细胞培养的注意事项
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每天对待细胞比孝敬爹妈还用心，那真是捧在手里怕碎了，含在嘴里怕化了，看在眼里怕丢了，培养细胞时有哪些惨痛经验教训可以分享呢?
早走早脱身，从此专注黑生物
1. 严格无菌操作，多喷喷酒精，要是对灭菌的东西不放心，自己包自己送自己烘干。
2. 不要和别人共用试剂耗材，自己准备一套。
3. 有可能的话在拿到新细胞的时候做好支原体衣原体检测。
4. 水浴锅很脏，生化培养箱要是得手动加湿的话盘里的水也会很脏，勤换(灭菌水加进去)。
5. 晚上离开的时候最好给细胞房照紫外，超净台是用完就开。
6. 最好的是同一时间就你一个人在用细胞房在养细胞。
非科班出身经验分享
1. 别怕浪费。枪头什么的只要有可能污染就换，如果用酒精灯就什么都稍微烤一下，别直接放到火上，离一段距离。
2. 动作要既轻柔又有力。动作太重会有一堆一堆的气泡，动作太轻就吹不下来... 刚开始的时候吹细胞太痛苦了，稍微一下就起泡。后来就是吹的时候枪里的培养基不要一次全都压出来，留一点，枪的最头部尽量深的在液面以下。
3. 离开过操作台的东西再进操作台之前一定要用酒精喷一遍，包括一切实验耗材、仪器、以及你带着手套的手。
4. 实验结束后对实验台的消毒。紫外什么的，用前用后都照个30 分钟。
5. 身体的各个部分尽量的少接触不需要接触的地方的地方。比如实验台，又比如培养箱内部。
6. 细胞的密度根据细胞的性质、传代的时间以及自己的心情来定。培养基的话最多最多不要超过2 天就要换一次。细胞可以不传代，但是培养基是一定要换的。
大概就是，不该碰的地方不碰，有影响的地方少碰; 该使劲的时候绝对不含糊，不该使劲的地方一定忍住。如果是比较简陋的操作台就一定要摆个酒精灯，所有操作紧密围绕在酒精灯周围进行。如果是高级台子就多用酒精喷喷。感觉生物的实验，心疼钱就还是不要做了。
最后一点点绝对非科班的经验。癌细胞真是坚挺。有一次实在是不想传了，放了 5 天
吧，感觉都长了几层出来，培养基都黄了。抱着试一试的心情传了一次，又坚强的活过来了。当然，状态肯定也差的很了。
换种心情，好好生活!
养了三年细胞，各种肿瘤细胞，说一点自己的看法：
1. 培养细胞前，可以看看细胞特点说明书，包括细胞正常生长的状态图、传代、培养基的类型等。
2. 不同细胞生长周期不同，有的生长很快，比如说MDA-MB-231，传代的时候取离心悬液的十分之一就已经足够了，有的又是特别慢，等的人心焦，BT474 就是，传代是一分二，复苏起始的时候两周多才能长满，所以就要在培养细胞的过程中多多摸索了。
3. 对于娇弱的细胞，就得细心呵护了，胰酶消化不能过久，吹得时候要轻柔，离心时候也要注意转速和时间，每天都要去看一下细胞，肉眼观察培养基状况、显微镜下观察细胞生长状况。
4. 冻存细胞复苏后第二天最好更换一次培养基。
5. 培养箱隔一段时间彻底用酒精棉擦洗一次。
6. 养细胞最大的教训：不能偷懒!
