凝胶层析柱特性测试
凝胶层析柱特性分析
（实验报告）
实验日期：2015年4月21日实验温度：室温
实验地点：生物化学与遗传学实验室指导老师：******
班级：2013级生物技术1班姓名：***** 学号：******
I. 实验目的
1.掌握凝胶层析柱的基本原理；
2.学习凝胶层析柱的操作技术；
3.了解凝胶层析柱的应用。
II. 实验原理
凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。把含有不同大小分子的混合液，铺加在胶面上，让它流过凝胶柱。由于凝胶具有网络结构，当混合液通过凝胶颗粒缝隙中时，溶液中的溶质凡是比网孔小的分子，都能自由进入颗粒内部，而比网孔大的分子则不能进入。因此，在洗脱过程中，大分子物质必然先于小分子物质向下移行，先流出的是大分子物质，小分子物质后流出，从而达到分离的目的。
在凝胶层析中，凝胶粒子间隙的外水相当于移动相，粒子内水相当于固定相。当溶质随洗脱液自上向下移动时，溶质在内水之间连续不断达成分配平衡。相对分子质量大的因不易渗入凝胶孔内，分配系数较小，用较少的洗脱液就能从
柱中洗脱出来；反之，相对分子质量小的因渗入凝胶孔内，分配系数较大，需较多的洗脱液才能从柱中洗脱出来。
为了精确地衡量混合物中某一被分离成分在一定的凝胶柱内的洗脱行为，常采用分配系数K d来衡量，K d的定义为：
i o
e d V V
V K -
=
式中V e ——某一成分的洗脱体积，即从加入样品算起，
到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积；
V o ——层析柱内凝胶凝胶颗粒之间空隙的总体积，
又称凝胶外水体积；
V i——层析柱内部微孔的总体积，亦称为内水体积。
洗脱体积V e与V o及V i之间的关系可表示为：
V e=V o+K d V i
当某种成分的K d值为0时，意味着这种成分完全被排阻于凝胶建立的微孔之外而最先洗脱出来，即V e=V o。可以用一个已知相对分子质量远远超过凝胶排阻极限的有色分
子如常用蓝色葡聚糖-2000溶液通过柱床，可测出柱床的外水体积V o。
当另一种成分的K d=1时，意味着这一成分完全不被排阻，它可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，在洗脱过程中它将最后流出柱外，V e=V o+V i。
处于上述极端情况（即分子最大与最小）之间的那些分
子，它们K d 值在大于0小于1的范围内。由此可见，K d 值得大小序列决定了被分离物质流出层析柱的顺序。K d 只与被分离物质分子的大小和凝胶孔隙的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关。
将凝胶装柱后，柱床总体积V t 是三种体积的总和，即凝胶颗粒外水体积V o 、凝胶颗粒内部的体积V i 和干凝胶颗粒体积V g 之和：V t =V o +V i +V g 。
V t 可从柱的直径d 和高度h 计算：1/4πd 2h 。
用有效分配系数（K av ）代替K d ，其定义为：
o t o e av V V V V K --=
本实验使用蓝色葡聚糖凝胶Sephadex G-50，其适用的相对分子质量范围在500～10000葡聚糖（线性分子）和1500～30000之间的多肽与蛋白质的分离。已含蓝色葡聚糖2000（相对分子质量在200万以上，呈蓝色）、细胞色素C （相对分子质量12400，呈红色）、铁氰化钾[K 3Fe(CN)6，相对分子质量329.26，呈黄色]的混合液做样品。当混合液流经G-50色谱柱时，三种有色物质因K d 不同，分级分离明显可见。通过作洗脱曲线可以计算出凝胶层析的特性参数。
III. 实验试剂与仪器
1.实验试剂
Sephadex G-50，蓝色葡聚糖-2000，细胞色素C ，铁氰化钾K 3[Fe(CN)6]，洗脱液Tris-HCl （0.05mol/L pH 7.5）。
2.实验器材
层析玻璃管（1cm×20cm），试管，烧杯，注射器，滴管、微量移液器，玻璃棒等。
IV.实验操作步骤
1. 凝胶溶胀称取3gSephadex G-50加入到50mL 蒸馏水中，沸水溶胀2h。用倾斜法除去凝胶上层水及细颗粒，以蒸馏水反复倾洗3～4次（此时无细小颗粒），再用0.05mol/L Tris-HCl（pH 7.5）洗脱洗涤后，将凝胶保存在洗脱液内。
2. 装柱将层析柱垂直地安装好，柱内装入洗脱液（dH2O），排除层析柱板下的空气泡，关闭底部出口，柱内留下约柱体积四分之一的洗脱液。加入搅拌均匀的Sephadex G-50的浆液，浆液不可太稀或太粘稠。装填时用一根玻璃棒，让浆液沿玻棒流入柱内（注射器灌柱，控制高度），同时打开柱底部出口，调流速0.3mL/min（10～12滴/min）。凝胶随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降到层析柱底部，不断补入均匀的浆液直到凝胶床高15cm为止，关闭出口。操作过程中注意决不能让凝胶床表面露出液面，装填时尽量一次装完，防止凝胶床出现“纹路”和气泡。（注：凝胶装填完毕后，剪一张滤纸片置于凝胶上端）
3. 加样用洗脱液分别配成6mg/mL的蓝色葡聚糖
-2000、8mg/mL的细胞色素C、5mg/mL的铁氰化钾三种溶液，然后三种溶液等体积混匀，取0.18mL混合液上样。先
用滴管吸去凝胶床上面大部分液体，打开出口使洗脱液恰好流到床表面为止，关闭出口（打开开关将多余液体放至滤纸，关闭开关加入洗脱液，洗柱调节流速10～12滴/min），（将柱内洗脱液放至滤纸，不得残余液体，取混合样品加入柱内）用滴管（滴管使用原则：尽量接近凝胶面或液面，垂直悬空靠近）小心地将上述样品加于柱床上成一薄层，切勿搅动床表面（一次加入柱内，将样品全部加入柱内至滤纸，关闭开关加入适量洗脱液，开始收集）。打开出口使样品溶液渗入凝胶内，并开始收集并计量流出液体积。当样品溶液流至与凝胶界面相平时，立即用滴管取极少量洗脱液轻轻冲洗管壁两次，使残余样液全部渗入凝胶床内，当液面降至床表面时，再加入洗脱液进行连续洗脱。
4. 洗脱与收集调节洗脱液流速为0.3mL/min（10～12滴/min）（已完成），仔细观察记录样品在层析柱内的分离现象，收集并量取洗脱液体积，当收集达6.0mL时，换小试管每隔0.3mL收集一管，用肉眼观察颜色深浅，以“-、+、++、+++”符号记录三种物质洗脱液的颜色变化。（注：先出液收集：只记滴数。蓝色色带接近凝胶底部开始收集。每管20滴）
V. 实验结果分析
1.绘制洗脱曲线：
以洗脱体积为横坐标，洗脱液的颜色强度为纵坐标作洗
脱曲线。
洗脱液颜色强度变化表
管号
1 2 3 4 5 6 7 8 9
蓝色葡聚糖- + +++ + - - - - - 细胞色素C - - - + +++ ++ ++ ++ ++ 铁氰化钾- - - - - - - - -
