LC-MS原理 质谱法原理及应用

LC-MS原理质谱法原理及应用

质谱法的原理及应用

质谱法的原理及应用

摘要：用电场和磁场将运动的离子（带电荷的原子、分子或分子碎片）按它们的质荷比分离后进行检测的方法。测出了离子的准确质量，就可以确定离子的化合物组成。这是由于核素的准确质量是一多位小数，决不会有两个核素的质量是一样的，而且决不会有一种核素的质量恰好是

另一核素质量的整数倍。

关键词：质谱法离子运动离子源质量分析器

正文：1898年W.维恩用电场和磁场使正离子束发生偏转时发现,电荷相同时，质量小的离子偏转得多,质量大的离子偏转得少。1913年J.J.汤姆孙和F.W.阿斯顿用磁偏转仪证实氖有两种同位素[kg1]Ne和[kg1]Ne 阿斯顿于1919年制成一台能分辨一百分之一质量单位的质谱计，用来测定同位素的相对丰度，鉴定了许多同位素。但到1940年以前质谱计还只用于气体分析和测定化学元素的稳定同位素。后来质谱法用来对石油馏分中的复杂烃类混合物进行分析，并证实了复杂分子能产生确定的能够重复的质谱之后,才将质谱法用于测定有机化合物的结构,开拓了有

机质谱的新领域。

质谱法的原理是待测化合物分子吸收能量（在离子源的电离室中）后产生电离，生成分子离子，分子离子由于具有较高的能量，会进一步按化

合物自身特有的碎裂规律分裂，生成一系列确定组成的碎片离子，将所有不同质量的离子和各离子的多少按质荷比记录下来，就得到一张质谱图。由于在相同实验条件下每种化合物都有其确定的质谱图，因此将所得谱图与已知谱图对照，就可确定待测化合物。

利用运动离子在电场和磁场中偏转原理设计的仪器称为质谱计或质谱仪。前者指用电子学方法检测离子，而后者指离子被聚焦在照相底板上进行检测。质谱法的仪器种类较多,根据使用范围,可分为无机质谱仪和有机质谱计。常用的有机质谱计有单聚焦质谱计、双聚焦质谱计和四极矩质谱计。目前后两种用得较多，而且多与气相色谱仪和电子计算机联

用。主要由以下部分组成：

1，高真空系统

质谱计必须在高真空下才能工作。用以取得所需真空度的阀泵系统，一般由前级泵（常用机械泵）和油扩散泵或分子涡轮泵等组成。扩散泵能使离子源保持在10～10毫米汞柱的真空度。有时在分析器中还有一只扩散泵，能维持10～10毫米汞柱的真空度。

2，样品注入系统

可分直接注入、气相色谱、液相色谱、气体扩散四种方法。固体样品通过直接进样杆将样品注入，加热使固体样品转为气体分子。对不纯的样品可经气相或液相色谱预先分离后，通过接口引入。液相色谱－质谱接口有传动带接口、直接液体接口和热喷雾接口。热喷雾接口是最新提出的一种软电离方法，能适用于高极性反相溶剂和低挥发性的样品。样品

由极性缓冲溶液以每分钟1～2毫升流速通过一毛细管。控制毛细管温度，使溶液接近出口处时，蒸发成细小的喷射流喷出。微小液滴还保留有残余的正负电荷，并与待测物形成带有电解质或溶剂特征的加合离子

而进入质谱仪。

3，离子源

使样品电离产生带电粒子（离子）束的装置。应用最广的电离方法是电子轰击法，其他还有化学电离、光致电离、场致电离、激光电离、火花电离、表面电离、X 射线电离、场解吸电离和快原子轰击电离等。其中场解吸和快原子轰击特别适合测定挥发性小和对热不稳定的化合物。

4，质量分析器

将离子束按质荷比进行分离的装置。它的结构有单聚焦、双聚焦、四极

矩、飞行时间和摆线等。

5，收集器

经过分析器分离的同质量离子可用照相底板、法拉第筒或电子倍增器收集检测。随着质谱仪的分辨率和灵敏度等性能的大大提高，只需要微克级甚至纳克级的样品，就能得到一张较满意的质谱图，因此对于微量不纯的化合物，可以利用气相色谱或液相色谱（对极性大的化合物）将化合物分离成单一组分，导入质谱计，录下质谱图，此时质谱计的作用如