细胞虐我千百遍，我待细胞如初恋。
1. 不管买的细胞、惠赠的细胞，刚拿到手赶紧做两件事：检测是否有支原体污染; 迅速扩增冻存。
2. 发现有污染迅速处理掉，特别是当你养了很多种细胞时; 细菌污染，真菌污染很容易发现，支原体污染的话，细胞会长的慢，买个支原体检测的kit 定期检测一下。
3. 细胞房日常的值日清洁是必须的，此外还要定期熏蒸。
4. 细胞的传代一定要规律，保持相同的confluency 和传代时间间隔，不要随心所欲或者拖延。
5. 注意个人卫生。
靠内心感动细胞
1. 自己的细胞自己养，血的教训。
2. 在生物安全柜(或者超净台)，枪头，血清管，血清，培养基，瓶子都足够好，并且
细胞房有良好的卫生措施(比如隔离服，手套，口罩，清洁，HEPA 等等) 且不违法操作原则的情况下，你其实很难污染。
3. 上述条件不完备的情况下，就要多注意无菌操作了：比如要用的东西提前拿到台子里照啊(不过这个其实也不大好，因为会挡住紫外线)，使用前SDS+酒精擦台子，进出超净台一定要酒精擦手。
4. 少对细胞说话，多靠内心来感动它们(是的! 心不诚是不可以的!) 至少 1 天看 1 次。
养细胞很容易
养细胞真的不难，最关键几点：
1. 所有的东西使用最好的，如果你用的血清、培养皿、培养基、胰酶什么的都是进口的，真的很难相信你会把细胞养坏。
2. 动作要快，胰酶消化，换液什么，细胞暴露在空气中的时间越少越好。另外，要掌握好胰酶消化时间，所谓的细胞状态差，很多时候是传代的原因。
3. 有时间的话，需要细胞计数，传相应数目的细胞到培养皿中，可以大致清楚细胞的生长曲线，不会临时要处理，手足无措。
4. 要做什么心里要非常清楚，合理安排时间，细胞房的实验穿插进行，可以节省很多时间，也不会耽误别人的实验。
5. 个人的实验器具自己收一套，不要和别人混用，最近换了什么新的东西稍微记一下，试剂一旦怀疑污染，马上丢。
6. 细胞房不能进去太多人，避免相互干扰。
细胞养不好，自挂东南枝
现在一大型药企养细胞做检测，工作量很大，很多地方都没办法非常仔细的做。但是两年下来只出现过一次污染，总结一下心得：
1. 好的洁净室，空调系统跟得上。
2. 好的生物安全柜，硬件跟的上。
3. 瓶子移液器吸头大都是进口，耗材跟的上。除了这些就是自己的操作习惯了。
4. 任何东西不要从敞开的瓶口上面经过。
5. 虽然酒精灯会干扰安全柜气流但是还是需要一盏用来勤烧瓶口。
6. 实验时所用材料的位置摆放要顺手，污染源和已灭菌物品要分开放置。
养细胞就像打仗
细胞饲养涵盖的内容太广了，而且不同种类细胞的饲养难度以及技术要求不同，肿瘤细胞，成纤维细胞，上皮细胞... 甚至各类干细胞... 每一种都有自己的生长要求。如果只是单纯的一般性操作，大同小异，个人觉得练好技术的情况下注意几点就好:
1. 各种无菌，从培养基到操作过程再到培养箱，时刻注意无菌。本人曾经所在的实验室出现过大规模污染并最终导致所有细胞集体毁灭... 教训惨痛。
2. 培养基的配制一定要做好梯度摸索并详细记录，否则细胞死都不知道怎么死的。
3. 尽量提高操作熟练度，减少培养皿在培养箱外的滞留时间，细胞很脆弱，经不起折腾，不像人，热了有空调，冷了能烤火。
4. 把握好培养基更换的时间，不同细胞类型时间不同，早了浪费试剂，晚了可能全军覆没。
5. 经验很重要，养细胞的很多经验你是无法在公开的书籍和资料上找到的。多向实验室前辈学习，他们会让你少走很多弯路，真的。
养细胞就像打仗，知彼知己，百战不殆。只有了解你养的对象，才能把他养好。
细胞就是矫情
养细胞细胞这个东西呢有的时候真说不清。养过一段时间的巨噬细胞，一开始操作各种谨慎小心，随时默念各种无菌原则，培养基什么的都用的进口的，其实国产货真的不差，有钱就是任性! 但细胞还是萎靡不振，两个多星期过后实在懒得管，换液等操作也很随意的草草进行，酒精也懒得喷，结果这货却开始疯长，过了几天居然达到一天要传一次代，而且数量甚至可以一传三，所以说，有的细胞就是矫情。
细胞培养的方法与步骤
细胞培养的方法与步骤 1．开紫外灯前先擦超净台，台内紫外30分钟，室内紫外10分钟。同时将放在4℃内的培养液提前放置到室温。（可放在抽屉中，防止紫外照射） 换液 2．先将培养液打开（开一层烧一层），放置在酒精灯旁。 3．将细胞从培养箱中拿出，进超净台前先要喷酒精。 4．打开培养瓶，烧瓶口，而后弯脖朝后，倒液，注意瓶口不要残留液体，若有残液要用纱布擦净。 5．倒培养液（之前要烧瓶口），注意量（5ml）不要再瓶口有残留液体是烧瓶口，否则碳化的培养液会对细胞的生长有毒害作用。 6．倒一瓶封一瓶，迅速放平，培养瓶口拧紧后再松一下，放入培养箱中。 传代 2．拿出细胞，开口，烧，倒液。 3．（5ml大枪加3ml）用PBS洗2~3遍（洗净血清，放置血清钝化胰酶）。 4．胰酶消化，37℃5分钟（时间可自控）。消化程度是细胞不能滑落，要吹落。500微升胰酶（4×，1%）+1.5mlPBS→工作浓度0.25%（此时要用大枪）。 5．（大枪）加入3mlDMEM完全培养液终止消化，用吸管缓慢吹打壁上的细胞（不要让吸管的嘴端接触到瓶壁） 6．将混合物吸入离心管，加封口膜，离心500g 5分钟（此时洗去胰酶）在此期间PBS 洗培养瓶3遍，PBS一定要吸净，否则加入培养液后会产生沉淀（培养瓶要重复使用，至少100次） 7．倒掉上清，此时动作要轻或用大枪吸，加入3mlDMEM完全培养液重悬细胞，用吸管吹掉（再洗，清除胰酶）。 8．离心完毕，加入3ml新鲜培养液，再次吹打（约50~100下，视细胞情况而定），防止起泡沫，至细胞单个，圆球状为宜。 9．在培养瓶中加入新鲜培养液4ml，将吹打起来的细胞分配至各培养瓶中（量依需要而定）。80微升，100微升都可以。 冻存 8．在冻存管中加入200微升冻存液，在离心管中加入1000微升冻存液，吹打（防止起泡），移入冻存管中，此段时间不宜过久（DMSO对细胞伤害很大）。 9．封口膜封紧冻存管，可多封几层，用胶布缠紧，只缠一层就行，然后写字。 10．放在4℃30分钟。 11．放在冰水混合物中10分钟。 12．-20℃中放置1~2小时（经验值是不超过1.5小时） 13．-70℃中过夜，（最多可存放7~8个月） 14．放入液氮。 注意：传代前一天换液（可换可不换） 冻存前一天换液（必换） 血清灭活: 56℃30分钟水浴。
细胞培养常见问题及其解决