管号10 11 12 13 14 15 16
蓝色葡聚糖- - - - - - -
细胞色素C + + - - - - -
铁氰化钾+ + +++ ++ + + -
2.计算凝胶柱Vt、V o及各成分的Ve和Kav
①每滴0.05mL每管20滴未收集部分的体积98滴98×0.05mL=4.9mL
②外水体积V o=4.9+0.05×20+0.05×20=6.9mL
柱体积V t=4.9+0.05×4×20+0.05×2×20/2=9.9mL
③K蓝色葡聚糖-2000=V e－V o/V t－V o=0（V e=V o）
K铁氰化钾=V e－V o/V t－V o=1（V e=V t）
VI. 注意事项
1.平时放置冰箱，取出放室温；
2.架柱垂直防漏放一半dH2O；
3.凝胶使用完毕回收。
凝胶过滤层析的基本操作
凝胶过滤层析的基本操 作 Company Document number：WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998
凝胶过滤层析的基本操作 ①凝胶介质的选择 根据待分离蛋白质的分子量选择具有相应分离范围的凝胶。对于未知蛋白，应选用分离范围较宽的凝胶，如用Sephacryl S-300。对于分子量在3~5kDa的蛋白质，脱盐时应选用Sephadex G 50或G 25；而对于小分子量多肽物质（1~5kDa），脱盐则应选用Sephadex G 10或Sephadex G 15。 ②凝胶介质的处理和装柱 商品凝胶一般是干粉，使用前应用水溶胀。一般情况下，1份凝胶加十份水，自然溶胀至少24小时。溶胀后，将上清中细小的凝胶碎块弃除，重新搅拌悬起，待凝胶沉淀后，再次弃去凝胶碎块，重复数次，直到液相澄清为止。为加速溶胀，可将凝胶煮沸一小时，该法同时具有灭菌的作用。 凝胶过滤层析柱的长与直径的比例应为50~100:1。装柱时柱体要垂直，先在柱内加入约 1/3柱床体积的水或缓冲液，然后沿柱一侧将缓冲液中的凝胶（凝胶：缓冲液=3：1）搅拌均匀，缓慢并连续地一次性注入柱内。装柱过程中，要避免柱内缓冲液流干，注意保持柱体凝胶均匀无气泡和裂缝。装完后，可用2 ml蓝色葡聚糖溶液检查柱体的均匀性。如柱体均匀，可见蓝色区带均匀平稳地通过凝胶，不留任何条纹。要保持凝胶和缓冲液温度一致，以减少气泡的产生。 ③上样 凝胶过滤柱层析对于样品的体积有严格的要求。样品体积不应超过柱床体积的1~5 %，如超过5 %，则会导致分离效率降低，低于1 %则分离效率也不会提高，所以蛋白质样品应尽可能浓缩至10~20 mg/ml。样品本身对洗脱液的相对粘度不能超过2，样品粘度过高，会使层析区带不稳定，或流速不规律，区带变宽或扭曲。上样前样品应经μm孔径滤膜过滤或10， 000 g离心5 min，去除残渣，加样时避免破坏柱体表面，保持其表面均匀平整。 ④洗脱 洗脱液应保持一定的离子强度以消除凝胶中含有的游离羧基和硫酸根等与蛋白质的结合作用。Sephadex和Sepharose CL凝胶层析所用的洗脱液的离子强度至少应为 mol/L；Sephacryl凝胶应为 mol/L。有时洗脱溶液的离子强度甚至可达 mol/L，以保证蛋白质不与凝胶介质结合。 在凝胶过滤层析过程中，洗脱速度要恒定。流速不应过高，一般在 1ml/min左右，低流速可提高分辨率。可以用恒流泵控制流速。 ⑤分离蛋白的监测和收集 凝胶过滤层析中，分离蛋白的监测和搜集与离子交换层析相同。
检测系统的基本特性
第２章 检测系统的基本特性 2.1 检测系统的静态特性及指标 2.1.1检测系统的静态特性 一、静态测量和静态特性 静态测量：测量过程中被测量保持恒定不变（即dx/dt=0系统处于稳定状态）时的测量。 静态特性（标度特性）：在静态测量中，检测系统的输出－输入特性。 n n x a x a x a x a a y +++++= 332210 例如：理想的线性检测系统： x a y 1= 如图2-1-1(a)所示 带有零位值的线性检测系统：x a a y 10+= 如图2-1-1(b)所示 二、静态特性的校准（标定）条件――静态标准条件。 2.1.2检测系统的静态性能指标 一、测量范围和量程 1、 测量范围：（x min ，x max ） x min ――检测系统所能测量到的最小被测输入量（下限） x max ――检测系统所能测量到的最大被测输入量（上限）。 2、量程： min max x x L -= 二、灵敏度S dx dy x y S x =??=→?)( lim 0 串接系统的总灵敏度为各组成环节灵敏度的连乘积 321S S S S = 三、分辨力与分辨率 1、分辨力：能引起输出量发生变化时输入量的最小变化量min x ?。 2、分辨率：全量程中最大的min x ?即min max x ?与满量程L 之比的百分数。 四、精度（见第三章） 五、线性度e L max .. 100%L L F S e y ?=± ? max L ?――检测系统实际测得的输出－输入特性曲线（称为标定曲线）与其拟合直线之
间的最大偏差 ..S F y ――满量程（F.S.）输出 注意：线性度和直线拟合方法有关。 最常用的求解拟合直线的方法：端点法 最小二乘法 图2-1-3线性度 a.端基线性度； b.最小二乘线性度 四、迟滞e H %100. .max ??= S F H y H e 回程误差――检测系统的输入量由小增大（正行程），继而自大减小（反行程）的测试 过程中，对应于同一输入量，输出量的差值。 ΔHmax ――输出值在正反行程的最大差值即回程误差最大值。 迟滞特性 五、稳定性与漂移 稳定性：在一定工作条件下，保持输入信号不变时，输出信号随时间或温度的变化而出 现缓慢变化的程度。 时漂： 在输入信号不变的情况下，检测系统的输出随着时间变化的现象。 温漂： 随着环境温度变化的现象（通常包括零位温漂、灵敏度温漂）。 2.2 检测系统的动态特性及指标 动态测量：测量过程中被测量随时间变化时的测量。 动态特性――检测系统动态测量时的输出－输入特性。 常用实验的方法： 频率响应分析法――以正弦信号作为系统的输入；
凝胶渗透柱层析法
