 细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心(1000r/min，10分钟)。 5. 去上清液，加入与细胞悬液等量的冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16～18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储 存。-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 1.室内紫外消毒；培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管，立即放入37℃水槽中快速解冻，离心。 3.去上清，加入培养基，吹打，然后移入培养瓶中，用培养基清洗冻存管，清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基，放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期；次日换液。
标准菌种确认标准操作规程完整
一目的 建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。 二围 本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。 三容 1.1 试验菌株 大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102] 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003] 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501] 白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)64941] 黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003] 铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104] 生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(F)98001] 1.1.1 标准菌株 1.1.1.1 标准菌株应来自认可的国或国外菌种收藏机构。 1.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。 1.1.1.3 标准储备菌株应进行纯度和特性确认。 1.1.2 工作菌株 1.1. 2.1 标准储备菌株可用于制备每两个月或定期转种的工作菌株。 1.1. 2.2 工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过 5 代（从菌种收藏机构获得的标准菌株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。因此必要时，应对工作菌株的纯度和特性进行确认。 1.2 菌种确认试验的主要容
1.2.1 菌种的纯度确认 1.2.1.1 纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。 1.2.1.2 试验容 ①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。 ②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。 1.2.2 菌种的特性确认 1.2.2.1 生化试验：各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代过程中所参与的物质分解和合成代的产物也不同，这些代产物又具有不同的生化特征。根据此特征，利用生物化学方法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的生化试验。 1.3 菌种的确定方法 用无菌接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培养。培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及菌形。再做生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定菌种。 1.3.1 大肠埃希菌的确认 1.3.1.1 菌落形态 1.3.1.1.1 取大肠埃希菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经35℃培养18～24h后，形成菌膜，管底有粘液状沉淀，培养物有粪臭味。 1.3.1.1.2 取上述培养物接种于曙红亚甲蓝琼脂(EMB)琼脂平板和麦康凯琼脂平板上，35℃培养18～24h后，观察结果。 ①曙红亚甲蓝琼脂(EMB)平板上菌落形态呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色,菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润，常有金属光泽。 ②麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。 1.3.1.2 革兰染色、镜检 1.3.1. 2.1 革兰染色
细胞生物学作业
