基因工程复习总结.docx
思考题
第二章分子克隆工具酶
1简述基因工程研究用的工具酶的类型和作用特点。
常用的工具酶
硝基序列内部进庁切割
DrU逵接癖
DT?A 1 i HaSe
将两条以上的纯性HA方子咸序喪傕化昭成磷酸二酣键逢接战一6盘傢
DNAJSt 合BBl DNA PDIytoeraSe 1通?u≡ιg'掰遥一蝎如械昔≡κ?
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减性辑酸酶
BΛP Or ClP 核酸外?^b?III CXOnUCICaSe TrT
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核酸酶RHl 31
IiuulcastJ Ikil.31
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核摘核瞋隔
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脱氧4?4???aifi?DvISe
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移解单链加A或R?A,产生带亍璘酸的单械甘酸或
專聚才茫昔百罠，祠时电可切害J J空t?棱酸分子的单1? 护琳双ι?l)?A, RKΛ??5f及3'末端.高专—性单健核昔酸
能在高温(72C ) -F???MDλA>??板.
从3'方向令咸新生的互补谜
专一懺降解RMA
内切械肢晦.4?M4tl?或双1?DNA
2?说明限制性内切核酸酶命名原则(举例)
ECORl
属毛
种类 株系 编号
3. 限制内切核酸酶的星活性是指什么？
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列， 这个改变的特殊性称星星活性。
星星活性是限制性内切酶的一般性质， 任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型 位点。
引起星星活性的因素：甘油浓度高（＞5%）,酶过量（＞100U∕ml ）,离子强度低（＜25 mmol/L ）， PH 值过高（＞8.0），或是加了有机溶剂如
DMSo （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙
酰胺、二甲基甲酰胺，或是用其它2价阳离子如 Mn2+、Cu2+、Co2+或Zn2+代替了 Mg2+。 4. T4 DNA IigaSe 和 E.coli IigaSe 有什么异同？
基本廉则 3-4
个宇母组咸M 方式是：毛+种希+俅毛+序号
首字母 取属名的第1个字毎*且大电 第2宇母 取种名的耶1个字母” 小写
第3字母
①車科毛的第2个字毎*小写；②若种名有词头，且 巨會电过內切δ?* 则耳又词头后■的第一宇母代替
第］字母
若有株毛F 株名则作为第4字母* 绘否大＜h 写” 杭J? 原来的情况而定 顺冷号
若在同一茵株中方离了几个限制性内切核酸酶，则按 先后顺库冠以1? IT.
TTT ............................................................... 夺
条目 耍点
ESChenChia COIi
Ry 13
5. 连接酶的反应温度如何选择，为什么？
连接酶最适的反应温度应是37C ,但在这一温度下粘性末端的氢键结合不稳定，因此连接
反应常采用的最佳温度一般在4-16 C间，通常多选用12-16 C 30分钟到16小时。
6. 什么是Klenow酶？有什么作用？
Klenow DNA聚合酶是从全酶中除去5'—3'外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性
和3' —5'外切活性不受影响。也称为Klenow片段(KlenOWfrgment ),或E.coli DNA聚合
酶I 大片段(E.coli DNA polymerase I large fragment)。
它也可以通过基因工程得到，分子量为76 kDa。由于没有5'—3'外切活性，使用范围进
一步扩大。
①补平3 '凹端，如果使用带标记的dNTP,则可对DNA进行末端标记。
②抹平DNA3'凸端在3'—5'外切活性
③通过置换反应对DNA进行末端标记
④在CDNA克隆中合成第二链
⑤随机引物标记
⑥在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA
??? 7.如何利用工具酶来研究某一个基因内含子的存在？
??? 8.哪些工具酶可以用于探针标记？
T4 DNA聚合酶的替代合成法标记DNA探针。反转录酶还可利用单链DNA或RNA作模板合成分子探针。
第三章分子克隆载体
1. 基因工程载体应具备哪些特点？
能在宿主细胞中独立复制；
有一定的选择标记，易于识别和筛选；
有合适的限制酶位点，可插入一段较大的外源DNA,而不影响其本身的复制；
最好有较高的拷贝数，便于载体制备。
2. 作为一个最基本的载体，它必须具备哪些功能元件？
能独立复制的单链或双链DNA;
选择标记基因；
合适的限制酶位点。
??? 3?请简要描述λ噬菌体溶原状态和裂解循环的基因调控模式及其在构建载体中的作用。
4?丝状噬菌体载体克隆中经常遇到哪些问题？
丝状噬菌体载体的优点
a. 可产生单链DNA或双链DNA,分别用于不同的目的单链：为丝状噬菌体，可分泌到细胞外，用于测序或制备探针
双链：为含双链RF DNA存在于细菌菌落中，可供基因操作，如酶切，重组、提取、转化均应为双链DNA O具有质粒的优点
b. 丝状噬菌体所能包装的DNA长度没有一定的限制，有些噬菌体颗粒可包装比野生型丝状
噬菌体DNA长7倍的DNA O
缺点
a. 较大的外源DNA片段被克隆以后，在噬菌体扩增过程中往往不稳定，很容易发生缺失的现象，这可能是由于感染较短的噬菌体比长的噬菌体更具竞争优势所致。
b. 单链载体分子感染的细胞中往往单双链混杂，纯化某种类型的分子（尤其是双链分子）比较费力，同时由于重组DNA容易产生缺失，培养时间不能长，故所得DNA的量有限。
C.重组中，经常出现一些能以两种可能方向插入的载体却仅以一种特定方向插入外源DNA 片段的情况，这是因为外源DNA反向链的序列，在不同程度上干扰了载体基因间区域的功
能所致。
克服“缺失”的办法
a. 侵染菌应避免在液体培养基中连续继代培养
b. 应用贮存于-70C ,重组Phage M13感染细菌后铺板，再从噬菌斑中央部分挑取细菌后进行小规模培养
c. 培养时间应尽可能短（通常4-8h）
d. 收获噬菌体的培养液不能再做为原液继续培养（因在重组子和野生型噬菌体共培养中，野
生型具有选择优势，几代培养后可消除重组子）。
第四章人工染色体载体
1. 大容量克隆载体有哪些种类，各有何特点？
表4-1 5种常见Λ,??Λ?tt体及其基本特性
....... 3?简述黏粒、YAG BAC克隆载体、P1噬菌体载体的基本构成元件。
4. 黏粒载体具有哪些优缺点？怎样克服其缺点？
黏粒的优点
(1)同时具有λ噬菌体和质粒载体的特性
(2)具有高容量的克隆能力
柯斯质粒的缺点
a. 两个粘粒之间，当存在同源序列时，可能会发生重组，结果使克隆的外源DNA片段重排
或丢失。
b. 含不同重组DNA的菌落生长速度不一。当柯斯质粒文库复制扩增时，由于不同的插入片段对宿主细胞作用的情况不同，结果会出现各种外源DNA 片段间的比例失调。另外不同重组柯斯质粒的产量相差悬殊。
c. 包装蛋白制备过程较复杂，每批包装蛋白的包装效率不稳定。而且，购买包装蛋白的费用较高。第五章表达载体
???? 1.以大肠杆菌为例，表达载体比克隆载体多了哪些功能元件，各有什么生物学功能？
2. 简述利用T7噬菌体启动子的PET系列表达载体的工作原理。
??? ? 3.何为穿梭载体，在遗传结构上有何特点？
??? 4 .将人的某个基因在大肠杆菌中表达应注意哪些问题？
??? 5.分泌表达载体需要哪些基本元件？
??? 6.什么是融合表达？有什么优点？
第8章PCR技术及其应用
??? 1简述PCR扩增的原理和过程？
PCR反应特点：
特异性强
灵敏度高
简便、快速对标本的纯度要求低
PCR的基本原理是什么？用PCR r增时，必须预先得知什么信息？
a. DNA的半保留复制原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。
b. 至少要知道足够合成一对引物的靶DNA序列。
?过程：
a. 变性(den aturation ):将模板DNA置于92-96 C,使dsDNA在高温下解链成为ssDNA,且热变性不改变其化学性质；