凝胶渗透柱层析法 南大生科院基础实验中心庄苏新、罗喜牛 4、试剂与配制： 4-1、试剂： (1)、葡聚糖凝胶 (2)、磷酸氢二钠 (3)、磷酸二氢钠 (4)、血红蛋白 (5)、核黄素 4-2、试剂配制： (1)、磷酸缓冲液（0.05 mol / L,pH 7.4）的配制： 分别称取磷酸二氢钠克；磷酸氢二钠克于一烧杯中，加蒸馏水毫升，搅拌溶解即可。 (2)、样品溶液的配制： 分别称取血红蛋白20.0毫克;核黄素20.0毫克于一烧杯中，加磷酸缓冲液10.0毫升， 搅拌溶解即可(2.0mg/ml)。 5、操作步骤： （1）、选择固定层析柱： 观察层析柱底端过滤及其它部件连接是否完好？将选择的层析柱垂直固定到台式铁架上，关闭柱底端出口，并向柱内注入一定量的平衡缓冲液，然后再打开柱底端出口，排除柱低端和连接出口的塑料管道内气泡，气泡排除完毕，再次关闭柱底端出口，并在层析柱内留有适量的平衡缓冲液。 （2）、装柱方法： 将烧杯中处理好的葡聚糖凝胶，用玻棒充分搅拌成悬浮液，随即用玻棒引流缓缓倒入层析柱中，静置约5分钟（或出现明显分层现象），再打开层析柱底端出口，让其柱内液体流出，同时柱内葡聚糖凝胶此时也向柱底端下沉，当柱床体积表面不下沉时，此时的高度即为柱床体积的实际高度，观其柱床体积高度是否与实验要求相一致。如果柱床体积过高或过低，则需要弃去多余或添加适量的葡聚糖凝胶，但是，无论是弃去多余葡聚糖凝胶还是添加适量的葡聚糖凝胶，首先需要关闭层析柱底端出口。然后用玻棒将柱床体积上部（要有足够的磷酸缓冲液，便于搅匀）1/3处充分搅匀，搅匀后用滴管吸去多余的葡聚糖凝胶或继续添加适量的葡聚糖凝胶悬浮液，如此反复多次操作，直至沉积高度达到实验所需的柱床体积高度为止。同时在装柱过程中要防止柱床流干。柱装好后，应无节痕，气泡，斑纹，界面平整等。（3）、平衡方法： 柱装好后，使柱床体稳定5.0—10.0分钟，然后接上恒流泵，打开柱下端的出口，用 2.0倍于床体积的磷酸缓冲液进行充分的平衡。同时也使层析柱床体稳定。平衡完毕，关闭恒流泵，打开柱上端端口，让其柱内平衡缓冲液继续流出至与柱床体积表面相平时，关闭层析柱底端出口，准备加样。 （4）、加样方法： 加样前先启动已调试完毕的色谱工作站（如：电脑、紫外检测仪和恒流泵等装置），使整个装置处于工作状态。然后按实验要求吸取1.0毫升样液沿柱管内壁缓缓加入，加样完毕，打开层析柱底端出口，等样液面流至与柱床体积表面相平时，关闭层析柱底端出口，准备洗涤。（5）、洗涤方法： a、洗涤柱内壁：取少量磷酸缓冲液（与上样量等体积），沿柱内壁四周缓缓加入柱内，加完毕，打开层析柱底端出口，等洗涤液面流至与柱床体积表面相平时，关闭层析柱底端出口。
测试技术第二章答案
第二章 习题 2-1：典型的测量系统有几个基本环节组成其中哪个环节的繁简程度相差最大 典型的测试系统，一般由输入装置、中间变换装置、输出装置三部分组成。其中输入装置的繁简程度相差最大，这是因为组成输入装置的关键部件是传感器，简单的传感器可能只由一个敏感元件组成，如测量温度的温度计。而复杂的传感器可能包括敏感元件，变换电路，采集电路。有些智能传感器还包括微处理器。 2-2：对某线性装置输入简谐信号x(t)=asin(φω+t )，若输出为y(t)=Asin(Φ+Ωt )，请对幅值等各对应量作定性比较，并用不等式等数学语言描述它们之间的关系。 x(t)=asin(φω+t )→y(t)=Asin(Φ+Ωt ), 根据线性装置的输入与输出具有的频率保持特 性可知，简谐正弦输入频率与输出频率应相等，既有：Ω=ω，静态灵敏度：K=a A = 常数，相位差：△??-Φ== 常数。 2-3：传递函数和频响函数在描述装置特性时，其物理意义有何不同 传递函数定义式：H （s ）=)()(s x s y =0 11 10 111a s a s a s a b s b s b s b n n n n m m m m ++++++++----ΛΛ，其中s=+αj ω称拉氏算子。H(s)是描述测量装置传输，转换特性的数学模型，是以测量装置本身的参数表示输入与输出之间的关系，与装置或结构的物理特性无关。 频率响应函数定义式： H （ωj ）=)()(ωωj x j y =0 11 10 111)())()()()(a j a j a j a b j b j b j b n n n n n n n n ++++++++----ωωωωωωΛΛ 反映了信号频率为ω时输出信号的傅氏变换与输入信号的傅氏变换之比。频率响应函数H （ωj ）是在正弦信号激励下，测量装置达到稳态输出后，输出与输入之间关系的描述。H （s ）与H （ωj ）两者含义不同。 H （s ）的激励不限于正弦激励。它不仅描述了稳态的也描述了瞬态输入与输出之间的关系。 2-4：对于二阶装置，为何要取阻尼比ζ=～ 当阻尼比ζ= ～时，从幅频特性曲线上看，几乎无共振现象，而且水平段最长。这意味着工作频率范围宽，即测量装置能在0～ω的较大范围内保持近于相同的缩放能力。满足了A(ω)= C 的不失真测量条件。 从相频特性曲线上看几乎是一条斜直线。这意味着ωτω?0)-=（，因此满足相频不失真测量条件。
第三章 测试系统的基本特性
第三章 测试系统的基本特性 （一）填空题 1、某一阶系统的频率响应函数为1 21)(+= ωωj j H ，输入信号2 sin )(t t x =，则输出信号)(t y 的频率为= ω，幅值= y ，相位= φ。 2、试求传递函数分别为5.05.35 .1+s 和2 22 4.141n n n s s ωωω++的两个环节串联后组成的系统 的总灵敏度。为了获得测试信号的频谱，常用的信号分析方法有、 和 。 3、当测试系统的输出)(t y 与输入)(t x 之间的关系为)()(00t t x A t y ?=时，该系统能实现 测试。此时，系统的频率特性为=)(ωj H 。4、传感器的灵敏度越高，就意味着传感器所感知的越小。5、一个理想的测试装置，其输入和输出之间应该具有 关系为最佳。 （二）选择题1、 不属于测试系统的静特性。 （1）灵敏度 （2）线性度（3）回程误差（4）阻尼系数 2、从时域上看，系统的输出是输入与该系统 响应的卷积。（1）正弦 （2）阶跃 （3）脉冲 （4）斜坡 3、两环节的相频特性各为)(1ωQ 和)(2ωQ ，则两环节串联组成的测试系统，其相频特性 为 。 （1）)()(21ωωQ Q （2）)()(21ωωQ Q +（3）) ()() ()(2121ωωωωQ Q Q Q +（4）) ()(21ωωQ Q ?4、一阶系统的阶跃响应中，超调量 。 （1）存在，但<5％（2）存在，但<1（3）在时间常数很小时存在 （4）不存在 5、忽略质量的单自由度振动系统是 系统。（1）零阶 （2）一阶 （3）二阶 （4）高阶 6、一阶系统的动态特性参数是 。 （1）固有频率 （2）线性度 (3)时间常数（4）阻尼比 7、用阶跃响应法求一阶装置的动态特性参数，可取输出值达到稳态值 倍所经过的
葡聚糖凝胶层析实验报告