细胞培养常见问题及其解决 1. 如何选用特殊细胞系培养基？ 培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。 2. 何时须更换培养基？ 视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。 3. 可否使用与原先培养条件不同之培养基？ 不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。 4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？ 不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。 5 何谓FBS, FCS, CS, HS ? FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清，FCS 乃错误的使用字眼，请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。 6 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？ 一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时，则应使用5 % CO2 培养细胞。 7.Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank's 平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？ HBS和EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles 液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。 8. 细胞之接种密度为何？
细胞培养方法
细胞株(系)细胞复苏 (1)戴手套，从液氮罐中取出冷冻管。 (2)迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化。 (3) 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。然后在无菌下取出细胞。冻存管用75%酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。 (4)在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。加入的培养液的量依冻存的细胞数量，如果冻存数量为106，则稀释10倍使细胞达到105即可。 注意事项 在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5～0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。 细胞换液 （1）贴壁细胞（包括半贴壁细胞的换液） 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯，将培养基瓶口用酒精棉球擦拭后，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上，瓶口对准酒精灯，且放在距离酒精灯最近的位置，瓶盖置于酒精灯的另一侧。
常规细胞培养方法
常规细胞培养方法（原代培养和传代培养）初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：动物组织块 试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s 液，碘酒 初代消化培养法
1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2.布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。 3.处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中3 0~60分钟。 4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。 5.消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速（500 ~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7.计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7. 4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHC O3调整。 8.培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1.剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静Hanks液，用眼科剪反复剪切1mm 3块为止。 2.摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一2 5ml培养瓶底可摆布20~30块。 3.轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 4.培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，46度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液
细胞培养基的基本知识
培养细胞的完全培养基由基础培养基（如MEM）和添加剂（如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子）组成，培养基的配方一直在改进，其中包括抗生素和抗有丝分裂剂等等。 一、基础培养基 绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而Ham`s F12 也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂（例如核苷酸）。MEM/F12 这两种培养基各取 1/2，形成神经生物学最通用的培养基。Dulbecco`s改良培养基——DMEM，现应用于快速生长的细胞，同MEM含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍。选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情形下培养基都有不足。例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这种培养基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境中时。F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒效应。 在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因为它具有不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。对于神经元的培养常常在基础培养基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸（若培养基中这两种物质缺乏时）。MEM与F12均要用5%的CO2来平衡，DMEM 含更高浓度的NaCO3，要用10%的CO2来平衡，当然也可以在较低CO2浓度下使用。这些基础培养基的组成成分是建立在对不同细胞系生长的研究之上的，但通常在原代培养中使用也能有比较令人满意的结果。 原则上，HEPES作为缓冲剂可用来代替碳酸氢盐，以解除需要高浓度CO2培养环境的限制。实际操作中并非如此简单。显然，溶解的CO2与碳酸氢盐对良好的细胞生长是重要的。Leiboviz`s L15培养基可用来在大气环境中令神经细胞生长，该培养基采用了与众不同的BSS作基础，它含有高浓度的氨基酸来提高缓冲能力，培养基中使用半乳糖作碳源，以阻止培养基中乳酸形成，少量溶解的CO2由丙酮酸代谢产生。这一培养基的优点是明显的，特别是在保持较高CO2有困难时，例如在长时间的显微操作及生理学研究中。L15培养基已用来成功的培养了外周神经元，但尚未在CNS神经元的发育研究中全面检测过。