同一个检测器。

由于色谱仪－质谱计联用后给出的信息量大，该法与计算机联用，使质谱图的规格化、背景或柱流失峰的舍弃、元素组成的给出、数据的储存和计算、多次扫描数据的累加、未知化合物质谱图的库检索，以及打印数据和出图等工作均可由计算机执行，大大简化了操作手续。

质谱中出现的离子有分子离子、同位素离子、碎片离子、重排离子、多电荷离子、亚稳离子、负离子和离子－分子相互作用产生的离子。综合分析这些离子，可以获得化合物的分子量、化学结构、裂解规律和由单分子分解形成的某些离子间存在的某种相互关系等信息。

质谱法特别是它与色谱仪及计算机联用的方法，已广泛应用在有机化学、生化、药物代谢、临床、毒物学、农药测定、环境保护、石油化学、地球化学、食品化学、植物化学、宇宙化学和国防化学等领域。近年的仪器都具有单离子和多离子检测的功能，提高了灵敏度及专一性，灵敏度可提高到10(克水平。用质谱计作多离子检测，可用于定性分析，例如，在药理生物学研究中能以药物及其代谢产物在气相色谱图上的保留时间和相应质量碎片图为基础，确定药物和代谢产物的存在；也可用于定量分析，用被检化合物的稳定性同位素异构物作为内标，以取得更准

确的结果。

在无机化学和核化学方面，许多挥发性低的物质可采用高频火花源由质谱法测定。该电离方式需要一根纯样品电极。如果待测样品呈粉末状，可和镍粉混合压成电极。此法对合金、矿物、原子能和半导体等工

艺中高纯物质的分析尤其有价值，有可能检测出含量为亿分之一的杂

质。

利用存在寿命较长的放射性同位素的衰变来确定物体存在的时间,在考古学和地理学上极有意义。例如,某种放射性矿物中有放射性铀及其衰变产物铅的存在，铀238和铀235的衰变速率是已知的，则由质谱测出铀和由于衰变产生的铅的同位素相对丰度，就可估计该轴矿物生成

的年代。

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液相色谱—质谱联用的原理及应用 简介 液色迷人https://www.360docs.net/doc/3c17890466.html, "

1977年，LC/MS 开始投放市场

1978年，LC/MS 首次用于生物样品

分析

1989年，LC/MS/MS 取得成功

1991年，API LC/MS 用于药物开发

1997年，LC/MS/MS 用于药物动力学

高通量筛选

2002年美国质谱协会统计的药物色

谱分析各种不同方法所占的比例。

1990年，HPLC 高达85%，而2000

年下降到15%，相反，LC/MS 所占的

份额从3%提高到大约80%。我们国

家目前在这方面可能相当于美国

1990年的水平。为此我们还有很长的一段路要走色谱质谱的在线联用将色谱的分离能力与质谱的定性功能结合

起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析。而且也简化了样品

的前处理过程，使样品分析更简便。

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色谱质谱联用包括气相色谱质谱联用(GC-MS)和液相色谱质谱联用(LC-MS)，液质联用与气质联用互为补充，分析不同性质的化合物。

液质联用与气质联用的区别:

气质联用仪(GC-MS)是最早商品化的联用仪器，适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物；用电子轰击方式（EI）得到的谱图，可

与标准谱库对比。

液质联用(LC-MS)主要可解决如下几方面的问题：不挥发性化合物分析测定；极性化合物的分析测定；热不稳定化合物的分析测定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图。

现代有机和生物质谱进展

在20世纪80及90年代，质谱法经历了两次飞跃。在此之前，质谱法通常只能测定分子量500Da以下的小分子化合物。20世纪70年代，出现了场解吸（FD）离子化技术，能够测定分子量高达1500~2000Da 的非挥发性化合物，但重复性差。20世纪80年代初发明了快原子质谱法（FAB-MS），能够分析分子量达数千的多肽。