b. 退火(ann eali ng):将温度降至37-72 C,使引物与模板的互补区相结合；
c. 延伸(extension ):在72C条件下，DNA聚合酶将dNTP连续加到引物的3 ‘-OH端，合成DNA。这三个热反应过程的重复称为一个循环，经过20-40 个循环可扩增得到大量位于两条引物之间序列的DNA片段。
PCR引物有哪些基本要求？
在多数试验中人们习惯使用的引物浓度为各 1 μ M ,即1pmol∕ μ l ,在100 μ l反应体系中
相当于6x1013个分子。如果5%用于扩增1 kb的DNA片段，可得到3.3 μ g的产物，足以用于常规分析。
引物设计要考虑的几个问题
①长度：至少16 bp ,通常为18-30 bp ,更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。
②解链温度（Tm值）：两个引物之间的Tm值差异最好在2-5C o
③避免引物内部或引物之间存在互补序列（3个碱基）
④G+ C含量尽量控制在40%-60%之间，4种碱基的分布应尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及T在3 '末端的重复排列。
⑤引物的3 '末端最好是G或G但不要GC连排。
? PCR技术产生污染的主要原因和预防方法？
污染原因：1、样本间交叉污染2、PCR试剂污染3、PCR扩增产物污染4、实验室中克隆质粒的污
染预防方法：
A. 防止污染：试剂小量分装，吸头及EP管一次性使用；器皿及工作区域要分开；无菌操作
B、设立对照：阳性对照阴性对照包括：标本对照和试剂对照。
???PCR技术有哪些应用？
??? 2.T/A克隆的基本原理是什么？
第九章DNA 序列分析
1. 简述化学降解法测序的基本原理以及主要应用范围。
a. 原理：将待测DNA片段的5 ‘端磷酸基团作放射性标记，再分别采用不同的化学方法对特
定碱基进行化学修饰并在该位置打断核酸链，从而产生一系列长度不一且分别以不同碱基结尾的DNA 片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过并列点样（lane-by-lane ）的方式用凝胶电泳进行分
离，再经放射自显影，即可读出目的DNA的碱基序列。
b. 核心原理：特定化学试剂可对不同碱基进行特异性修饰并在被修饰的碱基处（5'或3 ）打断磷酸二酯键，从而达到识别不同碱基种类的目的。
化学降解测序法的基本步骤包括：
（1）对待测DNA片段的5 '端磷酸基团作放射性标记；
（2）用化学修饰剂修饰特定碱基；
（3）凝胶电泳分离和放射自显影显示出各片段的长度
（4）读序，由于在同一反应体系中，各DNA片段的标记端相同、起始位点相同，所以，根据断
裂部位至标记端起始部位之间的距离（片段长度），即可得出碱基顺序。
化学降解测序法的应用
Maxam-Gilbert 化学降解测序法不需要进行酶催化反应，因此不会产生由于酶催化反应而带来的误差；
a. 对未经克隆的DNA片段可以直接测序。
b. 化学降解测序法特别适用于测定含有如5-甲基腺嘌呤、G+ C含量较高的DNA片段以及短
链的寡核苷酸片段的序列。
c. 测定长度大约250个碱基
2. 简述Sanger双脱氧链终止法测序的原理。
双脱氧核苷酸分子的脱氧核糖的3'位置的- OH 缺失，致使下位核苷酸的5'磷酸基团无法与
之结合。一旦双脱氧核苷酸整合到正在合成的DNA链中，该股DNA的合成就到此终止。
??? 3.试述化学降解法和双脱氧链终止法的异同点。
第^一章DNA文库的构建和目的基因的筛选
1. 基因组DNA文库有哪些类型？其相关的特点是什么？
⑴质粒文库
质粒是最早用于构建基因组文库的载体，质粒载体所容纳的外源DNA片段一般在IOkb以
内。
这类基因组DNA 文库一般应用于“鸟枪法”全基因组测序研究和用于构建亚克隆文库或亚基因组文库。
⑵噬菌体文库噬菌体文库是以细菌噬菌体基因组衍生的一系列载体系统构建的，常用的有l 噬菌体载体、
M13 单链噬菌体载体、P1 噬菌体载体及由噬菌体衍生的质粒载体。
M13载体所容纳的外源片段较小，一般用于构建CDNA文库或BAC和PAC亚克隆文库。
噬菌体文库中应用最广泛的是l 噬菌体。由于其有利于利用分子杂交的方法进行筛选，用l 噬菌体构建的基因组DNA文库在小基因组物种的基因克隆中起着重要作用。
⑶黏粒文库
黏粒又称柯斯质粒，是由I噬菌体的CoS序列、质粒的复制序列及抗生素抗性基因构建而成的一类特殊的质粒载体。
黏粒载体和噬菌体载体类似，主要用于构建小基因组物种的基因组DNA文库。
利用它们在筛选上的优势来分离单个基因或构建一定区间范围的亚基因组DNA文库等。
⑷人工染色体文库包括酵母人工染色体文库、细菌人工染色体文库和P1 人工染色体文库，也称为大片段基因组DNA文库，容纳的外源DNA片段为100 kb-1 Mb。
主要用于大基因组物种的基因克隆、物理图谱构建和基因组测序等，在基因组研究中应用越来越广泛。
⑸亚基因组文库亚基因组文库是相对于基因组文库提出的，文库的对象不是全基因组范围，而是基因组的某一区段，如基因组DNA某一特定大小酶切片段的组合、一条染色体或更小的区段(如一个YAC或BAC克隆等)。
??? 2?构建大片段基因组文库过程中需要注意哪些问题？
3. 均一化CDNA文库构建的基本原理是什么？
mRNA-cDNA杂交方法的原理是用过量的驱动mRNA与供体的CDNA文库质粒反复多轮杂交，
去除驱动和供体共同表达的基因，构建均一化的、扣除杂交CDNA文库。
4?扣除CDNA的基本原理是什么？
扣除杂交技术( SubtraCtive hybridization )
将含目的基因的组织或器官的mRNA群体作为待测样本(tester),将基因表达谱相似或相近
但不含目的基因的组织或器官的mRNA群体作为对照样本(driver)。将tester和driver的CDNA
进行多次杂交，去掉在二者之间都表达的基因，而保留两者之间差异表达的基因，使低丰度基因在文库中的比例大大提高，筛选到差异表达的基因的可能性也大大提高。
…5?全长CDNA文库构建的原理？
6.酵母双杂交的基本原理？酵母双杂交系统简称双杂交系统 (two-hybrid system )，也叫相互作用陷阱 (interaCtion trap )，是根据真核生物转录调控的特点创建的一种体内鉴定基因的方法。其筛选的基因不是探针的
直接编码物，而是能够与其相互作用的蛋白质的编码基因，即筛选与已知基因的产物发生相互作用的蛋白的编码基因。
?酵母双杂交系统的基本原理
来自酵母转录激活因子( transCriptionaI aCtivator)GAL4 是一种典型的转录因子，有两个功能域:
一是DNA 结合结构域( DNA binding domain, BD )
靠近羧基端,含有几个锌指结构，可与DNA 序列中半乳糖苷酶的上游激活序列( upstream activati ng SeqUe nce, UAS)结合；
二是转录激活结构域( activation domain, AD ) ,
可与RNA聚合酶或转录因子TFIl相互作用，提高RNA聚合酶的活性。这两个结构域的功能是独立的。
酵母双杂交系统利用融合蛋白的策略，将要筛选的“探针”蛋白X与BD融合为BD-X (通常称为诱饵，bait)；
将所要筛选的对象Y与AD构建成融合蛋白的AD-Y CDNA文库(即将目的CDNA与AD基因构建融合基因文库)，通常称AD-Y为猎物(Prey)；
将它们导入酵母细胞中共表达，如果X与Y相互作用，则会导致BD和AD在空间上接近形
成一个有功能的转录激活因子，激活下游报告基因的表达。
第十三章植物基因工程
1. 植物基因转化受体系统具备的条件？
a. 高效稳定的再生能力
b. 较高的遗传稳定性
c?具有稳定的外植体来源
d. 对选择抗生素敏感
e. 对农杆菌有敏感性
f. 是否具有经济价值或有潜在的生产应用价值
2. 植物基因工程常用的受体系统有哪些？
a. 愈伤组织再生系统
b. 直接分化再生系统
c. 原生质体再生系统
d. 生殖细胞受体系统
3. 植物基因转化方法有哪些？
a. 原生质体介导法
包括：
PEG介导的基因转化脂质体介导基因转化电激法介导基因转化显微注射介导的基因转化激光微束介导的基因转化
b. 基因枪法
c. 根癌农杆菌介导法
???4 .农杆菌转化的基本原理？
5. 什么是二元载体？和一元载体比有什么优点？
二元载体(binary VeCtOr)系统是指由两个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变质粒构成的双质粒系统
