密码子偏好性与异源蛋白表达

密码子偏性与异源蛋白表达

原文：Claes Gustafsson, et al. TRENDS in Biotechnology, 2004,22(7): 346-353.

https://www.360docs.net/doc/3c15208206.html,/corp/images/MS102504CG.pdf

翻译：zhxm409511

在1977年，当Genetech的科学家和他们的科研合作伙伴首次利用细菌生产出人类蛋白（生长激素释放抑制因子）时[1]，蛋白的异源表达在整个生物技术产业中发挥着关键的角色。那时，仅知道生长激素释放抑制因子的氨基酸序列，还不知如何从人的基因组中克隆该基因，因此，Genetech小组采用数条寡核苷酸合成了14个密码子长的生长激素释放抑制因子基因。Itakura和同事们设计这些寡核苷酸时遵循了三条标准[1]。首先，优先使用MS2噬菌体偏爱的密码子——尽管当时对大肠杆菌的基因组DNA序列还知之甚少，却已刚刚完成了MS2噬菌体的测序，并认为该噬菌体的序列能够代表大肠杆菌高表达基因所使用的密码子。其次，消除寡核苷酸不必要的分子内和分子间配对，因为这可能影响基因合成。第三，避免那些先是富含GC随后是富含AT的序列，当时认为这种序列可能会导致转录终止。结果，利用这条合成的基因首次制生产出来了具有功能活性的多肽。

25年后的今天，大多数基因克隆自cDNA文库或直接利用聚合酶链反应（PCR）从相应的基因组中扩增获得。要尽量避免从头合成基因，因为这样做需要消耗大量的财力和人力[2]。尽管基于PCR的克隆被广泛使用，但很多情况下它还是不及所描述的那样快捷和容易。它经常需要一些不易得到的模板（对于具有内含子的生物，需要cDNA模板），此外还需要进行PCR条件的优化，需要对PCR产物进行测序，如果PCR引入了任何的配对错误，还经常需要通过定点突变进行修复。然而，当扩增出的基因克隆入表达载体后，真正有趣的事情就发生了：经常是没有蛋白表达或表达水平很低。人们已经进行了大量的研究，以提高克隆基因的表达水平，包括优化宿主的生长条件，建立新的宿主系，改用新的宿主，和无细胞系统[3]。尽管这些方法都取得了一些进展，但它们都是围绕一个最根本问题进行的：一种生物所采用的编码蛋白的DNA序列经常不同于另外一种生物在编码该蛋白时所采用的DNA序列。

为什么不同的生物会偏爱不同的密码子？

遗传密码采用61组三连核苷酸（密码子）编码20种氨基酸，采用3个密码子终止翻译。因此每个氨基酸利用1个（Met和Trp）至6个（Arg，Leu，和Ser）同义密码子编码。这些密码子在核糖体中被互补的tRNAs阅读，而这些tRNAs已经事先携带了相应的氨基酸。密码子的兼并性使得同一蛋白可采用多种不同的核苷酸序列编码。对于两种不同的生物，或对于同一生物的高表达和低表达基因，有时甚至在同一个操纵子内部，对不同密码

子的使用频率差别可能很大[4]。

迄今，科学家仍在思索是什么进化压力导致了密码子使用偏性[5]。每种生物内同义密码子之间的突变-选择平衡至少可部分解释基因组GC含量对密码子分布的影响及密码子使用形式的改变[6]。一些研究者推断，旨在减少同工tRNAs多样性的密码子偏性能够降低新陈代谢负荷，因此，有利于生物在快速生长条件下节约部分能量[7]。不管是什么原因导致了密码子偏性，已日益清楚的是密码子偏性对异源蛋白表达有深远的影响[8]。

密码子偏性的观察

一个基因的密码子偏性及其表达水平之间的关联被用来定义密码子适用指数（CAI）[9]。这种衡量密码子使用的方法源自由众多高表达基因组成的引用集（reference set），而这些高表达基因通常被用于衡量一种生物对特定密码子的偏爱程度。根据基因组序列数据，这一指数可被用于预测内源基因的表达水平[10]。然而因为该指数衡量的是偏爱程度，而非偏爱的性质，因此不能用于评价一个基因和一个候选宿主之间的兼容性。基因可能具有更高的偏性，以至导致很高的CAI，但基因偏爱的密码子可能与宿主细胞偏爱的密码子截然不同。