题目： 一、光学显微镜、电子显微镜分别有哪些？说明其工作原理、观察对象和主要构造。请查阅文献资料截图举出每种显微镜拍摄的细胞生物学照片3张以上的图片。 二、试述单克隆抗体技术、FRET、荧光漂白恢复技术的原理与应用。 解答： 一、 （一）、光学显微镜 观察对象： 光学显微镜适用于比较大的物质，最小能看到十几微米尺寸的物体。且需要该物体对光的散射比较良好，景深不大。可用于观察细胞，细菌，以及大结构的金属组织。 1．普通光学显微镜 尼康E-600显微镜 （1）原理：
普通的光学显微镜是根据凸透镜的成像原理，要经过凸透镜的两次成像。第一次先经过物镜（凸透镜①）成像，这时候的物体应该在物镜(凸透镜①）的一倍焦距和两倍焦距之间，根据物理学的原理，成的应该是放大的倒立的实像。而后以第一次成的物像作为“物体”，经过目镜的第二次成像。由于我们观察的时候是在目镜的另外一侧，根据光学原理，第二次成的像应该是一个虚像，这样像和物才在同一侧。因此第一次成的像应该在目镜（凸透镜②）的一倍焦距以内，这样经过第二次成像，第二次成的像是一个放大的正立的虚像。如果相对实物说的话，应该是倒立的放大的虚像。 （2）主要构造： 普通生物显微镜由3部分构成，即：①照明系统，包括光源和聚光器；②光学放大系统，由物镜和目镜组成，是显微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜和物镜都由复杂的透镜组构成；③机械装置，用于固定材料和观察方便。 （3）图片： 蛔虫
钩虫 2．荧光显微镜 尼康E800荧光DIC显微镜 （1）原理： 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。 荧光显微镜依据光路可分为透射式和落射式两种，目前新型荧光显微镜多为落射式荧光显微镜，某些大型荧光显微镜中兼有透射利落射两种方式的激发光路。 ①透射式荧光显微镜，激发光源是从标本下方经过聚光镜穿过标本材料来激发荧光，适于观察对光可透的标本。其优点是低倍镜时荧光强，而缺点是随放大
细胞传代培养
细胞传代培养（胰蛋白酶消化法） 具体操作： 一. 传代前准备： 1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 2.用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 3.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 4.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。 6.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 7.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。 8.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。 二.胰蛋白酶消化； 1.加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。 2. 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 3.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。 三.吹打分散细胞： 1.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 2.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。 3.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。 4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 四.分装稀释细胞： 1.分装：将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。 五.继续培养： 用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。 传代细胞培养注意事项： 1.严格的无菌操作 2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。
细胞传代培养标准操作规程
创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 细胞传代培养（消化法）标准操作规程 一、原理 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 二、材料和试剂 1. 无菌磷酸生理缓冲液(PBS) 2. 胰酶-EDTA溶液(0.05%胰酶-0.53mM EDTA-4Na): 以10ml分装于15 ml 无菌离心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃水槽回温。 3. 新鲜培养基 4. 无菌吸管/离心管/培养瓶 三、操作步骤 1. 传代前准备 （1）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 （2）用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 （3）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 （4）点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 （5）准备好将要使用的消毒后的空培养瓶。