因为其T-DNA与Vir基因在两个独立的质粒上，通过反式激活T-DNA转移，故称之为反式载体(trans VeCtOr)。
二元载体较一元载体有更多的优点：
a. 首先，二元载体的构建较为方便；而一元载体还需在根癌农杆菌中进行共整合，构建效率相对较低。
b. 其次，二元载体的外源基因的转化效率要高于一元载体。所以目前在植物基因工程研究中主要使用二元载体系统。
6. 植物转化常用的选择基因和报告基因有哪些？报告基因有什么特点？植物基因工程中的选择标记基因主要是一类编码可使抗生素或除草剂失活的蛋白酶基因。
选择基因:与外界存在的筛选压力如抗生素等相互作用，以筛选出被转化的细胞；
最常用的有新霉素抗性基因（neor）、庆大霉素抗性基因（gentr）、潮霉素磷酸转移酶（HPT）
基因（hpt），以及膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）等。
报告基因是指其编码产物能够被快速测定、常用于判断外源基因是否成功地导入受体细胞（器官或组
织），是否启动表达的一类特殊用途的基因。
提供一种快速测定外源基因是否成功导入的检测手段，它的应用不依赖于外界选择压力的存在。
理想的报告基因具备的基本要求
①报告分子不存在于宿主中或易于与内源性基因相区别；
②应有一个简单、快捷、灵敏及经济的分析方法；
③报告基因的分析结果应具有很强的线性范围，便于分析启动子活性的大小变化；
④报告基因的表达必须不改变受体细胞或生物体生理活动。最常用的报告基因
β葡萄糖甘酸酶基因（gus）氯霉素乙酰转移酶基因（cat）荧光素酶基因（luc 绿色荧光蛋白（GFP基因（gfp）等。
7. 转基因植株的鉴定方法有哪些，作为一组完整的转基因植株鉴定数据至少应包含哪些参数？
a. PCR检测外源基因的整合
b. Southern 杂交检测外源基因的整合
c. RT-PCR检测外源基因的表达
d. Northern 杂交检测外源基因的表达
e. Western 杂交检测外源基因表达的产物
第十四章动物基因工程
…1简述反转录病毒在动物基因工程中的作用。
2. 试述基因敲除与基因敲入的区别。
3. 质粒载体与病毒载体有何异同？表达载体:
（1）带有原核复制区
（2）带有选择性标记基因
保证重组DNA分子能够在大肠杆菌中扩增
（3）必须包括能在真核细胞表达的相关组件
一般包括转录外源DNA序列的启动子元件、转录产物有效地加上Poly(A)尾巴所必需的信号
序列、真核细胞中的选择性标记，以及一些附加元件，如增强子、内含子、剪接供体与受体点，以保证外源基因的高效表达。
?病毒载体：
①携带外源基因并能包装成病毒颗粒；
②介导外源基因的转移与表达；
③对机体不致病。
4. 简述转基因小鼠的制备过程。
? DNA显微注射法制备转基因小鼠
?胚胎干细胞法制备转基因小鼠
DNA显微注射法制备转基因小鼠
⑴超数排卵对年轻、健康未孕母鼠( 4-5 周龄)注射促性腺激素，诱导超数排卵，与种公鼠合笼交配。从输卵管的壶腹部收集原核期受精卵，排卵率一般可达30 枚以上，但具体排卵多少受激素种类和小鼠品种影响较大。
⑵基因准备
从整合率上看线形DNA分子要好于环形DNA,而环形DNA在细胞内的半衰期较长，适用于瞬间表达与基因治疗。
尽管载体DNA序列不影响外源DNA的整合效率，但载体序列能抑制转基因的表达，因此应尽量去除转基因结构中的载体部分。
⑶显微注射
(1) 外源DNA进入原核
(2) 培养液中培养
(3) 进行冷冻保存，或直接用于移植，或继续培养发育到囊胚后再移植。
⑷胚胎移植
胚胎:囊胚期或囊胚期之前的胚胎，可依据早期胚胎的发育阶段和物种的不同决定移植的部位。
注射后的单细胞至桑葚期的胚胎应移植到0.5d 假孕鼠的输卵管内，而达到囊胚期的胚胎则须转移至2.5 d 假孕鼠子宫内。未经注射的新鲜胚胎的移植成功率为50%-70%，注射胚胎移植后的受胎率有所下降，仅为10%-30%。
⑸转基因个体鉴定接受胚胎移植的假孕鼠产下的幼鼠是否含有外源基因？
(1)分子鉴定，判定其基因组内是否整合了外源基因
(2)目的蛋白表达与否和表达水平测定
(3)产物的分离纯化及生物活性检测
2．胚胎干细胞法制备转基因小鼠
胚胎干细胞( embryonic stem cells ，ESCs) : 从早期胚胎内细胞团( inner cell
mass, ICM)中分离出的未分化、具有正常二倍体染色体和发育全能性的细胞。当将胚胎干细胞人工注入宿主早期胚胎的囊胚腔内 (又称内细胞团注射) 后，所注入的胚胎干细胞可以同宿主内细胞团细胞共同发育，分化成成体动物的各种组织（包括生殖细胞）形成嵌合体。
a. 转基因胚胎干细胞的获得
b. 囊胚注射c?嵌合体的检测和育种
5. 转基因动物的鉴定方法有哪些？
a. 标记筛选法利用正负筛选标记
b. 分子鉴定法：PCR扩增、斑点杂交、SoUthem杂交、荧光原位杂交
c. 表达水平检测：报告基因检测、Northem杂交、RT-PCR聚丙烯酰胺凝胶电泳、WeStern 杂交、目的蛋白的生物活性检测
判定是否产生出转基因动物的重要标准是检查外源基因是否整合到动物的生殖系统中，即是否能够稳定遗传。
第十五章酵母基因工程 2.作为一个酵母表达载体，包括那些基本元件？典型的酵母表达载体均为大肠杆菌和酵母菌的穿梭质粒。
?原核部分：大肠杆菌中Ori和抗生素抗性序列。
?酵母部分：维持复制的元件，如附加型的 2 μ m质粒复制起点序列，或染色体的自主复制
序列（auto-replication SeqUence, ARS）,或整合型载体的整合介导区；酵母转化子的筛选组分以及编码特定蛋白的基因启动子和终止子序列。
?分泌型表达载体还要带有信号肽序列酵母表达载体主要元件
①启动子
最常用的启动子是基因A0X1的启动子，在它控制下的外源基因在甲醇诱导时能得到高效表达。
PGAP （三磷酸甘油醛脱氢酶启动子）：在毕赤酵母中克隆到的一个组成型启动子，在它控制下的β -LaCZ基因表达率比甲醇诱导下的以PAOX1启动的产量更高。
PGAP不需要甲醇诱导，发酵工艺更为简单，又因其产量很高，所以成为代替PAOX1的最具潜力的启动子。
②选择标记
常用HIS4,以及ARG4 TRP1或URA3作选择标记的载体。
巴斯德毕赤酵母不能利用蔗糖，所以可用来源于酿酒酵母的蔗糖酶基因SUC2作为选择标记。抗性选择标记有抗生素G418抗性基因和ZeOCin抗性基因（一种强诱变剂）。
IeU-作为酵母载体的选择标记基因
③信号肽序列表达外源蛋白分胞内表达和分泌表达。毕赤酵母本身基本不分泌内源蛋白，所以外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。
如果自身信号肽序列效果不佳，可用α -交配因子引导序列引导外源蛋白的分泌。在巴斯德
毕赤酵母载体中还使用过蔗糖酶基因SUC2的信号肽序列、酸性磷酸酶基因PHO1的信号肽
序列等。
??? 3.叙述附加型表达载体和整合型表达载体用在表达外源基因上的区别。
??? 4 .如何提高基因在染色体上的拷贝数来提高异源基因的表达量？
附什么是蓝白斑筛选法？答：这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。主要是在载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌β -半乳糖苷酶（IaC）的基因片段，携带有IaC基因片段的载体转入IaC-宿主菌后,
在含有X-gal平板上形成浅蓝色的菌落或噬菌斑。外源基因插入lac（或Iac基因部分被取代）后，重组的菌体或噬菌斑将丧失分解的能力，转入Iac-宿主菌，在含有X-gal平板上形成白
色的菌落或噬菌斑，非重组的菌落或噬菌斑则为蓝色。
基因工程实验报告
基因工程实验报告 、
小麦GAPDH截短体的重组与表达 摘要：本实验通过基因工程（genetic engineering）手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞，诱导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测。通过本对实验的实践，我们对基因工程技术将会有一个比较全面的认识和了解。 关键字：小麦基因；载体；感受态 前言 基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。为在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。 （一）实验过程
1.实验部分流程：