主成分分析法能够将多维的信息压缩成一个两维图形。它提供了一个非常方便的方法去观察不同生物间密码子偏性的差别。图1展示了8个经广泛研究的生物基因组的平均密码子偏性。图中显示，Streptomyces coelicolor具有非常极端的密码子使用图形。该生物的每一个摆动位置（每个密码子的第三个碱基，遗传密码子的兼并性就产生于此）都是G或C，以至S. coelicolor具有很高的GC含量（71%）。图中还显示，Saccharomyces cerevisiae，Caenorhabditis elegans和Arabidopsis thaliana聚集成群，指示它们具有相似密码子偏性，提示在表达C. elegans和A. thaliana的天然基因时，S. cerevisiae可能是一个很合适的宿主。图1还明确的显示，E. coli和人之间的密码子偏性具有明显的不同。这证实了很多研究者通过大量研究获得的结果：在按人的密码子使用方式表达蛋白时，E. coli不是最佳的宿主。利用图中的密码子分布，可以帮助观察每种生物对密码子的使用与其他生物有何不同。例如，哺乳动物细胞通常使用AGG和AGA编码Arg（分别占人基因Arg密码子的11.2%），然而，它们却很少在E. coli中使用（分别为2.1%和2.4%）。因此，在图1中，从人的整体密码子偏性可以看出，AGG和AGA有助于主成分2（PC2）的正偏离。相比之下，E. coli 偏爱的Arg密码子为CGT（16.4%的情况下使用，在人基因的使用频率为4.5%），因此，CGT有助于PC2的负偏离。因此，“密码子使用间距”图非常有用，它能够快速鉴别出每种生物基因不经常使用的密码子，而这些密码子可能会给异源表达带来麻烦。

密码子偏性是如何影响蛋白表达的？

密码子偏性被确定为原核基因表达中一个最重要的因素[11]。其理由很明显，因为原核细胞偏爱的密码子与相应的tRNAs 浓度成正相关。这种关联有助于优化翻译系统，平衡密码子含量和同工tRNA 的浓度[12]。例如，在E. coli 中，tRNA 4Arg 阅读不经常使用的AGG 和AGA 两个Arg 密码子，在细胞中tRNA 4Arg 只具有很低的水平。看起来，密码子使用和同工tRNA 浓度好象是共同进化的结果，与低表达基因相比，这一共同进化的选择压力对高表达基因的影响更加显著[13]。

同工tRNAs 与密码子频率的共同进化有时甚至会偏离规范的遗传密码子[14]。比较基因组学研究为遗传密码子的进化带来了曙光[15，16]，不同生物间的轻微的密码子差别是异源蛋白表达的重要阻碍。的确，有些生物，尤其是纤毛虫在阐明端粒生物学方面发挥了重要的作用，它拥有tRNAs 能够将规范的终止密码子TAA 和TAG 识别为Glu ，使得这些图1. 以图形表示“密码子使用间距”。主成分分析（PCA ）所采用的算法能够将

几个相关变量（在此指密码子使用频率）转换成少数的被称为主成分的不相关变量。第

一个主成分尽可能多的代表数据中的变异，每个随后的变量尽可能多的代表剩余的变

异。八种生物（http://www.kazusa.or.jp/codon/）所有蛋白对每种密码子的使用频率被列

成表格(8行/生物×62列/密码子)，再通过PCA 生成一个“密码子使用间隔”图。Met

和Trp 分别由密码子ATG 和TGG 编码，在此这两个密码子被忽略。总密码子变异信息

的70%由PC1代表，12%由PC2代表。黑色方块表示负荷量（例如，每个密码子对两

个主成分的贡献；举例来说GAT 和CAG 对PC2没有什么贡献，但对PC1具有几乎相

等的负性和正性贡献）。The values of the codon loads have been normalized to that of the

organism distribution. 红色正方形表示该间距中每种生物的偏爱。该图形是采用

Mathworks 的MatLab （https://www.360docs.net/doc/3c15208206.html,/）绘制的。

基因不可能进行异源表达。

通过修饰宿主提高表达

如果密码子偏性对异源基因表达的负面影响来自于不同的tRNA水平，其解决方法之一就是拓宽宿主细胞内的tRNA库。这可以借助过表达编码稀有tRNAs的基因来实现。对于E. coli，argU基因就是促进表达人基因的首要目标，该基因编码稀有的tRNA4Arg（阅读AGG和AGA密码子），tRNA2Ile（阅读AUA），tRNA3Leu（阅读CUA和CUG），tRNA2Pro （阅读CCC和CCU）[8]。过表达这些tRNA基因的E. coli菌株可以从公司购买，如Stratagene (https://www.360docs.net/doc/3c15208206.html,/)和Novagen (https://www.360docs.net/doc/3c15208206.html,/html/NVG/home.htm /)。已有几个实验室的研究表明，当宿主细胞内相应tRNA的含量增加后，那些含稀有密码子基因的表达水平获得了显著提高[8]。

