基因工程技术与应用知识点
基因工程的定义：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作
与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。
基因工程的基本过程：切、接、转、增、检
基因工程理论依据：a) 生物的遗传物质是DNA。b) DNA的双螺旋结构和半保留复制机理。c) 遗传信息的传递方式（中心法则）和三联体密码子系统的建立
遗传工程：指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作，以改良品质或创造新品种。包括细胞工程和基因工程等不同的技术层次。
克隆。指由同个祖先经过无性繁殖方式得到的一群由遗传上同一的DNA分子、细胞或个体组成的特殊生命群体。
限制性核酸内切酶。是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
限制性内切酶由三个基因位点所控制：hsd R---限制性内切酶，hsd M---限制性甲基化酶，hsd S---控制两个系统的表达。Hsd S－识别特定DNA序列，Hsd M－甲基化，Hsd R－限制性内切酶功能。
命名法：例如Haemophilus influenzue）d 株中分离的第三个酶：Hin d III
同裂酶:不同来源的限制酶具有相同的识别位点和切割位点。同尾酶：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶
粘性末端：DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称之。
酶活性单位。在合适的温度和缓冲液中，在50μl反应体系中，1小时内完全切割1微克DNA所需的酶量为1个酶活性单位U。
星活性：指限制性内切酶在非标准条件下，对与识别序列相似的其它序列也进行切割反应，导致出现非特异性的DNA片段的现象。引起星活性原因：若使用buffer不当, 会有star activity，而star activity是指限制酶对所作用的DNA及序列失去专一性, 当酶辨认切割位置的能力降低，导致相似的序列或是错误的辨认序列长度也会作用，而产生错误的结果。
连杆：化学合成的8～12个核苷酸组成的寡核苷酸片段。以中线为轴两边对称，其上有一种或几种限制性核酸内切酶的识别序列，酶切后可产生一定的粘性末端，便于与具有相同粘性末端的另一DNA片段连接。
底物位点优势效应:酶对同一个DNA底
物上的不同酶切位点的切割速率不同
衔接头：化学合成的寡核苷酸，含有一种以上的限制性核酸内切酶识别序列。其一端或两端具有一种或两种内切酶切割产生的黏性末端。
逆转录酶：以mRNA为模板合成其互补DNA。RNA 聚合酶：以DNA为模板合成mRNA，不需引物，但必须有启动子。末端转移酶：不依赖于DNA的DNA聚合酶，来自于小牛胸腺组织，在DNA分子的3端增加一个或多个脱氧核苷酸。多核苷酸激酶：对核酸末端羟基进行磷酸化的酶。
防止载体分子的自身环化作用：使用不同的限制酶切；碱性磷酸酶预先处理质粒载体；DNA片段5’端脱磷酸化作用后连接。；DNA片段末端同聚物加尾后进行连接载体：指能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞，具有自我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。功能：1运送外源基因高效转入受体细胞2为外源基因提供复制能力或整合能力3为外源基因的扩增或表达提供条作为工程载体必备的条件：具有多个单一的限制酶切位点；有复制起点，在受体细胞中能自我复制，或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制；具有筛选转化子的选择性标记基因；安全，不含对受体细胞有害的基因，不会任意转入受体细胞以外的其它生物细胞中；分子量小，拷贝数多；携带外源基因的幅度宽。
克隆载体：用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。
表达载体。指专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的载体，可将重组体DNA导入适合的受体细胞，使所载的目的基因能够复制、转录和翻译。
穿梭载体：能在两种不同的生物体内复制的载体。主要用于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移
质粒：指独立存在于宿主细胞染色体外、能够自我复制的DNA分子。
严谨型质粒:拷贝数为1至几个的质粒。
松弛型质粒:拷贝数多于10个的质粒。
氯霉素扩增：用氯霉素抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制时，带有pMB1或ColEI复制子的质粒扔会利用丰富的原料大量复制的的现象。
质粒不亲和性：指在无选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒不能在同一个寄主细胞中稳定共存的现象。
