实验一 细胞的形态观察及其大小测量

实验一细胞的形态观察及其大小测量

【实验目的】

1、通过对原核和真核各种形态细胞的光学显微镜观察，了解细胞的形态及其显微结构；

2、学习显微测量的方法，对细胞的大小有一直观认识。

【实验用品】

普通光学显微镜;目镜测微尺;镜台测微尺;载玻片;盖玻片等。

【实验材料】

人肝细胞切片;鸡血红细胞;蚕豆叶片横切片;洋葱。

【实验内容和方法】

(一)细胞形态观察

l、动物细胞的观察

（1）鼠肝细胞切片：在显微镜下仔细观察肝细胞的形态构造。注意肝细胞之间的界限、细胞的形状、细胞核的形状和数量、核仁的形状和数量、细胞质的形态构造以及细胞质和细胞核染色的区别。

（2）鸡血细胞涂片的观察：注意观察血细胞的组成；红细胞、白细胞、血小板的形态特点。

2、植物细胞的观察

（1）取蚕豆叶片横切片的观察：注意表皮细胞和叶肉细胞的基本结构。

（2）洋葱表皮细胞的形态观察：用镊子撕取洋葱表皮，滴一滴蒸馏水，盖上盖玻片。在显微镜下观察的形态和结构。

（二）细胞的大小和测量

1、测微尺的使用

目镜测微尺是一块圆形玻片，中心刻有一尺，长5～10mm，分成50～100格。每格的实际长度因不同物镜的放大率和不同镜筒长度而异。镜台测微尺是在一块载玻片中央，用树胶封固一圆形的测微尺，长1mm或2mm，分成100格或200格，每格的实际长度0.01mm(10μm)。当用目镜测微尺来测量细胞的大小时，必须先用镜台测微尺核实目镜测微尺每一格的长度。方法如下：

(1)卸下目镜的上透镜，将目镜测微尺刻度向下装在目镜的焦平面上，再旋上目镜的上透镜。

(2)将镜台测微尺刻度向上放在镜台上夹好，使测微尺分度位于视野中央。调焦至能看清镜台测微尺的分度。

(3)小心移动镜台测微尺和转动目镜测微尺(如目镜测微尺分度模糊，可转动目镜上透镜进行调焦)，使两尺左边的一直线重合，然后由左向右找出两尺另一次重合的直线(如图所示)。

(4)记录两条重合线间目镜测微尺和镜台测微尺的格数。按下式计算目镜测微尺每格等于多少μm：

0 1 2 3

测定目镜测微尺每格实长的图解

上尺：目镜测微尺；下尺：镜台测微尺

镜台测微尺的格数

目镜测微尺每格的微米数= —————————×10

目镜测微尺的格数

例如，图中镜台测微尺1格=目镜测微尺6格，代入公式得：

目镜测微尺每格=1／6×10μm=1.66μm

(5)取下镜台测微尺，换上需要测量的玻片标本，用目镜测微尺测量标本。

2、计算：根据测量结果计算各种细胞及细胞核的体积。

椭球形：V=4πab2／3 a-长半径b-短半径

圆球形：V=4／3πr3 r-半径

圆柱形：V=πr2h r-半径h-高

【作业与思考】

1、血细胞分为哪几大类？分别描述你看到的不同血细胞的形态，并阐述其功能。绘图。

2、任意选择你所看到的动物细胞和植物细胞各一个，绘图并进行适当标注，测量其大小，并比较动植物细胞大小的差异。

3、在不同的放大倍数下，所测得的细胞大小一致吗？你认为在哪个放大倍数下测定得比较准确？为什么？

实验二PEG法诱导细胞融合

【实验目的】

1. 了解细胞融合的原理和过程；

2. 初步掌握利用PEG介导动物细胞融合的实验技术。

【实验原理】

细胞融合，即在自然条件下或利用人工法(生物的、物理的、化学的)，使两个或两个以上的细胞合并成一个具有双核或多核细胞的过程。由于不仅同种细胞可以融合，种间远缘细胞也能融合，甚至于动植细胞也能合二为一，因此细胞融合技术目前较广泛应用于细胞生物学、遗传学和医学研究等各个领域，并且取得显著的成绩。

化学融合方法一般使用聚乙二醇(PEG)诱导细胞在体外进行融合。商品PEG的相对分子质量有200-6000范围内的各种规格，它们均可用作细胞融合剂。普遍认为PEG分子能改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合。促进细胞融合的效力，必须采用较高浓度的PEG溶液，但在高浓度PEG溶液下，细胞可能因脱水而受到显著的破坏。因此，选择合适的PEG分子量，浓度及作用时间是PEG融合技术的关键。该方法的优点是：操作简单，容易获得融合体，融合效果好。