起初，tRNA过表达好象是一个非常有吸引力的手段，不过还是有几点警告是必需要注意的。表达来自不同生物的基因需要过表达不同的tRNAs，因此对于那些与E. coli比起来不易操作的宿主细胞，该策略的吸引力大为减少。此外，改变细胞内tRNA浓度还可能对新陈代谢产生影响。然而，或许最为重要的问题还是增加tRNA浓度会对氨酰化和tRNA 修饰产生怎样的影响，以及过表达蛋白的组成是否会稳定。

tRNA分子在氨酰化和参加翻译过程之前要经过很多加工。已经发现E. coli的tRNAs 需要进行30多处核苷酸修饰；一些发生在所有tRNAs的相同位点，一些仅发生在一个或少数几个tRNAs[17]。很多tRNA修饰散布在整个tRNA分子，尤其是那些位于反密码子环的修饰，已经表明能够促进读码稳定性[18]。这些修饰的目的之一被认为是减少翻译的移码：实验表明，缺少某些tRNA修饰可导致翻译过程中出现错义和无义错误[17]，例如，tRNA 上第37位鸟嘌呤核苷（m1G）的N-1位缺乏甲基化可导致翻译移码[19]。

因此，一个关于tRNA过表达策略的问题就是，产生完全功能的tRNA需要其他的细胞组分，而在单独过表达tRNA时这些组分的供应可能有限。当tRNA1Leu在E. coli中过表达时，tRNA至少在两方面严重缺乏修饰：37位的m1G和32位的假尿嘧啶核苷（ψ）。只有40%的tRNA Leu1分子被氨酰化，菌株生长缓慢，核糖体步移时间减少2-3倍[20]。情况相似， tRNA Tyr的过表达导致37位的2-甲硫基-N-6-异戊烯腺苷（ms2i6A）修饰下降，在体外tRNA的效率下降[21]。伴随tRNA Phe过表达产生的ms2i6A导致翻译的忠实性下降[22]。作为未氨酰化tRNA的函数，翻译错义置换率的增加大于一个数量级。对忠实性丧失的一个特殊关注是，如果将所产生的异源蛋白混合物导入脊椎动物体内，它可能会诱发产生免疫反应[23]。

除了翻译忠实性和宿主新陈代谢问题之外，tRNA过表达策略还不够非常灵活。与E.

coli相比，难以对真菌或哺乳动物宿主细胞进行工程改造。在真核细胞，tRNA表达受拷贝

数驱动，而非启动子强度，使得这一问题更加复杂化。对于某些应用，如DNA疫苗这一

新兴领域，宿主工程更是不可能。于是只好通过修饰基因获得高表达。

来自密码子优化的结果

通常，如果一个基因包含越多宿主细胞罕用的密码子，就越不可能获得高水平的异源

表达[8]。如果稀有密码子成串出现或出现在基因读码框的5’端，则会导致表达水平急剧下

降。提高表达常用的一个策略就是改变目的基因的稀有密码子，使之更接近于宿主细胞的

密码子使用方式，而不改变所编码蛋白的氨基酸序列。采用的技术包括序列定点突变[24]