随着生命科学的发展，欲分析的样品更加复杂，分子量范围也更大，因此，电喷雾离子化质谱法（ESI-MS）和基质辅助激光解吸离子化质谱

法（MALDI-MS）应运而生。

目前的有机质谱和生物质谱仪，除了GC-MS的EI和CI源，离子化方式有大气压电离（API）（包括大气压电喷雾电离ESI、大气压化学电离APCI、大气压光电离APPI）与基质辅助激光解吸电离。前者常采用四极杆或离子阱质量分析器，统称API-MS。后者常用飞行时间作为质量分析器，所构成的仪器称为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）。API-MS的特点是可以和液相色谱、毛细管电泳等分离手段联用，扩展了应用范围，包括药物代谢、临床和法医学、环境分析、食品检验、组合化学、有机化学的应用等；MALDI-TOF-MS 的特点是对盐和添加物的耐受能力高，且测样速度快，操作简单。

质谱原理简介：

质谱分析是先将物质离子化，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。以检测器检测到的离子信号强度为纵坐标，离子质荷比为横坐标所作的条状图就是我们常见的质

谱图。

常见术语:

质荷比: 离子质量(以相对原子量单位计)与它所带电荷(以电子电量为

单位计)的比值,写作m/Z.

峰: 质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰.

离子丰度: 检测器检测到的离子信号强度.

基峰: 在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的离子峰称作基峰.

总离子流图；质量色谱图；准分子离子；碎片离子；多电荷离子；同位

素离子

总离子流图:

在选定的质量范围内，所有离子强度的总和对时间或扫描次数所作的图,

也称TIC图.

质量色谱图

指定某一质量(或质荷比)的离子其强度对时间所作的图.

利用质量色谱图来确定特征离子，在复杂混合物分析及痕量分析时是LC/MS测定中最有用的方式。当样品浓度很低时LC/MS的TIC上往往看不到峰，此时，根据得到的分子量信息，输入M+1或M+23等数值，观察提取离子的质量色谱图，检验直接进样得到的信息是否在LC/MS 上都能反映出来，确定LC条件是否合适，以后进行MRM等其他扫描

方式的测定时可作为参考。

1.0

指与分子存在简单关系的离子，通过它可以确定分子量.液质中最常见

的准分子离子峰是[M+H]+ 或[M-H]- .

在ESI中, 往往生成质量大于分子量的离子如

M+1,M+23,M+39,M+18......称准分子离子,表示为:[M+H]+,[M+Na]+等

碎片离子：

准分子离子经过一级或多级裂解生成的产物离子.

碎片峰的数目及其丰度则与分子结构有关,数目多表示该分子较容易断

裂,丰度高的碎片峰表示该离子较稳定,也表示分子比较容易断裂生成该

离子。

Ephedrine, MW = 165

多电荷离子：

指带有2个或更多电荷的离子,常见于蛋白质或多肽等离子.有机质谱中,单电荷离子是绝大多数,只有那些不容易碎裂的基团或分子结构-如共轭体系结构-才会形成多电荷离子.它的存在说明样品是较稳定的.采

用电喷雾的离子化技术,

可产生带很多电荷的离子,最后经计算机自动换算成单质/荷比离

子。

同位素离子

由元素的重同位素构成的离子称为同位素离子.

各种元素的同位素,基本上按照其在自然界的丰度比出现在质谱中,这对于利用质谱确定化合物及碎片的元素组成有很大方便, 还可利用稳定同位素合成标记化合物,如:氘等标记化合物,再用质谱法检出这些化合物,在质谱图外貌上无变化,只是质量数的位移,从而说明化合物结构,反

应历程等

如何看质谱图：

(1)确定分子离子,即确定分子量

氮规则：含偶数个氮原子的分子，其质量数是偶数，含奇数个氮原子的分子，其质量数是奇数。与高质量碎片离子有合理的质量差，凡质量差

在3~8和10~13，21~25之间均不可能，则说明是碎片或杂质。

(2)确定元素组成，即确定分子式或碎片化学式

高分辨质谱可以由分子量直接计算出化合物的元素组成从而推出分子

式

低分辨质谱利用元素的同位素丰度，例:

(3)峰强度与结构的关系

丰度大反映离子结构稳定

在元素周期表中自上而下，从右至左，杂原子外层未成键电子越易被电离，容纳正电荷能力越强，含支链的地方易断，这同有机化学基本一致，

总是在分子最薄弱的地方断裂。

不同类型有机物有不同的裂解方式

相同类型有机物有相同的裂解方式,只是质量数的差异需要经验记忆。

质谱解析的一般步骤

(适于低分辨小分子谱图,若已经是高分辨质谱图得到元素组成更好) (1)核对获得的谱图,扣除本底等因素引起的失真,考虑操作条件是否适

当

(2)综合样品其他知识：例如熔点，沸点，溶解性等理化性质，样品来源，

光谱，波谱数据等.