2．小麦总RNA提取（Trizol法） 2.1 材料 小麦幼苗 2.2 试剂配制及器具处理 ① 0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯） ②器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在 0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。 ③无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃×2h）装蒸馏水，然后加入 0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 ④Trizol ⑤ 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 ⑥氯仿(最好用新的)。 ⑦异丙醇(最好用新的)。 2.3 操作步骤： ①先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。 ②室温放置5min，然后加入200μL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。 ③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500μL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm 离心10min。 ④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。 ⑤重复步骤④。 ⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30μL DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。 3. RT-PCR扩增目的基因cDNA 3.1 试剂 ① RNA模板 ②Olig（dT）18 ③反转录缓冲液 ④dNTP ⑤ M-MULV反转录酶 ⑥ RNA抑制剂（RNasin） ⑦Premix EX Taq DNA聚合酶 ⑧ PCR特异引物 3.2操作步骤： 3.2.1 RNA的反转录 采用Thermo Scientific（Fermentas）RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Total RNA 6μL（需加入RNA约1μg） OligodT primer 1μL H2O（nuclease-free）5μL 12μL 65℃ 5min，补加下列试剂： 5× Reaction buffer 4μL RibolockRNase Inhibitor 1μL 10mM dNTP Mix 2μL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL 20μL 42℃ 60min 70℃，5min，﹣20℃保存
建筑施工现场管理个人工作总结(20201117135536).docx
建筑施工现场管理个人工作总结 身为建筑公司的一员，有机会能在这样的条件下学习和锻炼，感到无比的自豪，这种环境和外部的条件给了我们一种自信和荣耀，但更多的是对我们的今后工作的鞭策，就要求我们在工作中时刻要以企业的形象来约束自己，我们所有的言行要符合特级企业的标准，逐步培 养自身的个人素质和修养，才能无愧于领导的信任和培养 . 通过总结一年来的工作，找出工作中的不足，以便在以后的工作中加以克服，同时还需要多看书，认真学习好规年的工作，有进步、有收获、有成绩，同时也存在着不足 一、整体工作状态 ( 一) 上半年的工作——紧张而忙绿 由于公司刚成立不久、人员配备不足， 20xx 年年底有多个项目同时开工的情况下，上半年我同时负责安徽 拓山重工机械有限公司综合楼工程、安徽马氏铸造设备制造有限公 司的厂区工程、安徽美诺华药物化学有限公司8#车间工程的现场管理和资料的收集、整理工作，由于三个工程的开工时间相对集中，同 时进行主体施工，因而显得紧张而忙碌，只好白天进行现场管理，晚 上加班整理资料。尽管如此，仍出现过几个工地同时有事情要处理， 因不能同时到场而被抱怨的情况。 ( 二) 下半年的工作——相对轻松 下半年，美诺华、马氏铸造、拓山重工和苏村幼儿园相继进行竣工
验收，此外两名实习生也可以帮我分担一部分工作，因而下半年的工作相对轻松起来。 二、岗位职责的履行 1.全面负责工地施工的组织、协调和指挥工作 每个项目部成立后，我均在第一时间协助项目经理进行现场查验， 绘制施工现场平面布置图，合理规划施工道路、料场、施工机具及临 时设施的位置，配合公司安全科指导现场临时用电的设置，几个项目基本上一次性满足施工规年来，各项目部工作的开展均算顺利，施工生产得到健康、有序的进行。 2.技术指导工作 (1)工程开工前认真研究图纸，并汇总监理及各班组发现的各种问 题，及时在图纸会审中一一解决。 (2)每个工序开工前及时对班组负责人进行技术交底，关键部位的 施工坚持旁站，发现问题时及时给予解决。 (3)在施工过程中发现图纸设计存在问题或存在施工难度大的，积 极寻找解决方案，并与现场监理及设计人员沟通，确保施工顺利进行。 3.质量控制 (1)严格控制进场材料的质量，包括核对质保资料，检查材料外观，并及时送样检测，杜绝不合格材料在工程中使用。 (2)施工规个环节发现有质量隐患的，均要求相关人员立即进行整 改，整改合格后方可进行下道工序的施工。 4.进度控制
基因工程知识点梳理
生物选修3知识点 专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过，赋予生物以，创造出。基因工程是在 上进行设计和施工的，又叫做。 （一）基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”—— （1）来源：主要是从中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别的核苷酸序列，并且使每一条链中的两个核苷酸之间的断开，因此具有。（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式： 和。 2.“分子缝合针”—— (1)两种DNA连接酶（）的比较： ①相同点：都缝合键。 ②区别：来源于大肠杆菌，来源于T4噬菌体， 只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来； 而能缝合两种末端，但连接的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。 DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 必须需要模板 3.“分子运输车”—— （1）载体具备的条件：①。 ②，供外源DNA片段插入。 ③，供重组DNA的鉴定和选择。 （2）最常用的载体是 ,它是一 种 。
（3）其它载体： (二)基因工程的基本操作程序 第一步： 1.目的基因是指：基因。 2.原核基因采取获得，真核基因是。人工合成目的基因的 常用方_ 和_。 3. 从基因文库中获取 基因文库（1）概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。 （2）类型：基因组文库和部分基因文库（如cDNA文库） （1）原理： （2）过程：第一步：加热至90～95℃； 第二步：冷却到55～60℃，； 第三步：加热至70～75℃，。 第二步：（核心步骤）
基因工程知识点总结归纳(更新版)
基因工程 绪论 1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。作动词：基因的分离和重组的过程。 2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。 3、基因工程诞生的基础 三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。 三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现 3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶 1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数 3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割 4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。 5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。 6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。 7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。 8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。 9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。