和全基因合成[25]。

如表1所示，我们力图找出在相同系统中对天然基因及密码子优化基因进行蛋白表达

水平比较的所有已发表文献。每个研究所采用的密码子优化方法不同，但都进行了一个或

一个以上的密码子替换，由宿主细胞中稀少使用的密码子替换为宿主细胞频繁使用的密码

子。

表1.文献汇编，在所有文献中对密码子优化和野生型序列的基因表达进行了直接比

较，并对蛋白产量进行了检测。

基因来源蛋白名称宿主提高情况文献

H. sapiens IL2 E. coli 16倍38

C. tetani 片段C E. coli 4倍39

B. thuringiensis CryIA(b), CryIA(c) L. esculentum 100倍40

B. thuringiensis CryIA(b), CryIA(c) Nicotiana tabacum 由未检测出至 >0.1%总蛋白 40 M. musculus IG κ链S. cerevisiae > 50 倍41

Bacillus hybrid (1,3-1,4)-β-葡聚糖

酶

H. vulgare 由未检测出至至每2 x 105原生质体40ng 42

H. sapiens TnT E. coli 10和40倍(两种不同结构) 43

HIV Gp120 H. sapiens >40 倍44

A. victoria GFP H. sapiens 由未检测出至出现实质性信号 44 A. victoria GFP H. sapiens 22 倍45

A. victoria 突变的GFP C. albicans 由未检测出至western出现强条带29

M. musculus c-Fos E. coli 由未检测出至占可溶蛋白的20% 27

S. oleracea 质体蓝素 E. coli 1.2倍46

H. sapiens 神经纤维瘤蛋白 E. coli 3倍47

L. monocytogenes LLO M. musculus 100倍48

H. sapiens M2-2 E. coli 140倍49

R. prowazekii Tlc E. coli 无效50

BPV1 L1 and L2 mammalian > 1 x 103倍51

H. sapiens PC-TP E. coli 由痕量至细胞裂解液蛋白的10% 26 H. sapiens hCG-βDictyostelium 4-5倍52

T. aestivum CYP73A17 S. cerevisiae 4、7和13倍(三种不同的构造) 53

T. aestivum CYP73A17 N. tabacum 5倍53 HIV gag H. sapiens > 322倍54 Dermatophagoides P roDer p1 P. troglodytes 5-10倍55 HIV gag H. sapiens 1.5-2倍28

Plasmodium EBA-175 region II

and MSP-1 M. musculus 4倍56

Tn10/Herpes simplex virus rtTA M. musculus >

20倍57

HPV L1 H. sapiens 1 x 104–1 x 105倍58 C. diphtheriae –

mammal hybrid

DT P. pastoris 0至10mg/L 59 P1 phage Cre Mammalian 1.6倍60 A. equina Equistatin P. pastoris 2倍61 H. sapiens IL-6 E. coli 3倍62 H. sapiens 葡糖脑苷脂酶Pichia pastoris 8-10倍(两种不同构造) 63 Schistosoma

mansoni

SmGPCR H. sapiens 由刚能检测到至western出现强条带64 C. elegans GluClα1, GluClβR. norvegicus 6-9倍65 Herpesvirus U51 Mammalian 10-100倍66 HIV gag , pol, env, nef H. sapiens 分别>250x, >250x, >45x, >20x 67 H. sapiens IL-18 E. coli 5倍68 HPV E5 Mammalian 6-9倍69 HPV E7 Mammalian 20-100倍70 Plasmodium EBA175的F2结构阈E. coli, Pichia pastoris 4倍9倍71

很多密码子优化的报道都是采用E. coli表达哺乳动物蛋白。在几种情况下，蛋白表达水平获得了急剧的提高。两篇论文指出，利用天然基因表达时，不能有效检测出目的蛋白。在密码子优化后，获得了占E. coli总可溶蛋白10%-20%的表达水平[26，27]。在E. coli中表达哺乳动物蛋白时，由密码子优化带来的表达增加通常在5-15倍之间，经常占E. coli 可溶蛋白的5%。

密码子优化的另一个非常成功的应用是提高病毒基因在哺乳动物细胞系中的表达，一般通过全部重新合成基因实现。病毒是一种特殊而又有趣的例子，因为它们的密码子经常受完全不同的压力约束：它们经常通过重叠读码框来负载高密度的信息。很多病毒基因还在编码序列内部编码顺势负调控序列。仅需要表达该蛋白时，可以按照宿主密码子偏性重新合成基因，同时也破坏了调控元件，使蛋白产量得以提高[28]。在DNA疫苗研究中通常对病毒基因的密码子进行优化，通过提高目的抗原的表达来提高免疫原性。在很多已发表的研究中，测定了注射DNA后诱发的免疫反应而不是蛋白浓度。在表1中遗漏了很多这样的例子，表1中仅列举了直接测定蛋白浓度的文献。

