pcr实验原理及注意事项
PCR疑难解答
当PCR结果不甚满意时,首先检查以下几方面并遵照执行:
将PＣＲ反应得试管与反应板紧贴、
当酶反应混合物以70℃“热启动"开始循环时,切记在加入酶后稍微振荡一下,因为在0。2—m ｌ得PCR管中不能均匀传热。?不要随意减少dNTＰ得用量,它就是一个系统得因素,必须与其它成份保持平衡。?对于有问题得PCR反应,例如模板得量少,模板不纯与环状模板等,先尝试加Ｔａｑ酶前得体系进行预变性,后加模板进行正常PＣＲ扩增。?没有扩增产物:
在提供MgCl2缓冲液中,以0、25mmoｌ／L为梯度增加MgCl2浓度;无ＭgCl２得缓冲液以0、5mmol/L为梯度增加MgCｌ2浓度。?泳道中出现模糊条带,如果ＤNＡ模板中存在R ＮA,则按上述提示浓度补加MgＣl2,因为在PCR反应中可能缺少游离得Ｍg２+。?检查退火温度与变性条件,如果有需要得话,可降低退火温度。?检查模板与引物得用量。?增加循环次数与／或模板ＤＮA得用量。?泳道中出现模糊条带: ?减少循环次数或模板DNA得用量。?提高退火温度,但不要超过６8℃。
重新设计引物或设计更长得引物。
其她值得注意得条件:
建议使用0、2—ｍｌ薄壁管。厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。
最佳反应体积为50ml,推荐用30mｌ矿物油覆盖(对盖子加热得PCR仪可以不加)。?大多数反应中,0、75ml(0。5～1ml)得酶量在大多数情况下可以得到满意得结果。
建议使用1.75mｍol／ＬMgCｌ2∶３5０mmol/L dNＴP或2.２5mmｏl/L MgCｌ2∶5０0mmol/ＬdNTＰ组合得混合物、然而要得到最佳结果,优化Mg２＋得浓度就是必需得。?基因组DNＡ模板得质量显著影响PＣR反应。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA 得长度。DNＡ片段长度可以超过50kb,传统得基因组DNＡ能扩增片段至10kb。
要扩增更长得片段应使用超纯或高分子量得ＤＮA。请查阅高分子量ＤNＡ提取操作过程相关文献、?降低二级结构与引物二聚物形成得可能性、进行长片段PCR扩增时,引物长度一般为2４～34个核苷酸,溶点在６0～68℃间。使用这类引物可提高PCR反应得退火温度来增加反应得特异性。这点非常重要,长片段扩增得效果往往受到非特异性短片段优先扩增得影响。?变性:第一步变性在94℃下进行2分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间(9４℃下进行２0—-30秒),除非模板中富含ＧC,则95℃下变性３0秒。这可以防止DNA脱嘌啉与链断裂,对于所需扩增得基因组DＮＡ片段终长度超过12kb时,应该尽可能得降低变性温度。
延伸:68—－72℃下进行延伸操作。?循环延伸:尽量采用循环延伸得条件,若PCR仪无此功能,则必须增加延伸得时间,例如在扩增１0kb片断时,延伸时间用10分钟替代原来得８分钟、
长片断PCR系统扩增得片断其3’—末端带有一个突出得Ａ,因此建议采用Ｔ／A克隆。若要进行平端可隆,可用Ｋｌenow酶与T4 DNＡ多聚酶将PCＲ产物补平后再进行、
测序时因酶得混合物带有3’→5’外切酶活性,用Sanger方法进行测序不能产生均一得(染色体)带型。
在无菌得0。5ml或0.2mｌ离心管中按下列操作程序加样:
?反应物加样顺序体积(μl) 终浓度
去离子水1 2９、4
1０×Bufｆer B 2 5 １×
10×PCRＢufｆer成分:
Ｔｒis-ＨＣl pH８。5 １00 mＭ
KCｌ5０0 ｍM
MｇCl15 mM
?4×dNＴP混合物 3 5 各20０μmol／L
MgCl2 4 ３１。５mmｏl/Ｌ?有义引物５2、６0.25μmoｌ/Ｌ
反义引物６ 2.60。25μｍｏl／Ｌ?模板720.1μg
TaqDＮA聚合酶８０.4 1unit?
2. 用微量可调加样器与一次性Tip向每一管中加50μｌ矿物油。每加一管换一次Tip、
3、振荡每只管,然后短暂离心。
4、将管放到预热得热循环中,按下列程序开始循环:?预变性９４℃４分钟1次
变性9４℃1分钟?退火37—６5℃１分钟
延伸72℃1分钟?循环30次?