基因工程实验(答案)
——凯1.简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程？（实验题目的总结） 答：①基因组DNA的提取；②PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCR扩增的DNA片段以及DNA的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。 2.如何正确使用微量移液器？（自己写的） 答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。 3.在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么？ 答：loading Buffer。主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。 溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。 4.简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。（题目有歧义） 答：①取0.5g琼脂粉置于锥形瓶，量取50ml 1×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂溶解； ②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55℃下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线；④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。 5.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？（实验书P75） 答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入染料的存在与否； 6.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么？（实验书P31） 答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。 7.在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用？ 答：酚——是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。 8.提取DNA实验中，通常可选用哪些试剂沉淀DNA？ 答：冷的无水乙醇，冷的异丙醇，终浓度为0.1～0.25mol/L 的NaCl 9.简述在DNA提取实验中个试剂的作用（SDS，EDTA，酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇，70%乙醇）。 答：SDS——破坏细胞膜，解聚核蛋白；EDTA——整合金属离子，抑制DNase活性；酚/氯仿/异戊醇——见第7题；无水乙醇——沉淀DNA；70%乙醇——洗涤DNA沉淀。 10.简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用（Mg2+，dNTP，引物，DNA，缓冲液，Taq
钻孔灌注桩施工总结计划.docx
钻孔灌注桩施工工艺 一、实施方案 1、质量管理体系见表1 表 1 项目经理：张玉涛项目总工：郭海峰指挥层 生产经理：冯永春倪金洲 合同经理：苏云长材料经理：刘敬涛 施工队长：王清波质检科长：贾绪军执行层 测量班长：贾占生设备科长：林宝清 操作层工长：陈会霞 测量员：曲建伟 试验员：朱守成肖丹 安全员：于淼 质检员：张力 操作手：张东王强等 2、材料要求 材料要求：水泥采用金宁羊42.5R 级普通硅酸盐水泥，粗集料产地南京，级配良好最大粒径为31.5 ｃｍ，细集料产地南京，采用级配良好的中粗砂，采用JM9缓凝泵送外掺剂。 3、施工控制参数 （1）每立米材料用量（质量比）为：水泥：砂：碎石：水：外加剂＝ 380：797： 1014：190：3.04 水灰比为 0.5砂率为0.44坍落度20ｃｍ （2）制备泥浆用塑性指数 IP>10的粘性土或膨润土 , 泥浆性能指标要求见下表 泥浆性能指标要求
钻孔地层相对粘度含砂率胶体失水率酸碱度方法情况密度（ ps.s ）(%)率(%)(ml/30min)PH 正循一般地 1.05—16— 228— 4≥96≤ 258— 10环层 1.20 易坍地 1.20—19— 288— 4≥96≤ 158— 10 层 1.45 4、施工方法 （1）准备场地、测量放线 施工前进行场地平整，清除杂物，钻孔位置处平整夯实。根据桩位坐标，用全站仪准确定出桩位。同时对施工用水、泥浆池 位置、动力供应、钢筋加工场地、施工便道做统一的安排。 （2）埋设护筒 护筒因考虑多次周转，采用 5mm钢板制成，护筒内径比桩径大300mm；护筒中心竖直线应与桩中心重合，平面允许误差为 50mm，竖直线倾斜不大于 1%，实测定位，护筒高度高出地面 0.3m。 (3)钻孔 ①将钻机调平对准钻孔, 把钻头吊起徐徐放入护筒内。钻进 时，连续补充泥浆，维持护筒内应有的水头，避免坍塌。 ②钻孔连续进行，不间断，视土质及钻进部位调整钻进速度。 在护筒刃脚处，低档慢速钻进，使刃脚处有坚固的泥皮护壁。钻 至刃脚下 1米后，可按土质以正常速度钻进。粘土中钻进，由于泥浆粘性大，钻锥所受阻力也大，易糊钻。选用尖底钻锥、中等转 速、大泵量、稀泥浆钻进。 ③钻进时，为减少扩孔、弯孔和斜孔，采用减压法钻进，使
基因工程知识点
基因工程各章知识点 第一章绪论 1．基因工程的首例操作实验 三大理论基础：DNA是遗传物质、DNA的双螺旋结构和半保留复制、遗传密码的破译和遗传物质传递方式的确定 三大技术基础：限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割、DNA连接酶的发现与DNA片段的连接、基因工程载体的研究与应用 基因工程的诞生： 72年，P.Berg首次实现体外DNA重组：体外用EcoRI分别切割SV40和λDNA,并用T4 DNA连接酶连接成为重组的杂种DNA分子 73年，S.Cohen 体外重组DNA并转化：具Kanr的E.Coli质粒R6－5和具Tetr的E.Coli质粒pSC101切割并连接转化的大肠杆菌具有双重抗性 S.Cohen 和H.Boyer首次实现真核基因在原核中表达：将非洲爪蟾的DNA与E.Coli质粒（pSC101）体外切割并连接，转化大肠杆菌 2．基因工程的基本概念 基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种新物体（受体）内，使之稳定遗传并表达出新产物或具有新性状的DNA体外操作技术，也称为分子克隆或重组DNA 技术。 供体、载体、受体是基因工程的三大基本元件。 3．基因工程的基本操作过程 a分离目的DNA片段：酶切、PCR扩增、化学合成等。 b重组：体外连接的DNA和载体DNA，形成重组DNA分子。 c转化：将重组DNA分子导入受体细胞并与之一起增殖。 d筛选：鉴定出获得了重组DNA分子的受体细胞。 e对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。 第二章载体 1．理解用PBR322和PUC18作载体的克隆外源基因的原理。答案不确定 PBR322作载体的克隆外源基因的原理:PBR322质粒具有12 种限制性内切酶的单一识别位点：Tet r 基因内有7个酶切位点：Bam HⅠ，SalⅠ：Amp r基因内有3 个酶切位点：PstⅠ。Eco RⅠ和HindⅢ不在抗生素基因内，不导致插入失活。 如果在pBR322质粒的Tet r基因内位点插入外源DNA片断，将切断了tet r基因编码序列的连续性，使tet r 失去活性，产生出Amp r Tet s表型的重组pBR322质粒，转化入Amp s Tet s的大肠杆菌细胞。先涂布在含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出具Amp r菌落，再将它们影印于含四环素的选择性培养基上。插入外源片断的重组质粒不能在这种培养基上生长，这样就找出了含重组质粒的大肠杆菌。如果在pBR322质粒的Amp r基因内位点插入外源DNA片断，则反之。 PUC18作载体的克隆外源基因的原理：