（6）取出预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。（7）从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。 （8）打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。 2. 胰蛋白酶消化 （1）加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。 （2）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 （3）吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。 3. 吹打分散细胞 （1）吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 （2）吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。 （3）平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。 （4）弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 4. 分装稀释细胞 （1）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。 （2）分装：将细胞悬液吸出分装至2～3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 （3）继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。 5. 悬浮型细胞的传代 （1）吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000 rpm 5 分钟。
细胞生物学课后练习及参考答案
细胞生物学课后练习参考答案 作业一 ●一切活细胞都从一个共同的祖先细胞进化而来，证据是什么想像地球上生命进化的很早时期。可否假设那个原始的祖先细胞是所形成的第一个仅有的细胞 1、关于一个共同祖先的假说有许多方面的证据。对活细胞的分析显示出其基本组分有着令人惊异的相似程度，例如，各种细胞的许多新陈代谢途径是保守的，在一切活细胞中组成核酸与蛋白质的化合物是一样的。同样，在原核与真核细胞中发现的一些重要蛋白质有很相似的精细结构。最重要的过程仅被“发明”了一次，然后在进化中加以精细调整去配合特化细胞的特定需要。●人脑质量约1kg并约含1011个细胞。试计算一个脑细胞的平均大小(虽然我们知道它们的大小变化很大)，假定每个细胞完全充满着水(1cm3的水的质量为1g)。如果脑细胞是简单的正方体，那么这个平均大小的脑细胞每边长度为多少 2、一个典型脑细胞重10-8g (1000g/1011)。因为1g水体积为1 cm3，一个细胞的体积为10-14m3。开立方得每个细胞边长2.1 × 10-5m即21 μm。 ●假定有一个边长为100μm，近似立方体的细胞 (1)计算它的表面积/体积比； (2)假设一个细胞的表面积/体积比至少为3才能生存。那么将边长为100μm，总体积为1 000 000μm3的细胞能在分割成125个细胞后生存吗 3、(1) 如图1所示，该细胞的表面积(SA)为每一面的面积(长×宽)乘以细胞的面数，即SA=100 μm ×100 μm ×6 = 60 000 μm2。细胞的体积是长×宽×高，即(100 μm)3=1 000 000 μm3因而SA/体积的比率=SA/体积=60 000μm/ 1 000 000μm= 0. 06 μm-1。 (2) 分割后的细胞将不能存活。125个立方体细胞应有表面积300 000μm2, SA/体积的比率为0.3。如果要使总表面积/体积达到3，可以假设将立方体边长分割成n份，每个小方块的表面积为SA l，总面积为SA t则有： 分割后的小方块表面积为SA l = 6 × (100/n) 2(1) 总面积为SA t = 6 × (100/n) 2 × n3(2) 根据细胞存活要求SA t/V = 3 (3) 即： 6 × (100/n) 2 × n3 / 1003 = 3 (4) 由(4)可知n=50，即细胞若要存活必须将其分割成125000个小方块。 ●构成细胞最基本的要素是________、________ 和完整的代谢系统。 4、基因组，细胞质膜和完整的代谢系统 图1 边长为100μm的立方体与分割成125块后的立方体
细胞冻存和复苏标准操作规程(SOP)
细胞冻存和复苏标准操作规程(SOP) 背景知识： 细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特*都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。 原理： 细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透*，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。 主体内容（操作步骤）： 一、材料 （一）仪器 1. 净化工作台 2. 离心机 3. 恒温水浴箱 4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃） 5. 倒置相差显微镜 6. 培养箱 7. 液氮冰箱 （二）玻璃器皿 1. 吸管（弯头、直头） 2. 培养瓶 3. 玻璃瓶（250ml、100ml） 4. 废液缸 （三）塑料器皿 1. 吸头 2. 枪头 3. 胶塞 4. 移液管（10ml） 5. 15ml离心管 6. 冻存管（1～2ml） （四）其他物品 1. 微量加样枪 2. 红血球计数板 3. 记号笔 4. 医用橡皮膏 5. 移液枪 （五）试剂 1. D-Hanks液
