植物生理学-过氧化氢酶的活性的测定

过氧化氢酶的活性的测定－紫外线吸收法

一、原理

H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度（A240）随反应时间而降低。根据测量率的变化速率即可测出过氧化氢酶的活性。

二、材料与设备

植物材料：植物的叶

实验材料：紫光分光光度计、离心机、研钵、250ml容量瓶、0.5ml 吸管1支、10ml试管1支

试剂：0.2mol/LpH7.8磷酸缓冲液

0.1mol/ H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）

三、操作步骤

1、酶提取液：称取叶片0.5g置于研钵中，加入pH7.0的磷酸缓冲液研磨成为匀浆，并用缓冲溶液清洗研钵数次（共用6ml磷酸缓冲液，缓冲液分几次加入），取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。保存备用。

2、测定：取10ml试管1支，按表20-2顺序加入试剂。

紫外线吸收法测定H2O2样品配置表

在管中加入0.3ml0.1mol/L的H2O2，加完后立即计时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔一分钟读数一次，共测三分钟，测完后，按下式计算酶活性。

四、结果计算

以1min内减少0.1的酶量为一个酶活单位（u）

△A240×V T

过氧化氢酶活性（u/gFW/min）=0.1×V×t×FW

=0.043×4.6÷0.1÷0.2÷0.3÷3

=10.99

五、实验反思

1、影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些？

过氧化氢酶提取自植物的新鲜叶片中，新叶与旧叶的酶活性存在差异，所以叶片的选择会影响酶活性的测定。

温度的变化也会引起酶活性的测定

研磨是否充分，洗涤是否洗干净也会影响。

2、实验测得的吸光度较小（吸光度的起始值较低），酶活性较小，可能是选取的叶片较老，实验中的失误，用滴定管滴定时，滴定的蒸馏水超过了1ml，造成了过氧化氢酶的浓度偏低，用紫外线吸收法测定时造成吸光度值偏低。

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