葡聚糖凝胶层析实验报告 一、实验目的 1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理； 2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。 二、实验原理 凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。 对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排 阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水 体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的 筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。 分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出 柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小 分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这 些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶 层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。 三、仪器、材料和试剂 1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。 2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。 四、实验步骤 1、装柱
将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。 2、上样 装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。 3、洗脱和收集 打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。 4、样品的检测 收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。 五、实验结果及分析 1、实验结果： 2、蛋白质样品洗脱曲线：
生物制药工艺学习题 第七章 凝胶层析
第七章凝胶层析 一、填空题 1、凝胶层析的分离原理有、、。这三种分离原理是互相补充的，在通常情况下起主导作用；的作用随流速增加而加强；只有在流速很高时才起作用。 2、琼脂糖凝胶的一个特征是分离的分子量范围非常大，其分离范围随着凝胶浓度上升而，颗粒强度随浓度上升而。 3、凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。一般来说，细粒凝胶柱流速低，洗脱峰窄，分辨率，多用于等。粗粒凝胶柱流速高，洗脱峰平坦，分辨率，多用于等。 4、在作分级分离时，为了提高分辨率，多采用比样品体积大倍以上的柱体积， 以上的柱比，较吸液量、较粒的凝胶固定相。5、溶质通过色谱柱时造成的峰加宽效应包括、、 、。 6、葡聚糖凝胶的孔径大小取决于，其越小，凝胶孔径越；而琼脂糖凝胶的孔径却依赖于。 二、选择题 1、凝胶层析中，有时溶质的Kd>1，其原因是（） A.凝胶排斥 B.凝胶吸附 C.柱床过长 D.流速过低 2、凝胶层析中，有时小分子溶质的Kd<1，其原因是（） A.水合作用 B.凝胶吸附 C.柱床过长 D.流速过低 3、在凝胶层析中样品各组分最先淋出的是（） A.分子量最大的 B.体积最大的 C.分子量最小的 D.体积最小的 4、为了进一步检查凝胶柱的质量，通常用一种大分子的有色物质溶液过柱，常见的检查物质为蓝色葡聚糖，下面不属于它的作用的是（） A.观察柱床有无沟流 B.观察色带是否平整 C.测量流速 D.测量层析柱的外水体积 5、在选用凝胶层析柱时，为了提高分辨率，宜选用的层析柱是（） A.粗且长的 B.粗且短的 C.细且长的 D.细且短的
三、名词解释 1、全排阻： 2、类分离： 3、分级分离： 4、柱比： 5、操作压： 6、全渗入： 7、分离度R s： 四、问答题 1、试述公式V e=V0+K d V i 各字母的物理意义。 2、利用凝胶层析如何测定蛋白质的分子量？ 3、凝胶层析的应用主要有哪些？并说明其原理。 第七章凝胶层析（答案） 一、填空题 1、凝胶层析的分离原理有平衡排除理论、扩散分离理论、流动分离理论。这三种分离原理是互相补充的，在通常情况下平衡排除理论起主导作用；扩散分离理论的作用随流速增加而加强；只有在流速很高时流动分离理论才起作用。 2、琼脂糖凝胶的一个特征是分离的分子量范围非常大，其分离范围随着凝胶浓度上升而下降，颗粒强度随浓度上升而提高。 3、凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。一般来说，细粒凝胶柱流速低，洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离等。粗粒凝胶柱流速高，洗脱峰平坦，分辨率低，多用于脱盐等。 4、在作分级分离时，为了提高分辨率，多采用比样品体积大25 倍以上的柱体积，25 以上的柱比，较大吸液量、较细粒的凝胶固定相。 5、溶质通过色谱柱时造成的峰加宽效应包括分子扩散、涡流扩散、流动相中传质阻力、固定相中传质阻力。 6、葡聚糖凝胶的孔径大小取决于交联度，其越小，凝胶孔径越大；而琼脂糖凝胶的孔径却依赖于琼脂糖浓度。 二、选择题 1、凝胶层析中，有时溶质的Kd>1，其原因是（B ） A.凝胶排斥 B.凝胶吸附 C.柱床过长 D.流速过低 2、凝胶层析中，有时小分子溶质的Kd<1，其原因是（A） A.水合作用 B.凝胶吸附 C.柱床过长 D.流速过低
葡聚糖凝胶G-25的使用方法
葡聚糖凝胶柱的使用方法： (1) 预处理 称取Sephadex G-25（50－100目）约5g ，加入蒸馏水100ml ，置室温下3h 进行溶胀。 (2) 装柱 凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。同时大开下口慢速流出蒸馏水。装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。否则，必须到出重装，装好后，用蒸馏水平衡2－3h 即可加样品分离。 (3) 加样 加样前，首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐（或留一极薄液层）为止。然后，由柱的上端加水解液2ml ，注意不要让溶液把凝胶冲松浮起，加完样品后，打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2－3次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。 (4) 洗脱与收集 洗脱时，用蒸馏水作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。本实验洗脱液流出的速度应控制在0.8－1.0ml/min 。洗脱液的收集采用分管连续顺序收集，每管收集3ml ，共收集10管。据经验，4或5号管核苷酸浓度最大，可作为层析鉴定的样品液。但因层析柱长度的差异，管号会有变化，必要时可用紫外检测A260nm ，找出浓度最大的管号。 (5) 凝胶的再生和回收 凝胶柱使用一次后，必须反冲疏松一次，平衡后再使用。若使用数次，就需要再生处理。用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl 溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性备用。若实验完毕，将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干，再用95%乙醇洗两次，在60℃烘箱中烘干，回收保存。