2. 小牛血清 3. 培养液 4. 双抗（青霉素、链霉素） 5. 胰蛋白酶（0.08%） 6. 1NHCl 7. 7.4%NaHCO3 8. DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油 四、操作步骤 （一）细胞冻存 1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液； 2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、； 3. 离心1000rpm，5min； 4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml； 5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml； 6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者； 7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/ min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。（二）细胞复苏 1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。 2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀； 3. 离心，1000rpm，5min； 4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养； 5. 次日更换一次培养液，继续培养。 五、注意事项 1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液； 2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤； 3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。
细胞生物学第五至第八章作业答案
第五章物质的跨膜运输 1 物质跨膜运输有哪三种途径？ATP驱动泵可分哪些类型？ 答：物质跨膜运输有简单扩散、被动运输和主动运输三种途径。ATP驱动泵可分P型泵、V型质子泵和F型质子泵以及ABC 超家族，其中P型泵包括Na+—K+泵、Ca+泵和P型H+泵。 各种ATP驱动泵的比较： 2.简述钠钾泵的结构特点及其转运机制。 答：Na+—K+泵位于动物细胞的质膜上，由2个α和2个β亚基组成四聚体。Na+—K+泵的转运机制总结如下：在细胞内侧α亚基与Na+相结合促进ATP水解，α亚基上的一个天冬氨酸残基磷酸化引起α亚基构象发生变化，将Na+泵出细胞，同时细胞外的K+与α亚基的另一位点结合，使其失去磷酸化，α亚基的构象再次发生变化，将K+泵入细
胞，完成整个循环。 3、简述葡萄糖载体蛋白的结构特点及其转运机制。 答：葡萄糖载体蛋白，简称为GLUT，是一个蛋白质家族，包括十多种葡糖糖转运蛋白，他们具有高度同源的氨基酸序列，都含有12次跨膜的α螺旋。GLUT中多肽跨膜部分主要由疏水性氨基酸残基组成，但有些α螺旋带有Ser、Thr、Asp和Glu残基，他们的侧链可以同葡萄糖羟基形成氢键。葡萄糖载体蛋白的转运机制为：氨基酸残基为形成载体蛋白内部朝内和朝外的葡萄糖结合位点，从而通过构象改变完成葡萄糖的协助扩散。转运方向取决于葡萄糖的浓度梯度，从高浓度向低浓度顺梯度转运。 4、举例说明协同运输的机制。 答：协同运输是一类靠间接提供能量完成的主动运输方式。物质跨膜运动所需要的能量来自膜两侧离子的电化学浓度梯度，而维持这种电化学势的是钠钾泵或质子泵。根据物质运输方向与离子沿浓度梯度的转移方向，协同运输又可分为：同向协同与反向协同。 ①同向协同指物质运输方向与离子转移方向相同。如人体及动物体小肠细胞对葡萄糖的吸收就是伴随着Na+的进入，细胞内的Na+离子又被钠钾泵泵出细胞外，细胞内始终保持较低的钠离子浓度，形成电化学梯度。 ②反向协同物质跨膜运动的方向与离子转移的方向相反，如动物细胞常通过Na+/H+反向协同运输的方式来转运H+以调节细胞内的PH值，即Na+的进入胞内伴随者H+的排出。选做：5、举例说明受体介导的内吞作用。 答：受体介导内吞作用大致分为四个基本过程∶①配体与膜受体结合形成一个小窝；②小窝逐渐向内凹陷，然后同质膜脱离形成一个被膜小泡；③被膜小泡的外被很快解聚，形成无被小泡，即初级内体；④初级内体与溶酶体融合，吞噬的物质被溶酶体的酶水解。具有两个特点，即：①配体与受体的结合是特异的，具有选择性；②要形成特殊包被的内吞泡。 例如LDL受体蛋白是一个单链的糖蛋白，为单次跨膜蛋白。LDL受体蛋白合成后被运输到细胞质膜，即使没有相应配体的存在，LDL受体蛋白也会在细胞质膜集中浓缩并形成被膜小窝，当血液中有LDL颗粒，可立即与LDL的apoB-100结合形成LDL-受体复合物。一旦LDL与受体结合，就会形成被膜小泡被细胞吞入，接着是网格蛋白解聚，受体回到质膜再利用，而LDL被传送给溶酶体，在溶酶体中蛋白质被降解，胆固醇被释放出来用于质膜的装配，或进入其他代谢途径。 名词：
T细胞培养标准操作规程
百利药业生物药研发部 标准操作规程 题目：293T细胞传代培养操作规程 编号：SOP-M-e-003- 制定者：（签名）日期：年月日批准者：（签名）日期：年月日生效日期：年月日