细胞融合率是指在显微镜的一个视野内，已发生融合的细胞核总数与该视野内所有细胞(包括已融合的细胞)的细胞核总数之比，通常以百分比表示。

【实验用品】

1．器材: 离心机、显微镜、天平、水浴锅、滴管、5ml离心管、烧杯、盖玻片、载玻片。2．材料：鸡血悬液。

3．试剂：

1）0.85%的生理盐水；

2）GKN液：8.0g NaCl，0.4g KCl, 1.77g Na2HPO4.2H2O，0.69g NaH2PO4.2H2O，2.0 g葡萄糖，0.01g 酚红，溶于1000mL重蒸水中。

3) 50%（m/V）PEG（43℃温浴）：

取50gPEG（相对分子质量＝4000）放入100ml瓶中，高压灭菌20min。让PEG冷却至50～60℃，勿让其凝固。加入50ml预热至50℃的GKN液，混匀，置37℃备用。

4）1%詹那斯绿B；

5) Hanks溶液（含NaCl，KCl, Na2HPO4, KH2PO4，MgSO4, CaCl2, 葡萄糖，酚红）Hanks原液（10×）

NaCl 80.0g

Na2HPO4·12H2O 1.2g

KCl 4.0g

KH2PO40.6g

MgSO4·7H2O 2.0g

葡萄糖10.0g

CaCl2 1.4g

称取1.4g的CaCl2，溶于30～50ml的重蒸水中。取1000ml的烧杯及容量瓶各一个，先放重蒸水800ml于烧杯中，然后按照上述配方，逐一称取药品。必须在前一药品完全溶解后，方可放入下一药品，直到葡萄糖完全溶解后，再将已经溶解的CaCl2溶液加入，最后加水定容至1000ml。

Hanks液：

Hanks原液100ml

重蒸水896ml

0.5％酚红4ml

配好的Hanks液，分装(500ml/瓶)包扎好贴上标签，经过高压灭菌后，4℃保存。

6)抗凝剂

称取0.48g 柠檬酸，1.32g柠檬酸钠，1.47g葡萄糖溶于80ml重蒸水中，最后加水定容至100ml。

【实验步骤】

1.鸡血红细胞悬液的制备：将抗凝剂与鸡血按1:3~1:4的比例稀释，制成鸡血红细胞细胞悬液，放入4℃冰箱内可保存3~4天；

2.取鸡血1ml，加入4ml0.85%的生理盐水，1000rpm离心3min, 弃上清液，重复上述操作一次；

3.沉淀用适量（4ml）Hanks溶液重悬浮，1000rpm离心3min, 弃上清液，用（3ml）Hanks 溶液稀释沉淀，制成10%左右的细胞悬液，迅速在显微镜下观察细胞密度；

4. 取1ml上述细胞悬液，加0.5ml 50% PEG溶液，43℃水浴中进行细胞融合（30min左右）；

5.缓慢加入Hanks溶液至4ml，口底颠倒轻轻混匀，终止PEG的作用，使细胞三三两两地分散开来（镜检），室温静置约20min;

6.托底轻摇后，取1小滴悬液于载玻片上，加少量的詹那斯绿B染液，染色5min左右；

7.镜检，观察细胞融合现象。

【实验结果】

1.绘出已融合的细胞形态图，描述你所观察到的细胞融合现象。

2.计算细胞融合率。

【作业与思考】

1．请分析Hanks溶液的作用是什么（可以从其成分的角度来回答）？

2. PEG诱导细胞融合率受哪些因素影响？

3．你认为在进行细胞融合时，要注意哪些问题?

实验三动物骨髓细胞染色体标本的制备与观察

【实验目的】

（1）掌握动物骨髓细胞染色体标本的制备技术

（2）观察染色体的数目以及形态特征

【实验原理】

骨髓细胞具有丰富的细胞质和高度的分裂能力，因此不必经体外培养，也不需要植物血球凝集素（PHA）的刺激，可以直接观察到分裂细胞。经过秋水仙素处理后，分裂的骨髓细胞被阻断在有丝分裂中期，再经离心、低渗、固定、滴片等步骤，便可制作出理想的染色体标本，是研究动物细胞遗传学的好材料。骨髓细胞染色体标本的制备，具有取材容易，方法简单易行等优点，设备也简单，在一般的实验室都可进行。