细胞培养各种培养基简介
DMEM、RIPA1640、F12、L15等细胞培养基的基本知识 培养细胞的完全培养基由基础培养基（如MEM）和添加剂（如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子）组成，培养基的配方一直在改进，其中包括抗生素和抗有丝分裂剂等等。 一、基础培养基 绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而Ham`s F12 也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂（例如核苷酸）。MEM/F12 这两种培养基各取1/2，形成神经生物学最通用的培养基。Dulbecco`s改良培养基——DMEM，现应用于快速生长的细胞，同MEM 含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍。选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情形下培养基都有不足。例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这种培养基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境中时。F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒效应。 在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因为它具有不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。对于神经元的培养常常在基础培养基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸（若培养基中这两种物质缺乏时）。MEM与F12均要用5%的CO2来平衡，DMEM含更高浓度的NaCO3，要用10%的CO2来平衡，当然也可以在较低CO2浓度下使用。这些基础培养基的组成成分是建立在对不同细胞系生长的研究之上的，但通常在原代培养中使用也能有比较令人满意的结果。 原则上，HEPES作为缓冲剂可用来代替碳酸氢盐，以解除需要高浓度CO2培养环境的限制。实际操作中并非如此简单。显然，溶解的CO2与碳酸氢盐对良好的细胞生长是重要的。Leiboviz`s L15培养基可用来在大气环境中令神经细胞生长，该培养基采用了与众不同的BSS作基础，它含有高浓度的氨基酸来提高缓冲能力，培养基中使用半乳糖作碳源，以阻止培养基中乳酸形成，少量溶解的CO2由丙酮酸代谢产生。这一培养基的优点是明显的，特别是在保持较高CO2有困难时，例如在长时间的显微操作及生理学研究中。L15培养基已用来成功的培养了外周神经元，但尚未在CNS神经元的发育研究中全面检测过。 二、血清 细胞在单纯的基础培养基中不能存活，在特殊类型的细胞培养中必须提供某些 痕量营养物质及生长因子才能使细胞得以生长并维持生长状态。基础培养基常常要添加血清，血清终浓度多为5~20%。特殊用途的血清来源须用经验确定，广泛应用的血清种类有马血清与胎牛血清。胎牛血清中富含有丝分裂因子，常选其作增殖细胞用的血清，也用于细胞系和原代培养。而马血清常常用来作有丝分裂后的神经元培养。然而，很多人也将胎牛血清
各类神经元细胞的培养方法
体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能 上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下: 一、鸡胚背根神经节组织块培养 主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。 1、材料和方法 （1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。 （2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。 （3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。 （4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。 （5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。 2、结果 鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。而未加NGF的神经节培养24 h, 未见神经突起生长。 二、新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养 背根神经节（DRG）细胞起源于神经嵴，NGF研究先驱Levi-Montalcini的实验表明，外原性NGF能刺激DRG细胞生长发育并形成广泛的神经网络。在体外，分离培养的神经节在NGF存在的情况下，神经突起的生长在一天之内可长达数
动物细胞培养常用方法
一.细胞增殖周期（cell proliferatinal cycle）概念 细胞周期是描述细胞增殖和分化交替发生变化的概念。而细胞增殖周期主要是从细胞增殖角度赋予细胞活动的概念，两者不应混为一谈。细胞增殖周期是指细胞从一次分裂结束开始生长，到下一次分裂结束所经历的过程。根据细胞增殖周期不同时期的生化特点，划分为四个连续的时期，即G 1 期（DNA合成前期），S 期（DNA合成期），G 2期（DNA合成后期），M期（有丝分裂期）。如以G 1 期为起点， 那么细胞增殖周期的各时期应循着G 1-S-G 2 -M的顺序进行，G 1 、S、G 2 三期合称为 细胞间期，此期完成细胞生长过程。M期完成遗传物质的分配。 因此，细胞增殖周期=间期（G 1期+S期+G 2 期）+分裂期（M期）。 二.培养细胞生命期（life span of culture cells） 很多细胞特别是正常细胞，在体外的生存不是无限的，而是具有一个生命期。索维培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。培养细胞的生命期与细胞的种类、性状和原供体的年龄、健康等情况有关。人胚二倍体成纤维细胞，在不冻存和反复传代条件下，科传30~50代，相当于150~300个细胞增殖周期，能维持1年左右的生存时间，最后衰老凋亡。如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；其他细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞生命的全过程中，大致都经历以下三个阶段：原代培养期、传代期、衰退期。 三.培养细胞一代生存期 培养细胞的生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖的速度