题目：293T细胞培养操作规程 1 目的 293T细胞是常用于包装和扩增病毒载体的工具细胞，因此做好293T细胞的培养，为保证相关实验的正常进行提供必要条件。 2 适用范围本部门293T细胞培养 3 操作方法 将移液器和移液枪、15ml离心管、离心管架、75cm2新的细胞培养瓶放于生物安全柜中，按照生物安全柜的标准操作规程，将生物安全柜的紫外开启半小时。 将含10%胎牛血清和100U/ml双抗的DMEM及PBS放于37℃水浴锅中预热。 培养箱中取出，先用75% 3.2.1将已长到80%-90%的293T细胞培养瓶从37℃，5%的CO 2 的酒精喷洒于瓶表面，将细胞培养瓶旋转放于生物安全柜中，用无菌的移液管吸净其中的培养基，加5ml的预热的PBS洗涤一次，吸净PBS。 3.2.2将含%tyption用PBS稀释两陪到五倍，向该75cm2的细胞瓶中加入3ml稀释好的%tyption，让其充分平铺于细胞表面。盖好瓶盖，将细胞瓶放在显微镜下观察，直到细胞变圆，加含10%胎牛血清的DMEM终止反应，用移液管轻轻将瓶上的细胞吹下，将细胞液移到15ml无菌的离心管中，1000rpm离心3分钟。 3.2.3将离心上清吸弃掉，用手指轻轻拍打离心管底将底部细胞分散开，再加3mlDMEM 培养基将分散的细胞重悬稀释开，取一定量的细胞液进行n倍稀释后计数，按照细胞计数标准操作规程进行。 3.2.4计数好之后细胞传代密度按照2~5×104个细胞/cm2进行传代培养，每个75cm2的 培养箱中培养。 培养瓶中加10mlDMEM培养基，放于37℃，5%的CO 2 3.2.5 24小时后观察细胞状态，待细胞长到80%-90%时进行下一次传代培养。
细胞生物学作业讲解
细胞生物学作业 姓名：学号：班级：学院：一、名词解释 细胞生物学的概念: 细胞外被（糖萼）： 易化扩散： ATP驱动泵： 协同运输： 配体门控通道： 电压门孔通道：
连续分泌： 受调分泌： 小泡运输： 受体介导的胞吞：分子伴侣： 信号肽： 蛋白分选： 膜流：
细胞呼吸： 呼吸链： 氧化磷酸化偶联： 细胞骨架： 核型： 核型分析： 染色体显带技术：踏车运动： 端粒：
二、填空 1、生物界的细胞分为三大类型：（如支原体、、、、 及蓝藻等），古核细胞和（包括、、和人类）。 是最小最简单的细胞；是原核细胞的典型代表；多生活在极端的环境。 2、在生物界中，是唯一的非细胞形态的生命体，它是不“完全”的生命体，是彻底的寄生物。 3、生物小分子主要包括，和；而、、 和是细胞中4种主要的有机小分子，它们是组成生物大分子的；生物大分子主要包括，和三大类。 4、膜脂包括，和三类；其中糖脂位于细胞膜的 面。 5、细胞膜蛋白根据与脂双层结合的方式不同，分为，和 三种基本类型；在膜蛋白中有些是，转运特定的分子或离子进出细胞；有些膜蛋白是结合于质膜上的，催化相关的生化反应进行；有些膜蛋白起，连接相邻细胞或细胞外基质成分；有些膜蛋白作为，接受细胞周期环境中的各种化学信号，并转导至细胞内引起相应的反应。 6、膜的生物学特性包括和，其中决定膜功能的方向性，而 是膜功能活动的保证；膜的不对称性包括， 和。 7、脂双分子层中不饱和脂肪酸的含量越，膜的流动性越；脂肪酸链越短，膜脂的流动性越；胆固醇对膜的流动性具有；卵磷脂与鞘脂的比值越大，膜的流动性越，脂双层中嵌入的蛋白质越多，膜的流动性越。 8、模型较好地解释了生物膜的功能特点，为普遍接受的膜结构模型。 9、小分子物质和离子的穿膜运输包括，， 和；膜运输蛋白包括和两类； 介导水的快速转运。 10、小分子物质和离子的主动运输，根据利用能量的方式不同，可分为（ATP 直接供能）和（ATP间接供能）。
实验五 细胞的传代培养
实验5 细胞的传代培养 一、实验目的 熟练掌握动物细胞的传代培养法。 二、实验原理 哺乳动物细胞的传代培养是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶，细胞才能继续生长,这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。 三、仪器、材料与试剂 1仪器 CO2培养箱，倒置显微镜，超净台 2材料 培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75%酒精棉球，酒精灯，细胞。 3试剂 完全培养基（RPMLl640或DMEM），0.25%胰蛋白酶，D-Hanks液。 四、实验步骤 1.入无菌室之前用肥皂洗手，用75%酒精擦拭消毒双手。 2.倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。 3.超净台台面应整洁，用75%酒精溶液擦净。 4.打开超净台的紫外灯照射台面20min左右，关闭超净台的紫外灯，打开抽风机清洁空气。 5.点燃酒精灯,取出无菌试管，刻度吸管；安上橡皮头；插在无菌试管内。 6.打开细胞培养瓶，过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。 7.倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2-3mL Hanks液洗去残留的旧培养基，或用少量胰酶涮洗一下。 8.加入胰酶消化液，盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶，然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液。
9.加入少量的新鲜培养基，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基（7-10mL/大瓶，3-5mL/小瓶）制成细胞悬液，分装到新培养瓶中。盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。 10.对悬浮培养细胞，步骤7-9不做。可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清，加入新鲜培养基，然后分装到各瓶中。 五、注意事项 1.传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。培养用液应严格分开。 2.每天观察细胞形态，掌握好细胞是否健康的标准：健康细胞的形态饱满，折光性好，生长致密时即可传代。 3.如发现细胞有污染迹象，应立即采取措施，一般应弃置污染的细胞，如果必须挽救，可加含有抗生素的BSS或培养基反复清洗，随后培养基中加入较大量的抗菌素，并经常更换培养基等。 六、实验报告 1.试述传代培养的步骤和注意事项，并指出哪些是关键步骤？ 2.细胞传代培养的目的是什么？