(3) 尽可能判断出分子离子。

(4) 假设和排列可能的结构归属：高质量离子所显示的，在裂解中失去

的中性碎片，如M-1，M-15，M-18，M-20，M-31......意味着失H，CH3，

H2O，HF，OCH3......

(5)假设一个分子结构，与已知参考谱图对照，或取类似的化合物，并作

出它的质谱进行对比。

有机质谱的特点

优点:

(1)定分子量准确，其它技术无法比。

(2)灵敏度高，常规10-7—10-8g,单离子检测可达10-12g。

(3)快速，几分甚至几秒。

(4)便于混合物分析，LC/MS，MS/MS对于难分离的混合物特别有效, 其

它技术无法胜任。

(5)多功能，广泛适用于各类化合物。

局限性:

(1)异构体，立体化学方面区分能力差。

(2)重复性稍差，要严格控制操作条件。所以不能象低场NMR，IR等自

己动手，须专人操作。

(3)有离子源产生的记忆效应，污染等问题。

(4)价格稍显昂贵，操作有点复杂。

质谱仪器：

质谱仪由以下几部分组成

数据及供电系统

┏━━━━┳━━━━━╋━━━━━━┓

进样系统离子源质量分析器检测接收器

┗━━━━━╋━━━━━━┛

真空系统

真空系统

质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须在高真空状态下工作，以减少本底的干扰，避免发生不必要的离子-分子反应。所以质谱反应属于单分子分解反应。利用这个特点，我们用液质联用的软电离方式可以得到化合物的准分子离子，从而得到分子量。

由机械真空泵(前极低真空泵)，扩散泵或分子泵(高真空泵)组成真空机组，抽取离子源和分析器部分的真空。

只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到达接收器，真空度不够则

灵敏度低。

进样系统

把分析样品导入离子源的装置，包括：直接进样，GC，LC及接口，加

热进样，参考物进样等。

离子源

使被分析样品的原子或分子离化为带电粒子(离子)的装置，并对离子进

行加速使其进入分析器，根据离子化方式的不同，有机质谱中常用的有

如下几种，其中EI，ESI最常用。

EI(Electron Impact Ionization):电子轰击电离—硬电离。

CI(Chemical Ionization):化学电离—核心是质子转移。

FD(Field Desorption):场解吸—目前基本被FAB取代。

FAB(Fast Atom Bombardment):快原子轰击—或者铯离子(LSIMS,液

体二次离子质谱) 。

ESI(Electrospray Ionization):电喷雾电离—属最软的电离方式。适宜极性分子的分析，能分析小分子及大分子(如蛋白质分子多肽等) APCI(Atmospheric Pressure Chemical Ionization):大气压化学电离—

同上，更适宜做弱极性小分子。

APPI(Atmospheric Pressure PhotoSpray Ionization):大气压光喷雾电

离—同上，更适宜做非极性分子。

MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption):基体辅助激光解吸电离。通常用于飞行时间质谱和FT-MS，特别适合蛋白质，多肽等大分子．其中ESI，APCI，APPI统称大气压电离(API)

实验室现有的离子源:

ESI电喷雾电离源

APCI大气压化学电离源

电喷雾（ESI）的特点

通常小分子得到[M+H]+ ]+,[M+Na]+ 或[M-H]-单电荷离子，生物大分子产生多电荷离子，由于质谱仪测定质/荷比，因此质量范围只有几千质量数的质谱仪可测定质量数十几万的生物大分子。

电喷雾电离是最软的电离技术，通常只产生分子离子峰，因此可直接测定混合物，并可测定热不稳定的极性化合物；其易形成多电荷离子的特性可分析蛋白质和DNA等生物大分子；通过调节离子源电压控制离子的碎裂（源内CID）测定化合物结构。