细胞培养常见问题的原因及其解决的办法
细胞培养常见问题的原因及其解决的办法： 问题1培养液pH值变化太快 可能原因 (1)CO2张力不对 (2)培养瓶盖拧得太紧 (3)NaHCO3缓冲系统缓冲力不足 (4)培养液中盐浓度不正确 (5)细菌、酵母或真菌污染 建议解决方法 (1)按培养液中NaHCO3浓度增加或减少培养箱内CO2浓度，2.0g/L到3.7g/L浓度NaHCO3对应CO2浓度为5%到10%。 (2)松开瓶盖1/4圈。 (3)改用不依赖CO2培养液。加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度。 (4)在CO2培养环境中改用基于Earle′s盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks盐配制的培养液。 (5)丢弃培养物，或用抗生素除菌。 问题2：培养液出现沉淀，但pH值不变 可能原因 (1)洗涤剂清洗后残留有磷酸盐，将培养基成分沉淀下来 (2)冰冻保存培养液 建议解决方法 (1)用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后灭菌。 (2)将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。 问题3：培养液出现沉淀，同时pH发生变化 可能原因 细菌或真菌污染 建议解决方法
丢弃培养物，或用抗生素除菌。 问题4：培养细胞不贴壁 可能原因 (1)胰蛋白酶消化过度 (2)支原体污染 (3)培养瓶瓶底不干净 (4)培养液pH值过碱(NaHCO3分解) (5)消化液或培养液配制错误、过期储存、储存不 细胞老化(如传代前细胞已汇合导致失去贴附性) (7)接种细胞起始浓度太低或太高 建议解决方法 (1)缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。 (2)分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。 (3)注意刷洗，或换用一次性塑料培养瓶 (4)使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2(将培养液敞口放入培养箱也可) (5)重新配置消化液或培养液 启用新的保种细胞 (7)调节最佳接种细胞浓度 问题5：悬浮细胞成簇 可能原因 (1)培养液中含钙、镁离子 (2)支原体污染 (3)蛋白酶过度消化使得细胞裂解释 (4)DNA污染 建议解决方法 (1)用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液。 (2)分离培养物，检测支原体。如发现支原体污染，丢弃培养物。
H9c2细胞培养方法
大鼠心肌细胞H9C2 细胞描述： 大鼠心肌细胞H9C2是来源于胚胎期BD1X大鼠心脏组织的亚克隆细胞系，表现很多骨骼肌细胞的特性。当H9c2细胞汇合时，细胞就会融合成多核的肌管并对乙酰胆碱刺激有反应，但该细胞缺少像心肌细胞一样的节律性搏动。此外，多项生化、电生理指标的检测也表明其具有骨骼肌的很多特点。由于来源于心脏，H9C2细胞作为心脏成肌细胞也用于心肌疾病的研究。 大鼠心肌细胞H9C2增殖能力取决于细胞取材、培养技术、培养条件等综合因素。请按照正确的培养方法来解冻、传代，以此保证细胞具备良好的增殖能力，方便您的后继研究顺利进行。 货号规格培养基运输保存 C0048 1×106个/管DMEM+10% FBS 干冰运输液氮保存 质量控制： 本细胞经过了检测，不含有细菌、真菌、病毒（HIV、HBV、HCV）、支原体。 培养条件： 37℃，5% CO2，PH值7.2~7.4，无菌恒温培养。 用途： 本产品只提供给进一步的科研使用，不可应用于治疗等其他方面。 细胞相关操作（注意：细胞操作都需严格按照无菌操作） 收到复苏好的贴壁细胞的处理方法： 1. 先从外包装盒拿出细胞瓶，在细胞瓶表面喷一层酒精，并小心去掉封口膜； 2. 在显微镜下观察细胞状态，并确定是否染菌，如有染菌，请立即拍照，并将细胞丢掉； 3. 将培养瓶置于37°C，5% CO2的无菌培养箱中培养4-6小时； 4. 倒掉多余的培养基，留正常体积的培养基； 5. 重新将培养瓶置于37°C，5% CO2的无菌培养箱中培养过夜； 6. 第二天传代。 收到冻存细胞的处理方法： 1.37°C水浴预热培养基； 2.从液氮中取出细胞迅速放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）； 3.在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，1000rpm离心5min； 4.弃上清，加入5ml培养基重悬细胞后转入T25培养瓶中，轻轻晃匀； 5.置于37°C，5% CO2培养箱中培养(培养瓶盖没有透气孔的话,瓶盖不要拧太紧)； 6.第二天，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养。 细胞传代 1.当细胞融合度达到90%以上时，给细胞传代； 2.37°C水浴预热培养基； 3.在超净台中，弃培养基，加入2-5mlPBS清洗细胞后，再加入1ml胰酶消化细胞； 4.显微镜下观察到细胞变圆，有细胞开始脱离瓶壁时，加入5ml培养基终止消化； 5.用移液器轻轻吹下瓶壁上剩余的细胞，并轻轻吹打将细胞吹散； 6.将细胞移入离心管中，1000rpm离心5min；
细胞培养热点常识
细胞培养热点常识 如何选用特殊细胞系培养基？ 培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM 做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始，各种目的无血清培养最好首选AIM V（12005）培养基（SFM）。 L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？ L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。 GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？ GlutaMAX-I 二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。