细胞传代标准操作规程版
细胞传代培养SOP（消化法） 具体步骤如下： 1. 传代前准备： 1.1预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37C水浴锅内预热。 1.2 用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 1.3 正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 1.4 点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 1.5 准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8 分钟再次消毒。 1.6 取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 1.7 从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。 1.8 打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。 2. 胰蛋白酶-EDTA消化： 2.1加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶-EDTA液）,注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37T < 2.2 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 2.3 吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。 3. 吹打分散细胞： 3.1 吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 3.2吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。 3.3 平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8 分钟。 3.4弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 4. 分装稀释细胞： 4.1 分装：将细胞悬液吸出分装至2-3 个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 4.1 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5X 105/ml。最后要做好标记。 5. 继续培养： 用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO培养箱中继续培养。传代细胞 2 小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时
组织细胞培养技术课程教学大纲
《组织细胞培养技术》课程教学大纲 课程编码：26990214 课程名称：组织细胞培养技术 英文名称：Cell and tissue culture technology 开课学期：第二学期 授课对象：统招硕士 开课院系：基础医学院 开课教研室：病理学与法医学教研室 学时：40 （其中理论学时：20 实验学时：20 ） 学分：0.5 课程类型：公共选修课（公共必修课/选修课/专业课） 选用教材：自编教材《组织细胞培养技术》 主要参考书：⑴鄂征主编. 组织培养和分子细胞学技术.北京：北京出版社，1994。⑵施新猷主编.实验动物学. 北京：人民军医出版社，2000。 大纲编写人员：张宏颖副教授 一、课程目的与任务 组织细胞培养技术是研究组织和细胞的技术方法，被培养的组织和细胞也是实验研究的对象。本课程是医学临床与基础专业硕士研究生的公共选修课程之一，在医学各专业高级人才培养中具有重要地位。本课程系统介绍了组织和细胞培养技术有关的概念、基本原理、操作程序和关键技术，及其在医学研究和临床实践中的应用，该领域的研究历史和最新发展动态；转基因动物技术的概念、研究进展、技术方法、建立方法、应用及前景展望。旨在提升医学专业硕士研究生的知识结构，掌握现代生物技术中的基本实验技能，培养学生开拓创新的能力，适应未来学科发展对人才的需求。 二、教学基本要求 本课程系统地论述了组织细胞培养技术的理论和方法，简要介绍了转基因动物技术及应用。要求学生全面系统地掌握组织细胞培养的操作过程，了解各种操作的基本原理；有判定细胞生长好坏和是否发生污染的能力；熟悉体外培养细胞的生存条件、细胞的生物学性状和与此有关的基本理论知识，了解国内外细胞培养的最新动态和研究进展，了解转基因动物技术的概念、研究进展、技术方法、建立方法、应用，并能自行根据需要设计实验，运用所学技术解决科研中的实际问题，提高学生综合分析问题，系统利用专业知识的综合素质。 三、各章节内容及学时分配 第一章组织培养技术的基本理论知识（4.5学时） 目的与要求 1、掌握组织培养基本概念；了解对组织培养的评价；熟悉对组织培养工作者的要求和工作方法。 2、了解体内外细胞的差异与分化；掌握培养细胞形态分类及培养细胞的大体形态；熟悉组织培养 细胞的生长和增殖过程。 3、熟悉培养细胞生存环境和条件。
细胞生物学作业(答案)