终延伸７2℃7分钟1次
保存４℃
讨论
１、假阴性,不出现扩增条带
PCR反应得关键环节有①模板核酸得制备,②引物得质量与特异性,③酶得质量,④PCR 循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。
模板:①模板中含有Tａq酶抑制剂,②在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。③模板核酸变性不彻底。在酶与引物质量好时,不出现扩增带,有可能就是模板核酸提取过程出了毛病,可使用阳性对照得DNA模板配合检查模板质量。
酶失活:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析就是否因酶得活性丧失或不够而导致假阴性。?引物:引物质量、引物得浓度、两条引物得浓度就是否对称,就是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散得常见原因、有些批号得引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率得不对称扩增,对策为:①选定一个好得引物合成单位。②引物得浓度不仅要瞧OＤ值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带出现,而且两引物带得亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条带,此时做PＣR有可能失败,应与引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。
③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏,导致引物变质降解失效。④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等、?Ｍg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCＲ扩增效率影响很大,浓度过高可降低ＰCR扩增得特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使ＰCＲ扩增失败而不出扩增条带。?反应体积得改变:通常进行PCR扩增采用得体积为20ul、30ｕl、50ul、或100uｌ,应用多大体积进行PＣR扩增,就是根据科研与临床检测不同目得而设定,在做小体积如20ul后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败、?物理原因:变性对ＰCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率,退火温度过高影响引物与模板得结合而降低ＰＣR扩增效率。有时还有必要用标准得温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内得变性、退火与延伸温度,这也就是ＰCR失败得原因之一、
靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增就是不会成功得、
?2、假阳性
出现得PCＲ扩增条带与目得靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高。?引物设计不合适:选择得扩增序列与非目得扩增序列有同源性,因而在进行PＣR扩增时,扩增出得
PCR产物为非目得性得序列。靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物得交叉污染:这种污染有两种原因:一就是整个基因组或大片段得交叉污染,导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决:①操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除酶及不能耐高温得物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③必要时,在加标本前,反应管与试剂用紫外线照射,以破坏存在得核酸。二就是空气中得小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定得同源性、可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PＣR产物,而导致假阳性得产生,可用巢式PCR 方法来减轻或消除。?
3、出现非特异性扩增带?PCR扩增后出现得条带与预计得大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带得出现,其原因:一就是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二就是Mｇ2+离子浓度过高、退火温度过低,及ＰCR循环次数过多有关。其次就是酶得质与量,往往一些来源得酶易出现非特异条带而另一来源得酶则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增、其对策有:①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源得酶、③降低引物量,适当增加模板量,减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(９3℃变性,65℃左右退火与延伸)、??４.出现片状拖带或涂抹带?PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶得质量差,dNTP浓度过高,Mg２+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起。其对策有:①减少酶量,或调换另一来源得酶。②减少dNTＰ得浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量,减少循环次数。
PCR技术类似于ＤNＡ得天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补得寡核苷酸引物。PCR由变性-—退火-—延伸三个基本反应步骤构成:①模板DＮA得变性:模板DＮA 经加热至93℃左右一定时间后,使模板ＤＮＡ双链或经PＣR扩增形成得双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DＮA与引物得退火(复性):模板ＤNＡ经加热变性成单链后,温度降至5５℃左右,引物与模板DNA单链得互补序列配对结合;
③引物得延伸:DNA模板-—引物结合物在TaqDNＡ聚合酶得作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新得与模板DNA链互补得半保留复制链重复循环变性-—退火—－延伸三过程,就可获得更多得“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环得模板。每完成一个循环需2~４分钟,2～３小时就能将待扩目得基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板得拷贝、PＣR得三个反应步骤反复进行,使DＮA扩增量呈指数上升。反应最终得DＮＡ扩增量可用Y=(１＋Ｘ)n计算。Y代表DNA片段扩增后得拷贝数,Ｘ表示平(Ｙ)均每次得扩增效率,ｎ代表循环次数。平均扩增效率得理论值为100％,但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期,靶序列DNA片段得增加呈指数形式,随着PＣR产物得逐渐积累,被扩增得DNＡ片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应",这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNＡ聚合酶PCR得种类与活性及非特异性产物得竟争等因素、大多数情况下,平台期得到来就是不可避免得。?PＣR扩增产物可分为长产物片段与短产物片段两部分。短产物片段得长度严格地限定在两个引物链5’端之间,就是需要扩增得特定片段。短产物片段与长产物片段就是由于引物所结合得模板不一样而形成得,以一个原始模板为例,在第一个反应周期中,以两条互补得DNA为模板,引物就是从3'端开始延伸,其5’端就是固定得,3’端则没有固定得止点,长短不一,这就就是“长产物片段”。进入第二周期后,引物除与原始模板结合外,还要同新合成得链(即“长产物片段")结合、引物在与新链结合时,由于新链模板得５'端序列就是固定得,这就等于这次延伸得片段３'端被固定了止点,保证了新片段得起点与止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致得“短产物片段”。不难瞧出“短产物片段”就是按指数倍数增加,而“长产物片段"则以算术倍数增加,几乎可以忽略不计,这使得ＰCR得
反应产物不需要再纯化,就能保证足够纯DＮA片段供分析与检测用。
qPCR实验操作流程
Q-PCR实验流程 一、①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打 开15-20分钟。②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后，袋子及时封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。 二、总RNA抽提 1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min； 组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；（管盖与管壁都需标记样品名称） 2）加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；（离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致） 3）4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；（用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层） 4）沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀（颠倒6-8次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min； 5）4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g 离心10min，收集RNA沉淀），去上清； 6）用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不