凝胶层析.
凝胶层析 简介 凝胶层析（gel chromatography）又称为凝胶排阻层析（gel exclusion chromatography）、分子筛层析（molecular sieve chromatography）、凝胶过滤（gel filtration）、凝胶渗透层析（gel permeation chromatography）等。它是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。1959年，Porath 和Flodin首次用一种多孔聚合物－交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不同分子量的样品，称为凝胶过滤。1964年，Moore制备了具有不同孔径的交联聚苯乙烯凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，称为凝胶渗透层析（流动相为有机溶剂的凝胶层析一般称为凝胶渗透层析）。随后这一技术得到不断的完善和发展，目前广泛的应用于生物化学、高分子化学等很多领域。 凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，它具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点，因此广泛用于蛋白质（包括酶）、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。 凝胶层析的基本原理 凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。层析过程如图11 所示。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。 凝胶层析的基本概念 1. 外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积、洗脱体积 如图3－6 所示，外水体积是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。内水体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。基质体积是指凝胶颗粒实际骨架体积。而柱床体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积。洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。我们设柱床体积为Vt，外水体积为Vo，内水体积为Vi，基质体积为Vg，则有： Vt＝Vo＋Vi＋Vg 由于Vg相对很小，可以忽略不计，则有： Vt＝Vo＋Vi 设洗脱体积为Ve，Ve一般是介于Vo 和Vt之间的。对于完全排阻的大分子，由于其不进入凝胶颗粒内部，而只存在于流动相中，故其洗脱体积Ve＝Vo；对于完全渗透的小分子，
检测系统的静态特性和动态特性
检测系统的静态特性和动态特性 检测系统的基本特性一般分为两类：静态特性和动态特性。这是因为被测参量的变化大致可分为两种情况，一种是被测参量基本不变或变化很缓慢的情况，即所谓“准静态量”。此时，可用检测系统的一系列静态参数（静态特性）来对这类“准静态量”的测量结果进行表示、分析和处理。另一种是被测参量变化很快的情况，它必然要求检测系统的响应更为迅速，此时，应用检测系统的一系列动态参数（动态特性）来对这类“动态量”测量结果进行表示、分析和处理。 研究和分析检测系统的基本特性，主要有以下三个方面的用途。 第一，通过检测系统的已知基本特性，由测量结果推知被测参量的准确值；这也是检测系统对被测参量进行通常的测量过程。 第二，对多环节构成的较复杂的检测系统进行测量结果及（综合）不确定度的分析，即根据该检测系统各组成环节的已知基本特性，按照已知输入信号的流向，逐级推断和分析各环节输出信号及其不确定度。 第三，根据测量得到的（输出）结果和已知输入信号，推断和分析出检测系统的基本特性。这主要用于该检测系统
的设计、研制和改进、优化，以及对无法获得更好性能的同类检测系统和未完全达到所需测量精度的重要检测项目进行深入分析、研究。 通常把被测参量作为检测系统的输入（亦称为激励）信号，而把检测系统的输出信号称为响应。由此，我们就可以把整个检测系统看成一个信息通道来进行分析。理想的信息通道应能不失真地传输各种激励信号。通过对检测系统在各种激励信号下的响应的分析，可以推断、评价该检测系统的基本特性与主要技术指标。 一般情况下，检测系统的静态特性与动态特性是相互关联的，检测系统的静态特性也会影响到动态条件下的测量。但为叙述方便和使问题简化，便于分析讨论，通常把静态特性与动态特性分开讨论，把造成动态误差的非线性因素作为静态特性处理，而在列运动方程时，忽略非线性因素，简化为线性微分方程。这样可使许多非常复杂的非线性工程测量问题大大简化，虽然会因此而增加一定的误差，但是绝大多数情况下此项误差与测量结果中含有的其他误差相比都是可以忽略的。
测试习题集-第二章 测试装置的基本特性
第二章测试装置的基本特性 2-1 试判断下述结论的正误并讲述理由。 (1) 在线性时不变系统中，当初始条件为零时，系统输出量与输入量值比的拉氏变换称为传递函数。 (2) 输入信号x(t)一定时，系统的输出y(t)将完全取决于传递函数H(s)，而与该系统的物理模型无关 (3) 传递函数相同的各种装置，其动态特性均相同。 (4) 测量装置的灵敏度越高，其测量范围就越大。 (5) 幅频特性是指响应与激励信号的振幅比与频率的关系。 (6) 测量装置的相频特性φ(ω)表示了信号各频率分量的初相位和频率间的函数关系。 (7) 一个线性系统不满足“不失真测量”条件，若用它传输一个 1000Hz 的正弦信号，则必然导致输出波形失真。 2-2 某压力测量系统由压电式传感器、电荷放大器和笔式记录仪组成。压电式压力传感器的灵敏度为 90 pC/kPa，将它与一台灵敏度调到 0.005 V/pC的电荷放大器相联。电 荷放大器输出又接到灵敏度调成 20 的笔式记录仪上。试计算该测量系统的总灵敏度。又当电压变化为 3.5 kPa时，记录笔在纸上的偏移量是多少？ 2-3 某压力传感器在其全量程 0-5 MPa范围内的定度数据如题 2-3 表，试用最小二乘法求出其拟合直线，并求出该传感器的静态灵敏度和非线性度。 2-4 题 2-4 表所列为某压力计的定度数据。标准时加载压力范围为 0-10 kPa，标准分加在（正行程）和卸载（反行程）两种方式进行。试根据题 2-4 表中数据在坐标纸上画出该压力计的定度曲线；用最小二乘法求出拟合曲线，并计算该压力计的非线性度和回程误差。 题 2-3 表压力传感器的定度数据题 2-4 表压力计定度数据 标准压力（ MPa ） 读数压力 （ MPa ） 标准压力 （ kPa ） 读数压力（ kPa ） 00正行程反行程0.50.50-1.12-0.69 10.9810.210.42 1.5 1.482 1.18 1.65