专题一、基因工程知识点归纳
专题一基因工程 一【高考目标定位】 1、专题重点：DNA重组技术所需的三种基本工具；基因工程的基本操作 程序四个步骤；基因工程在农业和医疗等面的应用；蛋白质工程的原理。 2、专题难点：基因工程载体需要具备的条件；从基因文库中获取目的基 因；利用PCR技术扩增目的基因；基因治疗；蛋白质工程的原理。 二【课时安排】2课时 三【考纲知识梳理】 第1节DNA重组技术的基本工具 教材梳理： 知识点一基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。 注意：对本概念应从以下几个面理解： 知识点二基因工程的基本工具 1.限制性核酸切酶——“分子手术刀” （1）限制性切酶的来源：主要是从原核生物中分离纯化来的。 （2）限制性切酶的作用：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。（3）限制性切酶的切割式及结果：①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。 2.DNA连接酶——“分子缝合针” （1）来源：大肠杆菌、T4噬菌体 （2）DNA连接酶的种类：E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。 （3）作用及作用部位：E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸
二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。注意：比较有关的DNA酶 （1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基 （2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94℃）、重金属盐的作用下，也可使DNA 解旋。 （3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。（4）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA聚合酶和DNA连接酶的异同点。 3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” （1）分子运载车的种类：①质粒：常存在于原核细胞和酵母菌中，是一种分子质量较小的环状的裸露的DNA分子，独立于拟核之外。②病毒：常用的病毒有噬菌体、动植物病毒等。 （2）运载体作用：①是用它做运载工具，将目的基因转运到宿主细胞中去。②是利用它在受体细胞对目的基因进行大量复制。 （3）作为运载体必须具备的条件：①在宿主细胞中保存下来并大量复制②有多个限制性切酶切点③有一定的标记基因，便于筛选。 思维探究：知识点3、4、5主要是介绍DNA重组技术的三种基本工具及其作用。限制酶──“分子手术刀”，主要是介绍限制酶的作用，切割后产生的结果。在这部分容学习时，应关心的问题之一是：限制酶从哪里寻找？我们可以联想从前学过的容──噬菌体侵染细菌的实验，进而认识细菌等单细胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵。那么这类原核生物之所以长期进化而不绝灭，有保护机制？进而联想到可能是有什么酶来切割外源DNA，而使之失效，达到保护自身的目的”。这样就对“限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来”的认识提高了一个层次。 基因进入受体细胞的载体──“分子运 输车”的学习容，不能仅仅着眼于记住这几个 条件，而应该深入思考每一个条件的涵，通过 深思熟虑，才能真正明确为什么要有这些条件 才能充当载体。 教材拓展： 拓展点一限制酶所识别序列的特点 限制酶所识别的序列的特点是：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱
基因工程总结
简述Southern blot,northern blot,western blot的原理，比较它们的不同. 答：Southern Blot 原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。DNA => 琼脂糖电泳=> 印迹转移=> 预杂交=> 杂交（变性探针）=> 洗膜=> 放射自显影或显色Northern Blot 原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。 mRNA提取=> 甲醛变性电泳=> 印迹转移=> 预杂交=> 杂交（变性探针）=> 洗膜=> 放射自显影或化学发光 Western Blot 与 Southern Blot或 Northern Blot杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 不同：所用于分析的对象不同。 Northern杂交用于分析RNA； Southern杂交用于分析DNA； Western杂交用于分析蛋白质。 转基因动物与转基因植物的产生有什么不同？ 答：技术原理相同，用转基因技术将具体特殊经济价格的外源基因导入动植物体内，不但表达出人类所需要的优良性状（如抗虫，抗病，抗除草剂，抗倒伏，产肉，产蛋量高）,还可以通过蛋白质重新组合得到新的品种。但是，对动物和植物进行目的基因导入的方法不同。动物一般采用显微注射法将带有目的基因的病毒注入细胞；而植物一般采用农杆菌转化法或基因枪法将目的基因导入受体细胞。
工程竣工报告模板总结模板计划模板.docx
房山区长阳镇起步区 2 号地北侧多功能用地 11#商 业楼等 2 项工程竣工 质 量 报 告 审定： 审核： 编制： 江苏省建筑工程集团有限公司
目录 1、工程概况 .................................错误!未定义书签。 2、工程实体质量情况评估.....................错误!未定义书签。 3、施工资料完成情况.........................错误!未定义书签。 4、主要建筑设备、系统调试情况...............错误!未定义书签。 5、安全和功能检测、主要功能抽查情况. .........错误!未定义书签。 6、结论 .....................................错误!未定义书签。
1、工程概况 总体简介 序号项目内容 1工程名称 房山区长阳镇起步区 2 号地北侧多功能用地11#商业 楼等 2 项 2工程地址房山区房山线长阳站8 号地东侧 3建设单位北京首都开发股份有限公司 4设计单位华通设计顾问工程有限公司 5监理单位北京赛瑞斯国际工程咨询有限公司 6勘察单位中兵勘察设计研究院 7质量监督单位房山区建设工程质量监督站 8施工总承包单位江苏省建筑工程集团有限公司 9合同承包范围土建、水电安装、通风空调、幕墙、消防及装饰工程 10结算方式中标价 +工程洽商 11合同工期607 日历天 12合同质量目标整体竣工验收合格 建筑设计概况 序号项目内容 1建筑功能商业楼 2建筑特点智能化建筑设计 3建筑面积 2总建筑面积 49925m 4层数地上 4 层局部 5 层地下 2 层 地上 首层地下一层 5建筑层高 层高 地下二层 2-5 层 直燃机房 ±标高室内外高差： 6建筑高度 檐口高度：建筑总高度 7耐火等级二级人防等级 6 级
工程项目年终总结(3篇).docx