大气压化学电离（APCI）特点

大气压化学电离也是软电离技术，只产生单电荷峰，适合测定质量数小于2000Da的弱极性的小分子化合物；适应高流量的梯度洗脱/高低水溶液变化的流动相；通过调节离子源电压控制离子的碎裂。

电喷雾与大气压化学电离的比较

电离机理：电喷雾采用离子蒸发，而APCI电离是高压放电发生了质子转移而生成[M＋H]+或[M-H]-离子。

样品流速：APCI源可从0.2到2 ml／min；而电喷雾源允许流量相对较

小,一般为0.2-1 ml／min.

断裂程度；APCI源的探头处于高温，对热不稳定的化合物就足以使其

分解.

灵敏度：通常认为电喷雾有利于分析极性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合物，而APCI更适合于分析极性较小的化合物。

多电荷：APCI源不能生成一系列多电荷离子

NanoSpray 离子源

专门设计的NanoSpray 离子源特别适合于做微量的生化样品，其流速范围可从5nL／min到luL／min。一滴样品就可做数小时的分析。可在最小的样品消耗量下获得最大灵敏度。灵敏度可高达fmole。并可

直接与微孔HPLC联用。

正负离子模式:

一般的商品仪器中,ESI和APCI接口都有正负离子测定模式可供选择。根据样品的性质选择，也可两种模式同时进行质量分析器: 是质谱仪中将离子按质荷比分开的部分,离子通过分析器后,按不同质荷比(M/Z)分开,将相同的M/Z离子聚焦在一起,组成质谱。

质量分析器的分类：

双聚焦扇形磁场-电场串联仪器(sector).

四极质谱仪(Q).

飞行时间质谱仪(TOF).

离子阱质谱仪（TRAP）

付利叶变换-离子回旋共振质谱仪(FT-ICRMS).

┏四极+TOF（Q-TOF）

串列式多级质谱仪┫三重四极（QqQ）

(MS/MS) ┗TOF+TOF

进行MS/MS的仪器从原理上可分为两类

第一类仪器利用质谱在空间中的顺序，是由两台质谱仪串联组装而成。

即前面列出的串列式多级质谱仪。

第二类利用了一个质谱仪时间顺序上的离子储存能力，由具有存储离子的分析器组成，如离子回旋共振仪（ICR）和离子阱质谱仪。但不能进

行母离子扫描或中性丢失。

实验室现有的质量分析器类型：

串联四极质谱仪(MS/MS) ：

三重四极（QqQ）

离子源→第一分析器→碰撞室→第二分析器→接收器

MS1 MS2

Q1 q2 Q3

QqQ仪器可以方便的改变离子的动能，因此扫描速度快，体积小，常作为台式进入常规实验室，缺点是质量范围及分辨率有限，不能进行高分辨测定，只能做到单位质量分辨。（通过高分辨能得到化合物的分子

式）

在液质联机中使用的碎片化手段，能量都是以碰撞的形式输送给分子离子，这个能量足以使得处在能量亚稳态分子中的某些化学键断裂并使一

些特定的分子发生结构重排。

碰撞诱导解离CID质谱：

选择一定质量的离子作为母体离子，进入碰撞室，室内充有靶子反应气体(碰撞气体：N2、He、Ar、Xe、CH4等) ，发生离子—分子碰撞反应，从而产生?子离子‘，再经MS2的分析器及接受器得到子离子质谱，一般称做CID (collision-induced dissociation)谱

影响CID质谱的因素：

较大影响的因素有：所用碰撞气体的种类，压力，离子的能量，仪器的

配置以及离子电荷状态

由于在不同的仪器上不可能在完全相同的条件下去分析样品，任何一个给定的化合物将在不同的条件下给出差别或大或小的质谱，尤其是各个离子峰的相对丰度的差别几乎是无法避免的。因而目前尚难以建立商品化的谱库供检索使用，只能进行人工解析或自己建库。

大气压电离技术中产生的离子为偶数电子离子，其主要的碎片应由化学键的诱导断裂和重排反应来产生，所以在EI质谱解析中总结出的偶数电子离子的开裂规则一般可适用于CID质谱的解释。

检测接收器：