葡聚糖凝胶 Sephade LH 使用说明及使用心得
葡聚糖凝胶 Sephadex LH-20 使用说明 Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。此君既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。虽然价位很高，但由性能颇佳，可再生利用，所以倍受钦睐。此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之一。 Sephadex LH-20适合用于有机溶剂分离嗜脂性分子，天然产物在有机溶剂中的纯化。可以非常经济的大规模制备各种天然产物，尤其在中药有效成分提取中作为大孔吸附树脂解析物的纯化。 结合凝胶过滤﹑分配色谱及吸附层析于一身，能分离结构相近的分子。因此使用中要考略几种色谱的作用机制。 最高载量可达250mg样品/ml凝胶﹑极少需要再生﹑使用得当，分离效果可保持不变。上样量视被分离物的结构性能的差异而定：差异大，则大；差异小，则小。凝胶过滤的上样量一般为5－7％的床体积，我们建议初次上样量控制在1－2％的床体积，视分离情况可以逐步增加；柱高的选择也与分离要求相关――难分物质要有一定柱高和流速控制；流动相可参考TLC 的条件，正确的流动相可以提高分离度并缩短分离时间。 流动相的常用溶剂为：水 甲醇 丙酮 乙酸乙酯 二氯甲烷 上述溶剂的极性依次降低，对带有极性的被分离物而言，保留值和分离度依次递增；同理选用的凝胶柱高可依次降低，流速可以增大（或上样量可以增加，树脂体积在低极性溶剂中明显收缩）。 溶剂的溶解性，极性，沸点，毒性都是要考虑到的。 二氯甲烷通常对被分离物质间的极性和碱性差异比较小时采用。甲醇通常对带环状（包括苯环）物质分离采用，葡聚糖凝胶对环状物质有强烈吸附。 LH-20同时具备亲水和亲脂双重性质，且被分离物质的极性在分离过程中起着重要作用。 使用方法：将干粉浸泡于60—70％乙醇中过夜（充分搅拌），洗去可能存在的残留物，抽干然后湿态不间隙装柱，绝对不能出现凝胶断层（否则要重新装柱），动态用一倍柱体积的60—70％乙醇淋洗，再用水洗净乙醇即根据自己选用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为
测试装置的基本特性
第二章 测试装置的基本特性 （一）填空题 1、 某一阶系统的频率响应函数为1 21 )(+=ωωj j H ，输入信号2sin )(t t x =，则输出信号)(t y 的频率为=ω ，幅值=y ，相位=φ 。 2、 试求传递函数分别为5.05.35.1+s 和2 224.141n n n s s ωωω++的两个环节串联后组成的系统的总灵敏度。 3、 为了获得测试信号的频谱，常用的信号分析方法有 、 和 。 4、 当测试系统的输出)(t y 与输入)(t x 之间的关系为)()(00t t x A t y -=时，该系统能实现 测试。此时，系统的频率特性为=)(ωj H 。 5、 传感器的灵敏度越高，就意味着传感器所感知的 越小。 6、 一个理想的测试装置，其输入和输出之间应该具有 关系为最佳。 （二）选择题 1、 不属于测试系统的静特性。 （1）灵敏度 （2）线性度 （3）回程误差 （4）阻尼系数 2、 从时域上看，系统的输出是输入与该系统 响应的卷积。 （1）正弦 （2）阶跃 （3）脉冲 （4）斜坡 3、 两环节的相频特性各为)(1ωQ 和)(2ωQ ，则两环节串联组成的测试系统，其相频特性 为 。 （1） )()(21ωωQ Q （2）)()(21ωωQ Q + （3）) ()()()(2121ωωωωQ Q Q Q +（4）)()(21ωωQ Q - 4、 一阶系统的阶跃响应中，超调量 。 （1）存在，但<5％ （2）存在，但<1 （3）在时间常数很小时存在 （4）不存在 5、 忽略质量的单自由度振动系统是 系统。 （1）零阶 （2）一阶 （3）二阶 （4）高阶 6、 一阶系统的动态特性参数是 。 （1）固有频率 （2）线性度 (3)时间常数 （4）阻尼比 7、 用阶跃响应法求一阶装置的动态特性参数，可取输出值达到稳态值 倍所经过的 时间作为时间常数。 （1）0.632 （2）0.865 （3）0.950 （4）0.982 （三）判断对错题（用√或×表示） 1、 一线性系统不满足“不失真测试”条件，若用它传输一个1000Hz 的正弦信号，则必然导致输出波形失真。（ ） 2、 在线性时不变系统中，当初始条件为零时，系统的输出量与输入量之比的拉氏变换称为传递函数。（ ） 3、 当输入信号)(t x 一定时，系统的输出)(t y 将完全取决于传递函数)(s H ，而与该系统
凝胶柱层析操作要点
凝胶柱层析操作要点 (一) 基本原理 凝胶是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，象筛子，直径大于孔径的分子将不能迸入凝胶内部，便直接沿凝胶颗粒的间隙流出，称为全排出。较小的分子在容纳它的空隙内，自由出入，造成在柱内保留时间长。这样，较大的分子先被洗脱下来，而较小的分子后被洗脱下来，从而达到相互分离的目的。洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量关系。在一根凝胶柱中，颗粒间自由空间所含溶液的体积为外水体积V。不能进入凝胶孔径的那些大分子，当洗脱体积为V。时，出现洗脱峰。凝胶颗粒内部孔穴的总体积称为内水体积Vi ，能全部渗入凝胶的那些小分子，当洗脱体积为V。+ Vi 时出现洗脱峰。 (二)凝胶的类型及性质 1.交联葡聚糖凝胶 交联葡聚糖凝胶的商品名称为Sephadex，由葡聚糖和3-氯-1.2-环氧丙烷(交联剂)以醚键相互交联而形成具有三维空间多孔网状结构的高分子化合物。交联葡聚糖凝胶，按其交联度大小分成8种型号(表6–2)。交联度越大，网状结构越紧密，孔径越小，吸水膨胀就愈小，故只能分离相对分子质量较小的物质;而交联度越小，孔径就越大，吸水膨胀大，则可分离相对分子质量较大的物质。各种型号是以其吸水量(每g干胶所吸收的水的质量)的10倍命名，如，Sephadex G–25表示该凝胶的吸水量为每g干胶能吸2.5克水。在SephadexG–25及G–50中分别引入羟丙基基团，即可构成LH型烷基化葡聚糖凝胶。 交联葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中较稳定，但当暴露于强酸或氧化剂溶液中，则易使糖甘键水解断裂。在中性条件下，交联葡