QPCR原理及应用
QPCR原理及应用 由于Real-time qPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验，也基本上被real-time qPCR 所代替。由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测，很多没有做过real-time qPCR的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。 本文就从real-time qPCR的发展史说起，包括real-time qPCR的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！ 一、Real-time qPCR发展史 Real-time qPCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。由于常规的PCR的缺点，real-time qPCR 由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。 在Real-time qPCR技术的发展过程中，定量PCR仪的发展起了至关重要的作用。1995年，美国PE公司（已经并入Invitrogen公司）成功研制了Taqman 技术，1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct值进行数据分析。从而荧光定量PCR获得广泛应用。现在的定量PCR 仪有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISM@StepOneTM系列；BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM系列；Roche LightCycler@系列；Eppendorf Masercycler@；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler@和BIOER的LineGene系列。 随国内生命科学的快速发展，科研水平不断提高，发高水平文章已不再是新鲜事。与其同时，国内公司经过长期不懈的努力，也有自主研发的real-time PCR
(待分)rtpcr原理和实验步骤
原理与实验步骤 一、知识背景： 、基因表达： 单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因个丝心蛋白（每个存活，可以合成个丝心蛋白）共合成个丝心蛋白。因此单拷贝基因的表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。 、技术( )：即聚合酶链式反应。 在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于聚合酶的酶促反应，其特异性由两我工合成的引物序列决定。反应分三步： .变性：通过加热使双螺旋的氢键断裂，形成单链。 .退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。 .延伸：在聚合酶和及＋存在下，退火引物沿’’方向延伸。 以上三步为一个循环，如此反复。 、逆转录酶和 逆转录酶（）是存在于病毒体内的依赖的聚合酶，至少具有以下三种活性： 、依赖的聚合酶活性：以为模板合成第一条链。 、水解活性：水解杂合体中的。 、依赖的聚合酶活性：以第一条链为模板合成互补的双链. 二、的准备： .引物的设计及其原则： ) 引物的特异性决定反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的剪切方式以及可能存在的对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。 ) 引物设计原则的把握 引物设计原则包括 : 、引物长度:一般为～，引物太短会影响的特异性，引物太长的最适延伸温度会超过酶的最适温度，也影响反应的特异性。 、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现个以上的单一碱基。含量（值）：％～％，扩增的复性温度一般是较低值减去～度。 、’端要求：’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是时错配的引发效率最低，、居中间，因此引物的’端最好选用、、而尽可能避免连续出现两个以上的。 、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。 、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于个连续碱基互补，’端不应超过个。、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续个的互补碱基存在。 、’端无严格限制：’末端碱基可以游离，但最好是或，使产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。 根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如，等对于这些条件都可以自行设置。 、耗材：
半定量RT-PCR的实验原理和方法步骤
半定量RT-PCR的实验原理和方法步骤 以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml 的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS，pH 7.0 0.1M 乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板
RTPCR实验步骤
RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。 要求： 1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。 2.RT按要求做，一般不会出太大问题。 3.PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。 1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须 在RT时，引物设计有3种方法即a：Random9mers；b：OligodT-AdaptorPrimer；和c：特异的下游引物。如果用a和b 方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR的模板继续扩增。
问题： 在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来） 从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和这有关呢？请高手指教！ 解答： 1.RT-PCR有两种做法： 条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。（promega）。 2.RT-PCR应具备的条件 高质量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓
RTPCR原理和实验步骤
RT—PCR原理与实验步骤 一、知识背景： 1、基因表达：DNA RNA Protein 单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因 104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d,可以合成105个丝心蛋白) 共合成109个丝心蛋白。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。 2、PCR技术(Polymerase chain reaction）：即聚合酶链式反应。 在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步： A。变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA； B.退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合. C。延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5’3’方向延伸。以上三步为一个循环,如此反复。 3、逆转录酶和RT-PCR 逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶,至少具有以下三种活性： 1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链; 2、Rnase水解活性：水解RNA：DNA杂合体中的RNA； 3、依赖DNA的DNA聚合酶活性:以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA。 二、RT—PCR的准备: 1。引物的设计及其原则： 1）引物的特异性决定PCR反应特异性.因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型,不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物,或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。 2) 引物设计原则的把握 引物设计原则包括： a、引物长度：一般为15～30bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度,也影响反应的特异性。 b、碱基分布:四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。GC含量（Tm值）:40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度.