接合质粒。指质粒所携带的基因的功能是使细胞彼此有效地接触，以便将质粒
DNA从供体细胞转移至受体细胞的质粒。
质粒有哪些性质：自主复制性、可扩增性、不亲和性、转移和迁移、重组性。
cos位点：指在连接酶的作用下，连接黏性末端结合形成的双链DNA区段。
柯斯质粒载体：是一类人工构建的含有DNA cos 位点、噬菌体包装有关的DNA短序列、质粒DNA 复制起点、抗生素标记基因等元件的特殊质粒载体。在宿主细胞中可以作为正常噬菌体进行复制，但不表达噬菌体的任何功能。
人工染色体：指人工构建的含有天然染色体基本功能单位的载体系统。主要有酵母人工染色体（YAC，在大规模的测序中例如人类基因组计划是非常有用的还有用于高等生物构建基因组文库，缺点是：1存在嵌合现象，嵌合体比例比较高，2 YAC 克隆的稳定性差, 插入片段存在重排和丢失现象，3插入片段的分离和纯化困难，不容易与酵母自身染色体相分离。）、细菌人工染色体(BAC)、源于噬菌体P1的人工染色体(PAC)，它们的特点是载体的容载能力扩大,
人工染色体具备三个元件：复制起始区/自主复制序列，参与染色体DNA复制起始结构的形成；着丝粒，负责染色体向子细胞传递;端粒, 对染色体DNA两个末端起封口和保护作用。
λ-DNA作为载体的优点：1) λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效感染大肠杆菌；2) λ-DNA作为载体，其装载外源DNA的能力为25kb，远远大于质粒的装载量；3) 重组λ-DNA的筛选较为方便, 可进行正向筛选和杂交筛选；4) 重组λ-DNA分子的提取比质粒容易
PCR反应体系的成份：Taq酶、模板DNA
、引物、dNTP、PCR 缓冲液
PCR反应的步骤：①DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。②退火：（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA 模板结合，形成局部双链。③延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。探针：具有一定序列的核苷酸片段，能与互补的核酸序列复性杂交，并且能通过适当标记进行检测。
目的基因。是指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定基因或DNA片段。
基因文库：是某种特定的生物所含有的能够包含所有基因的足够数目的克隆的集合
cDNA文库。以mRNA为模板，经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，贮存在一种受体菌群体中，这样的群体称为cDNA文库。构建步骤：分离纯化总RNA及mRNA；?cDNA第一链的合成?双链cDNA合成?与载体重组、转化
基因组文库：某种生物的基因组的全部
遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体中，这个群体即为这种生物的基因组文库。
探针杂交原理。任意两条单链核酸分子都有相互形成碱基对的趋势。但形成的大多数分子对由于只有少数链间氢键形成，杂交结构并不稳定。如果多聚核苷酸链是互补的，碱基对的大量形成使双链分子稳定。
原位杂交技术：基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。
cDNA文库的构建步骤：分离纯化总RNA及mRNA（P104-110）、cDNA第一链的合成、双链cDNA合成、与载体重组、转化
从基因文库中获取目的基因的方法：PCR法、
化学合成法、
分离目的基因的方法和原理：1从生物基因组群体中分离目的基因（原核生物基因组较小,基因容易定位,用限制性内切酶将基因组切成若干段后,用带有标记的核酸探针,从中选出目的基因.真核生物一般通过基因组文库的方法获得目的基因.）2人工合成目的基因DNA片段（人工合成目的基因DNA 片段有化学合成和酶促合成法两条途径.一般是采用DNA合成仪来合成长度不是很大的DNA片段.）3 PCR反应合成DNA（PCR 是以DNA变性、复制的某些特性为原理设计）
受体细胞选择的原则；?外源DNA分子能稳定存在，限制酶缺陷型；?重组基因缺陷型；
?易于转化/ 转导；?易筛选?遗传稳定性高，易于扩大培养；?安全性高；?内源蛋白酶基因缺失或缺陷；?遗传密码无明显偏好性；?具有较好的转译加工机制；?较高的理论和实践应用价值。
转化：以质粒为载体的重组DNA分子引入受体细胞的过程。转染：以噬菌体或病毒为载体的重组DNA分子引入受体细胞的过程。
转导：是指通过λ噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程。
感受态细胞：指处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞。
转化率：是指DNA分子转化受体菌获得转化子的效率