第4章测试系统的基本特性解析
第4章测试系统的基本特性 4．1 知识要点 4.1.1测试系统概述及其主要性质 1.什么叫线性时不变系统？ 设系统的输入为x (t )、输出为y (t )，则高阶线性测量系统可用高阶、齐次、常系数微分方程来描述： )(d )(d d )(d d )(d 01111t y a t t y a t t y a t t y a n n n n n n ++++--- )(d )(d d )(d d )(d 01111t x b t t x b t t x b t t x b m m m m m m ++++=--- （4-1） 式（4-1）中，a n 、a n -1、…、a 0和b m 、b m -1、…、b 0是常数，与测量系统的结构特性、输入状况和测试点的分布等因素有关。这种系统其内部参数不随时间变化而变化，称之为时不变（或称定常）系统。既是线性的又是时不变的系统叫做线性时不变系统。 2.线性时不变系统具有哪些主要性质？ （1）叠加性与比例性：系统对各输入之和的输出等于各单个输入的输出之和。 （2）微分性质：系统对输入微分的响应，等同于对原输入响应的微分。 （3）积分性质：当初始条件为零时，系统对输入积分的响应等同于对原输入响应的积分。 （4）频率不变性：若系统的输入为某一频率的谐波信号，则系统的稳态输出将为同一频率的谐波信号。 4.1.2测试系统的静态特性 1.什么叫标定和静态标定？采用什么方法进行静态标定？标定有何作用？标定的步骤有哪些？ 标定：用已知的标准校正仪器或测量系统的过程。 静态标定：就是将原始基准器，或比被标定系统准确度高的各级标准器或已知输入源作用于测量系统，得出测量系统的激励－响应关系的实验操作。 静态标定方法：在全量程范围内均匀地取定5个或5个以上的标定点（包括零点），从零点开始，由低至高，逐次输入预定的标定值（称标定的正行程），然后再倒序由高至低依次输入预定的标定值，直至返回零点（称标定的反行程），并按要求将以上操作重复若干次，记录下相应的响应－激励关系。 标定的主要作用是：确定仪器或测量系统的输入－输出关系，赋予仪器或测量系统分度
葡聚糖凝胶柱使用及注意事项
葡聚糖凝胶柱使用及注意事项 1 Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。其既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。虽然价位很高，但由于性能颇佳，可再生利用，所以倍受亲睐。此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之一。 2 Sephadex LH20 的原理。 Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反相溶剂洗脱， Sephadex LH20对化合物还起反相分 配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。 3 Sephadex LH20 洗脱溶剂。 看完第2点后，就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。用得 最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用50％氯仿－－甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。 4 Sephadex LH20 样品的处理和洗脱溶剂的选择。 如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！要是把Sephadex LH20 堵啦， 就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很心痛呀）。如果样品极性小，这选用正相溶剂 洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。 5 Sephadex LH-20的步骤。 (1) 选择条件： 梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。首先你的样品须要能溶解在尽量少量的洗脱剂中。极性在的用甲醇水系统;极性小者一般用不含水的系统。我们实验室常用正己烷二氯甲烷甲醇系统，用了很多年，效果较好。 (2) 饱和层析柱： 用洗脱剂将凝胶摇匀，直立柱身，让其自然沉降，此时要防止气泡留在其中。至少半小时打开开关，流出几个柱体种的洗脱剂，目的是使其膨胀在正确比例的洗脱剂中。 (3) 样品处理：用尽量少的洗脱剂溶解样品，常压过滤。 (4) 湿法上柱。这也是要有技巧的步骤。
凝胶层析柱特性测试
凝胶层析柱特性分析 （实验报告） 实验日期：2015年4月21日实验温度：室温 实验地点：生物化学与遗传学实验室指导老师：****** 班级：2013级生物技术1班姓名：***** 学号：****** I. 实验目的 1.掌握凝胶层析柱的基本原理； 2.学习凝胶层析柱的操作技术； 3.了解凝胶层析柱的应用。 II. 实验原理 凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。把含有不同大小分子的混合液，铺加在胶面上，让它流过凝胶柱。由于凝胶具有网络结构，当混合液通过凝胶颗粒缝隙中时，溶液中的溶质凡是比网孔小的分子，都能自由进入颗粒内部，而比网孔大的分子则不能进入。因此，在洗脱过程中，大分子物质必然先于小分子物质向下移行，先流出的是大分子物质，小分子物质后流出，从而达到分离的目的。 在凝胶层析中，凝胶粒子间隙的外水相当于移动相，粒子内水相当于固定相。当溶质随洗脱液自上向下移动时，溶质在内水之间连续不断达成分配平衡。相对分子质量大的因不易渗入凝胶孔内，分配系数较小，用较少的洗脱液就能从
柱中洗脱出来；反之，相对分子质量小的因渗入凝胶孔内，分配系数较大，需较多的洗脱液才能从柱中洗脱出来。 为了精确地衡量混合物中某一被分离成分在一定的凝胶柱内的洗脱行为，常采用分配系数K d来衡量，K d的定义为： i o e d V V V K - = 式中V e ——某一成分的洗脱体积，即从加入样品算起， 到组分最大浓度（峰）出现时所流出的体积； V o ——层析柱内凝胶凝胶颗粒之间空隙的总体积， 又称凝胶外水体积； V i——层析柱内部微孔的总体积，亦称为内水体积。 洗脱体积V e与V o及V i之间的关系可表示为： V e=V o+K d V i 当某种成分的K d值为0时，意味着这种成分完全被排阻于凝胶建立的微孔之外而最先洗脱出来，即V e=V o。可以用一个已知相对分子质量远远超过凝胶排阻极限的有色分 子如常用蓝色葡聚糖-2000溶液通过柱床，可测出柱床的外水体积V o。 当另一种成分的K d=1时，意味着这一成分完全不被排阻，它可以自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中，在洗脱过程中它将最后流出柱外，V e=V o+V i。 处于上述极端情况（即分子最大与最小）之间的那些分