GlutaMAX-I二肽非常稳定，即使在121磅灭菌20分钟，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺几乎完全降解。 什么培养基中可以省去加酚红？ 酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。 如何用台盼兰计数活细胞？ 用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000个/毫升，在0.1
细胞培养方法
2007-10-03 | 软琼脂集落形成率实验(软琼脂克隆) 将1.2％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1 的体积比混合制备 0.6％的底层琼脂，6 孔板中每个孔1.4ml 温室凝固，取对数期细胞，胰酶消化后吹散成单个细胞悬液，计数，并调细胞浓度为10000 个/ml，将0.6％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1 的体积比混合，制备0.3％的上层琼脂，每孔加1ml 上层琼脂和100ul 单细胞悬液（约1000cell/well)，混匀，室温凝固。置于37℃，5％CO2 的细胞培养箱中培养2－3 周，计数含50 个细胞以上得克隆，计算细胞集落形成率，SpotII 采集图像。 2007-10-03 | MTT检测细胞增殖及见解 细胞以每孔3000个接种至96孔板，分成不同组，每组3孔，利用含有10％胎牛血清的DMEM培养液培养24 h之后，向培养液中加入一定工作浓度的药物（单体或混合物），继续培养24 h或48h。培养结束，直接向每孔加入5mg/ml的MTT 10μl，孵育2－4小时（应常在显微镜下观察）。去除培养液，每孔加入DMSO 100μl，充分振荡3分钟，立即在酶标仪上测定490nm的吸光度值。 由于这种方法基于琥珀酸脱氢酶的活性，因而加入MTT之后应该在显微镜下观察，药物是否可以改变细胞琥珀酸脱氢酶的活性。若是改变则不可以使用此种方法。
另有根据细胞ATP含量测定细胞增殖的方法，但是都要考虑药物对细 胞ATP是否有影响。 所以测定细胞增殖，最简单，最原始，最麻烦的方法，进行细胞计数我 们感觉还是最好的方法。 细胞培养方法 哺乳动物细胞培养规则： 1，严格按照细胞培养室规则进行哺乳动物细胞，由于细胞为整合生物中心共用，使用紧张，在使用时尽可能提高速度，保证操作规范。 2，使用细胞间之后，主动将安全柜台面和桌面等清理整齐干净。 3，在自己培养细胞出现污染之时，及时通报同一培养箱培养细胞者，并将培养相关细胞的培养液/PBS/胰酶等全部清出细胞培养室，以减轻对细胞培养的影响。 4，实验所用细胞培养原则要求：A，细胞复苏之后两代开始使用；B，保证细胞每次传代前密度不超过90%；C，细胞使用最多12代（约2个月）。 5，最好每天观察细胞生长状态，若有异常及时处理。 6，具体参照https://www.360docs.net/doc/3a7430531.html,中细胞培养要求。 细胞传代方法 1，将长至80-90%细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2，加入0.5—1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。 3，瓶口用瓶盖盖好，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入适当体积的培养液终止消化。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1—3分钟。根据不同细胞而异。 4，用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，尽可能的避免气泡产生，分到另外两到三瓶中，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 5，细胞培养液参照https://www.360docs.net/doc/3a7430531.html,，一般含有10%胎牛或小牛血清。
细胞培养的注意事项
相关疾病: 每天对待细胞比孝敬爹妈还用心,那真就是捧在手里怕碎了,含在嘴里怕化了,瞧在眼里怕丢了,培养细胞时有哪些惨痛经验教训可以分享呢? ?早走早脱身,从此专注黑生物??１。严格无菌操作,多喷喷酒精,要就是对灭菌得东西不放心,自己包自己送自己烘干。 ?２.不要与别人共用试剂耗材,自己准备一套。 ?３、有可能得话在拿到新细胞得时候做好支原体衣原体检测。??4。水浴锅很脏,生化培养箱要就是得手动加湿得话盘里得水也会很脏,勤换(灭菌水加进去)。 5、晚上离开得时候最好给细胞房照紫外,超净台就是用完就开、?? 6、最好得就是同一时间就您一个人在用细胞房在养细胞。? 非科班出身经验分享 1、别怕浪费。枪头什么得只要有可能污染就换,如果用酒精灯就什么都稍微烤一下,别直接放到火上,离一段距离、? 2、动作要既轻柔又有力。动作太重会有一堆一堆得气泡,动作太轻就吹不下来.。、刚开始得时候吹细胞太痛苦了,稍微一下就起泡。后来就就是吹得时候枪里得培养基不要一次全都压出来,留一点,枪得最头部尽量深得在液面以下。??3。离开过操作台得东西再进操作台之前一定要用酒精喷一遍,包括一切实验耗材、仪器、以及您带着手套得手。??４。实验结束后对实验台得消毒、紫外什么得,用前用后都照个3０分钟、? 5。身体得各个部分尽量得少接触不需要接触得地方得地方、比如实验台,又比如培养箱内部。 ?6、细胞得密度根据细胞得性质、传代得时间以及自己得心情来定。培养基得话最多最多不要超过２天就要换一次。细胞可以不传代,但就是培养基就是一定要换得。 大概就就是,不该碰得地方不碰,有影响得地方少碰; 该使劲得时候绝对不含糊,不该使劲得地方一定忍住、如果就是比较简陋得操作台就一定要摆个酒精灯,所有操作紧密围绕在酒精灯周围进行。如果就是高级台子就多用酒精喷喷。感觉生物得实验,心疼钱就还就是不要做了。 最后一点点绝对非科班得经验。癌细胞真就是坚挺。有一次实在就是不想传了,放了5天吧,感觉都长了几层出来,培养基都黄了。抱着试一试得心情传了一次,又坚强得活过来了。当然,状态肯定也差得很了。? 换种心情,好好生活! 养了三年细胞,各种肿瘤细胞,说一点自己得瞧法: ?１。培养细胞前,可以瞧瞧细胞特点说明书,包括细胞正常生长得状态图、传代、培养 2. 不同细胞生长周期不同,有得生长很快,比如说MＤA-MB—2３1,传代基得类型等。?? 得时候取离心悬液得十分之一就已经足够了,有得又就是特别慢,等得人心焦,BT474就就是,传代就是一分二,复苏起始得时候两周多才能长满,所以就要在培养细胞得过程中多多摸索了。? 3、对于娇弱得细胞,就得细心呵护了,胰酶消化不能过久,吹得时候要轻柔,离心时候也要注意转速与时间,每天都要去瞧一下细胞,肉眼观察培养基状况、显微镜下观察细胞生长状况。?