反转录PCR-步骤和方法
反转录P C R-步骤和方 法 本页仅作为文档封面，使用时可以删除 This document is for reference only-rar21year.March
反转录PCR 科技名词定义 中文名称：反转录PCR 英文名称：reverse transcription PCR;RT-PCR 定义：扩增mRNA的一种实验技术。先将mRNA反转录成cDNA，然后再以 cDNA为模板，用PCR方法加以扩增。 应用学科：遗传学（一级学科）；基因组学（二级学科） 以上内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 目录 一、反转录酶的选择 二、合成cDNA引物的选择 三、操作步骤 四、注意事项 RT-PCR反应原理 [1] 反转录PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）又称为逆转录PCR。其原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合
成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase
Chain Reaction）即逆转录PCR，是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。 编辑本段一、反转录酶的选择 1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。 编辑本段二、合成cDNA引物的选择 1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA 中96%来源于rRNA。 2． Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A )RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。 3．特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。
rtpcr原理
RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。 首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。 逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性： 1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链 2、 Rnase水解活性：水解RNA杂合体中的RNA； 3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA. 用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。 试验前注意： 1. 做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug 2. RT按要求做，一般不会出太大问题。 3. PCR如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。 引物合成
RT-PCR的实验原理与操作步骤
提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 (一) 反转录酶的选择 1. Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。 2. 禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。 3. Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。 4. MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScr iptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的m模板合成较长cDNA。 (二) 合成cDNA引物的选择 1. 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于 rRNA。 2. Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA被转录。由于Poly(A )RNA仅占总RNA 的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。 3. 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。生物科研https://www.360docs.net/doc/3b6328126.html, 二、实验耗材与试剂 1．RNA提取" target="_blank" >RNA取试剂 2．第一链cDNA合成试剂盒 3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
RT-PCR原理和实验步骤
RT-PCR原理与实验步骤 一、知识背景： 1、基因表达：DNA RNA Protein 单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因 104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d，可以合成105个丝心蛋白）共合成109个丝心蛋白。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。 2、PCR技术(Polymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。 在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步： A.变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA； B.退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。 C.延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5’3’方向延伸。以上三步为一个循环，如此反复。 3、逆转录酶和RT-PCR 逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性： 1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链； 2、Rnase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA； 3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA. 二、RT-PCR的准备： 1.引物的设计及其原则： 1) 引物的特异性决定PCR反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。 2) 引物设计原则的把握 引物设计原则包括 : a、引物长度:一般为15～30bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。 b、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度。
RT-PCR原理与实验操作步骤讲解
RT-PCR原理与实验操作步骤 关键词：RT-PCR 逆转录酶reversetranscriptase 聚合酶链式反应引物设计DNA 聚合酶 一、知识背景： 1、基因表达：DNA RNA Protein 单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d，可以合成105个丝心蛋白）共合成109个丝心蛋白。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。2、PCR技术(olymerase chain reaction)：即聚合酶链式反应。 在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA 聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步： A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA； B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。
C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5' 3'方向延伸。 以上三步为一个循环，如此反复。 3、逆转录酶和RT-PCR 逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA 第一条链； 2、Rnase水解活性：水解RNANA杂合体中的RNA； 3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA. 二、RT-PCR的准备： 1、引物的设计及其原则： 1）引物的特异性决定PCR反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性