08生教1班细胞生物学课外作业 第一章绪论 1.名词解析：细胞生物学、细胞学说 细胞生物学：是一门从显微、亚显微、分子水平3个层次以及细胞间的相互作用关系，研究细胞生命活动基本规律的学科。 **细胞学说：1838年，德国植物学家施莱登发表了《植物发生论》，指出细胞是构成植物的基本单位。1839年，德国动物学家施旺发表了《关于动植物的结构和生长的一致性的显微研究》，指出，动植物都是细胞的聚合物。两人共同提出：一切植物、动物都是由细胞组成的，细胞是一切动植物的基本单位，这就是著名的“细胞学说”。 **2. 如何认识细胞学说的重要意义以及当今细胞生物学发展的主要趋势？ 细胞学说的主要内容： （1）认为细胞是有机体，一切动植物都是由细胞发育而来，并由细胞和细胞产物所构成；（2）每个细胞作为一个相对独立的单位，既有它“自己的”生命，又对与其他细胞共同组成的整体的生命有所助益；（3）新的细胞可以通过老的细胞繁殖而产生。 当今细胞生物学发展的主要趋势： （1）细胞生物学的形成和发展与物理化学相关仪器、技术的发明与改进密不可分，因此与最先进、最前沿的仪器和技术相结合进行细胞生物学研究是其发展的一个趋势； （2）无论是对细胞结构与功能的深入研究，还是对细胞重大生命活动规律的探索，都需要用分子生物学的新概念与新方法，在分子水平上进行研究，因此细胞生物学与分子生物学相互渗透与总的交融是总的发展趋势之一。 第二章细胞基本知识概要 1.名词解析：原核生物、真核生物、荚膜、病毒 **原核生物：没有典型的细胞核，由原核细胞构成的生物称为原核生物。 **真核生物：由真核细胞构成的生物称为真核生物。其细胞含有由膜围成的细胞核，含有核糖体并有由质膜包裹的许多细胞器。 荚膜：为细菌的特殊结构之一，是包绕在某些细菌细胞壁外的一层透明胶状黏液层，与细菌的致病性和细菌的鉴别有关。 病毒：是指能在活细胞中繁殖的、非细胞的、具有传染性的核酸-蛋白质复合体。 2.为什么细胞是生命活动的基本单位？细胞在结构体系上又有哪些共性？ 细胞是生命活动的基本单位： ①一切有机体都由细胞构成，细胞是构成有机体的基本单位。 ②细胞具有独立的、有序的自控代谢体系，细胞是代谢与功能的基本单位。 ③细胞是有机体生长和发育的基础。有机体的生长与发育是依靠细胞增殖、分化与凋 亡来实现的。 ④细胞是遗传的基本单位，细胞具有遗传的全能性。 **构成各种生物有机体的细胞种类繁多，结构与功能各异，但它们具有一些基本共性：
原代细胞培养和传代培养的方法及其
初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒 初代消化培养法 1. 准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 （500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。 7. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。 8. 培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。
无菌检测标准操作规程(培养法)
起草人：起草日期： 审核人：审核日期： 批准人：批准日期： 武汉仝干生物科技有限公司 Wuhan Togo Biotechnology Co.,Ltd
1、目的 建立无菌检测的基本操作，为无菌检测人员提供正确的操作规程。通过无菌检验后，确保产品能够达到无菌的要求。 2、适用范围 适用于我公司进行细胞质量检验的技术人员。 3、内容 3.1 简述：无菌检测系用于检查细胞是否无菌的一种方法。检查项目包括需氧菌、厌氧菌及真菌检查。若供试品符合该项检查方法的有关规定，仅表明在该检验条件下未发现微生物污染。 3.2 环境要求：该项检查应在环境洁净度万级背景下的局部百级的单向流区域内或隔离系统中进行。其过程必须严格遵守无菌操作，日常检验需对试验环境进行监控。 3.3人员要求：无菌检测人员应具备微生物及检验专业知识，并经过无菌检验培训。 4、无菌检验前的准备 4.1器具灭菌、消毒 试验过程中与供试品接触的所有器具必须采用可靠方法灭菌，可置高压灭菌锅内121℃蒸汽灭菌30分钟后使用（根据灭菌效果验证决定灭菌参数）。所有的灭菌物品不应超过2周即用毕，否则应重新灭菌。凡检验中使用的器材无法灭菌处理的，使用前必须经消毒处理，如无菌检验室的电子天平，工作台面等，可采用消毒剂浸泡或擦拭。 器具的灭菌、消毒后必须做好标识，标明灭菌、消毒时间和使用有效期。 4.2人员、物料进入无菌检验室
开启紫外灯或臭氧发生器进行空间灭菌处理，消毒时间不得少于30分钟。人员进入无菌检验室需在一更区脱去一般区工作鞋，换无菌检验室工作鞋，并在二更区穿戴无菌服、口罩和手套，口罩掩住口鼻，帽子包裹所有头发。 进入无菌检验室的所有培养基、供试品等需将外包装在传递窗拆除后，查看所有进入无菌检验室的器具上的灭菌、消毒标识，是否在有效期内，符合要求的于传递窗进行表面紫外消毒，传入无菌检验室。 5、无菌检验室操作要求 1）人员进入后，首先进一步消毒擦拭工作台面。 2）全过程必须严格执行无菌操作，防止微生物污染。 3）使用玻璃器皿应轻取轻放，避免破损，以防培养物扩散。 4）所有操作均应在近火焰区进行，且不得有大幅度或快速动作，以免搅动空气中的尘埃微粒。 5）使用金属接种器具时，用前、用后均需灼烧灭菌。 6）在接种培养物时，动作应轻、准，防止培养物溅出，产生汽溶胶，造成污染。 7）操作过程中所有的带菌物品，用后均应作消毒、灭菌处理。可在检验过程中随用随时放入消毒液缸内浸泡或消毒桶内，或在检验完成后经传递窗传至一般区，立即用压力蒸汽灭菌锅121℃灭菌30分钟。 6、培养基制备 6.1需氧菌、厌氧菌培养基（硫乙醇酸盐流体培养基）的制备 所用试剂： 酪胨（胰酶水解） 15.0g 葡萄糖 5.0g L-胱氨酸 0.5g 硫乙醇酸钠 0.5g （或硫乙醇酸）（0.3ml） 酵母浸出粉 5.0g 氯化钠 2.5g 新配制的0.1%刃天青溶液 1.0ml 琼脂 0.75g 水 1000ml