细胞培养知识2
细胞培养基础知识 细胞培养基本条件 1、合适的细胞培养基 合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。 2、优质血清 目前，大多数合成培养基都需要添加血清。血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。 3、无菌无毒细胞培养环境 无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。 4、恒定的细胞生长温度 维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。 5、合适的气体环境 气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。 细胞培养基种类与基本成分
细胞培养基的种类很多，按其来源分为合成培养基和天然培养基（目前使用的培养基绝大部分是合成培养基），按其物质状态分为干粉培养基和液体培养基两类。干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌，液体培养基由专业商家提供，用户可直接使用，非常方便。 1、合成培养基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其它辅助物质： 氨基酸 氨基酸是组成蛋白质的基本单位。不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应臵于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2 周以上时，还应重新加入原来量的谷氨酰胺。 碳水化合物 碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。 无机盐 培养液中无机盐的主要功能是帮助细胞维持渗透压平衡。此外，通过提供钠，钾和钙离子，帮助细胞调节细胞膜功能。培养液的渗透压是一个非常重要的因素, 细胞通常可耐受260mOsm/kg ～320
常用的五种动物细胞培养方式
?一、半连续式培养 1.半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系 统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基，让其生长至一定的密度，在细胞生长至最大密度之前，用新鲜的培养基稀释培养物，每次稀释反应器培养体积的1/2~3/4，以维持细胞的指数生长状态，随着稀释率的增加培养体积逐步增加。或者在细胞增长和产物形成过程中，每隔一定时间，定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。剩余的培养物可作为种子，继续培养，从而可维持反复培养，而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量，经过几次的稀释、换液培养过程，细胞密度常常会提高。 2.半连续式特点： ·培养物的体积逐步增加； ·可进行多次收获； ·细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。该操作方式的优点是操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。 二、连续式培养 1.连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。该模 式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限延续下去。
细胞培养第二版知识点总结
第一章：细胞组织培养的三种类型？ 原代外植块培养：是从人或动物体内取出一小块组织，模拟体内生理环境，在保证无菌、适宜温度和营养条件下，使之生存和生长并保持其结构和功能的方法。 器官培养：指的是应用和组织培养相似的条件，培养的是器官的原基或器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。 细胞培养：是以相似的培养方法体外培养单个细胞或单一细胞群，使其在适宜条件下生长并保持细胞特性。 第二章 1.体内体外的环境不一样，细胞之间的粘附是通过什么实现的？ 细胞的黏附是通过特异的细胞表面受体与细胞外基质分子结合实现的。 在细胞铺展之前，细胞已分泌了细胞外基质蛋白和蛋白聚糖。细胞外基质先黏着到带电底面上，然后再通过特异的受体附着到基质上。 因此，细胞曾经生长过的玻璃或塑料表面更适合细胞附着，用基质成分，如纤连蛋白、胶原或其衍生物（如明胶）预处理培养器皿，有利于要求复杂培养条件的细胞附着和增殖。 主要有四类跨膜蛋白参与了细胞与细胞、细胞与底物的黏附。 不依赖Ca2+的细胞间黏附分子介导同种或异种细胞与细胞粘附 依赖Ca2+的钙黏着蛋白参与同源细胞间的相互作用 整合蛋白，介导细胞与基质之间的相互作用，是基质分子 跨膜的蛋白聚糖，能和基质成分如其他蛋白聚糖或胶原相互作用，具有稳定、活化和把生长因子转运到高亲和性受体上的作用。2.细胞外基质成分及作用？ 细胞外基质（ECM）由胶原、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、透明质酸酶、蛋白多糖及膜结合生长因子（或细胞因子）等各种成分组成。ECM能提高细胞的生存、增殖和分化能力3.概念，接触抑制：细胞在生长过程中达到相互接触时运动停止，同时细胞质膜褶皱减少，最终细胞分裂停止。 4.诱导细胞分化的条件？ 有助于诱导细胞分化的条件： 细胞密度高 细胞与细胞、细胞与基质之间作用强 培养基中存在各种分化因子 5.细胞信号传递的类型？ 体内细胞的增殖、迁移、分化、凋亡均受细胞间、细胞与基质间相互作用及营养条件和激素等信号分子的调控。 