缩写：BPV1，牛乳头瘤病毒I型；Cry，结晶；DT，白喉毒素；EBA，红细胞结合蛋白；GFP，绿色荧光蛋白；GluCI，谷氨酸通道；Gp120，糖蛋白120；hCG-β，人绒膜促

性腺激素；HPV，人乳头瘤病毒；IL，白介素；LLO，listeriolysin O；MSP，裂殖子表面蛋白；PC-TP，磷脂酰胆碱转移蛋白；rtTA，reverse Tet transactivator；SmGPCR，Schistosoma mansoni G蛋白偶连受体；Tn，转座子；TnT，肌钙蛋白T；Tic，ATP/ADP转移酶。

对于那些使用不规范密码子的生物，在异源表达其蛋白时需要重新合成基因。这包括一些病原体如Candida albicans[29]，和纤毛虫模型生物如Tetrahymena[30]。在异源表达这些生物的基因时，消除可能被阅读为终止信号或不同氨基酸的密码子非常重要。

密码子偏性之外的因素

基因的密码子偏性对其表达有很大的影响，这可能误导人们认为它是唯一影响基因表达的因素。实际上，表达载体的选择和转录启动子也非常重要[3]。围绕基因读码框5’端的核苷酸序列显得优为敏感，包括对稀有密码子的存在[31，32]以及与起始密码子AUG相临的密码子[33，34]。翻译效率的降低可能伴随有更低的mRNA水平，因缺乏核糖体的保护会使mRNA暴露于内源性RNases，尽管这样，在翻译和不能完全去卷绕mRNA稳定性之间还是存在着某些相互作用[2]。mRNA的5’末端结构也会对翻译产生显著的影响[35]，已经表明，在目的基因上游耦合一个简短的可以翻译的开放读码框(ORFs)作为一种策略，可以成功的提高一些问题基因的表达效率[36]。

还值得注意的是，有效翻译是必要的但尚不足以产生功能性蛋白。因为多肽链必须经过正确的折叠，在有些情况下还要形成合适的二硫键，甚至要进行例如糖基化等翻译后期修饰才能生成功能性蛋白。对于这些过程，缺少恰当的氧化还原作用环境，伴侣蛋白，normal association partners或修饰酶将会是另一种挑战。这些问题已经超出本文的范围。

基因设计的考虑

重新设计一个基因既自由又费心。在选择谱受约束最小的一端有数量众多的DNA序列能够编码一个氨基酸序列。假设每个氨基酸平均可以被三个不同的密码子编码，则一个由100个氨基酸组成的蛋白，大约能够被3100（~5×1047）个核苷酸序列编码产生。这些可能的序列中有哪些可以带来高水平的异源蛋白表达，又如何将这些序列挑选出来呢？在Box1中描述了如何采用密码子使用分布图设计与合成密码子优化基因。

在选择谱的另一端则只有一个核苷酸序列。在这种情况下，每个氨基酸仅使用一个密码子——被宿主细胞最频繁使用的那个同义密码子。“一个氨基酸——一个密码子”的方法有几个缺点。首先，相对于tRNA的一个子集（组合）而言，由这种基因转录出来的大量mRNA将会产生一个高密码子浓度，导致tRNA库失去平衡、倾斜的密码子使用方式以及潜在的翻译错误[23]：异源表达的蛋白可能占总细胞质量的60%，因此采用单一的tRNA 库将是一个非常严重的问题。在“一个氨基酸——一个密码子”优化的基因中引入同义突

变可以提高蛋白表达水平4倍[37]。第二，在密码子选择上如果没有机动性，则难以避免基因和mRNA中产生一些重复元件和二级结构，抑制和糖体通过颈环结构[35]。重复元件可能使基因合成的难度增加，如果是内部合成则更加麻烦，如果是由商家合成则会更加昂贵和耗时。严重的重复元件还会影响基因在宿主内的稳定性。第三，经常需要在序列中引入或排除一些序列元件，如限制性内切酶位点，以便于随后的操作。如果密码子使用被严格固定下来，则不可能再提供这些便利。

结论

编码于ORF中的遗传信息远不止蛋白的氨基酸序列。根据目前的估计，40%-60%的人类多内含子基因都具有选择性剪接，在所有基因中，10%-20%都发生反义转录，mRNA编辑是常见现象（至少在神经细胞），调节元件亦很丰富，通过RNAi和其他mRNA降解途径引导mRNA降解的序列元件存在于整个人类基因组中。随着我们开始从不同层次洞察存在于DNA编码区的错综复杂的信息，我们已经开始懂得如何在设计基因和遗传网络时做出富于信息的决定。