几种常见的转化方法：1化学转化法：?原理：0oC、低浓度（50～100 mM）CaCl2，Ca2+改变细胞膜的磷脂层结构，提高膜的通透性，而且增强进入细胞的DNA分子抗DNase的能力。特点：操作简便，不需特殊仪器，一般实验室均可进行。2电激法?原理：利用高压电脉冲作用，在细菌细胞膜
上进行电穿孔，形成可逆的瞬间通道，促进外源DNA的有效吸收。?特点：感受态细胞制备简单；用途广泛，但需特殊仪器电激仪。原生质体转化、噬菌体转化。
正向选择?重组子在培养基上能生长，而非重组子不能生长。
根据插入序列的表型特征进行筛选：1限制性内切酶法：可以通过限制性酶酶切重组质粒，电泳分析插入片段长度是否正确。2 PCR法：如果已知插入DNA片段的某些序列，就可以通过PCR的方法进行鉴定。3菌落原位杂交法：直接把菌落或噬菌斑印迹转移到杂交膜上，不必进行核酸分离纯化、限制酶酶切及凝胶电泳分离等操作，而是经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与杂交膜结合，再与特异性标记探针杂交，筛选出含有插入序列的菌落或噬菌斑。4基因产物检测法：如果使用的是表达载体，那么就可以通过鉴定基因产物的方法鉴定正确的克隆。
α-互补：lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体lacZ’可以与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补。
根据载体的选择标记的初步筛选：①抗药性选择标记插入失活/插入表达筛选法（正向选择?重组子在培养基上能生长，而非重组子不能生长。）②β-半乳糖苷酶显色反应筛选法（α－互补筛选）（α-互补概念）③利用报告基因筛选植物转化细胞（通过不同报告基因产生不同的酶而采用不同的手段筛选）④利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞
外源基因表达系统：指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物。
大肠杆菌基因表达载体的重要组成元件：?复制起始区(ori)?选择标记?正确插入的多克隆位点(控制有效转录、翻译调控)?启动子：Lac和Tac；PL和PR；T7?核糖体结合位点
?翻译起始点AUG等
真核基因在大肠杆菌中表达遇到的问题和对策：细菌不能识别真核基因的表达信号。解决的方法是将外源基因插入载体中，使其处于一系列的E. coli表达信号的控制之下。这样基因可以转录和表达。克隆载体提供了表达的信号，所以可以用来生产重组蛋白，被称为表达载体。或者：1）外源基因可能含有内元。E. coli缺乏切除内元的机制。2）外源基因可能含有在E. coli作为终
止子的序列。3）基因的密码子可能不适合于E. coli中翻译。解决策略：1）如果克隆的基因含有内元，可以使用mRNA。2）定点突变的方法改变可能的终止序列。3用E. coli偏爱的密码子。
融合蛋白：将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，没有改变两个基因的阅读框，以这种形式表达的蛋白，称之。
分泌型蛋白：外源基因的表达产物N端连有一信号肽序列，通过运输和分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中。
包涵体：一定条件下，外源基因表达产物在大肠杆菌中积累并致密地聚集在一起形成无膜的裸露结构，称为包涵体。
基因表达产物的检测方法：?报告基因的酶法检测?酶联免疫吸附法?Western印迹法?表达产物生物学活性检测
植物遗传转化的方法：1直接基因转移技术（基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法）
2生物介导的转化方法(农杆菌介导和病毒介导两种转化方法)，常用于双子叶植物。
Ti质粒的结构
植物基因工程的应用：一. 利用植物转基因技术研究基因的表达与调控（可以利用报告基因研究环境因素的变化对基因表达的影响；Ti质粒上的T-DNA能随机整合入植物染色体中，因而已广泛应用于植物基因的定性及分离上。）二. 利用转基因植物生产外源蛋白质（利用转基因植物作为生物反应器，生产异源蛋白质及其它高分子化合物）三. 改良植物品种（可以通过转基因来控制植物果实的成熟时间，也可以培育抗虫害、抗病、坑除草剂和抗逆境的植物，还可以改变花型和花色及改良作物品质）转基因安全性：标记基因是否有害；环境危害；
不同的酶对离子强度要求不同，所以当DNA同時以两种限制酶处理时，选择可使两种酶活性反应均可达75﹪以上的restriction buffer，若找不到适当的buffer则先加低盐的buffer使其中一酶作用后，再加入高盐buffer使另一酶作用，若无法以盐的高低分別加入不同的buffer，则先加入一种buffer作用后，加95﹪alcohol沉淀DNA，再加另一种buffer 作用。
载体的类型：?应用范围：克隆载体、表达载体。?应用对象：原核载体、真核载体（酵母、植物和动物）、穿梭载体。?构建来源：质粒载体、噬菌体载体、单链DNA噬菌体载体、粘粒载体、人工染色体载体。