工程项目年终总结（ 3 篇） 工程项目年终总结 (一) 200x 年已经过去， 200x 年业已到来，下面我将200x 年一年来的工作情况做以下汇报。 〈一〉 200x 年全年工作内容： 200x 年我负责施工的内容是滨河湾小区住宅工程， 共包括 4 栋 7+1 框架住宅楼，建筑面积26500m2。该工程为公司重点工程项目，200x 年 5 月 20 日进场施工。目前 已经完成主体工程以及部分内外装修工程。 〈二〉全年各项工作完成情况： (1)工程质量完成情况： 滨河湾小区是公司2004 年重点建设项目，我作为项目经理被公司批准后，立即开始了项目部的组建工作。首 先根据滨河湾的工作要求，从公司抽调了工作人员，建立 了质量管理体系、项目管理目标和管理人员岗位责任 制。滨河湾小区的质量目标为创建“无质量通病小区”，为此公司下发了许多预防措施和实施办法。为保证整个目标 的实现，我组织项目部管理人员根据自己的实践经验，结 合工程的特点，编制了项目部质量预防措施。工程开工以
后，我们严格控制施工质量，从基础开始，一步一个脚印的进行。模板工程重点控制结构尺寸和支撑牢固性，确保设计尺寸的准确和观感的质量。钢筋工程重点控制绑扎质量，尤其是钢筋实物的间距和位置。在施工过程中，我要求坚决落实公司预防措施内容，并且坚持进行样板引路，同时组织管理人员对其他项目部在建工程进行参观学习，作到扬长避短，提高了项目部人员的质量争先意识。砼工程重点控制了砼的浇注和养护工作。规范浇注、及时养护是保证砼质量的根本途径。在整个主体施工期间，我们认真进行了落实。迄今为止，未发现砼裂缝现象。整个主体工程的施工，经过项目的认真控制，全部施工内容符合设计要求，主体质量较好，受到了金屋地产的奖励，达到了预期的质量目标。 (2)工程生产及进度控制： 滨河湾小区开工以后，我按照公司要求工期，组织制定了施工进度网络计划以及劳动力计划。并且根据施工进度要求，与各个施工班组签定了质量、进度、安全控制协议书。对其具体进度、生产内容提出了具体要求。在生产过程中，我根据实际情况，通过制定月计划和周计划，对
分子生物学实验心得体会
关于分子生物学实验的体会 梁慧媛（生技01 级） 不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。 首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。 失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的"试炼" 。 分子生物学实验心得体会 刘东强（生科01 级） 分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。 随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA 的制备、PCR 技术等。 我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。 此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。 总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值 刘佳凝（生技01 级） 一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会： 1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我
工程部年中工作总结.docx
上半年过去了，工程是否完工?进度如何?该写一份工作总结了哟?下面是为您带来的“工程部年中工作总结”，希望能给您带来帮助! 更多年中工作总结请关注工作总结栏目! 【工程部年中工作总结一】 xx年上半年，工程部在公司领导的正确带领下，以严谨认真的工作态度，努力营造良好的工作环境，在加速各在建工程项目的纵深推进的同时努力开展新工程。在全体成员的积极协作、通力配合下，上半年我部门顺利开展了工程、工程、公司办公楼装饰装修工程等共计3个项目的施工改造工作，并中标房建项目、房建项目、市政基础设施及配套建设项目共计3个标段。海外工程中完成移交，项目已正式开工，项目处于质保阶段。现将上半年工作总结如下： 一、xx年上半年主要工作的开展情况 (一)国内工程 1、改扩建工程：改扩建工程于9月开工，截至xx年6月底已基本完工。xx年5月服务区、服务区的投入使用，标志着整个改造工程主施工阶段基本结束。经初步测算，共完成工程量约1.96亿元。其中：xx年上半年，完成工程量约计2200万元，9421平方米。服务区完成工程量约计1100计万元,计4635平方米。 对已完工的工程，我部积极配合推进工程的结算审计工作，并于xx年2月将已完工程的结算书报业主单位。截至目前，合同范围的工程已基本审计结束，审计认定结果约计700余万元。 2、公司办公楼装饰装修工程：本工程于10月开工，截至xx年6月，已完成工程量人民币195万元整。 3、zzz装饰装修工程：本工程于xx年3月开工，5月28日竣工，已完成工程量人民币84.3万元。 (二)海外工程 1、工程：xx年上半年是项目最为关键的时段，共完成产值6000多万元。在公司领导、现场技术组及国内管理组的共同努力下，项目管理人员及施工人员面临时间紧任务重，克服现场各种困难，使项目6月5日顺利通过内部验收，评定为合格工程。 2、项目：项目进入实施准备阶段，xx年3月初技术组管理人员抵达现场，开始项目开工准备，4月份25名工人抵达现场，5月14日第一批材料物资抵达港，6月8日部批准了该项目的正式开工，项目正式拉开序幕。 (三)中标工程 1、房建项目：xx年3月，我部分别对共计4个标段递交了资格预审文件，4个标段均通过资格预审。进入招标阶段后，根据招标文件中同一项目只许中标一个标段的规定，我部在4月份的投标工作中以严谨认真的态度确保建设规模最大的2个标段中标，分别为第三标段与第三标段。具体情况为： (1)第三标段，中标价人民币万元，包括，共计平方米，计划工程12个月。 (2)第三标段，中标价人民币万元，包括，共计7987.2平方米，计划工程10个月。以上两个标段已经进场，约7月底开工。 2、设施及配套建设项目：xx年6月，我部中标设施及配套建设项目第一标段。包括两个馆，项目。工程量约人民币万元，预计工期个月，目前处于合同签订准备阶段。 (四)安全工作 上半年，我部安全工作主要有： 1、落实安全生产责任，签订安全生产责任书; 2、积极开展安全生产月活动; 3、认真开展安全教育与培训工作;
专题1基因工程知识点梳理(含教材答案)
专题1 基因工程 ※基因工程的概念： 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 ﹡原理：基因重组 ﹡目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 ﹡意义：能够打破生物种属的界限（即打破生殖隔离，克服远源杂交不亲和的障碍），在分子水平上定向改变生物的遗传特性。 ﹡操作水平：DNA分子水平 【思考】： （1）基因工程的物质基础是：所有生物的DNA均由四种脱氧核苷酸组成。 （2）基因工程的结构基础是：所有生物的DNA均为双螺旋结构。 （3）一种生物的DNA上的基因之所以能在其他生物体内得以进行相同的表达，是因为它们共用一套遗传密码子。 一、基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶） （1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 （2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。 （3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端（回文结构特点）。 ①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。 ②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶
（1）分类：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类 （2）功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 ★两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键 ②区别：E．coIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接； T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。 (3)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 （4）与DNA分子相关的酶