设计和使用合成基因为研究者提供了一种有效控制异源蛋白表达的机制。和操纵密码子偏性一样，可以增加一个肽标签，去除剪接位点，根据需要增加限制性内切酶位点。在过去的20多年，基因合成的花费和忠实性好象正在沿着一个与寡核苷酸合成相似的道路前进，使得基因合成越来越划算。这一趋势使得科学家们把精力更多的放在科学上，而不是花费在获得工作所需要的工具上。

Box1. 基因设计过程

在DNA2.0(https://www.360docs.net/doc/3c15208206.html,/)基础上所建立的一个设计基因序列编码特定蛋白的方法见图1。该过程包括，根据目的采用一个初始密码子表，通过一系列的筛选，排除那些与其他设计约束不相符合的序列。如图1所示，每次筛选都会排除一些可能的序列，除密码子偏性以外，再经过5-6次约束，还是会保留很多可能序列的。下面对每次筛选都进行了详细的描述。

图1. 基因设计流程图。这是一个设计核苷酸序列在异源宿主中表达的一般过程。对于

一个由100个氨基酸组成的蛋白，经每次筛选后，幸存下来核苷酸序列的大概数量被显

示于图中。

1.构建和使用一个密码子使用表

大量的基因组序列在当前都可以获得，使得构建任何生物的密码子使用表成为可能（非常出色的汇编见http://www.kazusa.or.jp/codon/）。例如，在E. coli中表达时，其高表达（II型）基因的密码子使用情况可以从https://www.360docs.net/doc/3c15208206.html,/~mmaduro/codonusage/ codontable.htm获得[72]。可以通过两个步骤对这些密码子使用表进行改编后用于基因设计。首先，设定阈值水平；即低于特定值（通常介于5%-10%之间）的所有频率都被设定为0，从而使稀有密码子被全部消除。对剩余的频率进行标准化，以使得每个氨基酸所对应的总密码子使用频率等于100%。

如果要在不止一个宿主中表达蛋白，还可以构建一个杂合的密码子使用表。消除低于任何宿主阈值的密码子。对剩余的密码子使用频率，按最具限制性生物的密码子频率进行标准化，或根据所有宿主计算出每个密码子的平均值。

一旦密码子使用表被构建出来，将由电脑根据密码子使用表中每个密码子的频率随机选择密码子，列举出各候选序列。每个设计的序列将通过随后的筛选，以确保与其他的设计标准相吻合。

2.消除不利的密码子配对和极端GC含量

基因的GC含量和临近密码子的出现频率（密码子配对几率）是两个与密码子使用频

率相关的重要因素。密码子配对频率能够使每个密码子的预期统计学分布发生显著的偏移。采用Boycheva等[73]描述的算法和GenBank中的E. coli序列，可以计算出在高表达E. coli基因中密码子配对是被避免的。以鉴别出的应该避免的密码子配对作为标准，就可以拒绝一些候选设计。

3.消除重复序列

可以通过标准的方法如BLAST对序列本身进行比对，找出直接重复序列[74]。那些包含明显长度直接重复序列的候选设计序列将被剔除。

4.避免不利的mRNA二级结构

已经有证据表明，稳定的mRNA结构尤其是转录产物5’端的结构能够减少基因的表达[2，35]。可以通过计算自由能，鉴别出哪些mRNA可能会采取这种结构。进行这种分析的软件可以在https://www.360docs.net/doc/3c15208206.html,/applications/mfold/找到。

5.避免或引入限制性内切酶位点

有没有选择合适的限制性内切酶位点，经常对随后的基因操作非常重要，在载体之间交换，交换蛋白结构阈，以及增加或去除多肽标签或融合蛋白部分。可以对候选序列进行检测，以确保正确安置或去除了限制性内切酶位点。

6.其他约束

还可以通过包括避免脆性剪接位点，调控元件，免疫激活或免疫抑制元件（对DNA 疫苗而言）[76]，RNA甲基化信号，selenocystein incorporation信号和许多其他依赖所使用生物系统的因素和特殊考虑，审查基因设计方案。还可以通过基因设计增大遗传距离，从而避免与内源基因同系物重组或避免侵害专利序列。