【实验仪器、材料和试剂】

1.仪器：

天平、低速离心机、恒温水浴锅、显微镜、1ml注射器、解剖盘、解剖剪、刀片、试管架、10ml离心管、吸管、烧杯、量筒、酒精灯、冰冻载玻片、玻璃板、吸水纸、擦镜纸、研钵

2. 材料

小白鼠或无尾两栖类青蛙或蟾蜍

3. 试剂

1）Carnoy固定液（新配制的甲醇：冰醋酸＝3:1）；

2）0.1％秋水仙素：称取10mg秋水仙素，加入10ml的0.65％生理盐水（1ml含有1000ug，0.1ml含有100ug秋水仙素）；

3）0.85%生理盐水；1%柠檬酸钠溶液；2%柠檬酸钠溶液；0.4%KCl溶液（0.075M）

4）0.0667mol/L磷酸缓冲液（pH7.4）

A液：1000ml含Na2HPO4 9.465 g或Na2HPO4·2H2O 11.876g 或Na2HPO4·12H2O23.88g B液：1000ml含KH2PO4 9.07g

取A液80ml+B液20ml混匀成pH7.4磷酸缓冲液；

5）1:10 Giemsa磷酸盐缓冲液

Giemsa母液：Giemsa粉0.5g，甘油（AR级）33ml，甲醇（AR级）33ml

先将少量甘油加入研钵中，将Giemsa粉充分研细，再倒入剩余甘油，并在56℃温箱中保温2h，然后再加入甲醇混匀，储存在棕色瓶中。

【方法与步骤】

1.骨髓细胞制备如下表

步骤小鼠

（1）秋水仙素注射按4ug/g体重腹腔注射，3～4h后处死。

（2）取后肢胫骨和股骨，切去两端。

（3）取骨髓细胞2%柠檬酸钠溶液1ml

用1ml注射器吸取柠檬酸钠溶液，通过针头将溶液注入骨髓腔，冲出骨髓细胞置10ml离心管中（细胞冲净后骨髓腔由粉红变为白色）；摘掉针头，用注射器筒轻轻反复吸打，使分散成单个细胞。

（4）低渗处理预热及低渗水浴温度：37℃，低渗时间：30min

视细胞多少加入7～9ml 预热的0.4%KCl溶液，在水浴中低渗处理（7ml)。

2. 600g或1500rpm离心10min。

3. 弃上清，沿离心管壁缓慢加入新配制的甲醇：冰醋酸（3:1）固定液5ml，口底颠倒轻摇，注意不要冲动细胞团块。加完后立即口底颠倒混匀，静置固定20min重复离心一次，弃上清，再次加入固定液重复固定一次，静置20min。

4 固定的细胞经离心后，吸去上层固定液，视管底的细胞多寡加入少量0.5~1ml新配制的固定液，将细胞团块轻轻吸打成悬液（注意：吹打不要过于用力）。

5. 在干净并预冷的载玻片上滴1～2滴细胞悬液。（注意：滴片时滴管离载玻片有一定高度有助于染色体分散），室温干燥。

6. 将玻片细胞面朝上水平放置，滴加1:10 Giemsa磷酸盐缓冲液3～4ml，染色10min。

7. 自来水缓慢冲洗掉染液，干燥后镜检。

【结果分析】

（1）样品的染色体数目是多少？19对常染色体，1对性染色体。共40条

（2）要成功制备染色体标本，在操作中应注意哪些问题？

【实验提示】

过去实验中曾经出现的问题

（1）染色后发现没有骨髓细胞

原因：未能将细胞从骨髓腔中洗出；离心不慎造成细胞流失；低渗过度造成细胞破裂，染色体流失；冲洗不慎等

（2）染色体分散不佳而造成无法计数

原因：低渗控制不好造成细胞体积过小；干燥过度等

注意：随时镜检才能确定各步骤是否存在问题

低渗与离心等步骤的操作要轻。

观察细胞的标准为：

1．细胞完整，轮廓清晰，染色体分布在同一水平面上。

2．染色体形态和分布良好。

3．最好无重叠，即使有个别重叠，也要能明确辩认，以免差错。

4．所观察的细胞处于同一有丝分裂阶段，即染色体螺旋化程度或染色体长短大致一样。

在所观察的细胞周围，没有离散的单个或多个染色体存在，以免影响计数。

【作业和思考】

选择染色体清晰，分散度好的中期分裂相，计数染色体，显微摄影，打印出照片。

在制备小鼠骨髓细胞染色体时为什么要进行预固定？

因为在之前你得到的染色体都处于不同的分裂期，预固定是为了使这些细胞及其染色体都固定在当前所处的时期，便于观察。其实质就是把细胞杀死，使其无法继续进行有丝分裂。