凝胶层析实验步骤及细节
温州大学第四届生物学科实验技能大赛 血清凝胶层析 实验成绩：实验过程＋实验结果＋实验报告 实验时间： 5月6日（周日）8:50到10B正门集合，上午9:00至12:00左右分离器使用指导及凝胶装柱。下午1:30开始血清离心操作及层析操作。 实验前：身穿实验服，用蒸馏水清洗实验器具 实验后：清理实验器具 凝胶层析的实验步骤
实验试剂和用品 1. 试剂 Sephandex 4B 凝胶（凝胶颗粒）、5%重铬酸钾、5%蓝葡聚糖、生理盐水 2. 主要实验用具 铁架台（滴定台架）、凝胶柱（层析柱）<多孔板、筛板>（10×1.0cm）、螺丝夹、移液管、烧杯、胶头滴管、试管（20个）、试管架、玻璃棒 凝胶层析定义 凝胶层析又称凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。它的突出优点是凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂。凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术。 凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析。 分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。 实验原理 不同类型凝胶的筛孔的大小不同。如果将这样的凝胶装入一个足够长的柱子中，作成一个凝胶柱。当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续不断地穿入珠子的内部，这样的小分子不但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长。凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。 凝胶柱的制备 在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。 凝胶的装填：将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液，将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，拆除柱顶装置，用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。在平衡过程中逐渐增加到层析的流速，千万不能超过最终流速。平衡凝胶床过夜，使用前要检查层析床是否均匀，有无“纹路”或气泡，或加一些有色物质来观察色带的移动，如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好，色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。 凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存 一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌，可在一次层析后加入0.02%的叠氮钠，在下次层析前应将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。 如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用70%、90%、95%乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90%以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。
(完整版)测试装置的基本特性
第二章测试装置的基本特性 本章学习要求 1.建立测试系统的概念 2.了解测试系统特性对测量结果的影响 3.了解测试系统特性的测量方法 为实现某种量的测量而选择或设计测量装置时，就必须考虑这些测量装置能否准确获取被测量的量值及其变化，即实现准确测量，而是否能够实现准确测量，则取决于测量装置的特性。这些特性包括静态与动态特性、负载特性、抗干扰性等。这种划分只是为了研究上的方便，事实上测量装置的特性是统一的，各种特性之间是相互关联的。系统动态特性的性质往往与某些静态特性有关。例如，若考虑静态特性中的非线性、迟滞、游隙等，则动态特性方程就称为非线性方程。显然，从难于求解的非线性方程很难得到系统动态特性的清晰描述。因此，在研究测量系统动态特性时，往往忽略上述非线性或参数的时变特性，只从线性系统的角度研究测量系统最基本的动态特性。 2.1 测试系统概论 测试系统是执行测试任务的传感器、仪器和设备的总称。当测试的目的、要求不同时，所用的测试装置差别很大。简单的温度测试装置只需一个液柱式温度计，而较完整的动刚度测试系统，则仪器多且复杂。本章所指的测试装置可以小到传感器，大到整个测试系统。 玻璃管温度计 轴承故障检测仪 图2.1-1 在测量工作中，一般把研究对象和测量装置作为一个系统来看待。问题简化为处理输入量x(t)、系统传输特性h(t)和输出y(t)三者之间的关系。常见系统分析分为如下三种情况： 1)当输入、输出能够测量时(已知)，可以通过它们推断系统的传输特性。－系统辨识 2)当系统特性已知，输出可测量，可以通过它们推断导致该输出的输入量。－系统反求 3)如果输入和系统特性已知，则可以推断和估计系统的输出量。－系统预测 图2.1-2 系统、输入和输出 2.1.1 对测试系统的基本要求 理想的测试系统应该具有单值的、确定的输入－输出关系。对于每一输入量都应该只有单一的输出量与之对应。知道其中一个量就可以确定另一个量。其中以输出和输入成线性关系最佳。许多实际测量装置无法在较大工作范围内满足线性要求，但可以在有效测量范围内近似满足线性测量关系要求。一般把测试系统定常线性系统考虑。 2.1.2 线性系统及其主要性质 若系统的输入x(t)和输出y(t)之间的关系可以用常系数线性微分方程来描述 a n y(n)(t)+a n-1y(n-1)(t)+…+a1y(1)(t)+a0y(0)(t) = b m x(m)(t)+b m-1x(m-1)(t)+b1x(1)(t)+b0x(0)(t) (2.1-1)