生物实训实验报告
生物实训实验报告 篇一：细胞生物学实验社会实践报告 建立一个动物细胞培养室与植物细胞培养室所需的条件与社会价值 无菌环境是细胞离体培养的最基本条件，所以构建一个细胞培养室需要保证工作环境不受微生物和其他有害物质污染，并且干燥无烟尘。细胞培养室的设计原则一般是无菌操作区设在室内较少走动的内侧,常规操作和封闭培养于一室,而洗刷消毒在另一室。 一、基础实验室配置 ⑴消毒间：消毒间主要为了处理实验器材以及实验材料，营造一个无菌的试验环境，一般消毒间会配备超净实验台、高压灭菌锅、排风灭火设备、细菌过滤设备、干热消毒柜、电炉、酸缸等。 ⑵无菌操作间：一般由缓冲间和操作间两部分组成。缓冲间在外侧，多用于实验之前的准备，例如：更衣，准备实验材料，处理实验数据等，可放置电冰箱,冷藏器及消毒好的无菌物品等。操作间放置净化工作台及二氧化碳培养箱,离心机,倒置显微镜等。工作人员进入操作间一定要消毒并更衣。 （3）培养基配制间：主要用于配置细胞培养所用的培养基。主要包括冰箱、天平、微波炉、pH计、培养基分装器、
药品柜、器械柜、抽气泵、电炉、各种规格的培养瓶、培养皿、移液管、烧杯、量筒、容量瓶、储藏瓶等。 （4）培养室：用于培养细胞，放置以接种的培养基等。为了控制培养室的温度和光照时间及其强度，培养室的房间不要窗户，但应当留一个通气窗，并安上排气扇。室内温度由空调控制，光照由日光灯控制。天花板和内墙最好用塑料钢板装修，地面用水磨石或瓷砖铺 设，一般要分两间，一为光照培养室，一为暗培养室。培养室外应有一预备间或走廊。培养室应配有培养架、转床、摇床、光照培养箱、生化培养箱、自动控时器等。 （5）洗涤间：主要用于清洗实验之后的用具。除配置水槽外，还需配置洗液皿、落水架、干燥箱、柜子、超声波清洗器等，有需求的还可以配置洗瓶机。 以上基础设施若实验室条件不够，可将消毒间，培养基配制间，洗涤间合并一起，但注意实验室卫生以及仪器摆放，房间要保持清洁，明亮。 二、辅助实验室 细胞学鉴定室：其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。应配置各种显微镜、照相系统等。 生化分析室：在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分
市政工程总公司2020年上半年工作总结.docx
2020年前半年，公司早动手、早打算，认真落实全市经济工作会议部署，采取有效措施，积极谋划全年工作目标，并有计划、稳步推进各项工作，现将前半年的工作情况总结汇报如下： 一、主要工作完成情况 (一) 扎实推进7项市属重点工程建设任务 今年公司共承揽市属重点工程建设项目主要有7项，分别为：府前街改造工程、运煤大道工程工程、第一污水处理厂提升泵房改造工程、XX市城区污水管网改造建设项目(二期工程)府前街(城排口-第一污水厂)、XX经济开发区孝能路道排工程、湿地公园工程、中六路道路工程。 截止到目前，各重点工程项目进展情况如下: 1、府前街改造工程 工程内容：建设单位为XX市政府工程建设事务管理局。该工程西起永盛路，东至迎宾路，全长2451.031m，道路红线宽30-40m。工程内容包含：雨水工程、污水工程、给水工程、照明工程、电力电信工程、路面工程，工程中标价为5687.09万元。 该工程4月4日开工，6月底全线铺油工程已完工。 2、运煤大道工程工程 工程内容:建设单位为XX市交通基础设施建设项目管理有限公司。我公司承建第二标段(K3+640--K7+945)，全长4305m，工程造价2574.55万元。 该工程4月25日开工，预计9月底主线完工，截至目前： 已完成:清表2.7万㎡;路基挖土方18万m3;路基填土填土方18万m3;强夯2.5万㎡，铺设20cm砂砾垫层2万㎡，浇筑c35混凝土小矮墙500m3，砌筑盖板涵202米，清倒垃圾7万m3。 3、第一污水处理厂提升泵房改造工程 工程内容：建设单位为XX市政府工程建设事务管理局。该工程位于XX市污水处理厂院内西侧。该工程共分为三部分，第一部分为进水井提升泵房，建筑基底面积1741.60㎡，建筑面积50.16㎡，地下深15m，地上一层檐高5.85m，主体为框架结构，池体为钢筋混凝土结构;第二部分为调节池，建筑基底面积1091.40㎡，建筑面积64.96㎡，地上一层檐高7.90m，蓄水4000m3，主体为框架结构，池体为钢筋混凝土结构;第三部分为污水管网，全长210m，采用泥水平衡机顶管施工。 该工程2020年11月开工，预计7月底完工，截至目前： 已完成：提升泵房箱体预制、下沉、封底工作、调节池及210米污水管网铺设工程全部完工。 4、XX市城区污水管网改造建设项目(二期工程)府前街(城排口-第一污水厂) 工程内容: 建设单位为XX市住房保障和城乡建设管理局。该工程起点位于府前街与城排口交叉口附近，终点位于XX市第一污水厂西门附近。管线全长1055.22m。根据工程特点，采用沉井配合泥水平衡机械顶管技术进行施工。工程中标价为911.18万元。 该工程4月15日开工，预计7月底完工，截至目前： 已完成：5个工作井的预制、下沉、封底工作全部完工，完成顶管工程300m，其余4个工作井正在施工中。 5、XX经济开发区孝能路道排工程 工程内容：建设单位为XX市政府工程建设事务管理局。该工程南起XX市梧西线(与吴汾路交叉口)，北至规划站前路，全长1590.28m，道路红线宽45m。工程中标价为2323.94万元。 该工程5月12日开工，预计8月底完工，截至目前：
高考生物基因工程专项知识点
-高考生物基因工程专项知识点 基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力 的手段，下文是为考生准备的生物基因工程专项知识点的内容。 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。 (一)基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(限制酶) (1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。 (2)功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯 键断开，因此具有专一性。 (3)结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶 (1)两种DNA连接酶(E?coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶)的比较： ①相同点：都缝合磷酸二酯键。 ②区别：E?coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来;而
T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。 (2)与DNA聚合酶作用的异同：DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。 3.“分子运输车”——载体 (1)载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。 ②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。 ③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。 (2)最常用的载体是??质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。 (3)其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒 (二)基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的获取 1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。 2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。 3.PCR技术扩增目的基因 (1)原理：DNA双链复制 (2)过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链;第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链;第三步：加热至70～