体内细胞信号传递的类型有： 自分泌：由细胞自身合成并通过与自身受体结合作用于细胞自身。 内分泌：信号分子通过体内脉管系统从一种细胞转移到另一种组织细胞中发挥作用的过程 同型（旁）分泌：某些细胞分泌的可溶性信号物质作用于同类型细胞。 异型旁分泌：同一细胞类型分泌的信号物质作用于不同的反应蛋白 旁分泌：不通过血液而直接作用于邻近细胞的方式 体内都存在这些类型的细胞信号传递方式，而在体外，在具有基本培养基的常规条件下，只有自分泌和同型分泌两种方式。 6.细胞传代分为哪三个阶段？ 原代培养期：从体内取出组织，接种培养到第一次传代阶段（初代培养） 1-4周、细胞呈活跃的移动、可见细胞分裂、形态结构和功能活动上与体内原组织相似性大、多呈二倍体核型 细胞群是异质的，细胞克隆形成率很低，即细胞独立生存性差。 传代期：初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存（10代内）。一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期，即有限细胞系。 衰退期：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，细胞很难长满培养空间；
细胞培养基的生产和过程控制
细胞培养基的生产和过程控制 细胞培养基作为生物制品生产的重要原材料之一，其质量对生物制品有重要的影响。细胞培养基的生产工艺和细胞培养基的原材料选用、生产过程及检验过程中的质量控制对于细胞培养基的产品质量具有直接影响。其中原材料的成份及其质量直接决定了细胞培养基产品的质量及安全性，选择合适的物料是实现细胞培养基功能过程中需要解决的基础问题。生产工艺的选择（如原料的研碎、混合技术等）及生产过程中的质量控制等直接影响产品的溶解性、批生产量及批次间差异，进而影响产品的质量。 cGMP稽查员在对国内细胞培养基生产企业进行cGMP审计时指出，细胞培养基的生产工艺及设备应经过验证，原材料必须做鉴别试验，记录应真实反映生产过程的实际情况，生产过程偏差处理应包括对出现偏差之前涉及到的批次均应进行调查等等。这些要求是基于FDA对生物制药用原料的质量要求方面提出，远远高于国内对药用原料的要求。随着对人用和动物保健用生物制品安全性要求的提高，严格执行GMP规范进行细胞培养基生产是国内细胞培养基行业发展的必然趋势。 1.1细胞培养基的原料选择及质量控制 1.1.2原材料的原料选择 由于动物细胞培养基产品属于药用原料，《哺乳类动物细胞培养基行业标准》对细胞培养基产品的微生物限度、内毒素含量进行了限定，所以细胞培养基所用原料宜采用注射级、药用级原料。对于部份没有注射级和药用级的原料，细胞培养基制造者针对自身产品质量要求，制定一些重要指标（微生物限度、内毒素、重金属等）进行原材料的质量控制。 1.1.2原材料的质量控制 细胞培养基生产企业建立完善的原材料质量标准，对于原材料的来源、检验、使用、及销毁等有明确的可追溯记录。在质量控制过程中，药用级原材料的质量标准应参考中国药典
实验总结细胞培养方法
一、培养细胞常用配置 培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：10 % DMSO + 90%胎牛血清 依次比例酌量配置。 超净工作台常规配置 移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个， 常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，冻存管 所需试剂：培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，75%酒精…… 实验前准备：所需的各项高压后的耗材及污物缸放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。培养基及胰酶恢复常温后使用，可37℃水浴5-10min
二、细胞复苏 步骤： 1. 紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。 2. 培养液（DMEM），恒温水浴箱37℃预热20min，备用。超净台内准备一支15ml离心管备用。 3.将所需的培养基确保瓶身干净后酒精消毒放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后需再次分别消毒瓶口和瓶盖。 4. 从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴中，快速摇晃，直至冻存液融化至黄豆粒大小后迅速取出。 5. 将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。 6. 取出2个培养皿并做好标记（复苏日期等），提前加入5-10ml培养液；离心结束后用1ml培养液悬液混悬沉淀细胞后分别加入培养皿内。 7. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。 8. 将培养瓶放入培养箱内培养 注意事项： 1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。 2. 冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作用较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。 3. 离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。 4. 离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基